ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Αναλυτική Μέθοδος- Αναλυτικό Πρόβλημα. Ανάλυση, Προσδιορισμός και Μέτρηση. Πρωτόκολλο. Ευαισθησία Μεθόδου. Εκλεκτικότητα. Όριο ανίχνευσης (limit of detection, LOD). Όριο ποσοτικοποίησης (limit of quantification). Επικύρωση μεθόδων.
ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ- ΠΟΡΕΙΑ- ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Αναλυτική Μέθοδος (Analytical Method): Χρησιμοποίηση μιας αναλυτικής τεχνικής (εφαρμογή φυσικοχημικού φαινομένου, π.χ. απορρόφηση ακτινοβολίας, διαχωρισμός συστατικών λόγω κατανομής σε δύο φάσεις) για τον ποιοτικό ή/και ποσοτικό προσδιορισμό μιας ουσίας ή μιας ομάδας ουσιών σε ένα συγκεκριμένο δείγμα. Παράδειγμα: Προσδιορισμός υπολειμμάτων φυτοφαρμάκων σε ελαιόλαδο, Προσδιορισμός επιπέδων παρακεταμόλης (Depon) στο αίμα ασθενούς. Πορεία (procedure): Γενική περιγραφή σταδίων για την εκτέλεση της μεθόδου. Πρωτόκολλο (protocol): Λεπτομερής περιγραφή της πορείας μιας συγκεκριμένης ανάλυσης (περιλαμβάνει π.χ. Τις ποσότητες των αντιδραστηρίων που απαιτούνται, χρόνοι εκτέλεσης διαφόρων διαδικασιών, κ.λ.π.).
ΑΝΑΛΥΤΙΚΟ ΠΡΟΒΛΗΜΑ, ΑΝΑΛΥΣΗ, ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΜΕΤΡΗΣΗ Αναλυτικό Πρόβλημα (Analytical Problem): Είναι το σύνολο των ερωτημάτων που απευθύνονται στα Εργαστήρια Ελέγχου (π.χ. «ποιά/ ποιες ουσίες βρίσκονται στο δείγμα», «ποια η συγκέντρωση των ουσιών», κ.λ.π.). Ανάλυση (analysis): Εφαρμογή μιας ή περισσοτέρων μεθόδων σε ένα συγκεκριμένο δείγμα για την επίλυση ενός αναλυτικού προβλήματος. Ο όρος «ανάλυση» αναφέρεται ΜΟΝΟ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑ. Δηλαδή: «Το δείγμα αναλύεται». Αντίθετα, οι ουσίες «προσδιορίζονται». Οι ουσίες που προσδιορίζονται ονομάζονται και «αναλύτες» (analytes). Μέτρηση (measurement): Εισαγωγή του δείγματος στο όργανο και λήψη του αναλυτικού σήματος.
ΠΟΡΕΙΑ ΕΠΙΛΥΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΥ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΟΣ Επιλογή μεθόδου χημικής ανάλυσης. Βελτιστοποίηση, επαλήθευση και επικύρωση μεθόδου. Δειγματοληψία- Συντήρηση δείγματος- Προκατεργασία. Μέτρηση φυσικής/ φυσικοχημικής παραμέτρου (σήματος). Συλλογή δεδομένων- Στατιστική επεξεργασία μετρήσεων. Μετατροπή σήματος σε αναλυτική πληροφορία (επιλογή κατάλληλης μεθόδου ποσοτικοποίησης). Παροχή τελικής πληροφορίας στον πελάτη/ χρήστη/ ασθενή.
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Συνήθως τα χαρακτηριστικά ποιότητας μιας μεθόδου αναφέρονται στο σύνολο των σταδίων της μεθόδου. Ορισμένα χαρακτηριστικά όμως μπορούν να αφορούν και στα επί μέρους στάδια. Ακρίβεια (accuracy). (Βλέπε «Στατιστικές Έννοιες»). Πιστότητα (precision). (Βλέπε «Στατιστικές Έννοιες»). Όριο ανίχνευσης (limit of detection, LOD). Όριο ποσοτικοποίησης (limit of quantification, LOQ). Ευαισθησία (sensitivity). Γραμμική περιοχή (linearity). Εκλεκτικότητα.
ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ, ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΓΡΑΜΜΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ Ευαισθησία: Εκφράζει την μεταβολή τυ σήματος προς την μεταβολή της συγκέντρωσης του αναλύτη. Έχει μονάδες σήματος/ συγκέντρωση. Η ευαισθησία εκφράζεται από την κλίση (slope) της καμπύλης αναφοράς. Γραμμική Περιοχή: Η περιοχή συγκεντρώσεων της ουσίας για την οποία υπάρχει γραμμική σχέση σήματος/ συγκέντρωσης. Αποδεικνύεται με οπτική εξέταση του σχετικού διαγράμματος και αξιολογείται με στατιστικές τεχνικές. Γραμμική δυναμική περιοχή: Η περιοχή στην οποία η ευαιθησία έχει σταθερή τιμή. Εκλεκτικότητα (ειδικότητα): Εκφράζει την έλλειψη παρεμπόδισης στον προσδιορισμό των ουσιών σε ένα δείγμα από άλλα συστατικά του δείγματος. Μια μέθοδος είναι εκλεκτική όταν δίνει ορθά αναλυτικά αποτελέσματα για τις επιμέρους ουσίες του δείγματος χωρίς να υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ τους.
ΟΡΙΟ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ (LIMIT OF DETECTION) Σφάλμα 1 ου είδους: Να θεωρηθεί πως υπάρχει ουσία ενώ δεν υπάρχει. Σφάλμα 2 ου είδους: Να θεωρηθεί πως δεν υπάρχει η ουσία ενώ υπάρχει.
ΟΡΙΟ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ Αποτελεί την ελάχιστη συγκέντρωση μιας ουσίας που μπορεί να ανιχνευθεί με έναν καθοριμένο βαθμό βεβαιότητας. Το όριο ανίχνευσης εκφράζει την ικανότητα της μεθόδου να διακρίνει το σήμα που οφείλεται στον αναλύτη από το σήμα του θορύβου. Στατιστικά το όριο ανίχνευσης αποτελεί την συγκέντρωση που αντιστοιχεί σε ένα ελάχιστο σήμα που μπορεί με αξιοπιστία (1-α) να θεωρηθεί πως προέρχεται από τον αναλύτη. Το α είναι η πιθανότητα σφάλματος πρώτου είδους. Το όριο ανίχνευσης είναι η συγκέντρωση του αναλύτη για την οποία το σήμα του οργάνου διαφέρει από το σήμα του λευκού δείγματος (blank) κατά 3 ή 3.3 φορές (δηλώνεται) την τυπική απόκλιση του σήματος του λευκού. Η τιμή 3.3 αντιστοιχεί σε 0.05% πιθανότητα σφάλματος πρώτου είδους. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η τιμή 3 που αντιστοιχεί σε 0.13% πιθανότητα σφάλματος πρώτου είδους.
ΤΡΟΠΟΙ ΕΥΡΕΣΗΣ ΤΟΥ ΟΡΙΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ Με βάση την τυπική απόκλιση λευκού δείγματος ή δείγματος χαμηλής συγκέντρωσης και την κλιση της καμπύλης αναφοράς. Σήμα που αντιστοιχεί στo όριο ανίχνευσης= Σήμα λευκού + 3.3 (ή 3) s. Όριο ανίχνευσης= (3.3 s)/ κλίση. Με βάση τον λόγο (σήμα/ θόρυβος). Συγκρίνονται σήματα λευκού δείγματος (blank) και δειγμάτων χαμηλών συγκεντρώσεων. Το όριο ανίχνευσης αντιστοιχεί σε λόγο (σήμα/ θόρυβος) 3 ή 3.3 (δηλώνεται). Η μέθοδος επιλέγεται όταν υπάρχει υψηλός θόρυβος. Ανάλυση σειράς δειγμάτων. Κατασκευή διαγράμματος τυπικής απόκλισης σε σχέση με την συγκέντρωση (συνήθως η σχέση είναι γραμμική) και υπολογισμός της τομής με προέκταση (αντιστοιχεί σε τυπική απόκλιση μηδενικής συγκέντρωσης). Από την τυπική απόκλιση της τομής της καμπύλης αναφοράς για χαμηλές συγκεντρώσεις. Χρειάζεται επιβεβαίωση. Από την τυπική απόκλιση των υπολοίπων της καμπύλης αναφοράς για χαμηλές συγκεντρώσεις. Χρειάζεται επιβεβαίωση.
ΟΡΙΟ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ (LIMIT OF QUANTIFICATION, LOQ) Όριο ποσοτικοποίησης είναι η συγκέντρωση του αναλύτη για την οποία το σήμα του οργάνου διαφέρει από το σήμα του λευκού δείγματος (blank) κατά 10 φορές την τυπική απόκλιση του σήματος του λευκού. Το LOQ εκφράζει την ικανότητα της μεθόδου να ποσοτικοποιεί χαμηλές συγκεντρώσεις του αναλύτη.
ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΗ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Περιοχή στην οποία το σήμα του αναλύτη δεν διακρίνεται από τον θόρυβο και επομένως η ανίχνευση του αναλύτη ΔΕΝ είναι δυνατή (C < LOD). Στην περίπτωση αυτή η παρουσίαση του αποτελέσματος δίνεται ως C < LOD (διευκρινίζουμε τιμή και μονάδες συγκέντρωσης). Περιοχή στην οποία το σήμα του αναλύτη διακρίνεται αξιόπιστα από τον θόρυβο και, επομένως, η ανίχνευση του είναι δυνατή. Ωστόσο, επειδή η διαφορά μεταξύ θορύβου και σήματος δεν είναι μεγάλη, δεν μπορούμε να δώσουμε αξιόπιστη ποσοτική τιμή (LOD < C < LOQ). Στην περίπτωση αυτή γράφουμε πως ανιχνεύεται ο αναλύτης, αλλά έχει τιμή < LOQ (διευκρινίζουμε τιμή- μονάδες). Περιοχή στην οποία το σήμα διακρίνεται ξεκάθαρα από τον θόρυβο και επομένως μπορούμε να προχωρήσουμε σε υπολογισμό της συγκέντρωσης. ΜΟΝΟ αν η συγκέντρωση είναι μεγαλύτερη από LOQ «έχουμε δικαίωμα» να δώσουμε αριθμητική τιμή.
ΟΡΙΟ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ- ΟΡΙΟ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΙ ΘΟΡΥΒΟΣ
ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΚΑΙ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Επικύρωση (Validation): Αξιολόγηση των χαρακτηριστικών ποιότητας της μεθόδου μέσω πειραματικής διαδικασίας και εξέταση της ανταπόκρισης της μεθόδου προς συγκεκριμένες προδιαγραφές (specifications) προκειμένου να αποδειχθεί πως η μέθοδος είναι κατάλληλη για τον σκοπό που προορίζεται (fitness for purpose). Επαλήθευση (verification): Επιβεβαίωση μέσω πειράματος πως μια επικυρωμένη μέθοδος που έχει χαρακτηριστεί ως κατάλληλη για τον σκοπό που επιλέχθηκε και διαθέτει συγκεκριμένα χαρακτηριστικά ποιότητας όταν εφαρμόζεται στο εργαστήριο εξακολουθεί να ανταποκρίνεται προς τις απαιτούμενες προδιαγραφές.
ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Επικυρώνονται: Μη πρότυπες μέθοδοι. Μέθοδοι που αναπτύσσονται στο Εργαστήριο. Πρότυπες μέθοδοι που όμως χρησιμοποιούνται για άλλες εφαρμογές. Πρότυπες μέθοδοι που έχουν τροποποιηθεί. Τρόποι επικύρωσης: Χρήση Πρότυπων Υλικών Αναφοράς (Certified Reference Materials, CRMs): Ομοιογενή υλικά, των οποίων μια ή περισσότερες ιδιότητες έχουν πιστοποιηθεί από Οργανισμό Πιστοποίησης και συνοδεύεται από έγκυρο πιστοποιητικό. Χρήση υλικών αναφοράς (reference materials). Σύγκριση αποτελεσμάτων με άλλες πρότυπες μεθόδους αναφοράς. Διεργαστηριακές συγκρίσεις.
ΟΡΘΗ ΧΡΗΣΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Ίδια μήτρα (matrix) και συγκέντρωση αναλύτη. Χρήση σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή του υλικού. Καθορισμός ελάχιστης ποσότητας πρότυπου υλικού που θα υποβληθεί στην δοκιμή. Σωστή θερμοκρασία διατήρησης (-20 o C, 4 o C, 18 o C). Αξιολόγηση πρόσληψης υγρασίας από το πρότυπο υλικό στις συνθήκες φύλαξης του (π.χ. ανάπτυξη μικροβιακής ενεργότητας. Ημερομηνία λήξης.
ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΕΙΔΗ ΛΕΥΚΩΝ Ανάκτηση κατά τον εμβολιασμό του δείγματος: Ανάλυση αρχικού δείγματος, προσθήκη γνωστής ποσότητας του αναλύτη στο δείγμα και ανάλυση του εμβολιασμένου δείγματος. Παράδειγμα: Αρχικό δείγμα: συγκέντρωση 10 μg/l, εμβολιασμός 5 μg/l, ανάλυση εμβολιασμένου δείγματος: 14.5 μg/l. Ανάκτηση εμβολιασμού: 4.5/ 5= 0.9 ή 90%. Πολλές φορές η ανάκτηση επηρεάζεται από τα συστατικά της μήτρας του δείγματος. Μήτρα= Οτιδήποτε άλλο υπάρχει στο δείγμα εκτός της υπό προσδιορισμό ουσίας. Λευκό: Εκτιμάται η παρουσία παρεμποδίσεων που προέρχονται από προσμίξεις στο δείγμα και ίχνη του αναλύτη στα αντιδραστήρια. Είδη λευκού: α) Λευκό μεθόδου: Δείγμα που περιέχει όλα τα συστατικά εκτός τον αναλύτη και έχει προέρχεται από όλα τα στάδια της αναλυτικής διαδικασίας. β) Λευκό αντιδραστήριο: Δεν έχει εκτεθεί σε όλες τις διαδικασίες προετοιμασίας του δείγματος. Λευκό πεδίου: Έχει εκτεθεί στο περιβάλλον του σημείου δειγματοληψίας.
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ: ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΩΝ (Ι) Κανονισμός SANCO 10684/ 2009 Ο κανονισμός αυτός αναφέρεται στην επικύρωση των αναλυτικών μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό υπολειμμάτων φυτοφαρμάκων σε διάφορα προϊόντα (π.χ. λάδι, φρούτα). Επίσης δίνει και διάφορες άλλες οδηγίες για χειρισμό δειγμάτων (π.χ. άμεση μεταφορά του δείγματος στο εργαστήριο (εντός 1 ημέρας), απαιτήσεις προτύπων διαλυμάτων, κ.λ.π. Η επικύρωση των αναλυτικών μεθόδων πραγματοποιείται με εμβολιασμένα (spiked) δείγματα στο μητρικό υλικό που πρόκειται να αναλυθεί (π.χ. ελαιόλαδο, φρούτα). Ποιοτικός προσδιορισμός: Το όριο ανίχνευσης (LOD) της μεθόδου ορίζεται ως η μικρότερη συγκέντρωση, κατά την οποία το φυτοφάρμακο ανιχνεύεται τουλάχιστον στο 95% των δειγμάτων.
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ: ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΩΝ (ΙΙ) Κανονισμός SANCO 10684/ 2009 Ποσοτικός προσδιορισμός: Οι αναλυτικές μέθοδοι εξετάζονται ως προς την ευαισθησία τους, την μέση ανάκτηση (μέτρο ακρίβειας ή ύπαρξης συστηματικού σφάλματος), την πιστότητα (επαναληψιμότητα) και το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ). Κάθε δείγμα αναλύεται 5 φορές για να ελεγχθεί για να ελεγχθεί η πιστότητα στα επίπεδα του ορίου αναφοράς και τουλάχιστον σε ένα ανώτερο επίπεδο (συνήθως το ανώτατο επιτρεπτό όριο Maximum Residue Limit). Το LOQ της μεθόδου ορίζεται ως η μικρότερη συγκέντρωση φυτοφαρμάκου που παρουσιάζει μέση ανάκτηση από 70% έως 120% και RSD 20%. Μόνο σε περιπτώσεις χαμηλής αλλά σταθερής ανάκτησης μπορεί να γίνουν αποδεκτές και ανακτήσεις κάτω του 70%.