Η Σημασία της Μοριακής Βιολογίας στη Διάγνωση των Λοιμώξεων. Αιμιλία Στ. Χατζηγιάννη Αναπλ. Καθ. Βιοπαθολογίας- Κλινικής Μικροβιολογίας

Transcript

1 Η Σημασία της Μοριακής Βιολογίας στη Διάγνωση των Λοιμώξεων Αιμιλία Στ. Χατζηγιάννη Αναπλ. Καθ. Βιοπαθολογίας- Κλινικής Μικροβιολογίας

2 Σημασία Διάγνωσης Λοιμώξεων Στοχευμένη, έγκαιρη θεραπεία Περιορισμός μετάδοσης Μείωση κατάχρησης αντιβιοτικών Μείωση ανάπτυξης στελεχών με αντοχή Μείωση χρόνου νοσηλείας Επιδημιολογία

3 Συνήθεις Εξετάσεις Κλινικής Μικροβιολογίας Σκοπός: να γίνει ο παθογόνος οργανισμός ορατός και μετρήσιμος Καλλιέργεια Μικροσκόπηση Φαινότυπος Αντιγόνα Αντισώματα Ανοσολογική αντίδραση

4 Καλλιέργεια - Μειονεκτήματα Χρονοβόρα διαδικασία Mύκητες, μυκοβακτήρια Ειδικά θρεπτικά υλικά Δεν αφορά όλα τα παθογόνα Κυτταροκαλλιέργειες για ιούς «Εκλεκτικά» - fastidious μικρόβια ( HACEK) (Haemophilus, Aggregatibacter (previously Actinobacillus), Cardiobacterium, Eikenella corrodens, Kingella) Σωστή λήψη δείγματος Μεταφορά Βιώσιμα παθογόνα

5 Μοριακή Βιολογία Μοναδικότητα γονιδιώματος κάθε οργανισμού Η επιστήμη της Μοριακή Βιολογίας έχει αναπτύξει μεθόδους μεγάλης ευαισθησίας και ειδικότητας με τις οποίες μπορεί να ανιχνευτεί (ποιοτικά) να χαρακτηριστεί (γονοτυπικά) και να μετρηθεί η ποσότητα οποιασδήποτε γνωστής (ή και άγνωστης) αλληλουχίας πυρηνικών οξέων

6 Μοριακή Διάγνωση στις Λοιμώξεις Ταχεία ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών Από καλλιέργεια Σε κλινικά δείγματα Και μετά από έναρξη αγωγής Όλα τα παθογόνα DNA και RNA

7 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Μόριο DNA Αποδιάταξη DNA (90 ο ) Σύνδεση ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων Εκκινητές (primers) (50 ο ) Σύνθεση καινούργιου συμπληρωματικού DNA Θερμοάντοχη DNA πολυμεράση (72 o )

8

9 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ (REAL TIME) REAL-TIME

10 Ευαισθησία PCR

11 Sequensing- Αλληλούχηση

12 Υβριδισμός

13 Εφαρμογές Μοριακών Εξετάσεις στις Λοιμώξεις Ανεύρεση νέων παθογόνων Ανίχνευση συγκεκριμένου παθογόνου Ποιοτική εξέταση (+/-): διάγνωση Ανίχνευση γονιδίων που οδηγούν σε αντοχή κατάλληλη θεραπεία Ποσοτικός προσδιορισμός ενεργότητα, ανταπόκριση και παρακολούθηση θεραπείας Τυποποίηση: Πολυμορφισμοί, μεταλλαγές, γονότυποι

14 Κλινική Σημασία Σε λοιμογόνους οργανισμούς που είναι: Σε εξαιρετικά μικρή ποσότητα Δεν καλλιεργούνται ή καλλιεργούνται δύσκολα σε ειδικές συνθήκες Επικίνδυνη καλλιέργεια Σε περιπτώσεις που είναι σημαντική: Η ταχύτητα Ευαισθησία Ειδικότητα

15 Πεδίο Ιολογία Διάγνωση Παραδείγματα Εφαρμογών Παραδείγματα Herpes simplex virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, varicella zoster virus, human herpes virus type 6, 7, 8. Ιοί αναπνευστικού(influenza virus, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, adenovirus, rhinovirus), SARS-CoV, avian influenza virus. HIV, hepatitis B, hepatitis C, human papilloma virus, enterovirus,orf virus, rotavirus, norovirus, enteric adenoviruses Βακτηριολογία C. trachomatis, N. gonorrhoeae, B. pertussis, M. tuberculosis, nontuberculous mycobacteria, T. whipplei, B. henselae, genital mycoplasmata, C. burnettii M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella spp., N. meningitidis, S. pneumoniae Παρασιτολογία Μυκολογία - Μυκοβακτήρια Plasmodium spp., T. gondii P. jiroveci, Aspergillus spp., ΜΤΒ

16 Ειδικές Εφαρμογές Εξέταση Ιικό Φορτίο Ιικός Γονότυπος Ιική Αντοχή Λοίμωξη Cytomegalovirus, Epstein-Barr virus hepatitis B, hepatitis C, HIV HIV, hepatitis B, hepatitis C, human papillomavirus Βακτηριακή Αντοχή MRSA, VRE, ESBL E. coli, K. pneumoniae, M. tuberculosis Βακτηριακός γονότυπος Ευρέως φάσματος PCR M. tuberculosis, N. meningitidis Ενδοκαρδίτιδα, Μηνιγγίτιδα

17 Πλεονέκτημα - Ταχύτητα Απάντηση σε σύντομο χρονικό διάστημα από τη λήψη του δείγματος Δεν «χάνεται» ο ασθενής Έγκαιρη κατάλληλη θεραπεία ασθενούς Εντόπιση θεραπεία άλλων ασθενών ή φορέων (π.χ. συντρόφων) Περιορισμός μετάδοσης

18 Παράδειγμα - Κοινές Λοιμώξεις

19 Κλασσική Διάγνωση Χρονοβόρα Παράδειγμα - Μυκοβακτηρίδια Μεγάλη επώαση καλλιεργειών (3-4 εβδομάδες) Φαινοτυπική ποικιλομορφία Δύσκολη απομόνωση από βιολογικά υγρά όπως ΕΝΥ, πλευριτικό και περικαρδιακό Σημαντικός αριθμός παθογόνων μυκοβακτηριδίων εκτός ΤΒ (HIV και άλλου τύπου ανοσοκαταστολή)

20 Μικροσκοπική εξέταση παρασκευασμάτων Ευαισθησία: 10 4 / ml πτυέλου Ειδικότητα: δεν αναγνωρίζεται το είδος

21 Καλλιέργεια Καλλιέργεια 3-6 εβδομάδες Βιοχημική ταυτοποίηση 3-6 εβδομάδες Θρ. Υλικά Middlebrook's medium (άγαρ) Lowenstein-Jensen medium (αυγό) περιέχουν ανασταλτές για περιορισμό επιμολύνσεων

22 ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ (TB) Ταχεία και αξιόπιστη διάγνωση άμεση θεραπεία (Π.Ο.Υ. συνιστά συνδυασμό 3 ή 4 φαρμάκων για τουλάχιστον 6 μήνες: ισονιαζίδη, ριφαμπικίνη, πυραζιναμίδη, ριφαπεντίνη, αιθαμβουτόλη) απομόνωση του ασθενούς (Δημόσια Υγεία) έλεγχος περιβάλλοντος του ασθενούς (προφυλακτική αγωγή) 1985: παγκόσμια της συχνότητας πολυανθεκτικά στελέχη (MDR) - INH και RIF 2006: XDR [ extensively drug resistant ]

23 Αντοχή

24 Μοριακή Διάγνωση Φυματίωσης Στόχος 16S rrna M. tuberculosis Ευαισθησία μεγαλύτερη σε θετικά (99%) από αρνητικά για οξεάντοχα βακτηρίδια δείγματα (46%) ΟΧΙ για αποκλεισμό νόσου Η ειδικότητα υψηλή για πνευμονική και εξωπνευμονική φυματίωση >98% Επιβεβαίωση κλινικής υποψίας Κατάλληλος τρόπος ανίχνευσης αντοχής στη φαρμακευτική αγωγή - ισονιαζίδη, ριφαμπικίνη (katg, inha, ahpc rpob)

25 ΝΑΑΤ για Φυματίωση Ευαισθησία: 10 4 / ml AFB smear (+) : Θετική προγνωστική αξία μεγαλύτερη (>95%) σε συνθήκες όπου είναι συχνά τα NTM (non tuberculous mycobacteria) Σε αρνητική NAAT, προσοχή ανασταλτέςεπανάληψη AFB smear ( ) : Ταχεία επιβεβαίωση M.tb σε 50-80% AFB smearnegative/culture-positive Σε αρνητική NAAΤ και καλλιέργεια ελάχιστη πιθανότητα TB OXI στην παρακολούθηση αγωγής

26 Amplification microarray flow cell genotyping of MDR and wild-type M. tuberculosis samples (250 pg and 15 pg). Wild-type to mutant probe ratios <1 (bold, shaded) indicate a mutation at the designated position within the gene(s) of interest. Microarrays 2012, 1, ; doi: /microarrays

27 Πλεονέκτημα Ανίχνευση μη Βιώσιμων Μικροοργανισμών Γυναίκα 55 ετών με γενικευμένη λεμφαδενοπάθεια (λέμφωμα??) υπόκειται σε βιοψία λεμφαδένα: κυτταρομετρία ροής και ιστολογική εξέταση (μονιμοποίηση ). Δεν έγινε καλλιέργεια CD4:CD8 = 0.1, HIV + Ιστολογικά: κοκκίωμα με οξεάντοχα βακτήρια M avium / intracellulare complex (MAI) - αντιβίωση clarithromycin- ethambutol- rifampin PCR στο μπλοκ παραφίνης: Mycobacterium tuberculosis complex University of Washington Molecular Diagnosis Microbiology Section

28 Πλεονέκτημα- Ευαισθησία Ενδοκυττάριοι οργανισμοί (Ιοί, Μυκόπλασμα, Χλαμύδια) Χαμηλή ευαισθησία καλλιέργειας (Neisseria) Δύσκολη ή αδύνατη καλλιέργεια Bartonella spp., Coxiella burmetti, Brucella spp., Legionella spp., Tropheryma whipplei

29 Ιολογία Η μεγαλύτερη συμβολή της Μοριακής Διάγνωσης Κυτταροκαλλιέργειες τεχνικά δύσκολες- χρονοβόρεςχαμηλής ευαισθησίας PCR - Ανίχνευση σε όλα τα βιολογικά υλικά Ποσοτικά (ιικό φορτίο)/γονοτύπωση (πρόγνωσηαντοχή) Μέθοδος αναφοράς: Ερπητική (HSV), από εντεροϊούς (EV) μηνιγγοεγκεφαλίτιδα, Ηπατίτιδα C, Λοίμωξη από HPV «Νέοι» ιοί

30 Use of High-Throughput DNA Pyrosequencing for Pathogen Discovery deaths (fatal encephalitis) three patients recently received visceral-organ transplants from a single donor Whitley R. N Engl J Med 2008 Νέος arenavirus «Νέοι ιοί» Παραδείγματα 1988 HEV 1989 HCV 1995 HHV hmpv 2003 SARS Co 2010 MERS-- CoV 2014 Bourbon virus

31 ENY - Λοιμώξεις Κεντρικού Νευρικού Συστήματος Σημαντική συμβολή της μοριακής διάγνωσης κυρίως στη γρήγορη ανίχνευση ιών αλλά και μικροβιακών παθογόνων στο ΕΝΥ ENY φυσιολογικά στείρο μικροβίων Τυπικά λοιμώξεις μονομικροβιακές Ανασταλτές σε μικρές συγκεντρώσεις Λιγότερα ψευδώς αρνητικά και ψευδώς θετικά Παραμένει ευαίσθητη και μετά την έναρξη αγωγής ΕΝΥ ΕΡΥΘΡΑ ΙΣΤΟΙ - ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗ

32 Etiology Common pathogens (eg, Strep pneumo, Haemophilus) When inclusion of NAT is indicated Gram stain +, culture - / prior tx Preferred testing method(s) Gram stain and culture Fastidious organisms When clinically suspected Serology, NAT +/ culture Mycobacterium tuberculosis When clinically suspected AFB stain, culture, and NAT Arboviruses When clinically suspected Serology and NAT Cytomegalovirus (CMV) When clinically suspected NAT, preferably quantitative Epstein Barr Virus (EBV) When clinically suspected Serology and NAT quantitative Enteroviruses When clinically suspected NAT Human herpesvirus 6 (HHV-6) When clinically suspected NAT, preferably quantitative Herpes simplex virus (HSV) When clinically suspected NAT Parechoviruses Primarily in young children (<5 y) 2017 UpToDate Varicella-zoster virus When clinically suspected NAT NAT

33 Είδη Μοριακών Εξετάσεων ΕΝΥ Targeted nucleic acid detection Συγκεκριμένα παθογόνα Multiplex (πολυπλεκτική) ή panel-based ΝΑΤ Ταυτόχρονη ανίχνευση παθογόνων 2015 πρώτη εγκεκριμένη από FDA εμπορική multiplex NAT για ΕΝΥ ανίχνευση και ταυτοποίηση 14 βακτήρια, ιοί και μύκητες (Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus agalactiae (ie, group B Streptococcus), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, enterovirus, herpes simplex virus 1 (HSV-1), herpes simplex virus 2 (HSV-2), varicella-zoster virus (VZV), cytomegalovirus (CMV), human herpesvirus 6 (HHV-6), human parechovirus, Cryptococcus neoformans/gattii Next-generation sequencing

34 Μοριακή εξέταση και αξιολόγηση αποτελεσμάτων με την προ της εξέτασης πιθανότητα λοίμωξης ΕΝΥ Αύξηση λευκοκυττάρων Πρωτεΐνη Tang YW et al. Clin Infect Dis. 1999, Simko JP et al. Clin Infect Dis. 2002, Davies NW et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry, CSF PCR 13 HSV +: όλα WBC/Pr WBC/Pr - : όλα PCR

35 Κλινική Σημασία Το αρνητικό αποτέλεσμα της PCR σε υψηλή κλινική υποψία πρέπει να χρησιμοποιείται με μεγάλη προσοχή Συχνά επιμόλυνση από αίμα μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά ή και θετικά αποτελέσματα Σε υψηλή κλινική υποψία όταν η PCR είναι θετική η προγνωστική της αξία φτάνει το 99% ενώ αν είναι αρνητική η πιθανότητα αυτής της διάγνωσης είναι περίπου 6% (Αναστολείς - αίμα, βακτηρίδια) Ελαττώνεται ο χρόνος νοσηλείας των ασθενών κατά 1,2-2,8 ημέρες

36 CMV - Ανοσολογική ανεπάρκεια- Μεταμόσχευση Tο συχνότερο μετά από μεταμόσχευση παθογόνο Ποσοτικός προσδιορισμός για έγκαιρη διάγνωση της νόσου Η συχνότητα του μοριακού ελέγχου σχετίζεται με τον κίνδυνο του κάθε ασθενή για την λοίμωξη (ορολογικό προφίλ δότη και λήπτη) Δείκτης για τερματισμό της θεραπείας ή έναρξης προφυλακτικής αγωγής

37 CMV Ιικό Φορτίο (CMV DNΑ) Η αξιολόγηση πολύπλοκη: παράγοντες που αφορούν ιό -ασθενή - μέθοδο Οι μετρήσεις δεν είναι συγκρίσιμες μεταξύ διαφορετικών τεχνικών Στον ίδιο ασθενή: ίδια μέθοδος - ίδιος τύπος δείγματος (ολικό αίμα ή πλάσμα) Σημαντική συνήθως θεωρείται η αύξηση x 3-5 Μετά από μεταμόσχευση η τάση αύξησης ιαιμίας είναι πιο σημαντικός δείκτης από την τιμή εκτός αν αυτή είναι πολύ υψηλή Σε έναρξη θεραπείας έλεγχος ιαιμίας εκείνη την μέρα (σε ενεργό νόσο οι τιμές αλλάζουν γρήγορα). Επανέλεγχος σε μεσοδιαστήματα 5 έως 7 ημερών. Σταθερές τιμές ή αύξηση - γονοτυπική αντοχή?

38 Αντοχή σε αντιικά φάρμακα Οργανισμός Αντοχή Γονίδιο HSV Acyclovir Thymidine kinase CMV Ganciclovir Φωσφοτρανσφ/ση, DNA πολυμεράση HIV RT inh, protease inh RT, πρωτεάση HBV Nucleot/side analogues πολυμεράση

39 Χαμηλές τιμές ιαιμίας Συχνές και πολλές φορές άνευ κλινικής σημασίας <1000 copies/ml Σε CMV αμφιβληστροειδίτιδα ή σε συμμετοχή του γαστρεντερικού, το ιικό φορτίο έχει χαμηλή προγνωστική αξία

40 Λοιμώξεις Αναπνευστικού Viruses Adenovirus Coronavirus 229E Coronavirus HKU1 Coronavirus OC43 Coronavirus NL63 Human Metapneumovirus Human Rhinovirus/Enterovi rus Influenza A Influenza A/H1 Influenza A/H Influenza A/H3 Influenza B Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Parainfluenza 4 RSV Bacteria Bordetella pertussis Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae FilmArray Respiratory Panel

41 PCR γρίπη Ποιος εξετάζεται με μοριακές μεθόδους?

42 Όταν δεν υπάρχουν κρούσματα στην κοινότητα δε σημαίνει απαραίτητα ότι ο ασθενής είναι μολυσματικός Σε περιόδους επίπτωσης Σε νοσηλευόμενους, με νόσο κατωτέρου αναπνευστικού, όταν δεν έχει βρεθεί άλλη αιτία, και υπάρχει υποψία γρίπης, πρέπει να γίνεται επανέλεγχος σε νέο δείγμα και αντιική θεραπεία να ξεκινά ή να συνεχίζεται Ψευδώς Αρνητικά Συλλογή χειρισμός δείγματος. Χρόνος από έναρξη συμπτωμάτων

43 Σήψη Καλλιέργειες αίματος - ανεπαρκής μέθοδος αναφοράς Χρόνος 1-5 μέρες Χαμηλή ευαισθησία στην κλινική σήψη Φαγοκυττάρωση Παρουσία παθογόνων μόνο στην εστία λοίμωξης Πολύ μικρός αριθμός κυκλοφορούντων μικροβίων Δύσκολα αναπτυσσόμενοι (Haemophilus, Actinobacillus, Cardiobacterium) ή μη καλλιεργούμενοι μικροοργανισμοί (Bartonella, Coxiella burnetii, Tropheryma whipplei) Έναρξη αντιβιοτικής αγωγής πριν την λήψη του αίματος Ψευδώς θετικά 5-50% ανάλογα τρόπου συλλογής δείγματος Εμπειρική αντιμικροβιακή αγωγή δύσκολη διαχείριση (step down)

44 O. Opota, K. Jaton, G. Greub, Clinical Microbiology and Infection, Volume 21, Issue 4, 2015,

45

46 Συμφωνία μεταξύ multiplex PCR και καλλιέργειας αίματος κυμαίνεται από 55-85% Η κλινική σημασία των θετικών μόνο με PCR δειγμάτων, με αρνητικές καλλιέργειες για τον ίδιο μικροοργανισμό και από άλλα σημεία δύσκολο να εκτιμηθεί Οι μοριακές εξετάσεις δεν αντικαθιστούν κ/α Συμπληρωματική αξία

47 ΜΔ - ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Πλεονεκτήματα σε σχέση με κλασσικές μεθόδους (όταν υπάρχουν) Ταχύτητα Ευαισθησία Ειδικότητα Ποσοτικός προσδιορισμός Οικονομικές σε μεγάλο όγκο δειγμάτων και μεγάλη οικονομία εκεί που το αποτέλεσμα μειώνει τη νοσηλεία, βοηθά στη διάγνωση και στην κατάλληλη θεραπεία

48 Pitfalls Δειγματοληψία Μεταφορά Φύλαξη Ψευδώς θετικά Ψευδώς αρνητικά

49 Επίπτωση στη Δημόσια Υγεία

50