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ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος...13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...17 Ι. ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ...19 Α. AΡΧΙΚΗ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗ...19 Α1. Αιμοπετάλια...19 α) Παραγωγή των αιμοπεταλίων:...19 β) Κυκλοφορία των αιμοπεταλίων:...20 γ) Δομή των αιμοπεταλίων:...20 δ) Λειτουργία των αιμοπεταλίων...21 Φάση της πυροδότησης...22 Η μεταβολή του σχήματος των αιμοπεταλίων....22 Προσκόλληση των αιμοπεταλίων...23 Αντίδραση απελευθέρωσης των αιμοπεταλίων:...24 Συσσώρευση των αιμοπεταλίων:...25 Φάση μεγιστοποίησης...25 Φάση ολοκλήρωσης της διέγερσης των αιμοπεταλίων....26 Η αντίδραση flip-flop. Προπηκτική δραστηριότητα των αιμοπεταλίων:...26 ε) Έλεγχος της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων...26 Α2. Ενδοθήλιο...27 Β. ΠΗΞΗ...28 Β1. Αναλυτική μελέτη των συστατικών της πήξης...28 Το μόριο του ινωδογόνου...34 Καρβοξυλίωση των παραγόντων της πήξεως:...36 Β2. Συνθετική Μελέτη...36 Β2. α. Ενζυμικά συμπλέγματα...37 Β2. β. Συνοπτική σύνθεση των ενζυμικών συμπλεγμάτων...39 Δεκάση Ι ή εξωγενής δεκάση (TF/VIIa/Ca ++ /φωσφολιπίδια)...39 Η δεκάση ΙΙ ή ενδογενής δεκάση (ΙΧa/VIIIa/ Ca++/φωσφολιπίδια)...40 Η προθρομβινάση (Xa/Va/Ca++/φωσφολιπίδια)...40 Β2. γ. Το σύστημα επαφής...41 Β2. δ. Φυσιολογικοί ανασταλτές του πηκτικού δρόμου...45 1. PC, ΤΜ, PS και EPCR...45 2. Ανασταλτής του δρόμου του ιστικού παράγοντα (Tissue factor pathway inhibitor- TFPI)...47 3. Το σύστημα της Αντιθρομβίνης...49 Β2. ε. Ο ρόλος της θρομβίνης...51 B3. Δυναμική μελέτη...52 Συμπεράσματα από τις μελέτες δυναμικής της πήξης...53 B4. In vivo ενεργοποίηση της πήξης...55 Γ. ΙΝΩΔΟΛΥΣΗ...57 Γ1. Εισαγωγή...58 Γ2. Συστατικά του ινωδολυτικού δρόμου...58 Γ3. Μοριακός μηχανισμός ινωδόλυσης...58 Γ4. Ο TAFI (Thrombin activatabe fibrinolysis inhibitor) και ο ρόλος του στην ινωδόλυση...60 Ο ρόλος του TAFI στην ινωδόλυση...61 Ο ρόλος του ενδογενούς συστήματος στην ενεργοποίηση του TAFI...61 O ρόλος του TAFI στις αιμορραγικές διαταραχές...62 ΙΙ. ΑΙΜΟΡΡΑΓΙΚΕΣ ΣΥΓΓΕΝΕΙΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ...64 ΜΟΡΙΑΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΩΝ ΣΥΝΔΡΟΜΩΝ...64 Οι παράγοντες VIII και ΙΧ στην πηκτική διαδικασία...64 Αιμορροφιλικά σύνδρομα...65 Τα γονίδια και οι πρωτεΐνες των παραγόντων VIII και IX...66 Factor VIII...66 Factor IX...70 Η μοριακή βάση των αιμορροφιλικών συνδρόμων...71 Τύποι μεταλλάξεων...72 Αναστροφή στο ιντρόνιο 22 του παράγοντα VIII...73 Μοριακή παθολογία- Σχέσεις αιτίων- αποτελέσματος...75 Μη νοηματικές μεταλλάξεις στα κωδικόνια CGA (αργινίνης)...75 Δυσνοηματικές μεταλλάξεις στις θέσεις ενεργοποίησης των VIII και ΙΧ...75 Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη θέση σύνδεσης του παράγοντα VIII με τον παράγοντα von Willebrand...75 Μεταλλάξεις που επηρεάζουν την έκκριση του παράγοντα VIII...75 Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη σύνδεση του παράγοντα ΙΧ με τον VIII...76 9

Μεταλλάξεις που προκαλούν ανεπάρκεια του παράγοντα ΙΧ κατά τη διάρκεια της αντιπηκτικής θεραπείας...76 Μεταλλάξεις στην περιοχή του προαγωγέα (promoter) του παράγοντα IX και η αιμορροφιλία B Leyden...76 Κλινική εικόνα αιμορροφιλίας...77 Γιατί οι αιμορροφιλικοί αιμορραγούν, κυρίως, στις αρθρώσεις...78 Δυνητικοί ρυθμιστές της σοβαρότητας της αιμορροφιλίας...79 Οι μεταλλάξεις και ο κίνδυνος ανάπτυξης αναστολέων...79 Κλινικές εφαρμογές της μοριακής διάγνωσης της αιμορροφιλίας Α...81 Κλινική διάγνωση βασιζόμενη στο DNA- προγεννητικός έλεγχος...81 Άλλες γενετικές βλάβες που σχετίζονται με ελαττωμένα επίπεδα παράγοντα VIII...82 Νόσος Willebrand (vwd)...82 Συνδυασμένη ανεπάρκεια των παραγόντων V και VIII...83 ΙΙΙ. ΣΥΓΓΕΝΕΙΣ ΘΡΟΜΒΟΦΙΛΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ...84 ΘΡΟΜΒΟΦΙΛΙΑ- ΟΡΙΣΜΟΣ...84 Σχετικός...86 ΟΛΙΓΟΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΦΛΕΒΙΚΗΣ ΘΡΟΜΒΩΣΗΣ...86 ΥΠΟΨΗΦΙΑ ΓΟΝΙΔΙΑ...87 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΟΘΡΟΜΒΩΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΜΕ ΕΡΕΥΝΑ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ (SEQUENCING)...88 ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΚΙΝΔΥΝΟΣ ΘΡΟΜΒΩΣΕΩΝ...89 ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΕ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΕΣ...94 Activated Protein C resistance (apc-r) ή και παρουσία μετάλλαξης FV Leiden...95 Μετάλλαξη της προθρομβίνης ΙΙ G20210A...99 Έλλειψη Πρωτεΐνης C (PC)...100 Ανεπάρκεια πρωτεΐνης S (PS)...100 Ανεπάρκεια Αντιθρομβίνης (ΑΤ)...103 Υπερομοκυστεϊναιμία/MTHFR C677T...104 Αύξηση των επιπέδων του παράγοντα V...108 Αυξημένα επίπεδα παράγοντα VII...108 Αυξημένα επίπεδα παράγοντα VIII...109 Αυξημένα επίπεδα παράγοντα ΙΧ και θρομβοφιλικός κίνδυνος...110 Υψηλά επίπεδα παράγοντα ΧΙ και κίνδυνος θρόμβωσης...110 Υψηλά επίπεδα παράγοντα von Willebrand και κίνδυνος θρόμβωσης...111 Ανεπάρκεια του παράγοντα ΧΙΙ και θρομβωτικός κίνδυνος...111 Ο ρόλος της ινωδόλυσης στη θρόμβωση...112 Αύξηση των επιπέδων του ΡΑΙ-1...112 Ανεπάρκεια του πλασμινογόνου...113 Aύξηση της α2-αντιπλασμίνης (α2-αρ)...114 Αύξηση των αιμοστατικών παραγόντων και θρομβοφιλική διάθεση- ελληνική μελέτη...115 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...117 Ι. ΥΛΙΚΟ...119 Αιμορραγικοί ασθενείς...119 Φυσιολογικά άτομα (ομάδα ελέγχου)...120 Θρομβοφιλικοί ασθενείς...120 ΙΙ. ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ...124 Δομή του DNA...124 Μέθοδοι ανάλυσης και τεχνικές μοριακής βιολογίας...125 Απομόνωση γονιδιακού (genomic) DNA...125 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction- PCR)...126 Αρχή της μεθόδου...126 PCR θερμής έναρξης (Hot start PCR)...128 Ανάλυση πολυμορφισμών μήκους θραύσματος από ένζυμα περιορισμού (Restriction Fragment Length Polymorphism- RFLP analysis)...129 PCR- RFLP ανάλυση...130 Ανίχνευση του παράγοντα V Leiden...131 Ανίχνευση του αλληλίου 20210Α του γονιδίου της προθρομβίνης...134 PCR μακράς ακολουθίας (Long PCR) για την αποκάλυψη της αναστροφής του ιντρονίου 22 στο γονίδιο του παράγοντα FVIII...137 PCR μακράς ακολουθίας (Long PCR) για την αποκάλυψη της αναστροφής του ιντρονίου 22 στο γονίδιο του παράγοντα FVIII...137 Ανίχνευση της μετάλλαξης C677T του γονιδίου της μεθυλενοτετραϋδροφολικής ρεδουκτάσης (MTHFR C677T)...142 ΙΙΙ. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΗΞΕΩΣ...145 1. Γενικές αρχές...145 Προετοιμασία του ασθενούς...145 Τρόπος αιμοληψίας...145 10

Συλλογή δείγματος...145 Βαθμονομήσεις καμπυλών...145 2. Ειδικό μέρος...146 2.1. Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα ΙΙ...147 2.2. Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα V...147 2.3. Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα X...148 2.4. Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα VII...149 2.5. Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα VIII...149 2.6. Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα IX...150 2.7. Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα XI...151 2.8. Πηκτική μέθοδος για τον προσδιορισμό του παράγοντα XIΙ...151 2.9. Μέθοδος για τον προσδιορισμό της Αντιθρομβίνης με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων...152 2.10. Μέθοδος για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης C (PC) με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων...153 2.11. Μέθοδος για τον προσδιορισμό της ελεύθερης πρωτεΐνης S (free PS) με τη χρήση ανοσοενζυμικής μεθόδου ΕΙΑ...153 2.12. Μέθοδος για τον προσδιορισμό της α2- αντιπλασμίνης με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων...153 2.13. Μέθοδος για τον προσδιορισμό του πλασμινογόνου με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων154 2.14. Μέθοδος για τον προσδιορισμό του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activator Inhibitor- PAI) με τη χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων...155 2.15. Ανοσο-θολοσιμετρική μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αντιγόνου του παράγοντα Willebrand (vwf:ag)...156 2.16. Μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό της δραστικότητας συμπαράγοντα της ριστοσετίνης παράγοντα Willebrand (vwf:ricof)...157 IV. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ...159 V. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...161 Α. Έλεγχος μεταλλάξεων (γονιδιακός έλεγχος)...161 Α1. Ομάδα ελέγχου (φυσιολογικά άτομα)...161 Α2. Ομάδα αιμορραγικών ασθενών...161 Α3. Ομάδα θρομβοφιλικών...161 Α4. Σύγκριση συχνότητας θρομβοφιλικών μεταλλάξεων μεταξύ αιμορραγικών ασθενών και ομάδας ελέγχου...162 Α5. Σύγκριση συχνότητας θρομβοφιλικών μεταλλάξεων μεταξύ θρομβοφιλικών ασθενών και ομάδας ελέγχου...162 Α6. Σύγκριση συχνότητας θρομβοφιλικών μεταλλάξεων μεταξύ αιμορραγικών ασθενών και θρομβοφιλικών...162 Β. Επίπεδα αιμοστατικών παραγόντων (πηξιολογικός έλεγχος)...163 Β1. Ομάδα ελέγχου (φυσιολογικά άτομα)...163 Β2. Ομάδα αιμορραγικών ασθενών...165 Β3. Ανεύρεση αιμορραγικών ασθενών με παθολογικά επίπεδα αιμοστατικών παραγόντων που μετατοπίζουν την αιμοστατική τους ισορροπία προς την πλευρά της θρόμβωσης...166 Β4. Σύγκριση μέσων τιμών των παραγόντων μεταξύ αιμορροφιλικών ασθενών και ομάδας μαρτύρων...168 Γ. Εμφάνιση θρομβωτικών επεισοδίων σε αιμορροφιλικούς ασθενείς...169 VI. ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...171 Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας...171 Α. Συνύπαρξη αιμορροφιλίας και προθρομβωτικών μεταλλάξεων...171 Β. Η μετάλλαξη του παράγοντα V Leiden ως πιθανός εξελικτικός μηχανισμός επιλογής...179 Β. Η μετάλλαξη του παράγοντα V Leiden ως πιθανός εξελικτικός μηχανισμός επιλογής...180 Γ. Θρομβοεμβολικά επεισόδια σε αιμορροφιλικούς...180 Δ. Αθηρωμάτωση και αρτηριακή θρόμβωση σε αιμορραγικούς ασθενείς...182 Συζήτηση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης...185 Α. Γονιδιακοί θρομβοφιλικοί παράγοντες...185 B. Επίπεδα αιμοστατικών παραγόντων- σύγκριση μεταξύ αιμορροφιλικών και ομάδας ελέγχου..188 Γ. Θρομβωτικά επεισόδια σε αιμορροφιλικούς...191 VII. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...192 VIII. Περίληψη...219 ΙΧ. Summary...223 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...227 11

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0. */, -/, 0+ Leydic (Goodwin et al, 2002). 1. / - -.)) 3 PS, 0-0 ;--, PROS1 PROS2. (Schmidel et al, 1990). ' PROS 1 80 * 15 4. ' 4 I ) VIII *-K 4 )7, 4 IX ) XV )-. «+ - +0» (sex hormone-binding globulin- SHBG),.. - ) * *- 4 )7 (Goodwin et al, 2002). (.0 4 PS +* /*) + + 1984 (Comp PC et al, 1984, Schwartz et al, 1984). ( PS - ) APC ) ) ) Va VIIIa. ( PS - 4 APC 0 /* - - Va, VIIIa, and Xa (van Wijnen et al, 1996, Koppelman S et al, 1995). 60% - 70% PS * --0 0, - )7 4 (C4 binding protein- C4BP) / )7 (Dahlback et al, 1990). & 0 - -/0 /0 - C4BP PS / -0. 0, - / - 0 ) ) PS. ( C4BP )7 2 +0 / 6 ) 7 -.) * -. - * - 0. /0 - PS, C4BP*+ C4BP* / / PS. (.0 C4BP PS 0 C4BP )7 4 +).., 0 de Frutos et al 0 / - / PS (free PS, -- --0 C4BP). - ) -) 4 +) 4 ) -+ / ) * -) C4 *) 4 PS - 4 C4BP*+. ( --0, ), PS - 0. -, / 0. - APC (de Frutos et al, 1994). 2. ) # '# # )$1 ( (Tissue factor pathway inhibitor- TFPI) O TFPI 0 0 ) Kunitz 0) ) ) +0 ) - (Tissue factor pathway inhibitor-tfpi exogenous pathway inhibitor- EPI, -/ - Rappaport Lipoprotein associated coagulation inhibitor- LACI, -/ - ) Broze Miletich). ' 0. 0 4 - / 3.0 Kunitz 0 * *4-. VIIa Xa )7.. - 1 2 Kunitz... TFPI 0 Xa, VIIa. Xa. ( 0 VIIa/TF. - -:. TFPI/Xa TFPI/Xa/VIIa/TF (Broze et al, 1988, Warn-Cramer et al, 1988).! / o TFPI -0 / 47

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+ 22: (A)' mrna VIII (B)' /0 )< VIII * -. 19 40) 0-2332 40) (, 2351 40)). A1 3, B, C1, C2.0. ' 4 -. /0 ) /*. (C) ' 0 VIII 0 0 - N- * C- + */ ) * (Ca2+) (Bowen DJ, 2002). (. - VIII /. Xa 0.. - ( VIIa). '. 4 /* - 40 ) Xa. /* - - - -.( +0 0). /*. - 4. ) () 0 Hemker 1980)., ) 4 -. - - 0 ** -/. -, ) 0. - +/, )7 C, ( 0 VIII V), ( /* ( 0 /* /*, VII, / ), 0, - (tissuefactor-pathway inhibitor, TFPI- 0 - ). 0 VIII, VIIIa, 0 /0. ). ( ), - 0 - ) /* Xa. + 0 -. + -.) ) - -). ( - + -.) &2. 0 VIIIa, VIIIa ) - 0 )7 C /0 Arg 336 and Arg 562 ((oyer, 1994). 68

, ) ) FVIII in vivo, 0 0 ( + & -/. ). 1.,, */ 0+ -.) ) ) (-/ - - /, + / - + +0 /) 0. (Hedner et al, 2000,!, 1996). ( )7 VIII + 0 ( 100 mg/ml). 0 VIII (0.2 µg ml ) 4, ) - -/ ((oyer, 1994,!, 1996). O VIII / )7,. /. +0 Willebrand (VWF). - -. 1, - )7 + ). ( * / VIII VWF /. - FVIII * VW ) ** 2N VWD.!0. VIII -. - ( *- 4 VIIIa, IXa, ) +)+- )) - 0 - +)+ - (Hoyer, 1994,!, 1996). 0,. 0 Willebrand. 0) VIII /0 **, 4 - Willebrand -/0 )7 ) ) /0 **..) Willebrand - + VIII /* Xa 1 Willebrand / +, VIII +0 -/ +)+ - (Hoyer, 1994). 69

+ 23: '. -. -+0 )7 VIII. +- - ) ) + 0.0 (a1, a2, a3) - ) ) ( ) - Willebrand. ( 2. 0 )0 ) 0.. ' ). -. /0 ) - * - ) 0, 4) ) /*, IX (IXa) X (Xa) 0 )7 C (APC). (Lenting et al 1998). Factor IX ' - IX -, VIII. ' 34 kb 0. 8 4, ) ) 1935 bp (. 24A). ' + 2803 *, * 5` +0. (29 *)), 0. ) 0 )- ( 1383 *)), 3` +0. (1390 *)) (. 24B). '. ) )- --)7,. ( - -) / 0 IX,. 0.. GLA, /0 - *4 * (*- 40) +0 0 *4 40 (glu) 0. GLA.! + «-» - +. ', 0. + ).) ) ) - )..0 0 - (Bowen, 2002) ( - - - - C-, 0 & 145, 0 180 (. 24C). - 0. 70

0 XI,. -0 - -, -0 0 /0 VII 4) - (Osterud and Rapaport, 1977). ( --, + * XI - -., * VII. * -.. ( - N- + C- *, 4 0 -+-- 4 ) ) 7 (. 24D) (Bowen, 2002). A 1 2 3 4 5 6 7 8 (~34 kb) B 5 UTR (29nt) FIX coding sequence + stop codon (1383nt) 3 UTR (29nt) C -46-19 1 40 85 415 p N r e pro GLA EGF EGF act catalytic C Arg145 Arg180 D S S GLA EGF EGF catalytic Light chain Heavy chain + 24: (A) ) - IX. (B) mrna IX +. 0/ /0. ). (C) ' /0 )< IX * - -. (27 19 40),.) 0-415 40) (, 461 40). (D) 0 IX * N- + - C- * - -0 -+- 0+ 4 ) ) ) < /0 132 279. "GLA"., 12 40 + -+ -*4 ) *- 4 *4 /0-0 0 *4 ; EGF, epidermal growth factor-like domain; act, activation peptide / ) /0 arg 145 arg 180; catalytic,. ) (Bowen DJ, 2002). $ "()* %$3 )#' 4 + & 20. /. 0 - /., 0. */ 0 / 4) +0 * ) + -) 4. 71

!,,.0 4 0 - /,. 4 0. /. + **.,. 0../ 4 ) ) 0 +0, - - -, + - ), )7 -, - -- -/ (splicing) mrna. ;+ ) 4) -. + 4 0, 0 / -+ 4, ) / )7, ) - ), -... ( -4 ) /0) -, + 0. *// +. ) ) + «0» *; )< - (Bowen 2002).? 4 0. + + * ) * --0): B+K H%9 V V%9: 2KQ:Y JO > E > } :š} :œ? žÿž:? #š}ž:? :ž:? : L Ž $Ÿ$š :! : : :Ÿ Ž œ? ªœš gœ? E B+KH%9 V V%9: 2KQ:YJl«[> E > + + g? : gª:ÿ:? :ž:? : L Ž g : E JK 9K 7C,9> E > 3 š}ž% :œ $?, ±ž$? :ž:? : L Ž ±ž$ I Ž g $ ², gª @? E Ž 1 (0 4 - ) ) VIII IX 0, ;, / 0/+0. 0 4 /0 90% ) ). 0 4-0 (missense- )- 0. ) 0 ) -+ 40), 0 4 (nonsense- 4 0. ) 0 ) )- stop ) +), 4 /0 -/ mrna (mrna splice site) (- /0-/ mrna - )., 0 4 -.- *, -0 * 40 (-- 0 4 -+0. + +, -+*,.). 4 /0 -/ mrna - *. 0 4 / 0.0 CG..0 CG /) /0.0 + 4 -. * C T G A (Duncan, Miller, 1980).. ) /0) 0. /) 4) (Duncan, Miller, 1980). 30% ) 4) + * 0 /0 CG. ' 79% - *.0 CG ; ) 0.0 )) - + DNA (Bowen, 2002). 72

0 4 4,,.. 4 * + & 2 *, ),.0 CG. ' 0.0 0. 40 4 ) 4) * 4. $., 4 - * /0 CG. &0 0 4 - - (founder effect) -/ --.0 0. 1, 0 )+0.0. & 4 + 0, + 4 * ( )0 - * )) 0. / / 0 (Green et al, 1992, Thompson et al, 1990, Bowen et al, 2002). ; -. 4 + 5 10% ) /. ; - ) ) VIII IX + -, - ; 0) *)., + 0. 0).0 ) - ) 0..! 0; 0. / -4 -, + 0 )7, ). 1, ; - * (Antonarakis, 1995, Bowen et al, 2002). / 0/+0 4 +, 4 +. / * + & (+ 22). / + 0 - - (Antonarakis, 1995, Bowen et al, 2002). )% ) 22 # ( VIII ( + 22 - VIII * + & * 40 50% ) /. (Lakich et al, 1993, Naylor et al, 1993). ( + 22 ) 0-4 int22h- 1 int22h-2 (- proximal) int22h-3 (0- distal) - ) (Lakich et al, 1993, Naylor et al, 1993) (. 25).! / (alignment) ) - ).) * -, 0. ) 0 5` - VIII 0/ -, 4)- 0/ - 3 - (. 25B). /0 0.)) 0 +. 4 int22h-1 int22h-2 int22h-3, 4)- + / 0 -- (. 25C). (. - VIII - : 1 0) 22 / + /0, 0+ +. 1 * + & (Bowen, 2002). 73

+ 25: ( + 22 - VIII. (A)' + - VIII int22h. (B)' 0 int22h (- 0) 0. 0 -- int22h. * -. (C)( / X.) 0. ) 0 0 - VIII -:' 4 10) 22 / - + / / +. 1 + - VIII, 0.. 4 10) 26, - - 0 + * + (Bowen DJ,2002). ( + 22 0 + DNA * - 0. )0 (Antonarakis et al, 1995):, -.) - - ) / -.)) -, -. 1, 0 + &, ** + 22, -./ ** /, **0, 0 / 0 (Antonarakis et al, 1995). ( + 0 4)-.,,, 4/ - 4 - VIII 0 int22h-3, -. / 0/ 0 0 -.0 (Antonarakis et al, 1995). ( + 22 0. -)/.*. Southern blot ( DNA + --0+ /, ),, -0+ 0 +) (Lakich et al, 1993, Naylor et al, 1993). +, ), +/.. PCR (Long distance PCR- LD-PCR), +/ + ) /-) (Liu et al, 1998). & ) - + 0 -,-, ), - 0 +. 74

$,!- +.)!-.) ) / +/ -.. -0 4 4 / -. 4 - -, - 0. )<, ; -/ 0. CGA ($!)!/0 /0 CG 0. ) 0 0-0 4, )- * C 0. / T G A. ( C T - + + )- CGA: ' 0 - )- TGA ( 4) *. '0 )-. 12 VIII 6 0. / 4 (Bowen, 2002). $! VIII # ( ) - ) ) VIII IX *. /0 372 1689 VIII (. 2), /0 145 180 IX (. 4). ' )- 0. -- CG; & * C T G A )- + & 2. ( 0. ) 0-4, /0 / 4 0. ) 0 )0 - ) ) VIII. -/ ) ) (Bowen, 2002). $* ' $ VIII $ von Willebrand?) / ), VIII + --0 von Willebrand - / VIII.?) +. 3.0 VIII 0 - +)0 ), ) 1680 &3..,0 4. 0. ) 0 )0 - VIII von Willebrand. -. * 0 - + ) (Bowen, 2002). 4 - VIII - von Willebrand,. 4 - von Willebrand 0 von Willebrand VIII ( von Willebrand 2N) (Nishino et al, 1989). 2N Von Willebrand. )0 - VIII, ) ( - von Willebrand *.)) 12 /0 12p12 12pter). 2 von Willebrand +0 );-+ & (Bowen, 2002). $* $ $ VIII 75

,0 4 arg 593 asn 618 <. - 0) VIII 0 0. &0 4, ), ) ) 0-) - VIII + + & (Bowen, 2002). $* ' $ # VIII 0 VIII -0. ).!4., 0 40 * /0 245, 0. ) 0 0 )0 0 VIII,. -/ (Bowen, 2002). $ ' $ $ # $ $! &0 0 - /..0. / ) -, + - /., -0 4 /0 & - 10 0. */ / : ( * /. ( -10 *. -, /0 * - *4 0 glu gla ) 0 *. ' ) - * - ) - *4, / )0 0. 6 0 0. *4 ) GLA, )0 -. & ) + 0) * + - *4 (Oldenburg J et al, 1997, Bowen, 2002). $( $ (promoter) $ IX $$! B Leyden 4 0. + 0.. ) )- ) ) - ) ) ) VIII IX,,, +0 )7. $. 4. )0 - - +0 -.. &0 4 *.0 - ) )< 0 -- +, - - )7- DNA 0 +.!0 4. )0 - * + 2. 8, / + + 2, ) ) + 2 Leyden,. * 0 - - 4 ) 0-) - +* ) (Crossley et al, 1992, Briet et al, 1982). ( / + B Leyden 0. /. (. )0-0.. - )7 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) LF-A1/HNF4, 0 -- +. 76

/0-0 - )< - + - ). $., ), /0 -. )0, / - ) -) (androgen response element -ARE),.. LF- A1/HNF4. & /0-0 4 )0-0+ (Briet et al, 1982, Bowen, 2002, Crossley et al, 1992). +* 0+ - / - /0 (C/EBP, LF-A1/HNF4, / ).!4 0.0 - - ).) )< + + 2. & +*, / 4 + ) -),. 4 +, *. ARE. 1, + 4 -* /0 ARE, 0. *) + 2 +* (Briet et al, 1982, Bowen, 2002, Crossley et al, 1992). + A ) 4). )0 - VIII - 0. -./. $ $ %! + + & 2, -/ /. - VIII, 0. 0 (1-4%) + (5-25%).(-, + 0 *, 0 - /.!, + + -)/. 0*. (Hoyer, 1994,! 1996). ( + * /, -.) 0.0 *,. *0 * -0.. * / ) ), ) ), ) +, ) ) ). ). -. ), - * -,. ' / -. /) *.. ' -.. + /), /, - /) / /. & / - ) - /).,., / --., / + 0 -/0 + ) / + ) ) + //. &. 0) / - 4.-, - ) (!, 1996) & - * /0, ) 0, 0 * * ) ), ), ). ( - 25% ) /) ) + AIDS (Hoyer, 1994,!, 1996). ( ; + / + /,. -. + / ). /*, 77

.. /*., - ) ) 4), 0 -+-) + & 2 ( ). &/ Willebrand, 0.. - VIII. /, ),. - VIII - + +- **, 0 -. Willebrand. ( -+ -) 4 Willebrand + & /) 0 ) 0-) Willebrand, ), - +, 4 Willebrand ). ( - (,., - Willebrand) )0 / Willebrand, /, + 40 / + &. ' + ) - ) +0 */ -+ -)., / + Willebrand ( ), Willebrand - -0 VIII, - / -) ) 0 - VIII Willebrand (Hoyer, 1994). 8. /* / 0 * ;. -) +. 1) H 0 VIII *, /. ), ), + - -/ *, ) * VIII. 2) H,,, ) -., ). /*. 3) 8 *, ), -, 0 ) ) + ( XII, ;- -* 7),,. /*,.), ), -/.! %$!1, $#!, ),3) - ) + ; 0 - - +. + (+ ) )). &/,.0 - * / / * ) Josso Prou -Wartelle (Josso F, Prou-Wartelle O. 1965). 0 0-4 / )0 /* ( ) +0) + 2 0. /*,. /*, / + - +.! Josso 0-4.0 4 ( /0 ) -, )0 +. Josso et al (1979) -) ; TF/VII in vivo - / (Gouault-Helimann M, Josso F. 1979). & 0 (by pass) - Josso. / ) + / 78

. + -. + VIII - 4. &. /0 + 0. 0-. TF, in vitro, V a -/0 Va. /*, - +. /* () +). &/, TF / +. /* ()0/* ). /*. & +,. 0, / */, +. /*, */ 0; VIII IX, Xa 10%.0. +., + / ) 0 4 -,. /0 + *), / +, +- - by pass, + VIII (!, 1996). &#*$! #,). * )"* * %!?) +0/ ), * + + & 2., ), - VIII.. & +/, ), ; +0, / 4 *. 1, 0. +/ / 0 4 - VIII, + -+ */ *. -., 7 /0 1689 0. +/ /, + + 0 * (Hedner et al, 2000). + 0 -+0 + - 4/ * ** VIII, / 0 +/ ;., + 0 - /*)0 4, ) V Leiden (FVL) / IIG20210A, + +, (Tizzano et al 2002, Escuriola et al 2001, Lee et al 2000, Nichols et al 1996), van t Veer et al 0-4 FVL 4. /* in vitro, / + (van t Veer et al 1997). 4 ;. 4 V Leiden / ( 5%), / *) 0 + /. 0 - - 0+ *) / +. 4 V Leiden (Arbini et al, 1995).? + 4 MTHFR C677T, - 0. -./ +0 0 +, /.0 /*) + *. (0 $ $!'# (#0* ). & ) + &- - 0 +0, + &(+) + &(-). &+ &(-) + 79

VIII,. 90% ) +. /) + - VIII. ( + &(+) +,, - (FVIII:Ag). H. + 6-10%. ( + VIII 4 0; - -+0*. )0) ). ' )- 0+ FVIII:C -0 () ), 0 / - 4-0) (neutralization of cross reacting material test). 8, + + CRM+ @ + &+ (! 1996). ( ) 4-) )). / VIII IX. - 0, ) / (Giannelli et al, 1996, Tuddenham et al, 1998)., - - /. 6 -+0 4*)/ -/0 4 0). +, / + 4 (Goodeve et al, 2000, Schwaab et al 1995, Giannelli et al, 1996, Tuddenham et al, 1998, Tuddenham et al, 1999):!4 < -, ) ; 0 4, ; - ) 0. &/, 4 - - < ( )7), 0, - + - ) 0.?),., 4 / 4,,. (Goodeve et al, 2000, Vianello et al, 1997). 8 0. ( / * * (MHC) 0. -/ / +,.) + (Hay et al, 1997, Oldenburg et al, 1997). 1. */ -.0 4 MHC (HLA) 4 II 4 0 0 VIII;.0 + 40 / +,.) +., 0 4/.0 4 + 4 - ) )). -, / 0 / ;, 0., ), ) 0 ), / 0+ 4-4 0).?), 0 * 0) 4 / + &. 0; / * - - (Oldenburg et al, 1997, Goodeve et al, 2000).! / 4 + + «+». - -/) ) - VIII - 0 (Oldenburg et al, 1997, Goodeve et al, 2000, Young M et al, 1997). &/, / 0. 0; / *),. *) -) - ),.. 6 *; / / 4 0 4 4 -.., ), 4 0) -. 4 ) / + ( / + 2, &). 20*,. / * + ( /. < - ), 0 10-15% ) ) (Bowen, 2002). 80

$. %. * $ '()* * %! 4 ) - * + & 10., 0. - /,,, - ) -0) ) VIII / ) ). 1 -, - 0 0. +, -).?) /, * -)- / + &, * + 4, ), - - VIII, ) )0 40 /-. & 4 VIII 0 * / 0 ) +, - *+/ * **., + 0 0-4 / + VIII,. -- - **,. 4 ( 10-20%) 0 - / * + & (Antonarakis et al, 1995, Hedner et al, 2000). $ '()* ")7 * ) DNA- *$. + /0 40 -) + 22, +0 * -) 45% ) * + ). & - -/ 0 -) / 0 +,.) 0-) VIII /.- 4 + VIII. 0 ** 55% ) * + / + 0 -./ ) 26 4 ) ) /0) -- (splice junctions) VIII. / * 4 - -/, -)../ 0 -. 0 0, VIII / - +0 -/ * ) -+ ) + - /0) 4 - +) -. -/0 0 / -- + -) 90% ). -.) - +0 -/,. / +, -- -.) +0 4 + &,.) ) - 4., - / - + VIII 0* 0 / 0* + +0 + & (Hedner et al, 2000). 6 / 0 +/ *. 0 - ) + DNA. H 0 ) )- -, / - -/0 0. /. 0.,, -. 4. )<, 0 0. - 0.))) -+., 0. - 0 ). 1 / * - DNA, 81

., ), ), + 2, + - (linkage disequilibrium), -- --0) -, 0 ) + (RJ Trend, A. K, 1993). ( / ) 4) - DNA *;.., 10 *--. -/0-0., - ; + - - FVIII. & 0/- *, / -, 0. - * (1%).,./ ** ) 0, - + / 0. ) 4) - -/0-) - - (Hedner et al, 2000). : $. "(" # )+!7.! ' ( VIII ) Willebrand (vwd) H vwd 4, ) 1% /.. -0 * (Fressinaud, Meyer,1995). 1. + : 1,. (70-80% ) )),. vwf, / ).. 2 +0 -. vwf. ( **. - ), / ).. 3. vwf, -/0-40. ( / ),.!$ 4: ' vwd.... 2%. 2(. 2/. 3 vwf:ag *** 0*** vwf:rco 0 Ristocetin-induced aggregation* $; - 0 0 -** 0 0 0 0 VIII * vwf:rco: -. ** (.0- + /.*** 0, +. 82

4 4 / VIII + - VW, )0 - VW / VW, - )0 - VIII., ) VW (-0 ) - ) +) - VIII - 20-50% +. 1 Willebrand. 2 VW /. - 1990 - )0 VIII, + VW. 2N VWD 4. - VIII VW, -. 2N VW - + ) ) -/ /. )0 - VIII. 4 2N VWD ) - - VWF,. + 0.. - VIII. (. 4, Arg91Gln, ) - VIII. &/ ) 4 0. - VIII 4 10-25%. 8 +0 0 0) - VIII. 4. - VIII - 0 + +. 1, 2N VWD. -+-) + 0 + + &. * +. (. 4 Arg91Gln 1% /0 -. ( 4 2 VWD, VWF - (null allele) 0. )0 - FVIII. ( ; -) 2N VWD / 0. /., *. / 0. 0. DNA 0-4) 2N VWD +, 0. / )0 VWF VIII + - + (Hedner et al, 2000) #'#).* ($ V $ VIII H -0 ) ) V VIII + + 40.. ) ) 0-) ) - ) - 10-15% +. (-. + + + 4 )7 ERGIC- 53, + ) ) V VIII - - Golgi, 0 25% ) / + +0 4 0 -,, ), - 0. */.! 100 0 -. 0. */, *!0 &. ( -) / * 0 ) ), / DNA + - (Hedner et al, 2000). 83

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10 V, + Arg506 Gln ( V Leiden). + 0 0-4 / apc, / V (R2- R485K) -) ) 0 (0) - - VIII).,. */ apc-r 4 */ /. +. +, / + 0. +/. 40 - /*), 0 ) * /0 0 case- control, ) 40-7, VIII, XI, IX / TAFI. ( ) - ) / + / - +.) 0. 0 /*+, 0.0 0 + 0 ).0) + / 4 + +. 2* ),. *-0 + 0 ;+ - -.! 0 0 */ ) 4) + +0 * /*) - 4 ) -+ ). ( -/ +0 /*) - ). - / 0 /*+ /) : ) --: -/ - 0, *) +-+ (phenocopy):.) -/ - (-- +), ) 0: +0 4 - / - 0. ) 0 + -) -- : +. 4) - (Bertina et al, 2001). &+ ) - /*). /, ) 4 4) -. 4 -, ) )< C, S &'. - 0. */ 0 4 - )0-0 )7. (. ) ) 4. (0,3% / ) ). &, 4. /*) + 0 4.0 /. '0, /, 0 - (linkage analysis) 4 + ). 1-0 ) Zoller Dahlback + / - + apc-r - V Leiden. ( ) ) 0 0-4 4 V Leiden )0-0, / 0 ;. - / (Zoller and Dahlback, 1994). 5 ; -/0 /*). 85

!$ 5: 0 ** /*+ (Press et al, 2002). AT= &/*, PC= )7 C, PS= )7 S, APC-r= - 0 )7 C, FVL= V Leiden, II= /*, VTE= venous thromboembolic disease ³-CE,5$<$D/TEDFJ GDS9$5 P[QT$W C$G!H$< ¹ V%9 H:X%9: 2KQK M,N X,Q$\X T Bƒ5,RSP2\VMLREK JO [» Bƒ5,RSP2\VMLREK Jl!Ä Bƒ5,RSP2\VMLREK Jl!Å +!ÄÁ1š ²Æ:^+Ç Ê8Z@%Z!=E@$ µ Q,R C%M 9 Y ºƒCE %JY 9 ^[»[¼ ½ƒP29$D/V%9%P K\ ¾/9$5 ^[»[¼ e#c,gk 9$Q$9$;K M <:] P[QT$W C,G!H%<:] ³ $RSD/K M <:] MEY5$7CE5$9:] ERS5,RSD/K MLÀ/] X,Q$\X$R/] a = ÁZ Z:Áa @ @%Z:Á²@ @,A ÃDR V:9$;,RS5,R Y] Z:Áa a:áf=@ @ Z:Á²@ i:áf=@ ÃDR V:9$;,RS5,R Y] = Á²b a:áf=@ @Â}= ÁF= ÃDR V:9$;,RS5,R Y] Z@ A@%Á²a@ b%á²è b%á²è RSDR V%9:Á a@%áf=e@@ 9 H$9:Á b%áë a:áf=@ = Á²b Z:ÁË#RSDR V%9:Á Å2É Å2É & 5 /59? + /*+, 0. ). * - --.0 0,. ).. & **/ &', PC PS. # /*+ 0 ).. - - + 0 - ). + ; 4 -. /*+ -. 1. -./ /*+0 0, - -0 ** /*) -., -.. &, Koeleman et al 0+ 6 0 -. -.0, V Leiden PC 0-4 - (linkage analysis) - - ) 0 -.0 --0 (Koeleman et al, 1994). & 4. V Leiden 4 ) probands PC ; /. 4 - - /*). 0 ) ) PC ( ) **), 4 ) V Leiden -0 (Miletich et al, 1987, Tait et al, 1995, Brenner et al, 1996). 86

$.. 0-4 0-4 V Leiden ** - PS (Zoller et al, 1995, Koeleman et al, 1995). 0 0, 40% ) ) probands PS +0 4 V Leiden., Castaman et al 0+ V Leiden 16 0 0 PS (Castaman et al, 2000). 30% ) 20210& - /*. * 0 /*) -. &- 4 V Leiden 20210& /* 4 / --0 ;. (10%) 4 4 ) probands /*+ 4 V Leiden (2ertina, 2000, Ehrenforth, 1999). 0 /*) - - 0-0 **. '0, 0. +/ - 4 V Leiden &' (van Boven et al, 1996). 4 ) - -0 ** * -.)) ) 0. -+0 - -. - - - ) -. -, + -. - 4 4 /* ** - PC (Bertina, 1998, Bovill, 2000, Bertina, 2000). $. - ) 0 4 V Leiden V R2 (Faioni, 1999) V null- allele (;-- ) apc) (Greengard et al, 1995, Simioni et al, 1996). ; & /),. *. / +0 /0. & / +* /*). - -. - - )-0 -. 20*, 0 - - 4 )- - / 0) - ). - / )7 ). 0. (;+ -) 0 4) + 0 0 +. +* /*). & 4 -+0 ) 0 + - ) (Single nucleotide polymorphisms- SNP) ;+ - -,./ 0. / 0 / ) )-0.0 (coding).0 )0) (promoter) ) - ) 0 0. SNP + +0 -+ 0) - ) )< 4 ) ). - 0 -) - (PCR) 0) ---0, 0. - ) SNP /*) - 0 case- control -+. 1, **+./ -. +..-, ). ( ;. SNP + - ) /, - ) ) 0 ;- / 0,. ;- 0. 1 / / 0. SNP + - 40 - - (linkage disequilibrium) 0 SNP + -. & 87

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) - /*.. 0. ( 0. ) )- (coding), (flanking). - /* 28. 0 (probands) /*+ ; 0 + 3 +0. - (20210G/A). ) 20210& *0/ 18% 0) / /*) 1% ) ). 0) case- control 0 / (Leiden Thrombophilia study) 0-4 20210& *0/ 6,2% ) --. / 2,3% - 0. (Poort et al, 1996). & 0 -. - 0. --. / - +* /*) 0 / /*+ 40. 40 4. -.,+0 ) /, ), 4 ) Odds ratios +* /*) ( R 2,0-6,6) 0. +/ -+ 0 ( Bertina, 1998).!0.. + - ** 20210&. 40 - +* /*) (Ridker et al, 1999). (. ) Poort et al, 20210&. 4 ) 0-) /* 30% 0. **)/ 0. ( - LETS 40 - /* (>115 U/lt) -0 4. - /*) 2.1 +0, 0-4 20210&. 4 /*) - - 0 4 ) 0-) /* (- -, - +, + -). 0, ) +0) 20210& 0-4. - (linkage disequilibrium) 0 - - (founder effect) (Zivelin et al, 1998).! -. 04 + - /* 22 ) 20210& -+ 0.? 20210& + 0. - (3728T-4125C-8845G-9832T-19911A-20210A) (Ceelie et al, 2001).?) * V Leiden 0 20210& 4 - + (Rosendaal et al, 1998). 1 + - 0 ;+ -, ) Merati et al. / - -/ -.0 )7 C (EPCR) (Merati et al, 1999). & -* )7 + -/ ) ) ) /* 0 )7 C. ) 4) ) EPCR -/*) / ;. 4 3. &+ / 23 - ) 4 ). - 0 0 )7 - / 0., -* 0 4), 4 / 0 0 EPCR null- allele.,.,., /, - 0. (1%), 0 - /.0 /*) - case- control 0. 0 0 / */ ; + 4. & /599 ( 0 - ) SNP + - 4 ( +) 4 -+. SNP +. - - 89

. «**0» )7., - )/ - + + 0 - (linkage disequilibrium) 4 (Gambaro et al, 2000).,. - + - - +0 +. -, -+ +. )0 promoter (Van t Hooft et al, 1999), )-. (coding domain) (Hunault et al, 1997) VII (Pinotti et al, 2000), + - VII. 0. - ) 0. (association). & 0 - - -. ) SNP. ) -. ) SNP 0 /.0 - ) - -), + /. - /) - 3 kb (Krugluak, 1999). O 6 ; SNP 0../ 0 /*+. V G1691A (V Leiden), II G20210A MTHFR C677T / +/.!0. -.. -4.0 - MTHFR 677T -) +* /*), V Leiden (Cattaneo, 1999, Kluijtmans et al, 1998). 6 04 +. * 0 0 /*+. 0, -+0 SNP - / VII, PAI-I, tpa )- 4 -+0 0 /*+ 0 /*) (Lane and Grant, 2000).? 0 0. - - 0 SNP ) - + +* /*). $., ), 0 -+0 ) /: -/ -, --. / / 0 /, ) *//*)/ /*) -. ' 0 ) ) */ +) 4 -+ 0)., 0 + -+0 - -+0 +0 + +* /*). -, V Leiden 0 - + «) */» /*) (Rosendaal et al, 1995),. + - ) (Martinelli et al, 1996), /*) ) +* (Martinelli et al, 1999) /*) +0* (Amitrano et al, 2001),. ) )/ * (Martinelli et al, 1997) /*) +*- (Ma et al, 1998)., 0 + /*) *,. -), / 4 - /*) + V Leiden 20210& (Vandenbroucke et al, 1994, Martinelli et al, 1999), -. - 4 ) ). *) (Svensson et al, 1997). 6, V Leiden - -. /*) / 0. /., D + 16 - / 0, 4-10 +0 (Philipp et al, 1998). & +. / - ) /*) - case- control 0 &+- &, - (Dilley et al, 1999). ' 0 / 4/ 90

.0 *. -0 /*) - -,.! 4./ 6. 4 -+0 + +* /*) (... XIII Val 34Leu). & 4 -+0. - /*) 4) + ) -. (Nichols et al, 1996, Lee et al 2000). 91

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/.) - 4 Leiden - V (G1691A). '. 4 Leiden -+ 4 - &', PC PS )0 - + /*) - ) 40. + (Martinelli et al, 1998). ( )7 C *- 4 )7 * /.!0 )<, 0 )7 C (apc), -/ + ) ). ( )7 C -0 0 - -.0 * ) -/ ) (endothelial C protein receptor -EPCR). 0. /* ) ** -0 0 -.0 * ) ) /* (Tm). ('-'!) )7 C. ( apc, *- 4 )7,, )7 S (PS),. 0 * ) - 0 4 V (Va) VIII (VIIIa),. Va VIIIa - 0, /* -,.. 0, 0 V -- VIIIa (Dahlback, 2003). - )7 C +. 15. Va - /0 Arg506 Arg306, - /0 Arg679 -. (- /0 Arg506 0. ) 0 - Va, / - /0 Arg306 +0 - Va (Kalafatis et al, 1994).! ;. - Va - 0 /0, 0 /0 Arg306 (Nicolaes et al, 1995). H PS - - /0 Arg306 (Rosing et al, 1995). H - VIIIa * /0 Arg335 Arg562 (Kottke-Marchant, Comp 2002). & * 4 /0 Arg506 V / Gln ( V Leiden), Va apc 10 +0 /, 0 + 0 40 -. 0,. 0 V, - ) 0 VIIIa apc PS (Shen et al, 1994). To 1993, - Dahlback (Dahlback et al, 1993) 0; + ) - 0 PC, -.) 0 /* (aptt).) / 4) (in vitro ) 0 )7 C (apc) + /.&"'', 4, ), - /. &, - Bertina Leiden ; ** / : /0 G1691 - V &, 0. ) 0 Arg506 Gln. & 4 V Leiden (Bertina RM et al, 1994). ' ) **/ 0 ) /* - Hemker (Hemker et al, 2000). 96

+ 26: Va - / : 0.. - /0 Arg-506, /, /0 306, /0 679. 1 0 - /* ) /*. ( - FVa Leiden - 40 ) /*,,, 40 - /* (Hemker et al, 2000) 2). V Leiden +0 4 - +* /*). &., 0; 0 /*+ Leiden (Leiden Thrombophilia Study- LETS), - 0 /-) (case-control) (Koster et al, 1993), - 0 (US Physicians Health Study) (Ridker et al, 1995) / / **)0 0. $. ;. V Leiden + ( 5%), + 0; (founder effect) 20000-30000. (Zivelin et al, 2000). H ;., 0 ) 40. - ( 8 +0), 0; 0 ) -. - () ) ) AT, PC PS) (Koeleman et al, 1994, Zoller et al, 1995, van Boven et al, 1996), *, ). (Vandenbroucke et al, 1994). O - -) /*) 4 apc-r/ V G1691A (Leiden) - /*) ) «) */» +* ) ) ). (/*) ) + ). + (Martinelli et al, 1996)., apc-r.) 4 Leiden - + ) - +* /** -, 97

. -., /-0.. /) - ;. /*).?) - 0 - + 4 /*) + 4 (Ryan et al, 1998)., / )0 - * - + 0. 40 - ) apc-r.) 4 V G1691A (Desmarais et al, 1996). 0 0 -. 0 / /*).0 *. /0., 4 V Leiden +0. 4. -. '0,. + - /*) 0 /*) - / +0 4 V Leiden, * + - + / 0 /*) - (Lane and Grant, 2000).! / 0. / apc-r, - +0 4 V Leiden. - )., - 0. +/.. 0. / / +0 4 /0 V Arg306 ( Thr Gln.) (Chan et al, 1998, Williamson et al, 1998). 4 0 + )0 +.. (. / apc-r V Leiden 4 - /- apc-r.!, 0 0-4 / apc-r. - 4 Leiden - ) 0 - /*) (de Visser et al, 1999). 0. + 4 Leiden apc-r 337 / +* /*) 455.! / -4.0 4 */ apc-r /*) -, -+ 4 ) ;).) apc-r. ' ; - VIII ) apc-r, 0 0-0 -/) ) 0-).! 0 ) / ) apc-r 0 - HR2 (Bernardi et al, 1997). H. + 40 / 4 Leiden. 0 / - apc-r, / - +0 0 4,. / apc-r. 0 + HR2 0 - +* /*) (Odds ratio 1,8) (Athenc- Gellas et al, 1999), - 0, - -) /*) - - /*) (Faioni et al, 1999). - HR2 AT, PC PS - - /*) -. &/, - Leiden 4. - ( 4,2 Leiden 10,9 - -). - 40), His1299Arg Met1736Val, +. )7.. + -./ * 0 ) ) -+ ) + + V / 0 ) (Castoldi et al, 1999). H. + 8%- 10% /, -. 3) $': H - apc-r. -.) APTT,.) / 0 )7 C. # / 98

. ) 2 +0. + apc (apc-r),. &"'' - /. -. - 0. (.. -. 4 Leiden - ) ).,, ),. 0 0/-: - + 0. +/ V 0 - ) ) ) )<, 4- /0 0 - ). 1, 0 0/- 0. - /. 4 Leiden, ) 4) - V, -. / apc - + 4 V. 0 * ), /. -), - ; - VIII. - PS, 0 **, / VIII, ) PC., ) 0. +/. 4 - V - / - apc-r: ) 4 Cambridge Hong-Kong /0 Arg306, / + (R2 - V (Press et al, 2002). (0* *,"!* G20210A 1) +!: ( 20210 4 - /* + Poort et al 1996, + - - 40 - /*. - -) /*) 2.1 +0. * G A 3 +0. (UTR) - /*,. 40 - /* ) +0) 4.!., ), 20210& 4 - ; )! + 0 4 20210&, 0-4. - 4 - / - /* 4 20210& (Soria et al, 2000). *) ( 4 20210& - / mrna /*, ) -+ -- ), +. (Pollac et al, 2002). ) ' 40 - /* 0. ) 0 /* -, / / )- (Wolberg et al, 2003).?) V Leiden, ) ) 0-4 + / 20000-30000. (Zivelin et al, 1998) 2) :?) + 1, ) 20210 4 - +* /*) 3 +0 ( Mc Glennen et al, 2002), *0 + +* /*) (Martinelli et al, 1998) - (... ) 4 - /*) (Rosendaal et al, 1997, Doggen et al, 1998). &,. - 8% +* /*) + (Eichinger et al, 1999). '0, 99

+ +0 0 - +* /*), - -0 ** 4 - (De Stefano et al, 1999). 3) $$ $': - /* + +0 -, 0 -/) / 0/- ; 4 20210&. 1,. & * -) - (PCR), /. 3 +0. - /*, * 20210 +., < - * 0; 0 (RFLP) / -* /- ) + -< (Mc Glennen et al, 2002). 4 <* =* C (PC) 1) +!: ( )7 C (PC),!2 62000 D *- K 4 )7, -), + / 4. ), * + - )0 -+- -, / -. (PROC) *.)) 2 (q13-14) (Kottke-Marchant, Comp, 2002). ( )7 C + 1981 Griffin (Griffin et al, 1981). 1 0. + ) 160 4, - -). 4 / PC 4/ ) +0...0 (75% ) )).. ), - PC, ) 0 )0 /. + / - ) PC, )0 -, + - )7 (Kottke-Marchant, Comp, 2002). 2) $$ $': & ),, -. PC 0 / 0/- ( */.)) ))), 0 0/- (ELISA, rocket electrophoresis),.. ) (Kottke- Marchant, Comp, 2002). 3) : & 1981 0. 0. +/ 0 0 0; PC. - /*) - -+0 4 ) -+) ) 0; PC ( ), 4 ) +) 4) (Reitsma et al, 1995).!0 0; PC 0. 8-10 +0 - /*), 0. ) 40 0; / 0.. 0 /*) - (Bovill et al, 1989, Allart et al, 1993). /0 0 0. 0. - 7 +* /*), 0. 0 0 (Koster et al, 1995).. -. 0 / /*) - 0. 3%. / 0.2%, &0, 0. - (Heijboer et al, 1990, Koster et al, 1995,Tait et al, 1995). ($ =* S (PS) 1) #)!: ( )7 S (PS) *- 4 )7 635 40, - ) PC. ( PS ) 100

, 0../, -/, 0+ Leydig..)) 3 0../ - -, 0 (PROS1) 0 ;--- (PROS2). ' - 15 4. ' 4 I ) VIII *- 4 )7, 4 IX ) XV )-. sex hormone-binding globulin (SHBG). ' 60% ) 70% PS + --0 C4 binding protein (C4BP, )7 / ) 0 -. 1, -/0 /0 - C4BP PS *. & * - C4BP PS - 0 ) ) PS. H C4BP 0 0 )<, 2 +0. &0 6 ) 7 -.) * -.(* - 0. /0 - PS, 0, C4BP*+ C4BP* / / PS. (.0 C4BP PS 0 0) C4BP )7 4 +).., 0. -./, - - 4 +, - / PS ( --0 C4BP) - *, 4 -+ / ) * -) C4BP 4 PS 4 C4BP*+. '0, ) / PS 0. -, PS --0 C4BP*+ - - apc (Goodwin et al, 2002). + 0. +/ PS 0. - 4 - ) apc: ) 0 / PS - - - (a- VIIIa), /* (Xa-Va), - 0 4 C4BP (Heeb et al, 1993, Heeb et al, 1994, Koppelman et al, 1995). '0 PS + -0 - -., / - -. + ) ) <,. PS / (Dahlback, Stenflo, 1994). $. PS 0) PS, / PS, - ) 0 PC. ( I PS ( 2/3 ) /). )0 - / PS, ) -. ( II PS (4 ). + - / PS,. -. '0, III PS ( 1/3 ) /). + 0). - PS,. - / PS,.- PS (Goodwin et al, 2002).. +, Zoller et al 0+ + - (Zoller et al, 1995). 0 Duchemin et al 0; / ;. (22%) 4 /) 0 + (Duchemin et al, 1995). TC )- 460, ) ) PS Heerlen. H. PS Heerlen 0,5% / - -+0 ) /*+ (0,7%) (Bertina et al, 1990). # /, Heerlen - Va Leiden. 101

( - PROS1-0 4 ;--, 0 40-50% ) / 0; PS - * - ** (Borgel et al, 1995, Reitsma et al, 1994, Gomez et al, 1995). 0. + ) 200 4 PS (Lane et al, 1996). 2) $$ $': ( PS -, + 4 / ) ) 4), +0 4 4 ;--- (PROS2). 8, 4 0/- -) +. ' - PS - 0 0 /-. -: ) ( PS 0/- Laurell,. ),. ELISA. *) ( / PS + - / - PS 0 PEG, - PEG, 0 C4BP-PS / 0. / PS. H 0/- 0. ; 4.*. 0. / ELISAs. ) 0. ) ( - PS ) 0 PC / 0, 40 /-, *0.&"'' "'. 0/- 0 -. ;- / 0 4 4 0 PC,, ; ) VIII, VII. 4 ) ) *) ) -,. - 0. - / PS. ' 0 - / PS - 4 (Goodwin et al, 2002). 3) : & 1984 0. +/ 0 0 /*+ PS (Swhwartz et al, 1984, Broekmans et al, 1985)., ) -+ (, ) - /*). ), 4 -. - /*) PS - 0.. 0; PS /, - 0. 4 0 *. -, * ;) - 0. -, 0, 0 0 / apc-r.../ / PS (Lane et al, 1996).! / 0 /- ) +. + ) ;. - PS --0+ 4 / - 0. (Koster et al, 1995). & ) - ** +0 0 0 PS /*+, ) ;. PS 0 / /*+, --. / 0 -. & -/0. - 0 PS 4 - /*), ) --0 0 + PC. #, --, -- (penetrance) PS 0 0, 4/ ).) ) -, ). Leiden. (Zoller et al, 1995). A - - / /*+ --. (Bovill EG et al, 1999). '0, PS 0. +, 4, + - - * PC (Lane et al, 1996). 102

($,"!* ( ) 1) +!: (&/* (&') 0 0 0 ) (Serine Proteinase Inhibitors). ' &' 0. * 58,2 kd 432 40. ' - &'*.)) 1 0. 7 4. (&' / ), - )7 4 +) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). ( AT -) + 0 ) -) /* a, 0 IXa, Xa, XIa, XIIa, 7, VIIa. (&', ), /*. 1:1, -- (Kottke-Marchant, Duncan, 2002).! &' )<. (. 1000 +0 - (, ) /<0 ). '. 0/ 0 0. +0 0 -+) &'. -, 5.. 0 a 0. -0 &', / /* 0.,. 18-. 0. )/ &'.! /* Xa,.) &'/ -/ &', + 0. -/ ) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). ( AT 4 ) -..( 4 &' * ), 0 ) ). 1,. ), ) (+ 40% ) / +* /*) &'). & - 0) : a 4 /0 &', IIb 4 * /0 - &' IIc * - 11 4) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). 0. + 157 4, 4 IIb - (Lane et al, 1993). 2) $$ $': ' - &' / 0 /- (Laurell +, ELISA), 0 /- (0..)) ))). - - &',. - / -. ( 0) 0-0 * ) 4) -0 0 4 - - (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). / 0 / - 0; &', ) 0 - ) / )7 (/, ), -+, +- 0) 40 ) (, / +... /, 4 -, 40 /*) -, / L- asparaginase ). (, / - + - &' (Kottke-Marchant, Duncan, 2002). 103

3) : H ) ) --0) 0 &', - 0 &' ; - ) )< C S. (/*) - / ) 16, / +0 /*) - ) 25 (Thaler et al, 1981, Hirsch et al, 1989). H &'. ; - /*) ) )< C S (Conard et al, 1990).?) + 1, &', 4 /, - 40. - /*), -+ 0 50) 50 +0 ) (Kottke-Marchant, Duncan, 2002, Heijboer et al, 1990, Tait et al, 1991)., 4/ * + /*+ / &', - ; / (Rosendaal and Heijboer, 1991, De Stefano and Leone, 1991):, -0 0. / ; ) +* /*) (Cosgriff et al, 1998),. (van Boven et al, 1994, Rosendaal et al, 1991). $#) >!/MTHFR C677T 1) +!: ( 7 0 +- 4. - / ) / +. ( 7 /)/ / + / - ) /-=-+ 4 (MTHF), - / /, 0. ) 0 * *) *7 (). ' MTHF ) 5,10- /- =-+, */ /=-+ - (MTHFR).?. / / 7, 7 0. - -+ ). -,. /, - / *- / (CBS), * 26 )., / - 7. ( / ), ), / / ) 0-) 7, -+ ) / ; 7, ) 0 + / (. 27) (Key et al, 2002). 104

+ 27: * 7. 1 0 / *-/ (CBS), 2 0 /=-+ - (MTHFR). - / ) / - - 7 *7 /=-+ 4 (MTHF). - + ), 26, ) CBS. To + 4 212 - / ) (Key et al, 2002). ( < 4 -. (1/200000) + 4 CBS. H ) CBS (0.3-1.0% /). + - 7 0 /,, ), 4 4-8 + / (Key et al, 2002). ' - MTHFR *.)) 1. & * MTHFR <, + - + 4 7. & +. 40 // 46C + * C T /0 677. 5-15% / 4, 0 < - - +.. 4 ) - 7 * ; + (Key et al, 2002).! /0: - < /0 ) + -., / 0. /.., 0. / -+,.).. -+ /0 0. -)/ - -. )7 *. -, 0 /0 *- / Ross, /) ** -/ ). /0 (Ross, 1999). ), ;+. < - -/ / - + 105

/0 ) - -) (cardiovascular disease-cvd), +* /** (Venous thromboembolism-vte)., -/: &- 4 -) 7 ) /) 4, - 4 -) ) +) )<. ) -/ *. 0/ < - 4- -/ / 4 (Key, McGlennen, 2002)., 0/ 7, - V, ) 0+ /*, / ) /, )- - 40 / (Rodgers, Kane, 1986, Lentz, Sadler, 1991, Rodgers, Conn,, 1990, Hajjar et al, 1998, Nishinaga et al, 1993, Fryer et al, 1993). + 0. */ 7 -+- 0 -/, *0 0+ -1 (vascular adhesion molecule-1- VCAM-1) (Hofmann et al, 2001)., ) 0 /* 0 -/ 4 0 in vivo, 0. / +0 4 / 0). -, - 0 )7 C + 4 (. ) 0 0 in vitro) / < (Cattaneo et al, 1998)., <0 : ( 0/ ) ) < 7 in vitro 0. ) 0 40 ) (Tsai et al, 1996)., -: ( < /, 0. 0 0 /*).! - ) ) */ /*4 (Khazuria et al, 2000, Di Minno et al, 1993, Durand et al, 1997). 0, - -4 0 Va, / 0 PC (apc) (Undas et al, 2001). & / in vitro - * in vivo 0 -./. 2) : 40. ) < - 4. //*) (cardiovascular disease-cvd) +* /** (Venous thromboembolism-vte).!, 25% ) **0) ) / + /*) - 0. ) 16 50% 0. ) 29 (Mudd et al, 1995).!. + ) - ) ).* 26. ' 0 0 / 0 +) + < /0 VTE CVD. 1 < /) 4 -, CVD VTE, 0. - - (Key, Mc Glennen, 2002).? + CVD, 0. - ) 30-0 0 / ) (case-control) *.0 <.! - 27 0), 0 1995, 0-4 4 5 mol/l - 7 0+ 0. - (odds ratios ORs) + + - 1.6 1.5,.. + / - 6.8 (Bourshey et al, 1995). 106

? + VTE 0.,. + -. - 2.5 (95% CI 1.8 3.5) 3.0 (95% CI 2.1 4.2) (den Heijer et al, 1998, Rey, 1998). -0 case-control 0, ), - - < 0 CVD VTE. 1. / - 7 4 ). - 0 4 /*) -.!, 0 -+,., / 0 - - 0. 6 0+ - 0. + - (Egerton et al, 1996, Lindgren et al, 1995)., ) + * VTE.! - 0) 40-7 ) 0 ) - ), ) +, 0; *,, 0; + -, 0 + ( 0 ). - 4 +/ 0 case-control 0* ; 0 04 0 ; - 7 4 -,. /)) (ey, McGlennen, 2002). '0 / 4.0 4 < VTE, - /)) - - VTE. 4 ), + 0. ) ) 4 - VTE, - < (ey, McGlennen, 2002). - 0. $. - 0 + 7 ) - CVD VTE.! + - ) 12 + < CVD, 0-4..0 - (pooled OR 1.3; 95% CI 1.1 1.5, Danesh, Lewington, 1998). & + ; - 7 ) - * ) -)0 + (Nygard et al, 1999). $.. - 0 + VTE. Ridker et al *.0 4 < -/ VTE,. VTE ) ) )(Ridker et al, 1997).,..0 4 VTE / ; - /-.. (Petri et al, 1996, Cattaneo et al, 1998). H 0 LITE - 0-4.0 < - VTE,..0 - (Tsai et al, 2003)., Eichinger et al 0-4 - VTE ; / < (OR 2.7; 95% CI 1.3 5.8). (.0 - VTE - - 4 < (Eichinger et al, 1998). -0 ) 0 0 * 7 -/0 ;! -.0 4 ) 4 MTHFR C677T CVD 0 4 <, - 4 - - - (Brattsrom et al, 1998)., ;+ ) case-control, ) - 0 LITE, - *.0 4 ) 4 MTHFR ) VTE. (Tsai et al, 2003, Cattaneo et al, 1999). A 0. +/ - VTE -0 107

-0 **, ) ) 4 MTHFR C677T -, ) Leiden (Ridker et al, 2001, Cattaneo et al, 1997), ) **/ 0 (Kluijtmans et al, 1998) 3) $$ $': 70% 7 --0 *, 0 30% 4-)0 -+- 0 2% /. ( 0 7 =/0 ) ) ) + 7. ( -; - : 1) '. ; 2) %;. 3 ) 6 + /. ( 0/- - / ; < +/ 100%.! ;, / ) -, /).)+ ; - (HPLC) 0 /- +/. '0, 4 MTHFR C677T./ 0 /- *0 - PCR (Key, McGlennen, 2002). 10*)*.' # ( V!0. - 0 0..0 4 ) 0-) V /*) -. Redondo et al 0+ ; - V. 40 - + -. 0 - V 200 0+ - 100 +. ( - - V 103% - 0., / 111% (p<0.001). 8 - V >109%. 4. - 0+ - 3.3 +0 (95% CI: 1.8-6.6).0.- <109%. (.0 0. -/).0, +, -*,--, 0 (Redondo et al, 1999). &/, Kamphuisen et al 0 - V 474 / +* /*),. /, 474 +. ( 0 ) 0-) 134% / 132% - 0. ( -+)., +..0 4 ) 0-) V +* /*). ' - V VIII. 4, V - + /*) -. 40 - VIII (Kamphuisen et al, 2002). #0*.! ' ( VII VII -+0 ) /*+ 0 Northwick Park Heart (Meade et al, 1986). ' 40 - VII. /. - - 5.) - 0 - /. / ) ) - ) 2-3 +0 ; - VII ; (>120%).0.. + -0 0 - ** ) ; - VII 4 - (Folsom et al, 1997, Smith et al, 1997, Redondo et al, 1999), +* /*) (Koster et al, 1994). + - VII,. 40 -, - - 40 - - (Iacoviello et al, 1998, Doggen et al, 1998). 108

#0*.! ' ( VIII ' ; - VIII 0../ - /*). Penick et al. 0 in vitro 0, 0-4 40 - VIII. - - (Penick et al, 1966). 0, - 0 VIII 0 40 - VIII., - 4 - VIII +. + 0-4 - ;,.. 4 ) )., - VIII.., ) - ABO. & - 0 0.. 15%. - - & 2.!. + -0 0 0-4 ; - VIII 0 4 - +* /*). Koster et al 0+ 40 - VIII. 40 - +* /*). 0 +. ; - ) - 4 +, - 0 - / 4 /*) -., ) 150% / 25% - 301 --. / /*) -, 10% - 0... - ) 40) 0-) VIII >150% 4.8 +0, ) V Leiden., * - von Willebrand.- -.. &/,. - 40 - von Willebrand 1.0.-O - 1.5. 1, VIII 4 - +* /*),.-O - 0 / -, 40 - von Willebrand - 0/ ) - (Koster et al, 1995). 0 40 - VIII. 40 /*) - 4 + ) - (Kamphuisen et al, 1999, De Mitrio et al, 1999, O'Donnell et al, 2000, Kraaijenhagen et al, 2000)., 0 / - - ) - (De Mitrio et al, 1999, Lensen et al, 2001). 1. 0 +/. -/ 40 - VIII (Kraaijenhagen et al, 2000, Kamphuisen et al, 2000, Schambeck et al, 2001). ' - von Willebrand - ABO +0 0 ) 0-) VIII / (Kamphuisen et al, 2001). 1, +. - VIII. & / * 0 - VIII --0, ) - 0. 5. )0 - VIII ( 0. ) - 0-) 0 0 - (Mansvelt et al, 1998). ' - VIII 0 - ) ) )7 0-4 VIII (Thompson et al, 2002). Kyrle et al * - +* /*) 4 340 & /. - - VIII;, ), - 109

- 0 ) 0-) VIII 0*, ) +- - (Kyrle et al, 2000). Kraaijenhagen et al +0 4 ) 0-) VIII.. +* /*) -.0. 0 - -, 4. +* /*), - ) (Kraaijenhagen et al, 2000). 1, 4 ) 0-) VIII, ) - -, /*) -, /)/ 0 - +* /*). & / / - 4 VIII +0 /*) -, ) 0. +/ ) +* /*) 0 + / * / VIII (Ettingshausen et al, 1998). - /*) - )/ 4... ( * VIII /*), --0 0. 0 ) + / *). (.0 4 40) 0-) VIII /*) 0. )/ -0 0 (Rosendaal, 1992, Reiner et al, 2001, Meade et al, 1994). 0 +. - + - )0 / + - )0 1.4 ) 1.8 (Tracy et al, 1999). - +.. - ) 0-) von Willebrand (Rumley et al, 1999). - +- +0 0 /*) -, // */ 4 ) 0-) VIII 4 - /*) (Lowe et al, 2001). #0*.! ' ( $,"%$ $!'#, + 0 0+ ; -. 40 - +* /*). 0 / - ELISA - 426 / - +* /*) 43, + (Vlieg et al, 2000).,0 ) 20% ) /. - ) 129%, 0. - 2.3 (95% CI 1.6 3.5).! -/) ) 0), +,., - VIII, XI, ) *-K 4) ),. - /*) ; - ) IX 2.0 (95% CI 1.3 3.2). $; - ) VIII - 4. - /*) 8 +0. - 0 / - IX 66 +* /*) 163 (Lowe et al, 2000). ( 0 - IX 150% +* /*) 138% (P =.07).? ; - 150%, ; - - IX. - +* /*) 4 2.34 (95% CI 1.26 4.35; P =.007). <*(! ' ( $ $!'#,")* ' - / 474 /, ) ) 70, - +* /*) / ) (Meijers et al, 2000) & - XI ) 90 /0 (>121%). 2.2 +0 4-110

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* Ratnoff 0 +* /** 40 + -. / " * (Goodnough et al, 1983).!, Harris et al 0; 1 / PK 0/ + /*) (Harris et al, 1985). ' 1991, * 0 0+ / - 0+ -,, /, - 18 0 /** - ) 40 (Lammle et al, 1991)..., - - 0 / /*) - 0 14 0 0; 0 0; - - (- ) +* /** + +4).! 0 / 4./ + * 0; (Zeerleder et al, 1999). Halbmayer et al 0 103 /. /*) / * 15% ) /. 0; XII, - *0/ /. / /*) 67% ) / (Halbmayer et al, 1992). 0 LETS (Leiden Thrombophilia Study), 4 474 / +*/*), - 0/ / / PK, HK, XII (van der Meer et al, 1997). & ) 0 + 0 +. / /.0 4 ( / HK PK) 40. +* /** 40) + ) - ). + 0.0. + 0 ) )0 - ) ) +,, ),,. 0. Yamada et al 0 / 04 *0 * 7 (2.9%) 241. - XII 4 2% ) 46%., ), 0. +)+- - (Yamada et al, 2000). * '#)* )*,")* 9), * - 0 )- / - 0 /*)0-.0,.. -., 0. -./ PAI-1 -. -, ),.0 * (Schleef et al,1999). &/, 4 PAI-1 / +0 /*+-/. -., 4 - PAI-1.0 * 0. ) 0. ) )- -, +0.. ), - )- - - 40 - PAI-1 levels (Francis, 2002) 10*)*.' # -1.0 4 )0 )- - ) 4 PAI-1 + 0. +/ 0 0. (.0 + 4 ) 0-) PAI-1 * - (- X) 0,.,, 40 - - ).0 112

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! -4 - - +* /*) 0. 0 4. / ( Sakata et al, 2001, Tait et al, 1996, Ooe et al, 1999, Sakata et al, 1996)., + 0 +0/. ; / (4.2%), /*+ (2.8%) (Sakata et al, 2001). 0 ) ) - (n = 9611),. 0.3%, 0. 1 (Tait et al, 1996). &.. +0/ 0 /*+ /, -+. 4 ) - / + - /*) 0 ). 1. )/ 0 2 /*+ 4 - /*) (Lane et al, 1996). ' 0. 0; V Leiden 0. / / (McColl et al, 1997, Castaman et al, 1998, Sartori et al, 2000). ' --0 -. 40 - /*) -0 4 V Leiden. &/. ligneous conjunctivitis, -... ;-* + * (Mingers et al 1999, Schuster et al, 1997, Schuster et al, 1999, Schott et al, 1998,Sartori et al, 2001). ;-* 0, 0. ), 0. 4- +. )4 + ) *)., ; + ) **. 9) ** + 0 ). ) ) ), / +. (Schott et al,1998). 4 ) / ligneous conjunctivitis - + -0. 40 - /*) (Mingers et al, 1999, Schuster et al, 1999). A10*)* * 2- )!* (2- ) ( 2-&" + 0, ), 2 + (Collen, 1976). & 0 ) (serino proteases inhibitors) 0-0. ) 0. / 0 - & (Plasmin-Antiplasmin, PAP) (Wiman et al, 1979).,. - --0. 4 2-&" /*+. 0 -- 0-4, 0; /*) - in vivo, 4 2-&" 4.. +* /*. 0 2-&" / 0 / +* /*) ; /*) (Matsuno et al, 2002). 114

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118

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+ 28:, ) + 0-0 DNA (a) '- 0 * 0 DNA,. + DNA. - ).) ) +)+ ( ). (.) ), + - -. * * 0-0 (major minor groove). &,, 0 *) 0 -. - - 4 ) *)* 0 -. (b),.- - 0 DNA, + -.) +)+ (.-0 - ), ) *) ( ) - - 4 ) *) (-0 0). - 0. / /. ' 5 3 ) 5 3 ) / - ).). / *) 0. *, - (A) (G), * -, / (T) (C) -0 4 - -. connected by hydrogen bonds (Dickerson, 1983). ut;vœ0w Œ+ŽWŠ )Ú ) Gš) ß WŠ^Ž. yx) Ž 2t ß )Œ+ÔŽ Š^ z) V 1Ž ŒL )Œ{ Û Š /}$~& -ƒj - ~ & ˆ0 W~ŠŒ C Ž & n $ / ' DNA. )/ -+--. 0 0./ 0/- -. -. ( 0/- 0. DNA 0/- -) - (Polymerase Chain Reaction- PCR), 0/- 0 125

(Restriction Fragment Length Polymorphisms- RFLPs). H. ) DNA (extraction DNA) ( + ) +)0 ). - ) *. ) ) ()< ) - * )< (), 0. DNA.) (Maniatis et al, 1982). )7 --.0. - (+,.)+) - (6! NaCl) (Miller et al, 1988). '0, DNA - *- -,. &/ - DNA - DNA ++) 260nm 280nm, )- DNA (Sambrook et al, 1989). & (OD) 260nm 0) DNA g/ml.? 0-4 -,. 50 g/ml - ) DNA 40 g/ml ) DNA. OD 260/280 nm 4/ / DNA )< 4). % OD 1.8 - - /,. 1.2 * 0 / (Sambrook et al, 1989). J B ƒ! Lšy 3ˆ š œ žˆ&ƒj -}$~ B 2ŸKžƒ 2 >. ŒŽ& Žª L«u /ŽB K / # # ( -) - + 0.0 DNA, - 4 0 +0! (Saiki et al, 1985). ( 0/- 0 +. DNA +.! -. 0. - * 0 + -. ( PCR 0-) - *< 0 -), / -- 0. ). DNA.! PCR /). DNA, * 0 +, 106 +0. ž & -š 2 -Ÿ± B ~ ( PCR * - ) ) + DNA, in vivo in vitro,. + )0 + 0. / -4 3. 0, ) ) DNA, 0. 0 - ) DNA /0 --.) - 3. ) + (primer). ) (template). (. ) - ) / ) -. ' - 0 DNA 4. PCR,. + in vitro -. DNA. (Saiki et al, 1985, Mullis, Fallona, 1987). (. + /. DNA (Bell, 1989), 0. )/ *- Thermus aquaticus (Taq)..) - + 0 (primers)- / - 0. - ). DNA., /0. 0 DNA /. 0 / 0 126

+)+ -4*-) (deoxyribonucleotide triphosphates- dntps), -0 - DNA, / Mg. ( - PCR * 3 -: 1. &-4 (!)-denaturation) - 0 DNA - ). 2. - (annealing) ) - - /.. ( / ) - ) 0, ) / DNA.. & - / -,. 0; * 0/. 3. / (extention) 0) ) DNA, ) ) / ) ) - ) / 0 / / ; /0. 1 PCR ) -.! 0 / ) / 0. - ) -. * 0 +0 / + / 0 / DNA.! --, ) *) ), 4 / / ) +) DNA., -.. ) (Repley et al, 1992, Templeton 1992). / * 3 -+0/ -. 1, -4 DNA. ; / 90-95 C,.- 30-60 sec. / ) 40-60 C 30-60 sec. - ), 70-75 C Taq /0 0 DNA. 0 0 / - 0 0 + / 0 (thermocyclers). ' + DNA ) --. + 0.. *). / - (ethidium bromide), * 4 ) - ) +/ ) - +). 1. -0) - ) - PCR, /0 + -+. &, < PCR +0 * (Southern blotting) 0. *-..0. '0, -./.)0 0/-. ) /0) <) PCR. ) - 0, 0. /, /.0, ) * +7. 127

DNA 3.3x10 9 bp 600 bp 1 2 3 4 5 + 29: ( -) - (PCR). H. PCR 0 0/ / DNA-.., -/ 0 + /. ( 4- PCR 0 - - 0. - / // / (. -.) DNA 0/ 600 bp ( DNA / - 0. 0/ 3.3.109 bp). 1. ' * /, / -. ) 600 bp ((, (). 0 ) / DNA )0 / -.. 2. ' - ) DNA 0 ) /0. 3. 0 / ) DNA 0; * *-. 4. 0. / 0 - ) - ) / 0., / 0. & -- 0 0 ). ' < 0 - ) DNA 0.. / 0. -.. - (template) 0; - +. 5. '* () -- (2)- (4) * 0 +0, 0 / +) DNA 2n ( n= / ) ) PCR). - 20 / - 0 / +) 1x106 (, 1993) # ²±ŸWž&B 2 L³ ˆ žµk 2 - k & K h & g.! - / 0 +0 - PCR 0 *-.0 DNA. 0 - / DNA., - 0 *- 4 0.. & + ) - Taq. /0 / 128

ºº -4 DNA. ) / -. + PCR / 04. 0, ) - / - Taq.! ) DNA (92-96 C), / / 72 C, / Taq. /, / *- ), **) 0 / *- DNA., +. 100% ), Taq / 4 / ) ) - <) DNA. 0. /.. / - < (%, 1993). (#)* #%)3 $#,1).7# )1 (Restriction Fragment Length Polymorphism- RFLP analysis) DNA 04 ; ) *-. ). - 40 DNA. ' 0 - * +0 0.... Eco R1 Escherichia coli, Hind III Haemophilus influenzae... ' 0 * DNA 0. ), - 2 +)+- - (0 / -). / 0 ) - -. 4-8 -. ' DNA * / -+ 0/ 0. (blunt ends) - (cohesive). ' 0. -) DNA. 0). *-..0 (Southern blotting), ) *-),.+ - ).,. ) ) 0.+ DNA, -+ ) ) ),. -+, ) 4 4).?- DNA 0. -/0-0 / 0. - 0/. ( 4 4 -+ 0-0 ; /0-0 /0, / 0. -+ 0/. '/ ) ) + / 0 (Restriction Fragment Length Polymorphism- RFLP) (Maniatis et al, 1982, 2*- 1993). ' 0 4 / /, - -20 C. / 0 + 0 /, /) - - / / -.!- 0 ) 1g DNA *0 / (/, ph.) $ +¹-º º#¹3»/¼0 Š cú ) Gš 129

. 0. - PCR ) +, 4) -+ ). &.. -.,. 0, 0/- PCR. 0. < PCR ) 0 0 /. /. &/ + ) 0/ ) <).0 ) - DNA ) 0/ (Lungu et al, 1992). E E* E RFLP + 30: RFLP. 1 DNA 0. Southern../0 DNA, *- (B), PCR, / / -.. ' RFLP s 0 (0) 4 + - /0 0 (*),.. 0. /0 -., 0 / ; DNA - /0, ). 0 / - /0 * (-4). RFLP s - (biallelic),. -- - -.0 ( ). & / 4/ /0 + (*).. DNA. 130

m!+ #)* # ( V Leiden O V Leiden 4 - V ( * - G / - - &). ( 4 0. ) 0 / 4 - Arg /0 506 V (/0 0 PC- apc Va - ) 4 - Gln. 1 Va 0 0. - 0. - 0 PC (apc-r test /) /*+. V Leiden.. PCR,. 0 (primers) 'aq. - 0. 4. ' 0 Mnl - < - ) 0. *) GAGG. & < - 0. 4 Leiden, 0. / AAGG, 0 - ) - 0. - (Beauchamp et al, 1994). $$ 1) 0 (Primers) FV3: 5 - CAT GAG AGA CAT CGT CTC TG- 3 FV6: 5 - GAC CTA ACA TGT TCT AGC CAG AAG -3 2)! --) (dntps mix datp, dgtp, dctp, dttp) 3) PCR master mix: 83.6 l 0 10.0 l / - PCR 3.0 l.). (MgCl2) 1.0 l F3 F6. 4) 'aq (Biotaq polymerase), /0-20 C -0 0) 1,5 u/2l. 5) Pre-mix 0; Mnl. 5.5 l 0 2.0 l / - NE 0.5 l BSA (Bovine Serum Albumine) 6) 0 Mnl (/0-20 C). &*.- 1:5 0. 7) +0 (Sigma) 8) 10 x TBE (TrisBorateEDTA) / -, / -). 108 g Tris Base 55 g Boric Acid 9.3 g Na2EDTA, 0 0. 1000ml. 9) &, Metaphore 10) Ethidium Bromide: 10mg/ml 0 0 4 C 0.. 11), +) (Loading Buffer½ PCR 131

To master-mix PCR 98l, 4.).,. / DNA 40-0) 200ng../ 1l. 0 -.) DNA./.. / ) - PCR 95 C 7 /0 Taq polymerase ( PCR hot start- / )). - 4: 1) 95 C 7 (0 - DNA) 2) 72 C 1 (/ Taq ) 3) 94 C 1 (-) 4) 57 C 1 (*- ) 4) 72 C 1 (/ < PCR) 3, 4 5 35 72 C 10 '0, - 0. 4 C 0. 4 0). $. ( + -)/ ) - 0-) < 4 -., 1,5g & 100ml TBE (1x) + ) / 2l Ethidium Bromide. ' / + ;./. / 1x TBE buffer (- +) + - */ / - +) (loading buffer). + DNA (ladder), / DNA 147bp. + 90Volts 1 / - * (Transilluminator). & - 0.. /- < 143 bp., - 0. 4, < -.) DNA -/- /. +, ).,- $$ * Mnl / ) Eppendorf / 8 l pre-mix 0; Mnl. /0 10 l PCR product / ),, 2 l Mnl. '. +0 (mineral oil) +./ 4. ' ) + -, 37 C.- 2 ) 15. " $ $ $* ' metaphore ( +. /0 - / DNA ) 500 bp. 100 ml '2 1x - 3,5 metaphore, ). &+ 4 + 20 l. -,. +./ -, */ loading buffer., + DNA - (ladder) (/) 123 bp). + 100 Volts, 2. 132

. $' : & Leiden:,, 25, 37 81 *). ) Leiden:, 4, 25, 37, 81 118 *). ) Leiden:, -, 25 118 *). (#)+ 1). 133

!+ #)* # *!# 20210 # '!# *,"!* ' 20210 & - /*. -) - (PCR) 142 bp - /*, * - 20210. 0 ).- (primers): PT1: 5 - ATT GAT CAG TTT GGA GAG TAG GGG 3 PT2: 5 - AAT AGC ACT GGG AGC A GAA GCT 3-0 - /* 3 +0., /0 20093 0) /0 20234. ' downstream primer (PT2) -+0. - 0. /0 20214 * & (0 ). ). 1,. & /0 20210, - /0 0 Hind III. 8,. 4 < - 0 0 (Makris et al, 1997). $$ 1) 0 (Primers) PT1: 5 - ATT GAT CAG TTT GGA GAG TAG GGG 3 PT2: 5 - AAT AGC ACT GGG AGC A GAA GCT 3 2)! --) (dntps mix datp, dgtp, dctp, dttp) 3) PCR master mix: 41,8 l 0 5,0 l / - PCR 3,0 l.). (MgCl2) 1,0 l 4) 'aq (Biotaq polymerase), /0-20 C -0 0) 1,5u/2l. 5) Pre-mix 0; Hind III 5,5 l 0 2,0 l / - NE 0,5 l BSA (Bovine Serum Albumine) 6) 0 Hind III (/0-20 C). &*.- 1:5 0. 7) +0 (Sigma) 8) 10 x TBE (TrisBorateEDTA) Buffer, / -). 108 g Tris Base 55 g Boric Acid 9.3 g Na2EDTA 134

, 0 0. 1000ml. 9) Agarose, Metaphore 10) Ethidium Bromide: 10mg/ml 0 0 4 C 0.. 11), +) (Loading Buffer) PCR To master-mix PCR 45l, 4.).,. / DNA 40-0) 150ng/2l../ 1l. 0 -.) DNA./.. / ) - PCR 95 C 7 /0 Taq polymerase ( PCR hot start- / )). - 4: 1) 95 C 7 (- DNA) 2) 72 C 1 (/ Taq ) 2) 94 C 20 sec (-) 3) 57 C 20 sec ($*- DNA-.) 4) 72 C 20 sec (/ < PCR) + 3, 4 5 * 35 72 C 10. '0, - 0. 4 C 0. 4. " $ $ $* ( + -)/ ) - 0-) < 4 -., 1,5g & 100ml TBE (1x) + ) / 10l Ethidium Bromide. ' / +. / TBE (1x) buffer + - */ - +). + DNA (ladder), / DNA 142bp. + 90Volts 1 / Transilluminator. & - 0. -0; / - < 142 bp., - 0. 4, < -.) DNA - / - /. +, ).,!0!$ Hind III. / ) Eppendorf / 8 l pre-mix 0; Hind III. /0 10 l < PCR / ),, 2 l Hind III. '. +0 (mineral oil) +./ 4. ' ) + -, 37 C.- 2 ) 15. $ metaphore. 135

( +. /0 -. DNA ) 500 bp. 100 ml '2 1x - 3,5, ). &+ 4 + 20 l. -,. +./ -, */ - +)., + - DNA (ladder) (/) 123 bp). + 100 Volts, 2..! : & 20210&:, 142 *). ) 20210&:, 3, 24, 118 142 *). ) 20210&:, -, 24 118 *). (#)+ 1) %! 1: 0 +)+ - 0 +. FV Leiden, -4 0 +)+.. 4 IIG20210. =/ 0 4, Het= 0 4 Hom= 4., 0 4 FV Leiden (4, 25, 37, 81 118 *)), 0 4 (2, 25 118 *)) 4 + (25, 37 81 *)). - - 4 IIG20210A (3, 24, 118 142 *)), 3 + ) 4 ( 142 *)). 136

PCR $( $#,! (Long PCR) * $(#<* * )% #!# 22 )!' # ( FVIII $( ( - PCR /. + 22 - VIII./. 4.* 0/- Southern blotting, / -. -0. & + / - 4. 9.5-kb 22 (int22h1) ) - 4)- ). int22h2 and int22h3;.0 int22h2 int22h3 0. ) 99% 4. - + 4)- / /.0 int22h1 (. 31) ( -. 9.5-kb. PCR + - GC 3.5-kb, 0 * 0 1.0-kb. GC ) 79%. 0, 0/- PCR -0. 40.. (. PCR. + - (overlapping) PCR (long-distance) PCR (. 31). ( +. PCR / DNA. 4 -+- (wild-type), +, +0., 0, P Q, *- -- /0 VIII /0 1212 bp +1334 bp * 0)/ int22h1. 8-0, A B, / /0 167 bp +118 bp * 0)/ ). int22h2 int22h3. ' PQ (12 kb) AB (10 kb).) 4. 8 + 4 +. PB (11 kb) AQ (11 kb), / 10-kb AB -0 4)-. + PQ (12 kb), PB + AQ (11 kb), AB (12 kb). AB.. 0 +. int22h2 int22h3 0 0+. '.) 0.6% 0. (. - PCR 4 / ) /0 long-distance PCR: (1) ;0 dimethylsulfoxide (DMSO) (2) 40 Taq ; (3) 50% deaza-dgtp (Liu et al, 1999). 137

+ 31: & - PCR. 0 0 (P, Q, A, B) 4 0 /0. ' ) int22h1, -0 0 -..0 0)/ (flanking).' ) int22h2 int22h3, 0 0 -. 0)/ (flanking).0. &+0 * - 4 int22h1 ) - int22h2 int22h3 (0 0). ) + < - PCR.) + (wild-type), + + (inversion) + (carriers) (Liu et al, 1999). $$ Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix, Buffer 2 (Abgene AB-0795b) MWG Custom Oligo s (5-3 ): Primer P: GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC Primer Q: GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA Primer A: CAC AAG GGG GAA GAG TGT GAG GGT GTG GGA TAA GAA Primer B: CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTC CCC TCT CAT A Dimethyl Sulfoxide 100ml Tris Base 5kg EDTA 500g 138