4 Predanalytická fáza 22 4 PREDANALYTICKÁ FÁZA Predpokladom dosiahnutia správnych výsledkov analýzy je voľba vhodného postupu analýzy. Všeobecne sa postup analýzy delí na tieto časti: definovanie problému a charakterizácia skúmaného objektu, odber vzorky, uvedenie vzorky do stavu, v ktorom môžeme vzorku analyzovať (úprava vzorky), vlastná analýza (meranie), spracovanie výsledkov (vyhodnotenie experimentu), interpretácia výsledkov a ich využitie na riešenie definovaného problému. Ak aplikujeme tento všeobecný postup analýzy na opis postupu laboratórneho vyšetrenia zistíme, že doba trvania vlastnej analýzy (merania) predstavuje len menšiu časť doby, ktorá obvykle uplynie od ordinovania (vyžiadania) laboratórneho vyšetrenia až po okamih, kedy ošetrujúci lekár dostane výsledok vyšetrenia. Laboratórne vyšetrenie okrem vlastnej analýzy (merania) vyžaduje prípravu pacienta, vlastný odber vzorky, transport odobratej vzorky do laboratória, prípravné práce a skladovanie vzorky pred vykonaním vlastného merania. Súbor všetkých postupov a operácií, ktorými prejde vzorka analyzovaného materiálu od požiadavky na analýzu až do okamihu, kedy je vzorka vložená do meracieho prístroja, sa označuje ako predanalytická fáza. Podobu informácie pre ošetrujúceho lekára dostáva výsledok vyšetrenia v postanalytickej fáze. Vo všetkých troch fázach postupu (predanalytickej, analytickej a postanalytickej) môžu vznikať chyby a môže dochádzať k ovplyvňovaniu výsledkov. Skúsenosti ukazujú, že chybný výsledok alebo jeho nesprávne hodnotenie je omnoho častejšie spôsobené chybami v predanalytickej fáze (zanedbanie, podcenenie vplyvov predanalytickej fázy) než vo fáze analytickej. V predanalytickej fáze môžu výsledok ovplyvniť tieto faktory: vyšetrovaná osoba a jej príprava na odber biologického materiálu, odber, transport a skladovanie biologického materiálu a príprava vzorky na meranie. Vplyv vyšetrovanej osoby je opísaný v kapitole 3, nasledujúci text opisuje problémy súvisiace s prípravou vyšetrovaného na odber, ako aj s odberom, transportom, skladovaním a spracovaním biologických materiálov. 4.1 Príprava vyšetrovanej osoby Príprava vyšetrovanej osoby na laboratórne vyšetrenie môže významne ovplyvniť výsledok vyšetrenia. Pacient by mal byť 30 min pred vlastným odberom v pokoji. Odber sa zvyčajne vykonáva ráno (medzi 6-8 h) nalačno (12 h po poslednej strave, ráno pred odberom konzumovať v malom množstve len vodu alebo neosladený čaj), a pokiaľ je to možné, aj po vysadení liekov na dobu aspoň 24-72 h. Pacient by nemal pred odberom fajčiť, piť kávu ani alkoholické nápoje. Pacient má byť na každý odber pripravený (informovaný o diéte, vysadení liekov a pod). Špeciálne funkčné a záťažové testy si vyžadujú špeciálnu prípravu. Napr. vykonanie záťažového testu na metabolizmus glukózy si vyžaduje splnenie týchto požiadaviek: 3 dni pred testom má strava obsahovať definované množstvo glycidov 250 g/deň, 3 dni pred testom vynechať (pokiaľ je to možné) lieky, 12 h pred vyšetrením nejesť.
4 Predanalytická fáza 23 4.2 Odber, transport a skladovanie biologických materiálov Odber biologického materiálu by mal vykonávať len kvalifikovaný pracovník. Ak si odber robí pacient sám, mal by byť podrobne poučený o vykonaní odberu. Na niektoré materiály sa kladú pri odbere, transporte a ďalšom spracovaní špeciálne požiadavky. Časový interval, v ktorom možno spoľahlivo vykonať analýzu, je pre rôzne analyty rôzny a závisí nielen od vlastností samotného analytu, ale aj od typu biologického materiálu (tab. 4-1). Tento časový interval sa zisťuje experimentálne a označuje sa pojmom stabilita. Stabilita sa kvantitatívne vyjadruje ako čas, kedy sa počiatočný obsah analytu nezmení o viac ako 1,5 násobok referenčného intervalu s pravdepodobnosťou 95 %. Na stanovenie málo stabilných zložiek je zvyčajne potrebné vykonať odber vzorky do nádobky s príslušným ochranným prostriedkom a vzorku dopraviť do laboratória čo najskôr. Tabuľka 4-1 Stabilita niektorých analytov v biologických tekutinách pri rôznych teplotách Analyt Vzorka Stabilita 20-25 o C 4 o C -20 o C Alkalická fosfatáza (ALP) S 4 dni 1 týždeň 2 mesiace α-amyláza S 4 dni 1 týždeň 1 rok α-amyláza U 2 dni 10 dní 3 týždne Aspartátaminotransferáza S 1 týždeň 1 týždeň 3 mesiace Kreatínkináza (CK) S 1 týždeň 1 týždeň 1 mesiac Laktátdehydrogenáza (LD) S/P 1 h 4 dni 2 mesiace Sodík S/P 4 dni 2 týždne 1 rok Draslík S/P 1 h 1 týždeň 1 rok Chloridy S/P 1 deň 1 týždeň roky Vápnik (celkový) S 2 dni 3 týždne 8 mesiacov ph, pco 2, po 2 Krv 15 min nestabilné nestabilné Albumín S 6 dní 3 mesiace 3 mesiace Bilirubín S klesá 1 týždeň 6 mesiacov Glukóza S/P 10 min 1 deň 1 týždeň Močovina S/P 1 deň 1 týždeň 3 mesiace Kreatinín S 2-3 dni 1 týždeň 3 mesiace Kreatinín U 2 dni 6 dní 6 mesiacov Cholesterol S/P 1 týždeň 1 týždeň 3 mesiace S - sérum, P - plazma, U - moč
4 Predanalytická fáza 24 4.2.1 Krv Krv je vhodné odoberať posediačky. Pacient by mal byť 30 min pred odberom v pokoji. Odber venóznej (žilnej) krvi Venózna krv je najvhodnejší druh biologického materiálu, pretože je pomerne ľahko dostupná, je možný odber väčšieho objemu vzorky a riziko technických chýb počas odberu je menšie. U dospelých jedincov sa venózna krv odoberá zo žily lakťovej jamky alebo zo žily na predlaktí, u detí aj zo žíl zápästia, prípadne nohy a u kojencov zo spánkových žíl. Pred vlastným odberom sa paža stiahne elastickým ovínadlom a miesto vpichu ihly sa dezinfikuje (Ajatin, Decidin, 70-80 % alkohol, Septonex). Miesto vpichu nesmie zostať po dezinfekcii vlhké, pretože už stopy dezinfekčného prostriedku vedú k hemolýze séra. Potom sa ovínadlo rýchle uvoľní, aby sa odobrala voľne prúdiaca krv. Po skončení odberu sa ihla zo žily vytiahne, na miesto vpichu sa priloží tampón, ktorý si pacient pritlačí po dobu minimálne 3 min, aby sa nevytvoril krvný hematóm. Ak sa elastické ovínadlo neuvoľní dostatočne rýchlo a cvičenie pažou bolo zbytočne intenzívne, pozoruje sa zvýšenie (ALP, bilirubín, celková bielkovina, hemoglobín, cholesterol) alebo zníženie (glukóza, fosfát, kreatinín) niektorých analytov v krvnom sére. Odber kapilárnej krvi Odber kapilárnej krvi predstavuje jednoduchý spôsob odberu, ale umožňuje získať iba malé objemy vzorky (3-5 kvapiek). Využíva sa predovšetkým u novorodencov a malých detí a na určenie glykémie. Treba si uvedomiť, že hodnoty zistené z kapilárnej krvi sa odlišujú od hodnôt vyšetrených z venóznej krvi. Odber kapilárnej krvi sa robí z dobre prekrveného miesta (bruško prsta, ušný lalôčik, päta) po dezinfekcii miesta vpichu. Na vytvorenie vpichu sa používa sterilná ihla alebo lanceta. Prvá kvapka krvi sa zotrie sterilnou gázou. Na odber sa používa mikropipetka (kapilára), odber je založený na nasávaní do kapiláry pomocou kapilárneho tlaku. Využíva sa hlavne na stanovenie priamo na mieste (pri samokontrole diabetikov sa krv z prsta kvapne priamo na diagnostický prúžok). Tento typ odberu by sa mal uprednostňovať všade tam, kde nie je potrebný väčší objem vzorky. Odberové nádobky Odber krvi a s ním súvisiace prostriedky sa postupne vyvíjajú a zdokonaľujú. Spočiatku sa na odber krvi používali kovové ihly a sklené injekčné striekačky, kedy nebol chránený ani pacient, ani personál a dochádzalo k prenosu rôznych infekčných chorôb. V 70. rokoch sa začali postupne používať jednorazové ihly a striekačky. Obsah striekačky sa preniesol do vopred označenej odberovej skúmavky, čím bol síce chránený pacient, ale riziko pre personál sa v podstate len znížilo. Takto vykonaný odber sa označuje ako otvorený odberový systém, pretože pracovník vykonávajúci odber sa môže priamo dostať do kontaktu s krvou. V 90. rokoch sa aj u nás začal používať uzavretý odberový systém, ktorý kontakt s krvou vylučuje, pretože striekačka plní súčasne aj úlohu odberovej skúmavky. Uzavretý systém teda chráni nielen pacienta, ale aj pracovníka vykonávajúceho odber.
4 Predanalytická fáza 25 Na odber plnej krvi sa používajú dva typy uzavretých systémov. Starší spôsob využíva skúmavku z plastu s objemom 2-10 ml s definovaným vákuom, uzavretú zátkou. Zátka je v strede zoslabená tak, aby ju bolo možné prepichnúť krátkou injekčnou ihlou. Na odber krvi sa používa špeciálna dvojitá odberová ihla, v ktorej má vlastná odberová ihla na druhom konci kratšiu ihlu. Odberová ihla sa zavedie do žily pomocou špeciálneho držiaka, druhou kratšou ihlou sa prepichne zátka vákuovej skúmavky a vákuum nasaje do skúmavky presne definovaný objem krvi (obr. 4-1). Celý systém je určený na jednorazové použitie. Odberová skúmavka Držiak ihly Druhá ihla Vlastná odberová ihla Obr. 4-1 Príklady uzavretých systémov na odber plnej krvi Novší systém využíva špeciálnu plastovú injekčnú striekačku s piestom. Odberová ihla sa zavedie do žily, krv sa nasaje piestom a potom sa piest zalomí (obr. 4-1). Na jednu do žily zavedenú ihlu možno postupne nasadiť ďalšie odberové striekačky. Skúmavky na odber krvi sú už pri výrobe plnené rôznymi aditívami a farebne odlíšené pre ľahšie rozlíšenie zdravotníckym personálom a pre zníženie rizika ich zámeny. Farebné rozlíšenie je zakotvené v príslušnej ISO norme. Pracovník vykonávajúci odber si zvolí farbu striekačky podľa požadovaného druhu vyšetrenia. V tab. 4-2 sú uvedené farby odberových nádobiek podľa ISO. Ako aditíva sa v odberových skúmavkách používajú prostriedky urýchľujúce zrážanie krvi, alebo naopak, prostriedky proti zrážaniu (antikoagulanty), prípadne ďalšie ochranné prostriedky. Tabuľka 4-2 Farebné označenie zátok odberových skúmaviek (BD Vacutainer) Farba Aditívum Použitie Červená bez aditív sérum a imunohematológia Zelená Na/Li heparín (14,3 U/ml) chémia plazmy Levanduľová K 2 /K 3 EDTA (1,5 mg/ml) plná krv a imunohematológia Modrá citran sodný (0,105 mol/l) koagulácia Šedá Na/KF (2,5 mg/ml) + oxalát draselný 2 mg/ml) alebo NaF (1,5 mg/ml) + Na 2 EDTA (3 mg/ml) glukóza
4 Predanalytická fáza 26 Na trhu sú bežne dostupné skúmavky so separačnými inertnými gélmi, ktorých hustota sa volí tak, aby po odstredení krvi vytvorili rozhranie medzi sérom alebo plazmou a krvným koagulom alebo krvinkami a tým napomohli oddeleniu séra alebo plazmy. Separačný gél zabráni vzájomnému ovplyvňovaniu krvných buniek a séra alebo plazmy po odstredení. Takto možno dosiahnuť podstatne vyššiu stabilitu analytov, ktorých koncentrácia je významne ovplyvňovaná kontaktom séra s krvnými bunkami, a preto nie je nutné rýchle oddelenie séra/plazmy od zvyšku krvi. Používanie skúmaviek so separačným gélom prináša značné výhody a v mnohých prípadoch aj znižuje veľkosť predanalytických zmien. Na druhej strane, pri stanovení hormónov, tumorových markerov, liečiv, stopových prvkov a iných, sa pri použití separačných gélov pozorujú nežiaduce efekty. Na niektoré laboratórne vyšetrenia je nutné použiť tzv. nezrážavú krv. Sú to vyšetrenia vykonávané z plnej krvi (acidobázická rovnováha, glykémia, laktát, minerály pomocou iónovoselektívnych elektród), z erytrocytov (glykovaný hemoglobín) alebo z plazmy (fibrinogén, kyslá fosfatáza). V tomto prípade sa používajú skúmavky plnené antikoagulantmi. Jeden typ antikoagulantov sú látky, ktoré vytvárajú vo vzorke komplexy s iónmi vápnika (ióny Ca 2+ v organizme, a teda aj vo vzorke, sú nevyhnutné pre zrážanie krvi). Ako komplexačné činidlá sa používajú sodné alebo draselné soli kyseliny citrónovej, šťaveľovej alebo etyléndiamíntetraoctovej (EDTA). Druhým typom antikoagulantov je heparín, ktorý akceleruje inhibítor krvnej koagulácie (antitrombín III). Heparín sa používa vo forme lítnej, vápenatej alebo amónnej soli. Na odber vzorky na stanovenie glukózy sa vyrábajú špeciálne skúmavky, ktorých náplň stabilizuje glukózu. Glykolýza Koncentrácia glukózy vo vzorke krvi rýchlo klesá, keďže erytrocyty aj po odbere krvi využívajú glukózu ako zdroj svojej energie. Pri teplote okolo 20 o C poklesne koncentrácia glukózy v priebehu dňa o 70 % a na druhý deň obsahuje krv asi 6 % z pôvodnej koncentrácie glukózy. Pri teplote 4 o C poklesne glukóza v plnej krvi v priebehu dňa o 20 % a na druhý deň obsahuje 32 % z pôvodnej koncentrácie. Rýchlosť glykolýzy závisí nielen od teploty, ale aj od vzorky, predovšetkým u novorodencov prebieha veľmi rýchlo. Pretože glykolýza je podmienená prítomnosťou erytrocytov a leukocytov, je nutné oddeliť sérum od krviniek do 30 min a sérum skladovať pri teplote 4 o C, alebo krv konzervovať. Vzorky na stanovenie glukózy v plnej krvi, sére a plazme sa často analyzujú spoločne až po viacerých odberoch, čo je ďalší významný dôvod, aby sa glukóza vo vzorkách stabilizovala. Reakciu glykolýzy (premena glukózy na laktát v organizme človeka) katalyzuje v prvom kroku nešpecifický enzým hexokináza, v nasledujúcich krokoch glykolýzy sa uplatňujú ďalšie enzýmy. Z nich sú pre stabilizáciu glukózy významné dva: glyceraldehyd-3-fosfátdehydro-genáza a enoláza.
4 Predanalytická fáza 27 Stabilizácia glukózy: o Účinok glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy inhibuje prídavok kyseliny monojódoctovej (0,5 mg/1ml plnej krvi), čo je jeden zo spôsobov potlačenia glykolýzy. o Enolázu, ktorá obsahuje v aktívnom centre horčík, inhibuje prídavok fluoridov. Floridy v prítomnosti endogénnych fosforečnanov viažu horčík z enzýmu enoláza do fosfofluoridového komplexu (2 mg Na/KF na 1 ml plnej krvi). Takto stabilizovanú vzorku krvi je možné uchovávať až 24 h pri laboratórnej teplote. o Tretí spôsob stabilizácie glukózy využíva prídavok manózy (15 mmol na 1 l plnej krvi), ktorá pôsobí namiesto glukózy ako alternatívny substrát pre enzým hexokinázu, čím sa predĺži stabilita glukózy až na 12 h pri laboratórnej teplote. V praxi prevažuje použitie NaF. Často sa využíva kombinácia NaF (1,5 mg) a Na 2 EDTA (3 mg) na 1 ml plnej krvi. Ak sa použije zmes NaF a manózy (2 mg obidvoch zložiek na 1 ml krvi), zostane počiatočná koncentrácia glukózy nezmenená minimálne 3 dni pri laboratórnej teplote. Po transporte do laboratória sa stanovuje glukóza buď v plnej krvi, alebo po odstredení v plazme. Hemolýza Normálne sérum a plazma majú byť nažltlé a priehľadné. Červené sfarbenie séra/plazmy poukazuje na hemolýzu (rozpad erytrocytov). Hemolýza ovplyvňuje výsledky najmä v nasledujúcich súvislostiach: z erytrocytov sa do plazmy alebo séra dostáva zvýšené množstvo draslíka, chloridov, ALT, AST, LD a červené sfarbenie hemoglobínu interferuje pri fotometrickom stanovení väčšiny analytov. Problémom je tiež hemolýza, ktorú nie je možné spozorovať vizuálne. Podľa príčiny sa hemolýza delí na: o mechanickú prudká manipulácia so vzorkou, rýchle nasávanie pri odbere, predčasné odstredenie krvi, odstredenie pri vysokých otáčkach, prepravovanie plnej krvi na veľkú vzdialenosť, o osmotickú mokrá skúmavka, o tepelnú krv vystavená mrazu alebo naopak vysokej teplote, o chemickú dezinfekčný prostriedok, ktorý poruší membránu erytrocytov. Aby sa hemolýza neprejavila, je nevyhnutné odstrediť a oddeliť sérum/plazmu od zrazeného krvného koláča (sérum) alebo od krviniek (plazma) optimálne do 30 min, najneskôr do 1 h po odbere. V odberových skúmavkách so separačným gélom, ktorý po odstredení vytvorí rozhranie a tým oddelí sérum/plazmu od zvyšku krvi, je riziko hemolýzy eliminované. Chylózne sérum Ak je v sére vysoká koncentrácia cholesterolu (nad 12 mmol/l) alebo obsahuje rozptýlené tukové kvapôčky, pozoruje sa mliečny zákal a takéto sérum sa označuje ako chylózne (lipemické). V tomto prípade dochádza k ovplyvňovaniu mnohých analytických reakcií (predovšetkým stanovenie katalytickej aktivity enzýmov) a vyšetrenie je potrebné zopakovať po 16 h bez príjmu potravy. Chylózne sérum alebo plazma sú pre väčšinu analýz nevhodné.
4 Predanalytická fáza 28 4.2.2 Moč Moč sa odoberá do sklenej alebo plastovej nádoby. Na vyšetrenie sa obvykle používa moč z jednorazového zberu (vhodný na kvalitatívnu analýzu) alebo zberaný moč (vhodný na kvantitatívnu analýzu), niekedy sa analyzuje moč odobratý cievkovaním. Na vyšetrenie z jednorazového zberu sa odoberie čerstvý moč, najvhodnejší je prvý ranný moč zo stredného prúdu. Na základné fyzikálne a chemické vyšetrenia a na vyšetrenie močového sedimentu je vhodný len nekonzervovaný prvý ranný moč, ktorý bol doručený do laboratória do 1 h po odbere. Inak je potrebné použiť na odber nádobky s konzervačnými prostriedkami (tab. 4-3) a moč vyšetriť do 2 hodín. Tabuľka 4-3 Konzervačné prostriedky na stabilizáciu zložiek v moči Konzervačný prostriedok Použitie na stabilizáciu 5 ml 10 % roztok thymolu v 2-propanole/l moču väčšina prípadov 10 mmol azid sodný/l moču glukóza, močovina, kyselina močová, Na, Ca, oxaláty, citráty 25 ml roztoku 6 mol/l HCl na objem moču za 24 h kyselina 5-hydroxyindoloctová, Ca, Mg, P, katecholamíny 2 g Na 2 CO 3 /l moču porfyríny, urobilinogén 10 mg kyseliny benzoovej (sorbovej)/ 24 h moč glukóza Azid sodný alebo kyselina ε-aminokaprónová na špičku noža na objem moču za 24 h Úprava ph nad 8 prídavkom NaHCO 3 a NaOH elektroforéza a imunoelektroforéza proteínov a paraproteínov kyselina močová Ak sa vyhľadáva cukrovka (screening), potom je vhodné vykonať vyšetrenie v moči odobratom 2 hodiny po sladkom jedle (čaj s 3 kockami cukru). Pri vyšetrení glukózy v moči na lačno by sa u pacientov s poruchou glukózovej tolerancie alebo v počiatočnom štádiu diabetu nemusela glukóza v moči stanoviť. Bilirubín a urobilinogén je potrebné vyšetriť v čerstvom moči ihneď, pretože na svetle a vzduchu sa oxiduje na biliverdín a urobilín. Na kvantitatívne účely (bilančné sledovanie) sa zberá moč v určitom časovom intervale, obvykle je to 3, 6, 12 alebo 24 h moč. Na kvantitatívnu analýzu sa uprednostňuje 24 h (du) zberaný moč, čím sa eliminuje ovplyvnenie výsledku stanovenia spôsobené rôznym objemom vylučovaného moču. Zo stanovenej koncentrácie analytu sa vypočíta jeho denné vylučovanie močom. Zberaný moč sa používa na stanovenie Na +, Ca 2+, Cl -, močoviny, glukózy, mikroalbuminurie, kreatinínu a kreatinínovej clearance. Na stanovenie niektorých zložiek je potrebné moč konzervovať (napr. prídavkom 5 ml 10 % roztoku thymolu v 2-propanole na 1 l moču). 4.2.3 Ďalšie biologické materiály Mozgovomiechový mok (likvor) Likvor sa najčastejšie odoberá lumbálnou punkciou. Vzorku je potrebné dopraviť do laboratória veľmi rýchlo a cytologické aj niektoré biochemické vyšetrenia vykonať najneskôr do 1 hodiny. Ak likvor stojí dlhšie, falošne sa znižuje koncentrácia glukózy a zvyšuje koncentrácia laktátu. Ak
4 Predanalytická fáza 29 sa likvor konzervuje s NaF, možno vykonať chemické vyšetrenie aj na druhý deň. Pre imunochemické vyšetrenie je nevyhnutné likvor stabilizovať prídavkom kyseliny ε-aminokaprónovej. V likvore sa stanovujú bielkoviny, glukóza, chloridy, tzv. elementy v moku a iné. Okrem špeciálnych testov a neurologických vyšetrení sa na analýzu likvoru používajú rutinné analytické metódy. Sliny Valček buničinovej vaty veľkosti asi 3 1 cm sa vloží do úst a žuje asi 1 min. Valček nasiaknutý slinami sa potom vloží do plastovej skúmavky s prederaveným dnom, táto skúmavka sa umiestni do skúmavky a odstreďuje sa 3 min pri 5000 g. Iná možnosť je vložiť do úst štvorček parafínu (3 3 cm) a žuvať 1 min. Potom sa odsatím z úst odpipetuje vzorka slín do skúmavky. Vzorka sa odstreďuje 3 min pri 5000 g. Vylučovanie slín je možné stimulovať kryštálikom kyseliny citrónovej. Takto sa získa asi 0,5-1,5 ml vzorky. Žalúdková šťava Na odber sa zvyčajne používa rtg kontrastná sonda, ktorá sa zavádza nosom a jej poloha sa kontroluje rtg. Žalúdková šťava sa odoberá kontinuálne 60 min (bazálna sekrécia) pred podaním stimulačného prostriedku a v štyroch 15 min intervaloch po podaní stimulačného prostriedku (pentagastrín). Vyšetruje sa krv, ph a kyselina močová. Po správnom odbere je dôležité, aby sa vzorka neznehodnotila následnou manipuláciou, preto je potrebné dodržať niektoré zásady. Pred vložením skúmavky (nádoby) so vzorkou do plastového vrecka sa skontroluje označenie skúmavky, odobraté množstvo, celistvosť a uzavretie skúmaviek a správne vyplnenie žiadaniek. So vzorkami sa manipuluje tak, aby nedochádzalo k traseniu a tým k mechanickej hemolýze. Vzorka krvi sa nesmie vystaviť teplote nad 37 o C a pod 1 o C, priamemu slnečnému svetlu a silnému elektromagnetickému poľu. Na odber, transport, odstreďovanie, dávkovanie a skladovanie ďalších telových tekutín sa tiež používajú rôzne plastové jednorazové uzavreté, v mnohých prípadoch aj sterilné nádoby (skúmavky na moč, kalibrované skúmavky na prípravu močového sedimentu, doštičky a skúmavky na imunoanalýzu, doštičky na určenie krvných skupín a iné). Každú nádobku určenú na odber vzorky je potrebné označiť menom pacienta a ešte pred vlastným odberom meno skontrolovať, čím sa vylúči možnosť zámeny. Výhodné je použiť na identifikáciu pacienta čiarový kód (bar code) alebo dokonca dot-kód, ktorý je vlastne dvojrozmerný čiarový kód umožňujúci uchovávanie veľkého počtu údajov o pacientovi. Konštrukcia väčšiny analyzátorov umožňuje vykonanie analýzy priamo z odberovej nádobky, čím sa podstatne zníži možnosť zámeny alebo kontaminácie.
4 Predanalytická fáza 30 4.3 Príprava vzorky na meranie Súčasný stav inštrumentácie a automatizácie analytických metód výrazne prevyšuje úroveň techník prvotného spracovania a prípravy vzoriek na meranie. Úprava vzorky predstavuje časovo najnáročnejšiu a najprácnejšiu časť analytického postupu a je všeobecne považovaná za faktor, ktorý najvýznamnejšie prispieva k celkovej neistote stanovenia. Ktoré každodenne vykonávané operácie umožňujú znížiť neistotu merania? 1. Použiť primeranú pracovnú techniku Na odmeranie objemu menšieho ako 200 μl použiť mikrostriekačku namiesto pipety. Váženie má lepšiu opakovateľnosť ako meranie objemu, ale je podstatne prácnejšie. Použitie automatického zariadenia na riedenie a dávkovanie roztokov namiesto manuálnych operácií môže významne znížiť rozptyl operácií merania objemu. 2. Použiť veľké objemy S malými objemami sa pracuje zložito, rastie riziko strát analytu. Manipulácia s väčšími objemami je zaťažená menšou chybou. Ak sa napr. použije piestová pipeta umožňujúca odmeriavať objemy od 50 do 250 μl, odmeranie 50 μl je spojené s chybou 7,8 %, ale odmeranie objemu 250 μl s chybou 2,3 %. 3. Minimalizovať počet krokov pracovného postupu Ak je potrebné zriediť vzorku 1000-krát, možno to dosiahnuť odpipetovaním 1 ml do 1 000 ml alebo trikrát zopakovať zriedenie 1 ml do 10 ml. Prvý spôsob riedenia je zaťažený chybou 0,3 % a pre druhý spôsob je chyba 0,6 %. Pri príprave veľkých objemov roztokov treba samozrejme zohľadniť aj ekonomické a ekologické požiadavky, keďže väčšia časť z pripraveného roztoku sa nepoužije na analýzu. 4. Merať referenčný materiál a vzorku za sebou v čo najkratšom časovom intervale Väčšina analytických metód si vyžaduje porovnanie nameraného signálu vzorky a referenčného materiálu. Ak sa vykonajú dve merania za sebou v krátkom časovom intervale, možno predpokladať, že sa meranie uskutočnilo za rovnakých podmienok. 5. Použiť vnútorný štandard Ak sa pridá vnútorný štandard do vzorky aj referenčného materiálu, všetky nasledujúce operácie (predovšetkým meranie objemu), sú menej kritické, keďže chyby sa kompenzujú. 6. Pripraviť syntetickú matricu alebo použiť certifikovaný matricový referenčný materiál Ak vzorka aj referenčný materiál obsahuje tú istú matricu, vplyv matrice napr. na ph, výťažnosť, spoluzrážanie a pod. sa prejaví v obidvoch prípadoch rovnako. 7. Vykonať viac analýz
4 Predanalytická fáza 31 Všeobecné dôvody, pre ktoré je potrebná úprava vzoriek, sú: o uvoľniť analyt z matrice vzorky, o odstrániť zložky matrice, ktoré môžu interferovať s analytom/analytmi, o znížiť medzu stanovenia, o zabezpečiť kompatibilitu vzorky s analytickým systémom, o stabilizovať analyt napr. proti termickej, chemickej a enzymatickej degradácii, o zvýšiť selektivitu a iné. Výber vhodnej techniky úpravy vzorky je ovplyvnený predpokladanou koncentráciou analytu vo vzorke, medzou detekcie použitej analytickej metódy, charakterom matrice (skupenstvo, zloženie) a tiež inštrumentálnymi a finančnými možnosťami laboratória. Úprava klinickej vzorky sa vykonáva až po doručení vzorky do laboratória. Ide predovšetkým o odstreďovanie plnej krvi, odstránenie bielkovín, v špeciálnych prípadoch tiež hydrolýzu, zahusťovanie vzorky (lyofilizácia, gélová filtrácia) alebo mineralizáciu. 4.3.1 Odstreďovanie Odstreďovanie je základná laboratórna metóda, ktorá sa využíva hlavne na oddelenie tuhých častíc z roztokov. Pri odstreďovaní je prirodzená sedimentácia tuhých častíc spôsobená gravitáciou urýchlená použitím odstredivky (centrifúgy). V odstredivke sú skúmavky umiestnené v rotore a pohybujú sa po kruhovej dráhe. Na skúmavky pôsobí odstredivá sila RCS, ktorej hodnota je tým väčšia, čím väčšou rýchlosťou a po dlhšej dráhe sa skúmavky pohybujú. Odstreďovanie sa charakterizuje relatívnou odstredivou silou (RCS, počet g), ktorá sa vypočíta podľa vzťahu: RCS = 1,118 10-5 r n 2, kde RCS udáva, koľkokrát je odstredivé zrýchlenie na dne skúmavky (nádoby) väčšie než gravitačné zrýchlenie g (g = 9,81 m s -2 ), r je kolmá vzdialenosť dna skúmavky od stredu rotora (cm), n je počet otáčok rotora odstredivky za 1 min. Odstredivky s výkyvným rotorom umožňujú vychýlenie skúmaviek až do horizontálnej roviny. Výhodou je, že odstredivá sila pôsobí kolmo ku dnu skúmavky, nevýhodou je nižšia mechanická odolnosť, preto sa zvyčajne dosahuje odstredivá sila do 5 000 g. Tento typ odstrediviek je potom vhodný len na sedimentáciu väčších častíc (bunky). V laboratóriách sa obvykle používajú odstredivky s pevným uhlovým rotorom a dosahujú odstredivú silu 10 000 až 30 000 g, ktorá je dostatočná napr. na rýchlu sedimentáciu zrazených molekúl DNA. Na špeciálne účely sa používajú odstredivky (ultracentrifúgy) dosahujúce RCS až okolo 80 000 g. Podmienky odstreďovania je potrebné špecifikovať minimálne udaním hodnoty RCS (počet g), času a teploty. Pre ľudskú krv sú najvhodnejšie nasledujúce podmienky: doba odstreďovania 5-10 min pri RCS 1 000 až 2 000 g a teplote 18-25 o C. Ak sa použije vyššia hodnota RCS, je potrebné skrátiť
4 Predanalytická fáza 32 časový interval odstreďovania, pretože inak dochádza k hemolýze séra. Pre skúmavky so separačnými gélmi je potrebné zvoliť také podmienky, aby sa vytvorilo dobré rozhranie medzi krvnými elementmi a sérom alebo plazmou. Zvyčajne sa používa vyššia hodnota RCS (1 600 až 2 000 g) a doba odstreďovania 10 min. Pre vyšetrenie močového sedimentu sa používa RCS maximálne do 400 g, inak dochádza k narušeniu rôznych útvarov v moči. 4.3.2 Deproteinácia biologického materiálu Prvým stupňom spracovania biologickej vzorky je často odstránenie/separácia prítomných bielkovín (deproteinácia). Proteíny možno odstrániť precipitáciou zrážadlami, pôsobením enzýmov, ultrafiltráciou alebo dialýzou. Najčastejšie sa používa precipitácia zrážadlami, kedy sa bielkoviny vyzrážajú, zrazenina sa odstredí a po oddelení zrazeniny bielkovín sa analyt stanovuje buď v hornej vrstve (roztok, označuje sa pojmom supernatant), alebo v zrazenine bielkovín. V zrazenine bielkovín sa stanovuje napr. organický fosfor, dusík podľa Kjeldahla. V supernatante sa stanovujú niektoré ióny, substráty, ale aj celkový podiel liečiva. Pri deproteinácii sa musí zohľadniť skutočnosť, že časť liečiva sa vo vzorke nachádza vo voľnej forme a časť je viazaná na bielkoviny. Pri precipitácii zrážadlami alebo denaturáciou pôsobením enzýmov sa uvoľňuje liečivo z väzby na proteíny, preto sa stanoví len celkové množstvo liečiva a informácia o koncentračnom pomere voľné/viazané liečivo sa stratí. Deproteinácia biologického materiálu musí spĺňať tieto podmienky: o kompletné odstránenie proteínov, o ak sa analyt stanovuje v supernatante, samotný precipitát nesmie adsorbovať na svoj povrch analyt, o deproteinačné činidlo nesmie pôsobiť na analyt, ani ovplyvňovať ďalšie pracovné postupy. K denaturácii bielkovín dochádza pri vysokej teplote, extrémnych hodnotách ph, ako výsledok pôsobenia solí ťažkých kovov (reakcia s SH skupinou), organických rozpúšťadiel (zmena polarity prostredia), tenzidov alebo iných denaturačných činidiel (rušia vodíkové a hydrofóbne väzby). V procese denaturácie bielkovín sa menia (strácajú) všetky vyššie štruktúry bielkovín, pričom sa zachováva primárna štruktúra. Denaturácia je nevratný proces. Precipitačná deproteinácia V klinickej chémii sa zvyčajne používa zrážanie bielkovín vo forme nerozpustných solí. Ako zrážadlá sa používajú roztoky kyselín (najčastejšie kyselina trichlóroctová, chloristá, niekedy pikrová, volfrámová, molybdénová, fosforečná a sulfosalicylová). Vo všetkých prípadoch sa získa kyslý supernatant.
4 Predanalytická fáza 33 Ak sa použije kyselina trichlóroctová, získa sa supernatant s hodnotou ph asi 1 a vyzrážanie bielkovín nie je úplné. Kyselina trichlóroctová absorbuje v UV oblasti spektra, supernatant preto nie je vhodný na priame meranie v UV oblasti. Povarením supernatantu možno kyselinu trichlóroctovú rozložiť na prchavé zložky CHCl 3 a CO 2, ale použitie tohto riešenia je limitované stabilitou analytu. Kyselina chloristá poskytuje supernatant, ktorého ph sa blíži k nule. Neutrálny supernatant sa jednoducho pripraví prídavkom draselnej soli a následným odstredením vyzrážaného chloristanu draselného. Supernatant sa môže použiť na priame meranie v UV oblasti spektra. Ani v prípade použitia kyseliny chloristej sa nedosiahne úplné vyzrážanie bielkovín. Kyselina volfrámová je považovaná za najšetrnejšie deproteinačné činidlo, supernatant má ph asi 6. Okrem kyselín sa ako zrážadlá používajú aj rôzne soli. Síran zinočnatý a hydroxid lítny majú veľmi dobrú precipitačnú účinnosť. Supernatant má výsledné ph okolo 7. Z ďalších činidiel je to chlorid ortuťnatý (40 g/l) a volfráman sodný (200 g/l). Veľmi účinný je aj chlorid hlinitý, predovšetkým na stanovenie zásaditých zložiek. Nevýhodou je vysoká koncentrácia solí v supernatante. Na dosiahnutie účinného vyzrážania je potrebné dodržať pomer objemov vzorky a zrážadla a zmes nechať postáť dostatočne dlhý čas a až potom odstrediť (tab. 4-4). Tabuľka 4-4 Podmienky deproteinácie niektorými zrážadlami Precipitačné činidlo Koncentrácia zrážadla v zmesi so vzorkou Doba potrebná na vyzrážanie Kyselina trichlóroctová 2,5-10 % 15 min Kyselina chloristá 1 mol/l 10 min Kyselina volfrámová 0,5 % a 0,016 mol/l H 2 SO 4 10 min Kyselina sulfosalicylová 5-20 % 10 min za chladu Ďalšie účinné deproteinačné činidlá sú organické rozpúšťadlá (metanol, etanol, acetonitril, acetón) pridávané vo vhodnom objeme ku vzorke. Výhodné je miešať vzorku a etanol v pomere (1 : 2). Ak sa použije acetonitril, zložky sa miešajú v pomere vzorka : acetonitril (1 : 1,5); tento postup je vhodný hlavne pre HPLC a GC. Nevýhodou metanolu a acetónu je vysoká absorpcia žiarenia v UV oblasti spektra. Precipitačná účinnosť organických činidiel klesá v poradí acetonitril > acetón > etanol > metanol. Pred deproteináciou je vhodné vzorku najskôr zriediť, čím sa získa jemnejší precipitát a zníži sa adsorpcia analytu na precipitát. Organické rozpúšťadlá sú vhodné predovšetkým pre analyty nestále v kyslých roztokoch. Výhodou pecipitačnej deproteinácie je jednoduchosť a rýchlosť. Nevýhodou sú možné straty analytov spôsobené adsorpciou na vznikajúci precipitát, vplyv silných zrážacích kyselín na stabilitu analytov pri nízkom ph a pod.
4 Predanalytická fáza 34 Enzýmová deproteinácia Deproteináciu možno dosiahnuť pôsobením proteolytických enzýmov (subtilisín, trypsín, papaín, ketodáza) alebo zmesi proteolytických enzýmov. Enzýmová deproteinácia je výhodná predovšetkým v screeningových metódach (liečivá, drogy, toxikológia), kde vzhľadom na širokú paletu možných zlúčenín a nedostatok času, je zložité spresňovať a optimalizovať podmienky deproteinácie, prípadne následnej extrakcie. Ultrafiltrácia Ultrafiltrácia je membránový separačný proces a používa sa na odstránenie makromolekulových zložiek prechodom vzorky cez separačnú membránu umiestnenú v skúmavke. Ultrafiltračné membrány sa pripravujú tak, aby v sebe zadržiavali minimálne množstvo filtrátu a pri opakovanom používaní nevykazovali krížovú kontamináciu. Ďalšou požiadavkou je odolnosť membrán (aj materiálu skúmavky) proti kyselinám, zásadám, alkoholom a možnosť použitia pri zvýšenej teplote. Ultrafiltračné membrány sa na rozdiel od membránových mikrofiltrov vyznačujú anizotropnou štruktúrou, ktorá vďaka asymetrickému usporiadaniu (vrchná vrstva membrány s malými pórmi chráni spodnú vrstvu) bráni makromolekulám vniknúť do vnútornej štruktúry membrány. Veľkosť pórov membrány určuje, ako veľké molekuly budú na membráne zadržiavané (tab. 4-5). Tabuľka 4-5 Membránová separácia v závislosti od veľkosti pórov membrány Veľkosť pórov Metóda Zachytené zložky < 10 nm reverzná osmóza malé molekuly solí 1 10 nm ultrafiltrácia peptidy, proteíny, vírusy M r 500 1 000 000 10 300 nm mikrofiltrácia baktérie Ultrafiltrácia umožňuje zistiť pomer liečiva viazaného na proteíny a voľného liečiva, pretože pri ultrafiltrácii zostáva viazaná forma liečiva spolu s proteínmi na rovnakej strane membrány a roztok, ktorý membránou prechádza, obsahuje len voľné liečivo. Ultrafiltrácia je vhodná napr. na: o stanovenie liečiv, ktoré nie sú naviazané na proteíny, ale pred vlastnou analýzou je potrebné ich od proteínov oddeliť, o stanovenie voľného podielu liečiva z celkového množstva liečiva, ktorého druhý podiel je viazaný na proteíny. Ak sa má stanoviť pomer voľného a viazaného liečiva, je potrebné buď najskôr stanoviť celkové množstvo liečiva, alebo vo zvyšku na membráne stanoviť množstvo zachyteného liečiva. Výhodou ultrafiltrácie je rýchlosť procesu a malá spotreba vzorky. Hlavnou nevýhodou je riziko naviazania analytu na membránu.
4 Predanalytická fáza 35 Dialýza Dialýza je separácia analytu od matrice difúziou cez polopriepustnú membránu (separácia molekúl podľa ich veľkosti). Difúzia je samovoľný pomalý proces a je riadená koncentračným gradientom až do ustálenia rovnováhy. Ak sa vzorka nachádza na tzv. donorovej strane membrány, analyty difundujú cez póry membrány do tzv. akceptornej časti v dôsledku existencie koncentračného gradientu. Počet molekúl prechádzajúcich cez membránu za jednotku času (tok), závisí od hodnoty tohto koncentračného gradientu a od mnohých iných parametrov (teplota, plocha a hrúbka membrány, difúzny koeficient analytu a rozmery analytu v porovnaní s veľkosťou pórov membrány). Tieto parametre je potrebné optimalizovať tak, aby sa dosiahla maximálna hodnota toku a tiež vysoká výťažnosť analytu. Z tohto hľadiska je potrebné použiť vhodne konštruovaný dialyzačný blok a vybrať vhodnú membránu. Iným dôležitým faktorom vplývajúcim na veľkosť toku sú rozmery pórov alebo presnejšie, keďže v membráne sa nachádzajú póry rôznej veľkosti, je to distribúcia pórov rôznej veľkosti. Membrána sa zvyčajne charakterizuje hodnotou MWCO (molecular weight cut-off), ktorá je definovaná ako molová hmotnosť najmenšej zložky, ktorú membrána zadrží na viac ako 90 %. Pre každú aplikáciu je potrebné vybrať membránu s vhodnou hodnotou MWCO, aby interferujúce zložky boli dostatočne zadržiavané a aby sa súčasne dosiahol dostatočne rýchly transport molekúl analytu. V mnohých prípadoch je hlavným cieľom dialýzy zadržať proteíny a iné veľké biopolyméry. Pre tieto aplikácie sa používajú membrány s MWCO 10 000-15 000, keďže umožňujú efektívne odstránenie interferujúcich makromolekúl a dávkovanie viac ako 1 000 biologických vzoriek bez poškodenia membrány. Dialyzačnú jednotku možno pomerne jednoducho spojiť s LC (obr. 4-2). vzorka donor donor membrána akceptor pumpa akceptor predkolónka detektor pumpa LC kolóna Obr. 4-2 On-line dialýza spojená s LC a detailný pohľad na dialyzačný blok Na stopovú analýzu sa takmer vždy používa kontinuálna dialýza, kedy vzorka kontinuálne prúdi v donorovej časti, analyt sa z akceptornej časti vymýva a zachytáva na predkolónke. Po určitom čase sa analyt z predkolónky vymyje a následne nadávkuje do LC systému. Keďže sú komerčne
4 Predanalytická fáza 36 dostupné rôzne typy predkolóniek, je pomerne jednoduché prispôsobiť zakoncentračnú časť systému požiadavkám vyplývajúcim z vlastností analytov. Vo väčšine prípadov sú analyty dostatočne hydrofóbne a na ich zakoncentráciu možno použiť predkolónku naplnenú s C8 alebo C18 fázou. V medicínskej analýze sa on-line dialýza v spojení s LC využíva hlavne na stanovenie liečiv v krvnom sére a plazme, menšia pozornosť sa venuje stanoveniu endogénnych zložiek. Značná pozornosť sa venuje aj využitiu na stanovenie voľného podielu liečiva v plazme. V tomto prípade sa používa rovnovážna dialýza (roztok v donorovej aj akceptornej časti je statický) v modifikovanej dialyzačnej jednotke (štyrikrát väčšia donorová časť). Pri rovnovážnom usporiadaní dialýzy sa rovnováha liečivo proteín významne nezmení a získajú sa výsledky prakticky totožné s výsledkami stanovenia voľného podielu liečiva ultrafiltráciou. Dialýza sa používa aj na stanovenie liečiv v plnej krvi. Účinnosť dialýzy plnej krvi je podobná ako pri dialýze séra alebo plazmy (bunkový materiál z plnej krvi nekomplikuje dialýzu). 4.3.3 Hydrolýza konjugátov V organizme prechádzajú látky endogénneho aj exogénneho pôvodu zložitým systémom biotransformácie. V prvej fáze biotransformácie dochádza k zavedeniu hydroxy-, amino- alebo sulfhydrylovej skupiny do štruktúry látky, v druhej fáze potom ku konjugácii tejto skupiny s polárnymi kyselinami, napr. kyselinou glukuronovou, sírovou, octovou, benzoovou a tiež fosforečnou a aminokyselinami. Najviac sú však zastúpené konjugáty s kyselinou glukuronovou glukuronidy a sírovou sulfáty. Príslušné konjugáty zvyšujú polaritu pôvodnej zlúčeniny, a tým aj jej rozpustnosť v polárnom biologickom prostredí, čo má za následok zrýchlenie vylučovania močom. Konjugáty sú významné predovšetkým v moči, kde sa prevažná väčšina metabolitov (napr. liečiv) nachádza vo forme dobre rozpustných konjugátov. Stanovenie nekonjugovaných (voľných) a konjugovaných (viazaných) foriem liečiva v moči poskytuje možnosť komplexného vysvetlenia ich účinku. Pri stanovení je potrebné zohľadniť typ konjugátu a podľa stability väzby voliť podmienky delenia nekonjugovaných foriem od príslušných konjugátov. Rozštiepenie konjugátov možno dosiahnuť kyslou alebo enzýmovou hydrolýzou. Kyslá hydrolýza Rozštiepenie konjugátov je možné dosiahnuť použitím silných anorganických kyselín, pričom sa uvoľnia príslušné pôvodné zlúčeniny, prípadne aj metabolity, ktoré vznikli v prvej fáze metabolizmu. Na hydrolýzu sa používajú silné anorganické kyseliny, najčastejšie je to koncentrovaná HCl. Kyselina sírová nie je vhodná, pretože reakciou vznikajú farebné produkty. Pri orientačných toxikologických metódach sa postupuje tak, že k 1 dielu moču sa pridá 1 diel koncentrovanej HCl a zmes sa intenzívne povarí v skúmavke po dobu 5 min. Pre kvantitatívne účely sa k 1 ml moču pridá 1 ml koncentrovanej HCl a varí sa 20 min pod spätným chladičom. Po ochladení sa analyt zvyčajne vyextrahuje do vhodného organického rozpúšťadla. Extrakciu možno dosiahnuť už v priebehu hydrolýzy. V tomto prípade sa pridá do reakčnej zmesi ešte 10 ml extrakčného organického činidla a postupuje sa rovnakým spôsobom. Po
4 Predanalytická fáza 37 ochladení sa organická fáza oddelí, odparí a odparok sa rozpustí v presne známom množstve vhodného rozpúšťadla. Takto možno dosiahnuť nielen hydrolýzu konjugátov, ale aj prečistenie a zakoncentráciu analytu, čím sa zjednoduší ďalší analytický postup. Enzýmová hydrolýza Ako štiepiaci enzým pre glukuronidy sa používa β-glukuronidáza. Aktivita enzýmu β- glukuronidáza závisí od hodnoty ph prostredia, pričom optimálne hodnoty ph sú rozdielne pre enzým získaný z rôznych zdrojov (optimálne ph pre enzým získaný z baktérií E. coli je v intervale 5,0 až 7,5). Sulfáty sa štiepia enzýmom sulfatáza, ktorá optimálne účinkuje v intervale ph 5 až 7. Enzým β-glukuronidáza v skutočnosti obsahuje aj aktívnu sulfatázu (zo surovín použitých na prípravu β-glukuronidázy), preto štiepi nielen glukuronidy, ale aj sulfáty. Výhodou enzýmovej hydrolýzy je špecifický mechanizmus štiepenia, reakciou nevznikajú rušivé produkty (napr. pôsobením HCl často vznikajú chlórderiváty). Inkubácia vzorky s enzýmom sa zvyčajne vykonáva pri laboratórnej teplote po dobu 12 až 24 h. Dobu hydrolýzy možno výrazne skrátiť použitím koncentrovanejšieho roztoku enzýmu alebo zvýšením teploty. Napr. moč sa inkubuje s enzýmom 2 h pri teplote 60 o C. 4.3.4 Mineralizácia Mineralizácia sa bežne používa predovšetkým pri stanovení celkového dusíka podľa Kjeldahla. Kjeldahlova metóda, založená na mineralizácii organickej vzorky v kyseline sírovej za prítomnosti solí zvyšujúcich bod varu a katalyzátorov, je referenčná metóda na stanovenie celkového dusíka. Okrem toho je mineralizácia vzorky potrebná len v špeciálnych aplikáciách (napr. stanovenie kovov v kvapalných a tuhých biologických vzorkách, toxikologický screening). Predanalytická fáza je a zrejme aj zostane najväčším zdrojom chýb, preto je potrebné venovať tomuto problému zvýšenú pozornosť a využívať dostupné prostriedky, ktoré umožňujú minimalizovať zmeny v predanalytickej fáze (napr. zvyšovať kvalifikácie pracovníkov vykonávajúcich odber formou kurzov a vzdelávacích programov, zabezpečiť pracovníkom prístup k informáciám o zmenách analytov v predanalytickej fáze, ktoré sa nepretržite zhromažďujú v rôznych databázach a informačných systémoch, používať priame identifikovanie laboratórnych vzoriek, automatizovať a štandardizovať predanalytickú fázu, vykonávať kontrolu dodržiavania zásad predanalytickej fázy v ordináciách a laboratóriách).
4 Predanalytická fáza 38 Kontrolné otázky Vysvetlite pojem predanalytická fáza. Vymenujte hlavné pravidlá pre odber plnej krvi. Vymenujte druhy vzoriek moču a ich využitie. Vymenujte druhy antikoagulantov pre plnú krv a vysvetlite mechanizmus účinku. Vysvetlite pojem glykolýza a uveďte spôsoby jej zníženia. Vysvetlite ako vzniká hemolýza a ako ovplyvňuje zloženie séra a plazmy. Vysvetlite pojem chylózne sérum. Uveďte aké je využitie odstreďovania v klinickej chémii a aké sú podmienky odstreďovania krvi a moču. Uveďte činidlá, ktoré sa používajú pri precipitačnej deproteinácii. Aké sú výhody a nevýhody tohto spôsobu odstraňovania bielkovín. Uveďte príklady využitia ultrafiltrácie a jej výhody. Vymenujte faktory, ktoré vplývajú na výťažok dialýzy a príklady využitia dialýzy. Opíšte techniky, ktoré sa využívajú na hydrolýzu konjugátov liečiv.