TO LTR TOY ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΤ ΕΝΔΟΓΕΝΟΤ ΡΕΣΡΟΙΟΤ - Κ (HERV-K) HML-2 ΚΑΙ Η ΕΚΦΡΑΗ ΣΟΤ CD4 ΤΠΟΔΟΧΕΑ Ε HIV-ΜΟΛΤΜΕΝΕ ΚΤΣΣΑΡΟΕΙΡΕ

Transcript

1 Σιμοκράτθσ Καραμιτροσ, PhD Μεταδιδακτορικόσ Ερευνθτισ Εργαςτιριο Εφαρμοςμζνθσ & Εξελικτικισ Ιολογίασ Πανεπιςτιμιο τθσ Οξφόρδθσ TO LTR TOY ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΤ ΕΝΔΟΓΕΝΟΤ ΡΕΣΡΟΙΟΤ - Κ (HERV-K) HML-2 ΚΑΙ Η ΕΚΦΡΑΗ ΣΟΤ CD4 ΤΠΟΔΟΧΕΑ Ε HIV-ΜΟΛΤΜΕΝΕ ΚΤΣΣΑΡΟΕΙΡΕ

2 Ενδογενείσ Ρετροιοί Σο ανκρϊπινο γονιδίωμα περιλαμβάνει ενδογενι ρετροϊικά ςτοιχεία (ERVs) θ πλειονότθτα των οποίων είναι ανενεργά λόγω ςυςςϊρευςθσ μεταλλαγϊν. 5-8% του γονιδιϊματοσ καταλαμβάνεται από αυτά τα ςτοιχεία που ζχουν ειςβάλει ςτο DNA μασ μετά απο επιτυχι μόλυνςθ των γενετικϊν κυττάρων των προγόνων μασ. Μζςω γενετικοφ αναςυνδυαςμοφ οι κωδικοποιοφςεσ περιοχζσ του ιοφ αποκόπτονται αφινοντασ μόνο μία εκ των "μακρϊν τελικϊν επαναλιψεων" (LTRs). Περιςςότερα από 1000 "solo LTRs" του HERV-K HML2 υπάρχουν ςτο ανκρϊπινο γονιδίωμα. Σα LTRs περιζχουν ρυκμιςτικζσ αλλθλουχίεσ και ζχουν τθν δυνατότθτα να επθρεάηουν τθν ζκφραςθ γειτονικϊν γονιδίων.

3 Ενδογενείσ Ρετροϊοί Ειςαγωγι Μζκοδοι Αποτελζςματα υμπεράςματα

4 HERV_K and HIV interaction. Ειςαγωγι Μζκοδοι Αποτελζςματα υμπεράςματα

5 HIV and HERVK up-regulation..? Contreras-Galindo, R. et al. A new Real-Time-RT-PCR for quantitation of human endogenous retroviruses type K (HERV-K) RNA load in plasma samples: increased HERV-K RNA titers in HIV-1 patients with HAART non-suppressive regimens. J Virol Methods 136, 51 57, doi: /j.jviromet (2006). Contreras-Galindo, R., Lopez, P., Velez, R. & Yamamura, Y. HIV-1 infection increases the expression of human endogenous retroviruses type K (HERV-K) in vitro. AIDS Res Hum Retroviruses 23, , doi: /aid (2007). Laderoute, M. P. et al. The replicative activity of human endogenous retrovirus K102 (HERV-K102) with HIV viremia. AIDS 21, , doi: /QAD.0b013e3282f14d64 (2007). Contreras-Galindo, R. et al. Human endogenous retrovirus K (HML-2) elements in the plasma of people with lymphoma and breast cancer. J Virol 82, , doi: /jvi (2008).

6

7 Bhardwaj, N., Maldarelli, F., Mellors, J. & Coffin, J. M. HIV-1 infection leads to increased transcription of human endogenous retrovirus HERV-K (HML-2) proviruses in vivo but not to increased virion production. J Virol 88, Garrison, K. E. et al. T cell responses to human endogenous retroviruses in HIV-1 infection. Plos Pathog 3, e165, doi: / journal.ppat (2007). Tandon, R. et al. Identification of human endogenous retrovirus-specific T cell responses in vertically HIV-1-infected subjects. J Virol 85, , doi: /jvi (2011).

8

9 Ο HIV ρυκμίηει αρνθτικά τον υποδοχζα CD4 μετά τθν είςοδό του ςτο κφτταρο ξενιςτι μζςω των πρωτεϊνϊν Nef, Vpu και Env Mark Harris, Current Biology, 1999

10 (Protein-protein interaction)

11 H Tat πρωτείνθ ρυκμίηει αρνθτικά τον CD4 μζςω μζςω NFkB και mir222 Tat NFkB mir222 CD4 mrna CD4 m-rna levels Orecchini et al. RNA Biol. 2014

12 CD4 mrna (mir222-mrna interaction)

13 CD4 gene? CD4 mrna

14 dthdfghdfghdgfhdgfh Ειςαγωγι Μζκοδοι Αποτελζςματα υμπεράςματα

15

16 Εξϊνιο 1 Εςϊνιο Εξϊνιο 2 Εξϊνιο 5 CD4 κφριο Μετάγραφο (mrna) Solo LTR HERV-K HML2

17

18 Σχεδιαςμόσ: Διαφορικι ανάλυςθ γονιδιακισ ζκφραςθσ ςε κυτταροςειρζσ (jurkats) μολυςμζνεσ με HIV-1 ςε ςφγκριςθ με αρνθτικοφσ μάρτυρεσ (μθ μολυςμζνεσ κυτταροςειρζσ θ μολυςμζνεσ με UVαπενεργοποιθμζνο ΗΙV-1) Δεδομζνα RNAseq Illumina HiSeq 2000 genome analyser (100bp, paired-end reads) 1) HIV-infected vs. Mock-infected or HIV1-UV-inactivated (3 replicates per sample, ~5GB each) 2) HIV-infected vs. not-infected (WT) (2 replicates per sample, ~90GB each)

19 Καταςκευι «pseudo-reference» : παράκυρα μικουσ 160 bp με κζντρο τα ςθμεία που εντοπίηονται ακριβώσ ςτα ςθμεία ζνωςθσ εςωνίου-εξωνίου και εςωνίου-ltr (start / end) τοίχιςθ (alignment) των RNAseq reads (length 90bp) ςτο «pseudo-reference» Coverage quantitative analysis

20 Early splicing Normal splicing Late splicing CD4 κφριο Μετάγραφο (mrna) Solo LTR HERV-K HML2

21 est_counts Ειςαγωγι Μζκοδοι Αποτελζςματα υμπεράςματα To κφριο mrna του CD4 υποδοχζα ρυκμίηεται αρνθτικά μετά από τθν μόλυνςθ των κυτταροςειρϊν με HIV1. ENST status infected uninfected 400 HIV_24hr_rep1 HIV_24hr_rep2 HIV_24hr_rep3 mock_24hr_rep1 sample mock_24hr_rep3 UV_24hr_rep1 UV_24hr_rep3

22 Normalised reads on LTR junctions ratio of transcripts HIV/mock UV HIV infected mock/uv LTR 5' (end) LTR 3' (start) early normal late

23 Ειςαγωγι Μζκοδοι Αποτελζςματα Συμπεράςματα - Τπάρχει αρνθτικι ρφκμιςθ του CD4 mrna κατά τθν HIV μόλυνςθ κυττάρων jurkats (CD4+ T λεμφοκφτταρα) - Τπάρχει ταυτόχρονθ κετικι ρφκμιςθ των «early-spliced» mrnas του CD4 - Τπάρχει ταυτόχρονθ κετικι ρφκμιςθ τθσ μεταγραφικισ ενεργότθτασ του ΗΕRV-K LTR ιδιαίτερα ςτο αριςτερό άκρο, που αντιςτοιχεί ςτο τζλοσ του LTR - H παραγωγι αντίρροπων πλιρωσ ςυμπλθρωματικϊν mrna υπο τθν κακοδιγθςθ του LTR ειναι πικανό να επθρεάηει τα επίπεδα του CD4 mrna είτε άμεςα, είτε ζμμεςα μζςω τθσ απορρφκμιςθσ του μθχανιςμοφ εναλλακτικοφ ματίςματοσ.

24 υνεργάτεσ: Καραμιτροσ Σιμοκράτθσ 1,, Παραςκευισ Δθμιτριοσ 2, Χατηάκθσ Άγγελοσ 2, Μαγιορκίνθσ Γκίκασ Πανεπιςτιμιο τθσ Οξφόρδθσ, Εργαςτιριο Εφαρμοςμζνθσ & Εξελικτικισ Ιολογίασ 2. Εκνικό και Καποδιςτριακό Πανεπιςτιμιο Ακθνϊν, Ιατρικι χολι, Εργαςτιριο Τγιεινισ Επιδθμιολογίασ και Ιατρικισ τατιςτικισ ασ ευχαριςτϊ για τθν προςοχι ςασ