Fluorimetrija. Molekulska emisiona spektroskopija u UV i vidljivoj oblasti

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Fluorimetrija. Molekulska emisiona spektroskopija u UV i vidljivoj oblasti"

Ξένα Βονόρτας
6 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Fluorimetrija Molekulska emisiona spektroskopija u UV i vidljivoj oblasti

2 Molekulska spektroskopija APSORPCIONA Vidljiva UV IR EMISIONA Fluorimetrija

3 Rastvori koji pod UV svetlošću fluoresciraju u vidljivoj oblasti

4 UVOD - LUMINESCENCIJA fenomen u kome se supstanca pobuđuje nekom vrstom spoljašnje energije, a zatim se apsorbovana energija emituje u formi svetlosti; svetlost ne podrazumeva samo elektromagnetne talase u vidljivoj oblasti, već i u bliskoj UV i bliskoj IR. Fenomen se pominje 1500 godina pre n.e. (svici); Aristotel, 4. vek pre n.e. (ribe); Termin luminescenca (lat. lumen - svetlost) je prvi uveo nemački naučnik Wiedemann godine, kao zajednički naziv za fluorescencu i fosforescencu.

kod koga je prvi put uočen kratki sjaj nakon

5 UVOD FLUORESCENCIJA Reč fluorescenca je uvedena da opiše pojavu karakterističnu za mineral fluorit (CaF2), kod koga je prvi put uočen kratki sjaj nakon ultraljubičaste ekscitacije; traje koliko i ozračivanje (osvetljavanje)

6 UVOD FOSFORESCENCIJA fosforescenca se odnosila na dugotrajnu emisiju koja može trajati i satima nakon prestanka pobuđivanja; traje i posle osvetljavanja.

7 Fluorimetrija pobuđivanje elektrona supstance osvetljavanjem fotonima visoke energije analitički značajno kada emitovano zračenje ima nižu energiju od upadnog zračenja FLUORESCENCIJA emitovana svetlost ima veće talasne dužine od apsorbovane ukoliko je talasna dužina emitovana svetlosti jednaka talasnoj dužini apsorbovane REZONANTNA FLUORESCENCIJA

8 Fluorescencija jedan od mehanizama kojim se molekul može vratiti iz pobuđenog u osnovno stanje predstavlja vrstu emisionog zračenja apsorpcija i emisija dešavaju se u kratkom vremenskom periodu (μs) ako se emisija javlja posle dužeg vremenskog perioda (nekoliko sekundi do nekoliko meseci) FOSFORESCENCIJA

9 Apsorpcija i fluorescencija

10 Kako pobuđeni molekul oslobađa apsorbovanu energiju? Neradijacioni prelazi emituje se toplota Radijacioni prelazi - emituje se svetlost

11 RADIJACIONI PROCESI odavanje energije emisijom fotona Fluorescencija emisija koja nastaje prelazom iz osnovnog vibracionog nivoa pobuđenog stanja na bilo koji vibracioni nivo osnovnog stanaja Rezonantna fluorescencija talasna dužina emitovane svetlosti ista kao λ apsorbovanog zračenja (nije analitički značajna)

12 NERADIJACIONI PROCESI odavanje energije u vidu toplote Vibraciona relaksacija Odigrava se prilikom sudara molekula u pobuđenom stanju sa molekulima okoline. Vrlo efikasan proces-prosečno trajanje ekscitovanog vibracionog stanja je oko s Unutrašnja konverzija Prelaz sa ekscitovanog elektronskog stanja na osnovno stanje. Manje efikasan proces s.

13 KARAKTERISTIKE FLUORESCENCIJE Emisiono zračenje je manje energije (većih λ) u odnosu na absorbovano zračenje.

14 Apsorpcioni i fluorescentni spektar (skoro kao predmet i lik u ogledalu)

Karakteristike fluorescentnog zračenja Frekvencija fluorescentnog zračenja ne zavisi od frekvencije absorbovanog zračenja već od strukture molekula

15 Karakteristike fluorescentnog zračenja Frekvencija fluorescentnog zračenja ne zavisi od frekvencije absorbovanog zračenja već od strukture molekula Vreme trajanja fluorescencije je određeno trajanjem pobuđenog stanja ( s). Fluorescencija prestaje odmah po uklanjanju izvora pobuđivanja

16 Fluorofore Teoretski sve supstance koje apsorbuju UV i VIS bi mogle da fluoresciraju Većina, ipak, ne fluorescira, jer imaju strukturu koja omogućava neradijativne (brže) puteve relaksacije Fluorofore su grupe atoma ili molekuli odgovorni za pojavu fluorescencije

sposobnost fluoresciranja mogu se obeležavati fluorescirajućim agensima ili

17 Jedinjenja koja mogu da fluoresciraju Nezasićena jedinjenja Konjugovana jedinjenja Policiklični aromatični ugljovodonici Jedinjenja koja nemaju sposobnost fluoresciranja mogu se obeležavati fluorescirajućim agensima ili podvrgnuti hemijskim reakcijama u kojima će se dobiti njihovi fluorescirajući derivati

18 Fluorimetar

19 Fluorimetar

20 Osnovni delovi fluorimetra izvor zračenja primarni (ekscitacioni) monohromator uzorak sekundarni (emisioni) monohromator detektor Pravac upadnog (ekscitacionog) i emitovanog (emisionog) zračenja je pod uglom od 90 o To omogućava osvetljavanje detektora samo emitovanom svetlošću (ne upadnom ili reflektovanom sa uzorka).

21 IZVORI ZRAČENJA ( nm) Lampe (deuterijumova, vodonična) Ksenonska lampa daje intenzivan, relativno kontinualan spektar između 200 i 800 nm LED diode Laseri

22 Kvarcne kivete

23 Monohromatori Filtri Prizme Resetke Koriste se dva monohromatora za pobudjivanje (primarni) i emisiju (sekundarni)

24 Detektori fotocev

25 Detektori fotomultiplikator

26 INTEZITET FLUORESCENCIJE (I F ) I F =Ф F I a = Ф F (I 0 -I P ) Ф F koeficijent fluorescencije I a - intezitet apsorbovanog zračenja I 0 - intezitet upadnog zračenja I P - intezitet propuštenog zračenja

27 INTEZITET FLUORESCENCIJE (I F ) Koristeći Lambert-Berov zakon dobijamo I F =Ф F I 0 (1-I P /I 0 )= Ф F I 0 (1-e -εcb ) ε-molarna apsortivnost(dm 3 mol -1 cm -1 ) c-koncentracija (mol dm -3 ) b- debljina sloja (cm)

28 Za razblažene rastvore (εbc <0.05 mol/l) I F =2,3Ф F I 0 εbc Koristi se u kvantitativnoj analizi Postoji linearna zavisnost između inteziteta flourescencije i koncentracije pri niskim vrednostima koncentracije

29 Uticaj temperature Sa porastom temperature opada fluorescencija-povećanje broja sudara favorizuje neradijativne procese Merenja na sobnoj temperaturi

Interferencije Uticaj rastvarača jako polarni rastvarači mogu intenzivirati spektar ako grade vodonične veze- smanjenje emisije (do gašenja spektra), viskozni rastvarači-

30 Interferencije Uticaj rastvarača jako polarni rastvarači mogu intenzivirati spektar ako grade vodonične veze- smanjenje emisije (do gašenja spektra), viskozni rastvarači- povećanje intenziteta Uticaj koncentracije niske koncentracije - linearan odnos koncentracije i intenziteta Koncentraciono gašenje: smanjenje intenziteta sa povećanjem koncentracije

31 Uticaj ph rastvora Bazira se na mogućoj promeni jonskog oblika molekula - promene spektralnih parametara (obojenost i inteziteta) Bira se ph oblast sa konstantnim intezitetom fluorescencije i po cenu smanjenja osetljivosti

.) Organski gasioci: ugljentetrahlorid, karbonilna jedinjenja.

32 Uticaj pratećih materija Gasioci apsorbuju deo ekscitacionog ili emisionog zračenja, sudaraju se sa pobuđenim molekulima Neorganski gasioci: O 2, joni halogena i prelaznih metala (Fe, Mn, Ni..) Organski gasioci: ugljentetrahlorid, karbonilna jedinjenja... Senzibilizovana fluorescencija je redak fenomen povećanja inteziteta pod uticajem stranih molekula ili jona koji sami imaju sposobnost fluoresciranja.

33 PRIMENA Kvalitativna analiza (indentifikacija nepoznatih supstanci) poređenjem maksimuma talasne dužine emisionog zračenja nepoznate supstance sa podacima iz baze

34 Kvantitativna analiza Niska granica detekcije posledica direktnog merenja inteziteta proporcionalnog koncentraciji Nepoznata koncentracija se određuje metodom kalibracione krive

35 PRIMENA neorganska hemija, organska hemija, biohemija... detekcija sastojaka u tragovima u biološkim i ekološkim uzorcima detekcija u hromatografiji i elektroforezi određivanje vitamina (B1, B2) u biološkim ekstraktima DNA sekvenciranje izučavanje vezivanja liganda u biološkim sistemima... luminescentne materijale sadrže televizori, monitori računara, fluorescentne lampe, medicinski uređaji za rendgensko snimanje, laseri

36 Prednosti fluorimetrije nad UV-Vis spektroskopijom Visoka osetljivost (1000 puta niže koncentracije nego UV- Vis) Velika specifičnost (neznatna interferencija drugih komponenti)

37 LUMINESCENCIJA različite pojave emisije svetlosti nakon pobuđivanja supstance različitim vrstama energije, bez zagrevanja. Prefiks u nazivu vrste luminescencije ukazuje upravo na metod kojim je izazvano pobuđivanje. Fotoluminescencija apsorpcija elektromagnetnog zračenja (fluorescencija i fosforescencija) Hemiluminescencija - pobuđeni molekul se formira u hemijskoj reakciji Bioluminescencija - proces se odvija u živim organizmima, energijom metaboličkih reakcija.

38 Luminescencija

39 Luminescencija u forenzici

40 Bioluminescencija

Σχετικά έγγραφα

Spektroskopija u UV-Vis oblasti

Spektroskopija u UV-Vis oblasti APSORPCIONE METODE EMISIONE METODE Apsorpcija u vidljivom delu spektra zasniva se na stabilnim promenama u elektronskim energetskim nivoima. Apsorpcioni spektar nastaje