CAPITOLUL 9. Separarea cromatografică aspecte generale

CAPITOLUL 9 Separarea cromatografică aspecte generale 9.1. Clasificarea metodelor cromatografice Începuturile separărilor cromatografice se datorează lui Ţvet (1903), care a realizat primele separări de coloranţi vegetali pe coloană umplută cu carbonat de calciu. Termenul de eluţie cromatografică a fost introdus mai târziu, de către Reichstein şi van Euw (1938), care să descrie principial procesul cromatografic de separare a componenţilor probei la trecerea printr-o fază staţionară. Tot în acelaşi an, Izmailov şi Shraiber şi-au publicat rezultatele privind primele separări cromatografice pe strat subţire. Separarea cromatografică are la bază interacţia diferenţiată a componenţilor unei probe faţă de două faze, numite: faza staţionară şi faza mobilă (aflată în mişcare faţă de faza staţionară). Procesul se petrece într-o coloană cromatografică, sau pe suprafaţa plană a unei plăci pe care este depusă faza staţionară. Analiza cromatografică este un proces cuplat între separarea cromatografică şi determinarea (detecţia) compuşilor separaţi (proces care se bazează pe măsurarea unei proprietăţi fizice). Din această prezentare, rezultă că separările cromatografice pot fi clasificate fie din punct de vedere al naturii celor două faze (staţionară şi mobilă), fie din punct de vedere al mecanismului de separare, sau fie din punctul de vedere constructiv al ansamblului de faze. Din punct de vedere al naturii celor două faze distingem următoarele clase de separări cromatografice: - cromatografie de gaze (GC) în care faza mobilă este un gaz inert; în funcţie de natura fazei staţionare se disting următoarele tehnici gaz-cromatografice: a) separarea gaz-lichid în care faza mobilă este un gaz inert, iar faza staţionară este un lichid, depus pe un suport inert, sau pe peretele unei coloane cromatografice; b) separare gaz-solid (SGC), în care faza mobilă este un gaz inert, iar faza staţionară este un solid; - separare prin cromatografia de lichide (LC), în care faza mobilă este un lichid, iar faza staţionară este de regulă un solid; - cromatografie în fluide supercritice (SFC), în care faza mobilă este un fluid supercritic. Mecanismul care stă la baza de separării cromatografice se poate baza pe: 1) adsorbţie; ) repartiţie; 3) schimb ionic; 4) excluziune sterică, etc. Adeseori, procesele cromatografice pot decurge printr-o combinaţie a acestor mecanisme. In funcţie de mecanismul de separare cromatografia de lichide (în care polaritatea şi hidrofobicitatea analiţilor, a fazei staţionare şi a fazei mobile joacă un rol determinant) se împarte în trei variante: i) cromatografia de lichide în faza normală (denumită aşa mai degrabă din punctul de vedere istoric), în care faza staţionară este polară, iar faza mobilă este nepolară; ii) cromatografia de lichide în faza inversă, în care faza staţionară este nepolară şi hidrofobă, iar faza mobilă este polară. iii) cromatografie de lichide prin mecanism de schimb ionic, în care faza staţionară 133

este un schimbător de ioni, iar faza mobilă este apoasă cu ph controlat. Din punct de vedere constructiv se disting: cromatografia pe coloană şi cromatografia planară (pe hârtie sau pe strat subţire). In prezent, cromatografia pe coloană, în una din clasele menţionate anterior reprezintă una dintre cele mai importante tehnici de investigare a probelor multicomponent în chimia analitică. După cum spune şi denumirea, rolul central în separarea cromatografică îl are coloana cromatografică, în care se găseşte faza staţionară. 9.. Parametrii unei separări cromatografice Cromatograma reprezintă dependenţa în timp a proprietăţii măsurate de detectorul sistemul cromatografic. Intr-o cromatogramă întâlnim picuri cromatografice şi o linie de bază (constantă sau variabilă). O separare cromatografică a unui amestec de n componenţi trebuie să conducă la o cromatogramă cu n picuri cromatografice. De exemplu, în figura 9.1 este redată cromatograma HPLC a unei probe conţinând 14 hidrocarburi aromatice polinucleare în acetonitril. După cum se poate observa, numărul de picuri cromatografice este egal cu 14; dintre acestea doar picurile 10 şi 11 nu sunt perfect separate în linia de bază. Absorbanta (mau) 60 55 50 45 40 35 3 4 8 9 30 5 7 10 11 14 0 15 10 1 6 5 1 13 5 0 0 4 6 8 10 1 14 16 18 0 4 6 8 30 3 Timp (min) Fig. 9.1. Cromatograma unui amestec de 14 compuşi. (amestec de 14 hidrocarburi aromatice polinucleare separate prin HPLC în fază inversă şi detecţie prin spectrometrie de absorbţie moleculară UV). Semnalul cromatografic este numit pic cromatografic, a cărui formă redă de fapt o imagine a echilibrelor de distribuţie ale moleculelor de analit între faza mobilă şi faza staţionară, care se petrec în coloana cromatografică. Parametrii matematici ai unui pic cromatografic ideal (picul 5 din Fig. 9.1, apropiat de forma Gauss) sunt daţi în figura de mai jos, care la rândul lor sunt utilizaţi la determinarea aşa-numiţilor parametri cromatografici ai unei separări. [85] 134

Semnal 15 14 13 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 1 0 Y 0 Y 0 / Y 0 /10 σ σ t R w 1/ w 10% Punct de inflexiune Linia de bază 7. 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 min w Fig. 9.. Parametrii unui pic cromatografic ideal (de formă Gauss). Forma ideală a picului cromatografic este descrisă de ecuaţia de tip Gauss, în forma următoare: 4(t t R ) ln w Y = Y 0 e 1/ (9.1), în care Y o este înălţimea maximă a picului cromatografic, măsurată la valoarea timpului, numit timp de retenţie (t R ), w 1/ este semi-lăţimea picului (lăţimea picului măsurată la jumătatea înălţimii); ln = 0,693. Forma unui picul cromatografic simetric, dar mai larg în bază poate fi descrisă la fel de bine şi de funcţia Cauchy: Y0 Y = (t tr ) (9.) 1+ [ ] w1/ unde, de asemenea: Y 0 este înălţimea picului pentru t = t R, iar w 1/ este lăţimea picului la jumătatea înălţimii (semi-lăţime). [87] Forma celor două funcţii nu diferă foarte mult, aşa după cum se poate observa din regresiile respective aplicate unui pic real în figura următoare, prelucrat din cele redate în Fig 9.1. 135

Semnal 65 60 55 50 45 40 35 30 5 0 15 10 5 Gauss 0 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5. 5.3 5.4 5.5 Timp de retentie (min) Semnal 65 60 55 50 45 40 35 30 5 0 15 10 5 Cauchy 0 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5. 5.3 5.4 5.5 Timp de retentie (min) Fig. 9.3. Modelarea unui pic cromatografic real (punctat gros) prin funcţia Gauss, respectiv prin funcţia Cauchy (linie continuă). Pentru un pic simetric de tip Gauss, lăţimea acestuia măsurată între punctele de inflexiune este σ. Cum punctele de inflexiune sunt mai dificil de evidenţiat, se preferă a se măsura lăţimea picului la jumătatea înălţimii acestuia, notată mai sus cu w 1/. Intre w 1/ şi σ exista relaţia simplă: w 1/ =,35 σ (9.3) Aria picului (A) care este o mărime cantitativă, ce depinde de cantitatea de analit injectată în coloana cromatografică, se obţine din integrarea funcţiei Gauss: [88] 1 π A = Y0 w1/ (9.4) ln sau a funcţiei Cauchy: π A = Y 0 w 1/ (9.5) In practică, integrarea picurilor se face în mod automat cu ajutorul soft-ul sistemului de achiziţie şi prelucrare a datelor cu care este dotat sistemul cromatografic. Analistul trebuie să precizeze aria minimă de pic care poate fi măsurată. Sub această limită picurile cromatografice din cromatograma înregistrată nu vor fi raportate de către soft-ul sistemului de achiziţie şi prelucrare a datelor. Integrarea se poate face şi manual de către analist. Problema alegerii liniei de bază ( baseline ), faţă de care se va face integrarea, este dificilă atunci când picurile cromatografice se apropie ca mărime de semnalele din linia de bază (analitul se găseşte în proba injectată la limita de detecţie a detectorului cromatografic). In acest caz, analistul trebuie într-o bună aproximaţie vizuală să stabilească media semnalului de bază faţă de care vor alege punctele X şi Y în care se 136

va integra picul cromatografic. Această situaţie este ilustrată în figura de mai jos, cu alegerea greşită şi corectă a punctelor de integrare. Semnal Pic cromatografic de integrat Linia medie de bază X Y Linie de bază greşită t R (min) Fig. 9.4. Fereastra unei porţiuni dintr-o cromatogramă în care picul cromatografic este corect integrat prin alegerea punctelor X şi Y în linia media a semnalului de bază (ales neconstant cu drift). ( Q injectat analit In general, între aria picului (A pic ) şi cantitatea de analit injectată în coloană, exprimată în µg, sau în ng, sau în pg, etc) există o relaţie de linearitate în conformitate cu funcţia de răspuns 1.3 şi a discuţiei asupra domeniului de linearitate din cap. 1.: injectat Apic = a + b Q analit (9.6) Mărimea Q poate fi substituită şi prin concentraţia probei injectate, cu condiţia ca în procedura de calibrare şi cea de analiză, volumele de soluţii standard, respectiv de probă analizată, să fie identice. Factorul de răspuns (F i ) al unui detector faţă de un anumit analit i detectat la ieşirea din coloana cromatografică este dat de raportul dintre aria picului corespunzător analitului i şi cantitatea de analit (unităţi de masă) injectată în coloană: Apic,i F i = (9.7) injectat Qanalit,i 137

Atunci când picul cromatografic creşte ca arie, porţiunea de arie rezultată prin integrarea mai puţin corectă, ilustrată în figura de mai sus, devine nesemnificativă în raport cu aria acestuia, astfel că în practică nu se mai măreşte imaginea semnalului de fond pentru a găsi punctele corecte de integrare. De foarte multe ori, forma picurilor este asimetrică. In acest caz, alegerea unei funcţii utile în descrierea formei picului cromatografic este mai dificilă. De regulă, asimetria se datorează unei aşa-zise cozi ( tailing ) a picului cromatografic, care poate fi în faţa picului ( pre-tailing ) sau în spatele picului (post-tailing ). [89] Simetria unui pic cromatografic (notată cu Sim) poate fi exprimată în mai multe moduri. Dacă aceasta se măsoară în punctele de inflexiune a curbei picului redat în Fig. 9., Sim devine: σ' Sim = (9.8) σ Simetria poate fi măsurată mai exact la jumătatea înălţimii picului cromatografic, atunci când w 1/ este împărţită de verticala din maximul picului în două părţi: B în partea dreaptă şi C în partea stângă. In acest caz simetria devine: B Sim = (9.9) C In mod practic, cozile picurilor cromatografice se evidenţiază după jumătatea înălţimii maxime a picului cromatografic. In acest caz simetriile redate de ec. 9.8 sau 9.9 nu mai sunt corecte. De aceea, se preferă măsurarea lui B şi C, la o înălţime a picului cromatografic cât mai aproape de linia de bază, dar suficient de mare ca să se evite erorile legate delimitarea picului (măsurarea lui w este afectată de erori). In acest caz, cea mai recomandată măsurare este la 10% din maximul înălţimii picului, când parametrii B şi C sunt notaţi cu B 10%, respectiv C 10%, iar simetria are expresia: B10% Sim = (9.10) C10% Un parametru important a unei separări cromatografice este timpul mort (notat cu t 0 ). Acesta semnifică durata de timp în care faza mobilă parcurge coloana cromatografică. Acest parametru se poate măsura cunoscând debitul fazei mobile şi lungimea coloanei (în cromatografia de gaze) sau introducând în proba injectată un component total inert faţă de faza staţionară (în cromatografia de lichide), care va elua astfel din coloana cromatografică la timpul de retenţie notat cu t 0. Cu ajutorul acestui parametru se pot calcula alţi doi parametrii foarte importanţi ai unei separări cromatografice: timpul de retenţie ajustat, numit şi timp de retenţie net (t R ) şi factorul de capacitate (k ), definiţi prin relaţiile: t' R = tr t0 (9.11) tr t0 t' k ' = = R (9.1) t0 t0 138

Din punct de vedere practic, minimul separării cromatografice a doi compuşi injectaţi (notaţi în ordinea eluţiei crescătoare cu i şi j) în coloana cromatografică se obţine atunci când picurile lor cromatografice ajung în semnalul liniei de bază. Gradul de separare cromatografică este exprimată prin rezoluţia cromatografică (R s ). Pentru picuri simetrice formula de calcul a acestui parametru este dată de expresia: (tr, j tr,i) (tr, j tr,i) Rs = = (9.13) 0,5 (wi + w j) (w1 + w) In felul acesta se poate deduce că minimul lui R s pentru ca cele două picuri cromatografice i şi j să fie separare în linia de bază este 1. Dacă picurile nu sunt separate, măsurarea pentru w i şi w j nu poate avea loc. Ţinând cont că: w i = w 1/,i şi w j = w 1/,j, formula rezoluţiei devine: tr, j tr,i Rs = (9.14) w1/,i + w1/, j O măsură a selectivităţii cromatografice este dată de factorul de separare (notat cu α ij ) a doi compuşi i şi j (eluând în această ordine), care este definit prin relaţia: [90] t' R, j k' j αij = = 1 (9.15) t' R,i k' i Eficienţa unei separări cromatografice se reflectă în lărgimea picului cromatografic: cu cât picul cromatografic este mai îngust, cu atât mai mare este eficienţa separării cromatografice. Cantitativ, eficienţa unui proces de separare se exprimă prin numărul de talere teoretice (notat cu N). Conceptul de taler teoretic este împrumutat din teoria distilării, care în cazul unei separări cromatografice s-ar traduce prin porţiunea din coloana cromatografică în care se stabileşte echilibrul de distribuţie al analitului între faza mobilă şi faza staţionară. Formula de calcul a numărului de talere teoretice N i corespunzător unui analit i este următoarea: [90] tr,i N i = ( ) (9.16) σi Ţinând cont de relaţia 9.3, formula de calcul a parametrului N devine: tr,i Ni = 5,54 ( ) (9.17) w1/,i Înălţimea talerului teoretic (notată cu h) se poate calcula cunoscând lungimea coloanei cromatografice L: h = L/N. Cu aceste ultime noţiuni, se poate reveni la formula de calcul a rezoluţiei. Ţinând cont de relaţiile anterioare se poate deduce formula de calcul a rezoluţiei, pentru picuri cromatografice de arii aproximativ egale şi caracterizate într-o bună aproximaţie de aceiaşi eficienţă (N): 139

N k' R i s = (αij 1) (9.18) 4,7 k' i + 1 Ecuaţia de bază pentru rezoluţia între picuri cromatografice inegale ca arie, notate cu i şi j poate fi propusă prin modificarea celei de mai sus, în forma: N k' Rs = (αij 1) (9.19) 4,7 k' + 1, unde k ' este media aritmetică a celor doi factori de capacitate pentru analiţii i şi j, k i şi respectiv k j. Cu aceste precizări, rezoluţia dintre cele două picuri cromatografice devine: N k' j k' i k' i + k' j Rs = (9.0) 4,7 k' i k' i + k' j+ k' Maximul raportului i + k' j este 1, atunci când k i şi k j sunt foarte mari. Pe de altă parte, k' i + k' j+ pentru k mare, picurile cromatografice devin foarte largi, cu timp de retenţie foarte mare, uneori greu de integrat. De aceea, valoarea lui k între 1 şi 0 este considerată ca acceptabilă. 9.3. Teoria talerelor Aceasta teorie este una dintre cele mai importante teorii în modelarea procesului cromatografic, iniţiată de Martin şi Singh şi apoi dezvoltată de Said. [91] Teoria talerelor descrie practic curba de eluţie (cromatograma) unui anumit compus chimic. Această teorie propune că un analit participant la un proces cromatografic participă la un echilibru de repartiţie (distribuţie) între faza mobilă şi faza staţionară, pe o porţiune mai mult sau mai puţin îngustă din coloana cromatografică. Această imagine (modelare) conduce imediat la o conexiune cu teoria distilării, care consideră că o coloană este structurată într-un număr de celule sau talere, numite în cazul procesului cromatografic talere teoretice. Fiecare taler are o lungime finită, în care analitul se găseşte (staţionează) un anumit interval de timp. Cu cât un taler are dimensiunea mai mică, cu atât mai eficient este procesul de partiţie al analitului între cele două faze; cu micşorarea dimensiunii unui taler, numărul acestora atribuit unei coloane cromatografice creşte. Ca urmare, numărul de talere teoretice atribuit unei coloane cromatografice a fost identificat cu eficienţa coloanei. Teoria talerelor arată că lăţimea unui pic cromatografic (dispersia unui pic cromatografic) este invers proporţională cu rădăcina pătrată a eficienţei, sau altfel spus: cu cât eficienţa este mai mare, cu atât picul cromatografic este mai îngust. Pentru aceasta să considerăm echilibrul de repartiţie cromatografică a unui analit X, între o fază mobilă (notată cu indicele m) şi o fază staţionară (s): X m X s (9.1) 140

Acest echilibru este caracterizat de constanta respectivă de echilibru (K), dată de ecuaţia: [X] s K = (9.) [X] m Prin [X] este notată concentraţia analitului X în faza staţionară sau mobilă indicată prin indicele respectiv. Prin diferenţierea ecuaţiei 9. se va obţine următoarea relaţie: d[x] s = K d[x] m (9.3) Teoria talerelor îşi propune să stabilească o relaţie între concentraţia analitului X în faza mobilă după parcurgerea a n talere din coloana cromatografică. Pentru aceasta să considerăm 3 talere teoretice consecutive, notate cu (p 1), p şi (p + 1), iar parametrii eluţiei cromatografice în aceste talere redaţi în Fig. 9.5. Taler (p-1) Taler p Taler (p+1) Faza staţionară v s [X] s,p-1 Faza staţionară v s [X] s,p Faza staţionară v s [X] s,p+1 Faza mobilă v m [X] m,p-1 Faza mobilă v m [X] m,p Faza mobilă v m [X] s,p+1 Fig. 9.5. Reprezentarea a trei talere teoretice succesive dintr-o coloană cromatografică. Prin dv se notează variaţia de volum de faza mobilă ce trece din talerul (p 1) în talerul p, iar dm reprezintă variaţia de masă de analit din talerul p. Variaţia dm reprezintă diferenţa de masă de analit X, atunci când volumul dv de fază mobilă iese din talerul (p 1) şi intră în talerul p. In acest caz se poate scrie: dm = ([X] m,p 1 [X] m, p)dv (9.4) In condiţii de echilibru de distribuţie a analitului X între faza mobilă şi faza staţionară valoarea lui dm poate fi scrisă: dm = vs d[x] s,p + vmd[x] m,p (9.5) Substituind pe d[x] s,p din ec. 9.3 se va obţine: dm = (vm + Kvs) d[x] m,p (9.6) Din ec. 9.4 şi 9.6 se obţine următoarea ecuaţie: 141

d[x] m,p dv [X] m,p 1 [X] m,p = vm + vsk (9.7) Numitorul din această ecuaţie este definit ca volumul talerului şi este notat cu v t. Numărul de talere (ν) din coloana cromatografică având volumul V devine: V V ν = = (9.8) vt vm + K vs De unde prin diferenţiere se va obţine: dv dν = vm + K v (9.9) s Cu aceasta, ecuaţia 9.7 devine: d[x] m,p dν = [X] m,p 1 [X] m,p (9.30) Aceasta ecuaţie diferenţială descrie viteza de modificare a concentraţiei unui analit în faza mobilă din talerul notat cu p, la trecerea fazei mobile prin el. Soluţia acestei ecuaţii redă concentraţia analitului X în faza mobilă din talerul notat cu p, pentru un număr de talere teoretice din coloana cromatografică notat cu ν: ν p [X] e ν [X] 0 m,p = p! (9.31), unde [X] 0 reprezintă concentraţia iniţială a analitului X, la injectarea sa în coloana cromatografică, care se găseşte în faza mobilă. Ecuaţia (9.31) arată că modelul distribuţiei continue între faza mobilă şi faza staţionară este unul de tip Poisson. Pentru valori mici ale lui ν distribuţia este asimetrică, devenind simetrică pentru valori mari ale lui ν. In practică ν este mult mai mare decât 100, iar distribuţia de mai sus devine una Gauss, în acord cu forma experimentală obţinută pentru picurile cromatografice. Înălţimea unui taler teoretic este notată cu H. Numărul de talere teoretice dintr-o coloană cu lungimea L fiind notat cu N, rezultă că H va fi: L H = (9.3) N Înălţimea redusă a talerului teoretic este dat de raportul H/d p, unde d p este diametrul particulelor fazei staţionare. 9.4. Ecuaţia van Deemter Teoria talerelor redă din punct de vedere cantitativ o imagine asupra proceselor care au loc în coloană şi exprimă calitatea unei coloane prin numărul de talere teoretice 14

atribuite procesului cromatografic pentru un anumit analit injectat în coloană. Cu toate acestea, această teorie nu redă şi o explicaţie asupra mecanismelor şi fenomenelor care stau la baza echilibrelor de distribuţie ale analiţilor între faza mobilă şi faza staţionară. Teoria dispersiei frontului de analit în coloana cromatografică studiază fenomenele care au loc la transferul probei în coloana cromatografică. Aceasta se bazează pe viteza fazei mobile şi a parametrilor procesului, precum viteza transferului de masă între cele două faze participante la procesul cromatografic, viteza de difuziune a moleculelor de analit (solut) de-a lungul coloanei şi hidrodinamica fazei mobile. O reprezentare a acestui fenomen este redată în figura următoare. Fig. 9.6. Reprezentarea lărgirii frontului de analit la trecerea prin coloana cromatografică. Glueckauf a studiat efectele a trei factori asupra procesului cromatografic, descrişi în continuare: [9] 1) difuzia obişnuită în faza mobilă în direcţia de deplasare a acesteia; acest proces are loc de regulă atunci când există o regiune de concentraţie mare şi una de concentraţie mică, în acord cu legea lui Fick; ) difuzia longitudinală în faza mobilă, în special datorită ciocnirilor moleculelor de analit cu particulele fazei staţionare (pentru coloane umplute) şi între moleculele de analit şi cele ale fazei mobile; 3) mărimea particulelor fazei staţionare. Măsura împrăştierii zonei după o distribuţie normală Gauss este dată de deviaţia standard. Această împrăştiere este definită de modelul deplasării aleatoare ale moleculelor de analit prin numărul de paşi efectuaţi (n) şi lungimea fiecăruia (notată cu l): σ = l n (9.33) Această relaţie simplă arată că împrăştierea zonei este proporţională cu lungimea porilor şi rădăcina pătrată a numărului acestora. Din teoria statistică se ştie că deviaţia standard nu este o mărime aditivă, în cazul influenţei mai multor factori. In schimb, pătratul deviaţiei standard este aditiv şi este demonstrat de teoria propagării erorilor (vezi cap. 1.5): σ = σi (9.34) i 143

, unde σ i reprezintă deviaţia standard pentru fiecare din cele 3 procese discutate ca influenţând lărgirea zonei moleculelor de analit. Termenul procesului de difuziune obişnuită (σ d ) este definit prin ecuaţia de difuziune a lui Einstein: σd = D t (9.35), în care D este coeficientul de difuziune, iar t reprezintă intervalul de timp în care o moleculă de analit o petrece în faza mobilă şi este dat de relaţia: L t = (9.36) u (L lungimea totală a deplasării, u viteza fazei mobile). De aici rezultă că: D L σ d = (9.37) u Difuzia turbulentă descrie modificarea traseelor (canalelor) şi a vitezei moleculelor de solut în raport cu zona centrală. Aceasta poate fi imaginată prin traseele dintre particulele fazei staţionare prin care se pot mişca moleculele de solut. Dacă o moleculă se găseşte într-un canal rapid aceasta va migra în faţa frontului, iar dacă aceasta se găseşte pe un canal încet, atunci molecula va rămâne în spatele zonei centrale a frontului. Numărul paşilor (notat cu n) pe care molecula îi străbate prin parcurgerea coloanei de lungime L va depinde de diametrul particulelor (notat cu d p ): L n = (9.38) d p Deviaţia standard atribuită acestui proces (σ E ) poate fi derivată din ec. 9.33: L 1/ 1/ σe = dp ( ) = (L dp) (9.39) dp Pentru a evalua efectele de ne-echilibru, referitoare la intervalele de timp în care moleculele de solut se află în una din cele două faze, să considerăm următoarele mărimi cinetice necesare: k 1 viteza de tranziţie a unei molecule de solut din faza mobilă în faza staţionară (adsorbţie); 1/k 1 intervalul de timp pentru ca adsorbţia să aibă loc; k viteza de tranziţie a unei molecule de solut din faza staţionară în faza mobilă (desorbţie); 1/k intervalul de timp pentru ca desorbţia să aibă loc. O moleculă de solut în faza mobilă se mişcă mai repede decât centrul zonei. Viteza zonei va fi δu, n care δ este fracţia de molecule de solut în faza mobilă, iar u este viteza fazei mobile. Prin urmare, (1 - δ) va fi fracţia de molecule din faza staţionară cu o 144

viteză de deplasare 0. Astfel, moleculele de solut se deplasează în faţă sau în spatele zonei centrale la fiecare transfer între faze. Intervalul de timp necesar zonei solutului să se deplaseze prin coloana de lungime L la o viteză δu este: L t = (9.40) δ u Intervalul de timp în care fracţia (1 - δ) de molecule se găseşte în faza staţionară va fi: (1 δ) L t = (9.41) δ u Numărul de desorbţii (n des ) care au loc în acest interval de timp va fi dat de intervalul de timp, dat de relaţia 9.41, împărţit la 1/k : (1 δ) L 1 ndes = (9.4) δ u k Numărul de transferuri interfazic (n) va fi dublu celui de desorbţie: (1 δ) L 1 ndes = (9.43) δ u k In intervalul de timp în care o moleculă de solut este în faza staţionară, zona centrală a frontului solutului se deplasează în faţă cu lungimea de δ u/k. Folosind ec. 9.33 prin substituţia lui l cu δ u/k şi n cu expresia de mai sus, se va obţine deviaţia standard (σ k ) caracteristică procesului de transfer de masă între cele două faze (contribuţia de neechilibru): δ (1 δ) L u 1/ σk = [ ] (9.44) k Această ecuaţie arată că prin creşterea vitezei de curgere u (imprimată de faza mobilă), efectele de ne-echilibru cresc, măsura acestei creşteri fiind dată de σ k. Introducând expresiile lui σ d, σ E şi σ k în rel. 9.34 se obţine expresia: δ (1 δ) 1 σ = L [dp + u + D ] (9.45) k u Martin şi Synge au introdus înălţimea echivalentă a talerului teoretic H, dată de relaţia: σ H = (9.46) L Cu aceasta, expresia lui H devine: 145

δ (1 δ) 1 H = dp + u + D (9.47) k u Minimul înălţimii talerului, H min, se stabileşte din condiţia dh/du = 0 şi conduce la expresia vitezei fazei mobile pentru care valoarea înălţimii talerului teoretic este minimă: k D u = [ ] 1/ (9.48) δ (1 δ) Ecuaţia 9.47 este cunoscută ca ecuaţia van Deemter şi scrisă în forma simplificată: B H = A + + C u (9.49) u Termenul A reprezintă constanta de difuziune turbulentă (datorită neomogentităţii mediului prin care curge faza mobilă), B este constanta difuziei longitudinale, iar C constanta transferului de masă al analitului în faza staţionară. H H min A u optim u (cm/s) Fig. 9.7. Reprezentarea grafică a ecuaţiei van Deemter. Reprezentarea grafică a acestei ecuaţii este dată în figura de mai sus. Din această dependenţă a înălţimii talerului teoretic (H) determinat din mărimi ale separării cromatografice funcţie de viteza fazei mobile (u) se stabileşte valoarea optimă u optim pentru care H este minim, şi prin urmare separarea are o eficienţă maximă. 9.5. Semnificaţia cinetică şi termodinamică a factorului de capacitate Factorul de capacitate pentru un compus i (k i ) este definit ca raportul cantităţilor de analit în faza staţionară şi faza mobilă, la un moment dat. Experimental valoarea sa este stabilită prin măsurarea parametrilor cromatografici de retenţie, daţi de ec. 9.1. Din punct de vedere cinetic, acesta poate fi exprimat de ecuaţia următoare, derivată din 146

definiţia de mai sus: ni,s [i] s Vf.s. k' i = = = Ki φ (9.50) ni,m [i] m Vf.m., în care: n i,s numărul de moli de analit i din faza staţionară; n i,m numărul de moli de analit i din faza mobilă; V f.s. volumul fazei staţionare din coloana cromatografică; V f.m. volumul fazei mobile din coloana cromatografică; ϕ - raportul de volume al celor două faze (V f.s. /V f.m. ); K i constanta de echilibru a partiţie analitului i între faza mobilă şi faza staţionară. Din punct de vedere termodinamic trebuie ţinut cont de relaţia generală a constantei de echilibru K i : K 0 ΔG RT i = e (9.51) ΔG 0 reprezintă variaţia de entalpie liberă standard Gibbs pentru transferul speciei i din faza mobilă în faza staţionară şi la rândul său poate fi scrisă în funcţie de variaţie de entalpie standard (ΔH 0 ) şi variaţia de entropie standard (ΔS 0 ): ΔG 0 0 0 = ΔH T ΔS (9.5) Prin introducerea lui K i şi ΔG 0 în ecuaţia 9.51, urmată de logaritmare rezultă ecuaţia fundamentală în cromatografie, ce descrie dependenţa factorului de capacitate de temperatura la care are loc procesul de retenţie cromatografică (temperatura din coloana cromatografică): ΔS ln k' i = ln φ + R 0 ΔH R 0 1 T (9.53) Prin urmare, factorul de capacitate scade prin creşterea temperaturii coloanei cromatografice. Dependenţa valorii ln k este lineară în raport cu inversul temperaturii absolute, iar ecuaţia de mai sus este cunoscută în literatura de specialitate din domeniu ca ecuaţia van t Hoff. Din regresia ln k ~ 1/T se poate stabili variaţia de entalpie standard ΔH 0 din panta dreptei, iar din intersecţia cu ordonata (T ) se poate determina cu o bună aproximaţie (cunoscând parametrul constructiv ϕ) valoarea variaţiei de entropie standard ΔS 0 a procesului de transfer al analitului din faza mobilă în faza staţionară. 147