2 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI

Transcript

1

2 2 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI

3 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Vytas Tamošiūnas, Ingrida Pumputienė, Raimonda Kvietkauskaitė 3 LOGIJOS ir TECHNOLOGIJOS p a g r i n d a i Vadovėlis 2015

4 UDK 612(075.8) Ta83 Recenzentai: Dr. Mykolas Mauricas (VMTI Inovatyvios medicinos centras) Prof. habil. dr. Aniolas Sruoga (Vytauto Didžiojo universitetas) Doc. dr. Vytautas Semaška (Lietuvos edukologijos universitetas) Vadovėlis apsvarstytas ir rekomenduotas išleisti Vytauto Didžiojo universiteto Gamtos mokslų fakulteto tarybos posėdyje 2013 m. vasario 21 d. (protokolo Nr. 2013/01). Vadovėlio leidyba finansuota VDU klasterio KLIGEN B lėšomis. Leidinio rengėjai dėkoja Ritai Nikitenkienei, Marinai Jefimovai ir Miglei Datkūnaitei už patarimus ir techninį darbą. ISBN (spausdintas) ISBN (spausdintas) ISBN (internetinis) ISBN (internetinis) Vytas Tamošiūnas, 2015 Ingrida Pumputienė, 2015 Raimonda Kvietkauskaitė, 2015 Vytauto Didžiojo universitetas, 2015 Versus aureus leidykla, 2015

5 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 5 Turinys Santrumpos...9 PRATARMĖ...13 I dalis I skyrius 1. IMUNOLOGIJOS SAMPRATA 1.1. Pirmosios žinios Imunologija ir imunotechnologija pasaulyje Imunologija ir imunotechnologija Lietuvoje Imunologijos kryptys ir šakos II skyrius 2. IMUNITETO RŪŠYS 2.1. Įgimtasis (nespecifinis) imunitetas Įgytasis (specifinis) imunitetas III skyrius 3. IMUNINĖ SISTEMA: FILOGENEZĖ IR ONTOGENEZĖ 3.1. Nespecializuota apsaugos sistema Specializuota apsaugos sistema Imuninės sistemos filogenezė Imuninės sistemos ontogenezė IV skyrius 4. IMUNINĖS SISTEMOS ORGANAI 4.1. Limfagyslės Limfiniai organai Pirminiai (centriniai) limfiniai organai Antriniai (periferiniai) limfiniai organai Limfiniai audiniai kituose organuose Kiti imuninės apsaugos organai V skyrius 5. IMUNOKOMPETENTINĖS LĄSTELĖS 5.1. Imunokompetentinių ląstelių genezė Kamieninės ląstelės Fagocitinės ląstelės T limfocitai B limfocitai Bendros T ir B limfocitų savybės Natūralūs naikintojai, arba NK ląstelės Antigeną pateikiančios ląstelės... 74

6 6 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI VI skyrius 6. IMUNINĖS SISTEMOS MAKROMOLEKULĖS 6.1. Makromolekulės, susijusios su įgimtuoju imunitetu Makromolekulės, susijusios su įgytuoju imunitetu VII skyrius 7. ANTIGENAI 7.1. Antigenų rūšys Antigenų savybės VIII skyrius 8. IMUNOGLOBULINAI (ANTIKŪNAI) 8.1. Imunoglobulinų struktūra Imunoglobulinų genai Imunoglobulinų klasės ir jų savybės IX skyrius 9. KOMPLEMENTAS 9.1. Komplemento sistema Komplemento aktyvinimo būdai Komplemento sistemos reguliavimas Komplemento receptoriai Komplemento sistemos funkcijos X skyrius 10. CITOKINAI IR CHEMOKINAI Citokinai ir jų rūšys Pagrindiniai citokinai: veikimo būdai ir jų funkcijos Citokinų receptoriai Chemokinai Chemokinų receptoriai XI skyrius 11. SUKIBIMO (ADHEZIJOS) MOLEKULĖS Sukibimo (adhezijos) molekulės ir jų rūšys Sukibimo (adhezijos) molekulių šeimos Leukocitų ekstravazacija XII skyrius 12. IMUNINIS ATSAKAS Antigeno atpažinimas Antigeno sunaikinimo efektorinės sistemos Imuninio atsako reguliavimas XIII skyrius 13. IMUNINĖS SISTEMOS PAKITIMAI Pirminiai pakitimai Imuniteto nepakankamumas Imuninės sistemos ligos Imuninės sistemos stimuliacija ir gydymas

7 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 7 II dalis XIV skyrius 14. Imunotechnologija Antigenai Adjuvantai Antikūnai XV skyrius 15. IMUNOLOGINIAI METODAI: IMUNINIO SERUMO TYRIMAI 15.1 Agliutinacija Precipitacijos reakcija Komplemento sujungimo reakcija Imunofermentinės analizės metodas ELISPOT metodas Radioimuninis metodas Imunodifuzija ir jos variantai Imunoelektroforezė Imunoblotingas XVI skyrius 16. IMUNOLOGINIAI METODAI: IMUNOKOMPETENTINIŲ LĄSTELIŲ TYRIMAI Rozečių metodas Imunofluorescencijos metodas Tėkmės citometrijos metodas Elektroninės mikroskopijos metodas XVII skyrius 17. TRANSPLANTACIJA Transplantato atmetimo reakcijos Imuninės reakcijos prieš transplantatą Ląstelinio atmetimo mechanizmas Humoralinio atmetimo mechanizmas XVIII skyrius 18. IMUNOPROFILAKTIKA: SKIEPAI IR SKIEPIJIMAS Bendros žinios apie skiepus Skiepų kalendorius Dažniausia naudojami skiepai BAIGIAMOSIOS MINTYS...205

8

9 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 9 Santrumpos Ag (antigen) antigenas AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) įgytasis imuniteto nepakankamumo sindromas Ak (antibody) antikūnas EALT EFIS (eye-associated lymphoid tissue) akių gleivinės limfinis audinys (European federation of immunological societies) Europos imunologų draugijų federacija BaIS (Baltic society for immunology) Baltijos šalių imunologų draugija ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) imunofermentinis tyrimas BALT (bronchi-associated lymphoid tissue) bronchų gleivinės limfinis audinys BCG C CC CXC CD CFA CNS ConA CR (Bacillus Calmette Guerin) skiepai nuo tuberkuliozės bacilos Calmette Guerin pagrindu (complement) komplementas (β-chemokines subgroup) β chemokinų pogrupis (α-chemokines subgroup) α chemokinų pogrupis (cluster of differentiation) diferenciacijos antigenas (colony stimulating factors) kolonijas stimuliuojantys faktoriai (central nervous system) centrinė nervų sistema (concanavalin A) konkanavalinas A (complement receptor) komplemento receptorius CTLA (Cytotoxic T lymphocyte antigen) citotoksinių T limfocitų antigenas Da (dalton) daltonas atominės masės vienetas DNR (deoxyribonucleic acid) dezoksiribonukleorūgštis EAACI (European academy of allergy and clinical immunology) Europos alergologijos ir klinikinės imunologijos akademija Fab (fragment, antigen binding) antigeną prijungiantis imunoglobulino fragmentas Fas (member of the TNF receptor family) TNF šeimos receptorius Fc (fragment, crystalizable) Fc fragmentas imunoglobulino molekulėje, išskirtas kristalizuojant FcR (Fc receptor) Fc fragmento receptorius FITC (fluorescein isothiocyanate) fluoresceino izotiocianatas GALT (gut-associated lymphoid tissue) žarnyno gleivinės limfinis audinys G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) granuliocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius GM-CSF (granulocyte-macrophage colonystimulating factor) granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius H-2 (mouse major histocompatibility complex) pelių didysis audinių dermės kompleksas HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) hipoksantinas, aminopterinas, timidinas HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphorybosyl transferase, thymidinkinase) hipoksantino guanino fosforibozilo transferazė, timidino kinazė

10 10 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI HLA Hsp ICAM IFN Ig IL Ir (human leukocyte antigen) žmonių leukocitų antigenas (heat schock proteins) terminio šoko baltymai (intercellular adhesion molecules) ląstelių sukibimo molekulės (interferon) interferonas (immunoglobulin) imunoglobulinas (interleukin) interleukinas (immune response) imuninis atsakas M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius MEG-CSF (megakaryocyte colony-stimulating factor) megakariocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius MG (myastenia gravis) sunkioji miastenija MHC (major histocompatibility complex) didysis audinių dermės kompleksas MIP (macrophage inflammatory protein) uždegimą skatinantis makrofagų baltymas ISCOM (immunostimulating complex) imunitetą skatinantis kompleksas ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) imuninės sistemos aktyvinimo receptoriaus gale esanti konservatyvi aminorūgščių seka ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) imuninės sistemos slopinimo receptoriaus gale esanti konservatyvi aminorūgščių seka IUIS (International union of immunological societes) Tarptautinė imunologų draugijų sąjunga kda (kilodalton) kilodaltonas atominės masės vienetas LAD (leukocyte adhesion deficiency) leukocitų sukibimo nepakankamumas LALT (larynx-associated lymphoid tissue) gerklų gleivinės limfinis audinys LFA (lymphocyte function-associated antigen) leukocitų funkcinis antigenas LPS (lipopolysaccharide) lipopolisacharidas MAC (membrane attack complex) komplemento membranos kompleksas MadCAM (mucosal cell adhesion molecule) gleivinės ląstelių sukibimo molekulės MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) gleivinės limfoidinis audinys NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) NALT NK PGR PECAM PWM kofermentas nikotinamido adenino dinukleotidas (nasal-associated lymphoid tissue) nosies gleivinės limfinis audinys (natural killer) natūralioji ląstelė naikintoja (polymerase chain reaction) polimerazės grandininė reakcija (platelet-endothelial cell adhesion molecule) trombocitų ir endotelio ląstelių sukibimo molekulės (pokeweed mitogen) mitogenas, išskirtas iš amerikinės fitolakos RAG (recombination activating gene) RNR SALT SDS T C TCR rekombinaciją aktyvinantys genai (ribonucleic acid) ribonukleorūgštis (skin-associated lymphoid tissue) odos limfinis audinys (sodium dodecyl sulphate) natrio dodecilsulfatas (cytotoxic T lymphocytes) citotoksinis T limfocitas (T cell-like receptor) T ląstelių receptorius TGF (transforming growth factor) T H transformuojantis augimo faktorius (T helper) T ląstelė pagalbininkė

11 TIR TLR TNF TP (Toll-interleukin receptor) interleukino Toll receptorius (Toll-like receptor) Toll baltymo receptorius (tumour necrosis factor) naviko nekrozės faktorius (thymopentin) timopentinas VALT (vascular-associated lymphoid tissue) kraujagyslių limfinis audinys VCAM (vascular cell adhesion molecule) kraujagyslių ląstelių sukibimo molekulės VEGF (vascular endothelial growth factor) kraujagyslių endotelio augimo faktorius

12

13 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 13 PRATARMĖ Šiandien kiekvienam, ypač besidominčiam biologijos dalykais, būtina suvokti, kas yra imunitetas. Toks aktualumas dar labiau padidėja, nes farmacijos, farmacinių kompanijų atstovai (dažniausiai ne imunologijos specialistai), net gydytojai sergamumą vienomis ar kitomis ligomis paprastai paaiškina,,susilp nėjusiu imunitetu. Neretai ir profilaktinės medicinos atstovai (higienistai, dietologai ir kt.) nesistengia paaiškinti, kuri gi imuniteto grandis susilpnėjusi? Suprantama, kad ne visi gali suvokti imuniteto susidarymą, tuo labiau ištirti jį specializuotose laboratorijose. Galima teigti, kad visavertis žmogaus gyvenimas, žinoma, atsižvelgiant į amžių, mitybą, fizinį krūvį, stresą, neturi negrįžtamai paveikti konkrečios imuninės sistemos grandies ir negali išsivystyti vadinamasis,,susilpnėjęs imunitetas. Tokiu būdu net minimalus supratimas apie imuninę sistemą gali daug pasakyti apie imunitetą, ypač esant imuniteto nepakankamumui ar sergant imuninės sistemos ligomis. Šioje knygoje bus kalbama apie svarbiausius imuninės sistemos formavimosi etapus, imuniteto komponentus ir veikimo mechanizmus, apžvelgiamos imuninės sistemos ligos, transplantacijos imunologiniai pagrindai, organizmo apsaugos (skiepų) veikimo mechanizmai. Jau motinos įsčiose vaisius įgyja pirmųjų apsaugos požymių. Tuomet ir pradeda vystytis įgimtasis imunitetas, o vienos ar kitos grandies nebuvimas ar nutrūkimas sukelia įvairius imuninius sindromus, patologijas ar net imuninės sistemos ligas, apie kurias trumpai bus rašoma. Ne visi žino, kas sudaro imuninę sistemą (pvz., ar skiriasi ši sistema vaiko ir suaugusio žmogaus organizme). Ar visi imuninės sistemos organai reikalingi suaugusiam žmogui? Pagaliau, kada imuninė sistema galutinai subręsta ar susilpnėja? Kaip nustatyti, kokius diagnostinius metodus taikyti imuninei būklei įvertinti? Iki šiol neaišku, kas yra antigenas, kuris sukelia antikūnų gamybą, ir ar visuomet ją sukelia? Kokiomis savybėmis pasižymi antigenai? Ar skiriasi antigenai ir alergenai? Kokias ligas jie sukelia ir pan.? Daug klausimų kyla ir dėl ląstelių dalyvavimo. Egzistuoja dvi nuomonės: imuninį atsaką gali sukelti tik specializuotos imuniteto ląstelės (makrofagai, limfocitai, plazminės ir kt.); atsake netiesiogiai dalyvauja visos kraujo ląstelės. Kalbant apie ląsteles, dažnai kyla klausimas, ar jos,,atsimena ligos sukėlėją. Žinoma, į šį klausimą atsakyti nesunku, nes tuo paremtas vakcinacijos (skiepų) būtinumas kūdikystėje ar vaikystėje. Kartais vakcinuojami ir suaugę žmonės, jeigu jie keliauja į tam tikrų užkrečiamųjų ligų paplitimo regionus.

14 14 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Ar pakanka organizmo apsaugai tik ląstelių? Žinoma, kad nepakanka imuninės sistemos darbe dalyvauja ir kiti komponentai: komplemento baltymai, sukibimo (adhezijos) molekulės, imunoglobulinai (antikūnai), citokinai ir chemokinai (populiariai dar vadinami,,molekuliniais kurjeriais ) ir kitos imunitetui susidaryti reikalingos molekulės. Vis dėlto, ar imunitetas susidaro visais atvejais? Svetimą medžiagą organizmas gali toleruoti arba ją atsakyti. Pasirodo, tolerancija ir atsakas labai įvairūs ir, norint juos aprašyti, reikia gerai žinoti jų susidarymo mechanizmus. Pvz., tam, kad būtų persodintas vienas ar kitas organas, reikia gerai pažinti tiek recipiento, tiek donoro imuninę sistemą, žinoti atmetimo reakcijos mechanizmus. Turint minimalių imunologijos žinių, galima suvokti ir imunotechnologijos pagrindus. Imunologijos metodų kompleksas leidžia įvertinti imuninės sistemos būklę, nustatyti ligą, parinkti donorus ir kt., bet tam reikia imunologų specialistų, imunologijos laboratorijų ir atskiros įrangos. Regis, ne vienam rūpi, ypač šiais naujųjų technologijų laikais, ar galima imunologijos principus panaudoti kuriant naujas technologijas? Vienareikšmiškai. Šie principai buvo naudojami jau seniai, kai buvo gautos pirmosios vakcinos, imuniniai serumai ir kt., o dabar šiuos principus naudoja imunotechnologai, ruošdami vakcinas, gamindami monokloninius ir polikloninius antikūnus, citokinus ir kitus imunologinius produktus. Pateiktoje pratarmėje iškelta daug imunologijos problemų, kurios bus aptartos šioje knygoje. Knyga skirta biomedicinos mokslus studijuojantiems studentams, magistrantams, doktorantams, taip pat visiems, kurie domisi biologija ar siekia supras ti imuniteto susidarymą, funkcijas ir galimybes. Autoriai

15 I Dalis 15 I dalis I skyrius 1. IMUNOLOGIJOS SAMPRATA 1.1. Pirmosios žinios Dabar daugelis žino, kad imunologija mokslas apie imunitetą, kitaip tariant, apie žinduolių organizmo apsaugą, gebėjimą atpažinti svetimas medžiagas, jas neutralizuoti ir pašalinti iš organizmo. Terminas,,imunitetas (lot. immunis neimlus) biologijoje vartojamas įvairiais atvejais: organizmo neimlumas infekciniams ir neinfekciniams veiksniams ar kitoms svetimoms medžiagoms, turinčioms antigeninių savybių, t. y. imuninės sistemos atpažįstamų kaip organizmui svetimų medžiagų antigenų; organizmo apsaugos būdas, kurio pagrindinė užduotis išsaugoti vidinę homeostazę, apginti nuo visko, kas jam genetiškai svetima; gebėjimas atpažinti, neutralizuoti ir pašalinti iš organizmo genetiškai svetimas struktūras (įvairius biopolimerus, virusus, bakterijas, parazitus, transformuotas bei infekuotas ląsteles), aišku, siekiant išsaugoti organizmą. Žinoma, šioms užduotims vykdyti gali būti naudojami ir kiti būdai. Šiuolaikinė imunologija, kaip atskira mokslo šaka, susiformavo tik XIX a. antroje pusėje. Iki tol imunologija buvo mikrobiologijos, fiziologijos ir infekcinių ligų taikomoji mokslo šaka. Imunologijos pasiekimų taikymas iki šiol susijęs su medicina, farmacija, veterinarija, biotechnologija ir kitomis mokslo šakomis. Užuominų apie organizmo apsaugą randama egiptiečių, kinų, indų ir kitų Rytų šalių atstovų, gyvenusių keletą tūkstančių metų prieš mūsų erą, raštuose. Dažnos ligų epidemijos padėjo žmonėms suvokti kai kuriuos dėsningumus: ne visi žmonės per epidemijas susirgdavo; persirgusieji ir pasveikusieji antrą kartą ta pačia liga nesusirgdavo (,,atsimindavo ligos sukėlėją) susidarydavo antikūnai ir specialios ląstelės. Jau XI a. Kinijoje buvo kovojama su raupais, įpurškiant į sveiko žmogaus nosį išdžiovinto, sergančio raupais pūslelių

16 16 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI turinio. Indijoje žmonės rinkdavo sergančiųjų raupais pūlius ar pūslelių medžiagą ir ją sveikiesiems įtrindavo į įbrėžtą odą. Persijoje panašios procedūros buvo atliekamos pirtyse m. ponia M. W. Montagu į Didžiąją Britaniją iš Turkijos atvežė šios procedūros principą varioliacijos (lot. variola raupai) metodą. Šis metodas greitai paplito ir kitose Europos šalyse, taip pat ir Lietuvoje (D. Adomaitienė ir kt., 2001). Lietuvoje pirmosios imunologijos žinios ( m.) siejamos su Vilniaus universiteto profesoriais, kurie, skaitydami bendrosios higienos, chirurgijos ir patologijos paskaitas, jau kalbėjo apie varioliacijos metodą Imunologija ir imunotechnologija pasaulyje Į Didžiąją Britaniją atsivežtas skiepijimo būdas buvo taikomas neilgai, nes, neteisingai jį naudojant, kartais kildavo epidemijos m. E. Jenner (Didžioji Britanija) bandymais įrodė, kad žmogų skiepijant karvės raupų medžiaga galima jį apsaugoti nuo tikrųjų raupų. Šis metodas pavadintas vakcinacija, arba skiepijimu m. L. Pasteur (Prancūzija) sukūrė bendruosius skiepijimo principus, pagamino skiepus nuo juodligės, raudonligės, pasiutligės. I. Metchnikoff (Rusija) 1884 m. paskelbė ląstelinę imuniteto teoriją ir tvirtino, kad fagozitozė padeda organizmui gintis nuo infekcijos. P. Ehrlich (1897 m., Vokietija) teigė, kad organizmui apsisaugoti nuo infekcijos didelę reikšmę turi humoraliniai (susiję su krauju, limfa ar kitais biologiniais skysčiais) kraujo serumo veiksniai. Šie teiginiai pagrindė humoralinio imuniteto teoriją m. E. A. Behring (Vokietija) ir Sh. Kitasato (Japonija) sukūrė difterijos ir stabligės imuninius serumus. Jų darbai padėjo atsirasti naujai imunologijos šakai seroterapijai (imunoterapijai ir imunoprofilaktikai). K. Landsteiner (Austrija) 1900 m. aprašė žmogaus eritrocitų izoantigenus atrado žmogaus kraujo grupes. J. Bordet (1901 m., Belgija) įrodė, kad imuninę hemolizę (eritrocitų irimą) gali sukelti antikūnai prieš eritrocitus ir komplementas. Ši komplemento sujungimo reakcija buvo pritaikyta infekcinėms ligoms diagnozuoti m. P. B. Medawar (Didžioji Britanija) ir M. Hašek (Čekija) atrado imuninės tolerancijos reiškinį m. F. M. Burnet (Australija) sukūrė įgytojo imuniteto kloninės atrankos teoriją. Šios teorijos principai buvo taikomi persodinant ląsteles, audinius ar organus. Ląstelinės imunologijos pradininkas yra J. Miller (Australija), kuris nustatė, kad imuniteto susidarymą lemia atskiros ląstelių populiacijos. T limfocitai lemia ląstelinį imunitetą, o B limfocitai humoralinį imunitetą. Pradėjus taikyti fizikinius, cheminius, biocheminius tyrimo metodus susiformavo imunologijos šaka imunochemija. G. M. Edelman (JAV) ir R. R. Porter (Didžioji Britanija) išaiškino imunoglobulinų cheminę

17 I Dalis I skyrius 17 struktūrą (1972 m.) m. buvo atrastas didysis audinių dermės kompleksas ir žmogaus leukocitų antigenai (G. D. Snell, JAV; J. B. Dausset, Prancūzija; B. Benacerraf, JAV) m. C. Milstein (Didžioji Britanija) ir G. F. Köhler (Vokietija) sukūrė monokloninių antikūnų gavimo technologiją, N. K. Jerne (Danija) imunoreguliacijos, 1987 m. S. Tonegava (Japonija) antikūnų sintezės genetinės įvairovės teoriją m. P. C. Doherty, R. M. Zinkernagel (Šveicarija) atrado ląstelinio imuniteto specifiškumą. Imunologijos srityje už svarbius atradimus mokslininkai gavo daugiau nei 20 Nobelio premijų Imunologija ir imunotechnologija Lietuvoje J. Briotet (1785 m.) skiepijo žmones nuo raupų, dėstė chirurgijos kursą Vilniaus universitete, kur skaitė paskaitas apie varioliaciją. A. Becu (1802 m.) buvo nuvykęs tobulintis į Didžiąją Britaniją pas E. Jenner ir 1803 m. išleido monografiją Apie vakcinaciją arba vadinamuosius karvių raupus m. Vilniuje veikė J. Frank ir A. Becu įsteigtas Vakcinacijos institutas m. Vilniuje gydytojo V. Orlovskio iniciatyva įkurta Pastero stotis, kurioje buvo gaminami skiepai, skiepijama nuo pasiutligės, atliekami moksliniai stebėjimai. A. Jurgeliūno iniciatyva 1918 m. Kaune įsteigtas Higienos institutas, veikęs iki 1940 metų. Jame buvo atliekami serologiniai tyrimai, gaminami raupų, pasiutligės skiepai, skiepijami žmonės m. Kaune veikė Serologijos (iki 1938 m. Bakteriologijos) institutas, kuriame gaminti antitoksiniai difterijos ir stabligės imuniniai serumai, skiepai nuo vidurių šiltinės m. V. Girdzijauskas pirmasis apgynė medicinos daktaro disertaciją iš imunologijos srities. Jis laikomas medicininės imunologijos pradininku Lietuvoje. Nuo 1970 m. imunologiniai tyrimai daugiausia buvo atliekami Imunologijos, Eksperimentinės ir klinikinės medicinos, Biochemijos, Biotechnologijos, Ekologijos institutuose, Lietuvos AIDS centre, Vilniaus universitete, Kauno medicinos universitete, Lietuvos veterinarijos akademijoje, kituose institutuose ir klinikose. Tiriamas imuninis atpažinimas (N. Janulevičiūtė, I. Pumputienė), vietinis imunitetas (A. Kondrotas), imunogenezės reguliacija (I. Dumalakienė, V. Tamošiūnas), imunitetas, susirgus vėžinėmis ligomis (E. Moncevičiūtė-Eringienė, D. Characiejus, V. Pašukonienė), imunobiotechnologiniai procesai (A. Žvirblienė, M. Mauricas, I. Girkontaitė), ekologinės imunologijos ypatumai ir jų modeliavimas (J. Ačaitė, I. Jonauskienė), transplantacinis imunitetas (N. Šekštelienė, L. R. Pikelytė, R. Malickaitė, T. Rainienė), retrovirusinis imunitetas (A. Laiškonis, S. Čaplinskas), reprodukcinė imunologija (A. Eidukaitė), užkrečiamųjų ligų diagnostika ir imunoprofilaktika (A. Ambrozaitis, V. Usonis, B. Morkūnas), imunogenetika (A. Sruoga), gyvūnų ir paukščių imunitetas (P. Sadauskas, J. Pieškus, A. Šiaurys).

18 18 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Imunologijos ir imunotechnologijos tema išleista nemažai vadovėlių bei monografijų: A. Svičiulis, V. Vaičiuvėnas ir B. Tilindis Imunologija (1989); V. Tamošiūnas Molekulinės imunologijos ir imunochemijos pagrindai (1991); A. Kondrotas, J. Pieškus Vietinis imunitetas (1998); G. Mikalauskienė, J. Pieškus Imunologijos praktikos darbai (1999); J. Pieškus, A. Šiaurys Paukščių imunitetas (2000); J. Pieškus Veterinarinės imunologijos pagrindai (2001); D. Adomaitienė, N. Janulevičiūtė, R. Kazakevičius ir V. Vaičiuvėnas Klinikinės imunologijos įvadas (2001); I. Girkontaitė, R. Kvietkauskaitė, V. Valčeckienė, N. Gerasimčik Imunotechnologija (2008). Nuo 1991 m. veikia Lietuvos imunologų draugija, nuo 1991 m. Baltijos šalių (Lietuva, Latvija, Estija) imunologų draugijų asociacija (BAIS), priklausanti Europos (EFIS) ir Pasaulio (IUIS) imunologų draugijoms (1992). Šiuolaikinė imunologija ir imunotechnologija vystėsi lygiagrečiai su kitomis mokslo šakomis, papildydamos vienos kitas. Per visą savo egzistavimo laiką imunologija ir imunotechnologija sėkmingai naudodavo kitų biologinės ir technologinės krypčių mokslo šakų pasiekimus bei atradimus, ypač žmogaus fiziologijos, biochemijos, molekulinės biologijos ir biotechnologijos srityse. Sparčiai vystantis inžinerijai, elektronikai, informacinėms technologijoms bei vykstant šių sričių integracijai į biomediciną, atsirado naujų technologijų, patobulėjo senieji tyrimo metodai, todėl imunologijos neįmanoma įsivaizduoti be šiuolaikinių besivystančių imunotechnologijų Imunologijos kryptys ir šakos Plačiąja prasme imunologija mokslas apie imunitetą, nagrinėjantis sudėtingus procesus, į organizmą patekus svetimoms medžiagoms antigenams, tačiau būtina smulkiau aprašyti ir imunologijos šakas, nurodyti tyrimų kryptis, specifiškumą, rezultatus (1 lent.). Viena iš artimiausių imunologijos šakų alergologija, nes alergijų išsivystymą lemia imuniniai mechanizmai, kurie pasireiškia padidėjusiu jautrumu kai kuriems atskiriems produktams, vaistams ir aplinkos veiksniams. Alergija gali būti nulemta antikūnų ir imunokompetentinių ląstelių. Daugeliu atvejų antikūnai, sukeliantys alergines reakcijas, priklauso IgE izotipui. Kai kuriais alergijų atvejais, pavyzdžiui, sergant alerginiu kontaktiniu dermatitu, odos uždegimas atsiranda dėl padidėjusio tam tikros rūšies imunokompetentinių ląstelių (limfocitų) aktyvumo. Imunochemija imunologijos šaka, tirianti antigenų ir antikūnų biosintezę, struktūrą, tarpusavio sąveiką. Trumpai tariant, ši mokslo šaka nagrinėja cheminius imuniteto procesus: antigenų, antikūnų, komplemento komponentų, citokinų, didžiojo audinių dermės komplekso, sukibimo (adhezijos)

19 I Dalis I skyrius 19 molekulių sandarą ir prigimtį, imunokompetentinių ląstelių augimą ir brendimą, stimuliuojančių veiksnių cheminę sudėtį, struktūrinę organizaciją. Dabar imunochemija dažniausiai vadinama molekuline imunologija, nes padeda suvokti imuniteto susidarymo molekulinius mechanizmus. Imunogenetika kaip atskira imunologijos šaka tiria antigenų specifiškumo, paveldėjimo dėsnius, genetinių mechanizmų reikšmę imuninėms reakcijoms, antikūnų sintezės įvairovės genetinius mechanizmus, nagrinėja klonų selekcijos ir kitų imuniteto teorijų pagrindus. Praktikoje imunogenetikos principai naudojami nustatant kraujo grupes, transplantacinių antigenų tapatybę, parenkant donorus ar recipientus organams bei audiniams persodinti. Imunomorfologija viena iš imunologijos šakų, tirianti imuninės sistemos bei jos komponentų morfologiją, naudojanti anatomijos, histologijos ir citologijos metodus. Ši imunologijos šaka tiria imuninės sistemos organų formą, dydį ir struktūrą, atsiribodama nuo jų funkcijų. Imunomorfologija nagrinėja limfinio audinio formavimosi, struktūros ir organų susidarymo morfologines savybes ontogenetinio ir filogenetinio vystymosi periodais. Viena iš medicinos ar veterinarijos plačiai naudojamų imunologijos šakų imunodiagnostika, t. y. organizmo būklės ar ligos nustatymo metodas, pagrįstas antigeno ir antikūno sąveikos principais. Ligos diagnozuojamos, nustatant antigenus ar jiems būdingus specifinius antikūnus, kurių randama kraujo serume ar kituose biologiniuose skysčiuose (seilėse, piene, šlapime ir kt.). Galima išskirti ir nustatyti pačius ligos sukėlėjus mikrobus, virusus parazitus ir t. t. Pagrindiniai imunodiagnostikos metodai: agliutinacija, precipitacija, komplimento sujungimo reakcija, imunodifuzija, imunofluorescencija, radioimuninė analizė, imunofermentinė analizė, imunoblotingas. Dar viena imunologijos šaka imunofarmakologija, kuri tiria vaistų poveikį imuninei sistemai. Yra trys pagrindinės kryptys: imunologinių metodų panaudojimas farmakologiniuose tyrimuose; vaistų įtakos imuniniams procesams tyrimai; vaistų veikimo mechanizmų, susijusių su imunine sistema, tyrimai. Dažnai nustatomi imunopatologiniai sutrikimai, kurie išsivysto dėl įvairių pažeidimų ar net ligų, bet būdingi imuninei sistemai. Tipiškos ligos, atsirandančios dėl imuninių kompleksų (antigeno ir antikūno sąveikos metu susidarantis darinys) formavimosi. Šioms ligoms priskiriamas reumatoidinis artritas, sisteminė raudonoji vilkligė, bakterinis endokarditas, odos kraujagyslių uždegimas. Dažnai pasitaiko ir kitų autoimuninių ligų: hemolizinė naujagimių anemija, trombocitopenija, Adisono (antinksčių žievės funkcijos nepakankamumas), sunkioji miastenija (raumenų silpnumas). Patekę į organizmą retrovirusai sukelia imuniteto nepakankamumą, ypač įgyto imunodeficito (AIDS) atveju. Imuninės sistemos pažeidimai (imunopatologija) lemia infekcinių, navikinių ir kitų ligų vystymąsi, o atsiradusios ligos sutrikdo imuninės sistemos funkcijas ir pusiausvyrą.

20 20 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Imunotechnologija labai artima biotechnologijai, kai biologinei gamybai panaudojami ne mikroorganizmai, fermentai ir kt., o imuninė sistema ar atskiri jos elementai, skirti imuninės sistemos produktams gauti, jų savybėms nustatyti bei panaudoti. Šalia cheminių medžiagų dažnai naudojami biologinės imuninės kilmės vaistai. Imunoterapija tai ligų gydymas imuniniais preparatais (serumais, vakcinomis, imunoglobulinais (antikūnais)) ir kitomis imunitetą skatinančiomis medžiagomis. Nustatyta, kad efektyviausia gydomos užkrečiamos ligos, kai kurios neužkrečiamos ligos, sunkūs nudegimai. Infekcijos metu į organizmą pakliūna ir ligos sukėlėjų (bakterijų, virusų, parazitų ir kt.), kurie ne tik sukelia ligą, bet veikia visas imuninės sistemos grandis. Šiuos imuninės sistemos pokyčius infekcijos metu tiria atskira imunologijos šaka infekcinė imunologija. Norint išvengti užkrečiamųjų ligų, ypač jų epidemijų, kūdikystėje ir vaikystėje arba keliaujant į kai kurias šalis, būtina imunoprofilaktika apsisaugojimas nuo užkrečiamų ligų skiepais (vakcinomis). Taigi imunologija plačiąja prasme yra mokslas apie sudėtingus imuniteto susidarymo mechanizmus. Žinoma, imunologijos ir jos atskirų krypčių bei šakų pasiekimai tampriai susiję su kitų mokslų laimėjimais. Nuo šių laimėjimų priklauso imunologinių tyrimų metodai, gautos informacijos apimtis, pagaliau, ir mūsų žinios apie imunitetą. 1 lentelė. Imunologijos šakos Imunologijos šakos Alergologija Imunodiagnostika Imunofarmakologija Imunogenetika Infekcinė imunologija Imunomorfologija Imunopatologija Imunoprofilaktika Imunotechnologija Imunoterapija Molekulinė imunologija (imunochemija) Tiria Padidėjęs jautrumas (alerginės reakcijos maistui, vaistams, aplinkai) Organizmo būklės įvertinimo ir ligų nustatymo imunologiniai metodai Farmacinių preparatų (vaistų) poveikis imuninei sistemai Antigenų paveldėjimo dėsniai, genetinių mechanizmų reikšmė imuninėms reakcijoms Ligos sukėlėjų nustatymas ir poveikis imuninei sistemai Imuninės sistemos organų forma, dydis ir struktūra Būdingi imuninei sistemai sutrikimai ir pažeidimai Apsisaugojimas nuo užkrečiamų ligų skiepais (vakcinomis) Imuninės sistemos veikimo principai biologiniams preparatams gauti Ligų gydymas imuniniais preparatais Imuniteto susidarymo molekuliniai mechanizmai

21 I Dalis I skyrius 21 SANTRAUKA Šiuolaikinė imunologija, kaip atskira mokslo šaka, susiformavo XIX a. antroje pusėje. Iki tol imunologija buvo mikrobiologijos, fiziologijos ir infekcinių ligų taikomoji mokslo šaka. Imunologija atskiras mokslas apie imunitetą, kuris apsaugo organizmą, sugeba atpažinti svetimas medžiagas (taip pat ir ligų sukėlėjus), jas neutralizuoti ir pašalinti iš organizmo. Imunologija ir imunotechnologija vystėsi lygiagrečiai su kitomis mokslo šakomis, papildydamos viena kitą, sėkmingai naudojo biologijos ir technologinius pasiekimus, ypač fiziologijos, genetikos, biochemijos, molekulinės biologijos ir biotechnologijos srityse. Atsirado nauji tikslai ir siauresnės imunologijos kryptys: alergologija (nagrinėja padidėjusį jautrumą vaistams, aplinkai, maistui); imunodiagnostika (susijusi su organizmo imuninės būklės įvertinimu, ligų nustatymu imunologiniais metodais); imunofarmakologija (tiria vaistų poveikį imuninei sistemai bei imuniniams procesams); imunochemija (tyrinėja imuninių reakcijų cheminius pagrindus); imunogenetika (nagrinėja antigenų, imunoglobulinų, receptorių ir kitų imuninės sistemos molekulių genus, paveldėjimo dėsnius); infekcinė imunologija (tiria imuninės sistemos pažeidimus infekcijos metu); imunomorfologija (nagrinėja limfinių audinių ar organų formavimosi laiką, struktūros ir morfologines savybes ontogenetinio ir filogenetinio vystymosi metu); imunopatologija (nagrinėja imuninės sistemos sutrikimus ir pažeidimus); neuroimunologija (nagrinėja ryšius tarp nervų ir imuninės sistemos normos ir patologijos atvejais bei šios sąveikos įtaką organizmui); molekulinė imunologija (tiria molekulinius imuniteto susidarymo mechanizmus). Nauja imunologijos kryptis imunotechnogija naudoja imunologinius metodus ir imuninės sistemos komponentus pramoniniu būdu gaminant imuninius produktus, kurie gali būti ir imuninės sistemos pakaitalais. Imunoterapijos uždavinys imuniteto nepakankamumo ar imuninės sistemos ligų gydymas imuniniais preparatais. Norint išvengti užkrečiamųjų ligų kūdikystėje, vaikystėje ar atsidūrus kituose žemynuose, yra būtina imunoprofilaktika, t. y. apsisaugojimas nuo užkrečiamų ligų skiepais (vakcinomis). Lietuvoje pirmosios imunologijos žinios ( m.) siejamos su Vilniaus universiteto profesoriais J. Briotet, A. Beku, J. Franku, kurie skaitydami paskaitas kalbėjo apie skiepijimą nuo raupų, parašė pirmas monografijas, įsteigė Vakcinacijos institutą. Dabartinės imunologijos pradininku laikomas profesorius V. Girdzijauskas, kuris 1939 m. apgynė medicinos daktaro disertaciją. Joje nagrinėjo endokrininės sistemos liaukų įtaką agliutininams susidaryti m., skaitydamas medicininės mikrobiologijos kursą, profesorius A. Jurgeliūnas dėstė infekcinę imunologiją, 1918 m. įkūrė Kauno valstybinį higienos institutą. Šiuo metu imunologijos kursai (priklausomai nuo universitetų specializacijos) skaitomi Vilniaus, Lietuvos sveikatos mokslų, Vytauto Didžiojo, Gedimino technikos, Lietuvos edukologijos universitetuose.

22 22 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI II skyrius 2. IMUNITETO RŪŠYS Imunitetas, priklausomai nuo gynybinių mechanizmų ir kilmės, skirstomas į 2 pagrindinius tipus: įgimtąjį (nespecifinį); įgytąjį (specifinį) Įgimtasis (nespecifinis) imunitetas Įgimtojo imuniteto veiksniai ir komponentai egzistuoja visuose sveikuose individuose, nereikalauja išankstinio aktyvinimo, kad būtų efektyvūs, ir funkcionuoja, susidūrę su antigenu (pvz., infekcijos sukėlėju). Įgimtiems gynybos komponentams priklauso įvairūs mechanizmai ir fiziologiniai barjerai, sekrecijos produktai ir uždegimo ląstelės (2 lent.). Įgimtojo imuniteto mechanizmai yra nespecifiniai, t. y. įgimtojo imuniteto ląstelės ir molekulės atsake į įvairias svetimas medžiagas (baltymus, nukleorūgštis, angliavandenius, mikroorganizmų paviršiaus struktūras) dalyvauja nespecializuotu būdu ir atpažįsta konservatyvias molekules ir struktūras, kurias gamina patogenai. Daugelis įgimtojo imuniteto sistemos faktorių organizme yra nuolat ir pastoviame lygmenyje, o kai kurių skaičius ir koncentracija kinta atsako į antigeninį stimulą metu, bet vėl sugrįžta prie pastovaus lygio tam stimului išnykus. Įgimtajam imunitetui nebūdingas atminties fenomenas. Įgimto imuniteto veiklos efektyvumui turi įtakos fiziologinės sąlygos (pvz., amžius, hormonai, mityba ir kt.). Pagrindinis įgimtojo imuninio atsako procesas yra uždegiminė reakcija, arba uždegimas. Uždegimo metu bendradarbiauja visa eilė įgimtojo imuniteto komponentų. Tai kompleksinė apsauginė organizmo reakcija į žalingo veiksnio sukeltą vietinį pažeidimą. Dažniausia uždegiminę reakciją sukelia mikroorganizmai, tačiau tai padaryti gali ir kiti pažeidžiantys veiksniai (mechaninis sužalojimas, fizinis poveikis, cheminės medžiagos). Pirmasis įvykis uždegimo metu yra vazoaktyvių medžiagų (histamino, kinino), keičiančių kraujagyslių spindį, išsiskyrimas. Šias medžiagas ląstelės gamina kaip atsaką į pažeidimą, jos skatina kapiliarų ir kraujagyslių išsiplėtimą bei didina jų pralaidumą.

23 I Dalis II skyrius 23 2 lentelė. Įgimtojo imuniteto komponentai ir jų funkcijos Komponentai Funkcijos Anatominiai barjerai oda gleivinių membranos ir gleivės mechaninis barjeras mikrobams patekti į organizmą; odos riebalinių liaukų išskiriamas sekretas padeda palaikyti rūgštų odos paviršiaus ph (3 5), nepalankų kai kurių mikrobų augimui virškinimo trakto, kvėpavimo takų ir urogenitalinių takų gleivinių membranos yra vidiniai anatominiai barjerai, apsaugantys nuo patogenų įsiskverbimo į audinius; gleivės įklampina svetimus mikroorganizmus ir daleles; kai kurios žarnyno ląstelės gamina defensinus-kriptidinus, kurie pažeidžia bakterijų membranas Fiziologiniai pokyčiai ph temperatūra rūgštinis skrandžio ph sunaikina daugelį patekusių mikroorganizmų pakilusi kūno temperatūra slopina kai kurių patogenų augimą Cheminiai mediatoriai komplementas aktyvinti kraujo serume esantys komplemento sistemos baltymai lizuoja mikroorganizmus (susiformuoja membraną atakuojantis kompleksas) arba palengvina mikrobų fagocitozę (veikia kaip opsoninai); pritraukia kitas imuninės sistemos ląsteles (neutrofilus, eozinofilus) į komplemento aktyvacijos vietą lizocimas aptinkamas gleivinių sekretuose, ašarose, seilėse; jo substratas yra bakterijų sienelių komponentas peptidoglikanas; pažeidžiamas bakterijų sienelių vientisumas ir jos žūsta inteferonai grupė baltymų, kuriuos ląstelės gamina kaip atsaką į virusinę infekciją; jie sukuria bendrą antivirusinę būklę aplinkinėse ląstelėse geležį surišantys baltymai žinduolių organizme produkuojamas laktoferinas ir transferinas stipriai prisijungia geležį, kurios, kaip būtino mitybinio kofaktoriaus, negali panaudoti bakterijos; šie baltymai pasižymi ir kitomis antibakterinėmis savybėmis, susijusiomis su skilimo produktų susidarymu, kurie veikia kaip antimikrobiniai peptidai, suardo bakterijų membraną ir taip jas užmuša Fagocituojančios ląstelės (neutrofilai, monocitai / makrofagai) fagocituojančios ląstelės internalizuoja (fagocitozė) ir padedant cheminėms medžiagoms (azoto oksidui, hipochloritinėms rūgštims, superoksidui) fagosomose suardo prarytas bakterijas; aktyvuoti makrofagai gali atpalaiduoti šias chemines medžiagas į ląstelės aplinką ir užmušti šalia esančias bakterijas

24 24 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 2 lentelės tęsinys Komponentai NK ląstelės Toll tipo receptoriai (TLR) Funkcijos pagrindinė šių citotoksiniu aktyvumu pasižyminčių limfocitų funkcija organizmo apsauga nuo pakitusių ląstelių, kurioms būdinga sumažėjusi ar išnykusi MHC I molekulių raiška; NK ląstelės suardo vėžines ir virusais infekuotas ląsteles tai įgimtojo imuniteto receptoriai, kurie atpažįsta struktūriškai konservatyvias, daugeliui mikroorganizmų būdingas molekules (pvz., LPS); žinoma apie 13 skirtingų TLR, aptinkamų stuburiniuose ir bestuburiuose gyvūnuose; šių receptorių raiška stebima ant monocitų / makrofagų, dendritinių ląstelių, NK ląstelių; TLR aktyvinimas lemia citokinų produkciją ir ląstelių aktyvinimą kaip atsaką į mikrobą Natūrali mikroflora konkuruoja su patogenine mikroflora dėl maisto medžiagų ir ląstelių prisirišimo vietų; gamina antimikrobines medžiagas (pvz., E coli produktas kolicinas), kurios stabdo kitų bakterijų kolonizaciją Kapiliarų tinklas pažeidimo vietoje priplūsta kraujo, kuris sukelia paraudimą (eritemą), pakyla audinio temperatūra. Padidėjęs kapiliarų pralaidumas lemia skysčio (eksudato) ir ląstelių kaupimąsi pažeistame audinyje. Eksudate yra krešėjimo baltymų ir fermentų, kurie lemia audinio pabrinkimą (edemą). Šioje uždegimo stadijoje fagocitinės ląstelės palieka cirkuliaciją ir migruoja į pažeistą audinį apsaugoti jį nuo galimos infekcijos. Tai vyksta keliais etapais. Pirmiausia, fagocitinės ląstelės sukimba su endotelio ląstelėmis, kurios iškloja kraujagysles. Šiame etape tarpininkauja sukibimo (adhezijos) molekulės. Vėliau fagocitinės ląstelės prasiskverbia į audinius, prasmukdamos pro kraujagyslių epitelio tarpuląsčius (diapedezė). Tuomet fagocitinės ląstelės migruoja į uždegimo vietą (chemotaksis) ir atkeliavusios praryja bakterijas. Fagocitozė lemia atsipalaidavimą fermentų ir cheminių medžiagų, kurios gali pažeisti šalia esančius audinius. Taigi bakterijų sunaikinimą gali lydėti normalių šeimininko ląstelių ir audinių pažeidimas. Susikaupusios mirusių ląstelių liekanos, suskaldytos medžiagos ir skystis yra vadinami pūliais. Kadangi eksudate yra krešėjimo fermentų ir baltymų, aktyvinama kraujo krešėjimo kaskada. Tai lemia fibrino (pagrindinio kraujo krešulio baltymo) siūlų tinklo susidarymą. Krešulys tarnauja kaip siena, atskirianti pažeistą vietą, ir neleidžia infekcijai plisti. Vėliau uždegimas vyksta nutolusiose nuo aktyvaus uždegiminio proceso vietose. Atsipalaiduoja vadinamieji aktyvios fazės baltymai. Pavyzdžiui, kepenys gamina C- reaktyvų baltymą. Šis baltymas jungiasi su konservatyviomis struktūromis C- polisacharidais, kurie yra daugelio bakterijų ir grybų sienelėse. C- reaktyvaus baltymo surišimas aktyvina komplemento sistemą,

25 I Dalis II skyrius 25 sustiprina mikroorganizmų lizę ar fagocitozę. Ūmios fazės atsakas taip pat sustiprina komplemento baltymų sintezę. Gijimas ir regeneracija prasideda, kai fagocituojančios ląstelės pašalina didžiąją dalį liekanų ir uždegiminis atsakas nurimsta. Kapiliarai įauga į krešulį ir, kai šis ištirpsta, jungiamojo audinio ląstelės (fibroblastai) fibriną pakeičia pirminiu kolagenu. Atsistatęs audinys yra paprastai randinis audinys, išskyrus kepenis, kurios gali regeneruoti ir kaulus, kur vyksta atstatymas (remodelingas). Įgimtojo imuniteto mechanizmai bendradarbiauja ne tik uždegimo metu, bet ir kitais atvejais. Ypač komplemento sistema sustiprina ir aktyvina kitus įgimtojo imuniteto mechanizmus. Pavyzdžiui, aktyvinti komplemento baltymai padengia bakterijas ir jas lengviau fagocituoti (opsonizacija). Komplementas aktyvina fibrinolitinę sistemą. Pagaliau, aktyvuoti komplemento baltymai yra chemotaktiniai veiksmai neutrofilams ir eozinofilams Įgytasis (specifinis) imunitetas Šis imunitetas yra neaktyvus tol, kol organizmas nesusiduria su antigenu (imunogenu): jam aktyvinti reikalinga stimuliacija arba imunizacija. Įgytojo imuniteto mechanizmai geba labai specifiškai atskirti skirtingus mikroorganizmus ir keičia imuninio atsako intensyvumą ir pasireiškimo greitį po pakartotino susidūrimo su antigenu (antrinis imuninis atsakas, arba imuninė atmintis). Įgytojo imuniteto sistemą sudaro limfiniai organai, turintys specializuotų ląstelių, molekulių ir procesų sistemą, užtikrinančią svetimų antigenų nukenksminimą ar pašalinimą. Įgytajame imunitete skiriamos 2 imuninio atsako rūšys: humoralinis ir ląstelinis. Humoralinio imuniteto pagrindas yra antikūnų antigenui specifinių baltyminių molekulių susidarymas. Antikūnus gamina plazminės ląstelės, kilusios iš aktyvuotų B limfocitų. Antikūnai, kaip tirpios baltyminės molekulės, aptinkami daugelyje organizmo skysčių, kadaise lot. vadinamųjų humor, iš kur ir yra kilęs humoralinio imuniteto pavadinimas. Ląstelinį imunitetą lemia T limfocitų aktyvinimas jiems susijungiant su antigeniniais peptidais ar glikolipidais komplekse su MHC molekulėmis. T limfocitai arba aktyvina kitų tipų ląsteles, sustiprindami jų savybę užmušti ar pašalinti svetimus mikrobus, arba tiesiogiai patys užmuša infekuotas ląsteles, padedant citotoksiniam mechanizmui. Specifinių antigenui antikūnų gamyba ir specifinių antigenui limfocitų susidarymas lemia įgytojo imuniteto specifiškumą antigeno atžvilgiu. Specifinio imuninio atsako metu humoralinis ir ląstelinis imunitetas funkcionuoja kartu, vyksta glaudi jų sąveika ir kooperacija.

26 26 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Humoralinis ir ląstelinis įgytasis imunitetas gali būti aktyvus ir pasyvus. Aktyvus imunitetas yra įgyjamas palaipsniui (per 5 14 dienų po susidūrimo su antigenu), gali trukti kelerius metus ar net visą gyvenimą, gerai apsaugantis. Pasyvus imunitetas yra greitas, trumpalaikis (dienos, mėnesiai), turi mažą ar vidutinį apsauginį efektyvumą, nesivysto imuninė atmintis. Tiek aktyvus, tiek pasyvus imunitetas toliau gali būti suskirstyti į natūralų ir dirbtinį (1 pav.). ĮGIMTASIS IMUNITETAS (NESPECIFINIS) ĮGYTASIS IMUNITETAS (SPECIFINIS) Humoralinis imunitetas Ląstelinis imunitetas Natūralus Dirbtinis Aktyvus Pasyvus Aktyvus Pasyvus Imunitetas (antikūnai ar sensibilizuotos T ląstelės) yra infekcijos rezultatas Vaisiui antikūnai pereina per placentą arba patenka su motinos pienu Imunitetas (antikūnai ar sensibilizuotos T ląstelės) yra imunizacijos rezultatas Individui duodami in vitro ar iš kito organizmo gauti antikūnai ar sensibilizuotos T ląstelės 1 pav. Įgimtojo ir įgytojo imuniteto rūšys Esant aktyviam imunitetui, individas turi įgytą imunitetą, kurio pagrindą sudaro antikūnai arba sensibilizuoti T limfocitai (T ląstelės), kurie susiformavo tame pačiame individe. Jei individas susidūrė su svetima medžiaga natūraliai savo aplinkoje, o ne buvo imunizuotas vakcina, tuomet jo aktyvus imunitetas yra natūralus, priešingai nei vakcinacijos atveju, aktyvus, bet dirbtinis imunitetas. Esant pasyviam imunitetui, individas turi įgytąjį imunitetą, nulemtą kitame organizme susidariusių antikūnų (ar sensibilizuotų T ląstelių).

27 I Dalis II skyrius 27 Antikūnai įvedami (perkeliami) iš vieno šeimininko kitam, pastarajam sukuriant pasyvų dirbtinį imunitetą. Antikūnų perėjimas per placentą iš motinos organizmo vaisiui arba su motinos pienu kūdikiui yra pasyvaus natūralaus imuniteto pavyzdžiai. T ląstelių (ar kitų imuninių ląstelių) perkėlimas tarp tos pačios linijos gyvūnėlių ar kaulų čiulpų transplantacija žmogui yra pasyvaus dirbtinio įgytojo imuniteto pavyzdžiai. Įgimtojo ir įgytojo imuniteto sistemos kooperuojasi imuninio atsako metu ir gali sustiprinti viena kitos veikimą. Pavyzdžiui, antigeną pateikiančios ląstelės (dendritinės, makrofagai) pateikia antigenus įgytojo imuninio atsako ląstelėms T ląstelėms, o T helperių ląstelių (pagalbininkių) sintetinami citokinai reguliuoja įgimtojo imuniteto ląstelių (fagocitų, NK ląstelių, antigeną pateikiančių ląstelių) proliferaciją, aktyvinimą, sekreciją. SANTRAUKA Imunitetas, priklausomai nuo apsauginių mechanizmų ir kilmės, skirstomas į 2 pagrindinius tipus: įgimtąjį (nespecifinį) ir įgytąjį (specifinį). Įgimtojo imuniteto veiksniai ar jo komponentai egzistuoja visuose individuose. Šis imunitetas nereikalauja išankstinio aktyvinimo, jo veiksniai ir veikimo mechanizmai yra nespecifiniai, nėra imuninės atminties. Įgimtojo imuniteto komponentai yra anatominiai barjerai (oda, gleivinių membranos ir gleivės), fiziologiniai pokyčiai (ph, temperatūra), cheminiai mediatoriai (lizocimas, komplementas, interferonai, geležį surišantys baltymai), fagocituojančios ląstelės (neutrofilai, monocitai / makrofagai), NK ląstelės, Toll tipo receptoriai ir natūrali mikroflora. Aukščiausia įgimto imuniteto išraiška yra uždegimas kompleksinė apsauginė organizmo reakcija į svetimo veiksnio sukeltą vietinį pažeidimą. Uždegimo metu pirmiausia išskiriamos vazoaktyvios medžiagos (histaminas, kininas), kurios plečia kraujagyslių spindį. Pažeidimo vietoje kapiliarų tinklas priplūsta kraujo, atsiranda paraudimas (eritema), pakyla audinio temperatūra, padidėja kapiliarų pralaidumas, vyksta skysčio ir ląstelių kaupimasis pažeistame audinyje, išsivysto audinio pabrinkimas (edema). Uždegimo metu svarbus ląstelių vaidmuo, nes pvz., fagocituojančios ląstelės palieka cirkuliacijos indus ir migruoja į uždegimo židinį. Pirmiausia fagocituojančios ląstelės sąveikauja su kraujagyslių endotelio ląstelėmis, vėliau pro kraujagyslių epitelį prasiskverbia į audinius ir migruoja į uždegimo židinį, kur fagocituoja bakterijas. Uždegimą gali skatinti kraujo krešėjimo kaskada, pvz., fibrinas (kraujo krešulio baltymas), tai apriboja pažeistą vietą, stabdo infekcijos plitimą. Uždegime dalyvauja ir ūmios fazės baltymai (pvz., C reaktyvusis baltymas). Ūmios fazės atsakas sustiprina komplemento baltymų sintezę. Gijimas ir audinio regeneracija prasideda tuomet, kai fagocituojančios ląstelės pašalina uždegimo liekanas ir pati reakcija nurimsta. Įgytasis (specifinis) imunitetas vystosi tik tuomet, kai organizmas susiduria su antigenu (imunogenu). Šiam imunitetui būdingas specifiškumas ir imuninė atmintis.

28 28 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Siekiant apibūdinti įgytojo imuniteto mechanizmus, santykinai jis yra skirstomas į humoralinį ir ląstelinį imunitetą. Humoralinio imuninio atsako metu susidaro antigenui specifinės baltyminės molekulės antikūnai. Ląstelinį imunitetą lemia T limfocitų aktyvinimas antigenu kartu su MHC molekulėmis. Imuninio atsako metu humoralinis ir ląstelinis imunitetas funkcionuoja kartu, vyksta jų sąveika ir kooperacija. Įgytasis imunitetas gali būti aktyvus ir pasyvus. Aktyvus imunitetas įgyjamas, kai pačiame organizme, jam susidūrus su antigenu, pasigamina tam antigenui specifiški antikūnai ir (arba) sensibilizuoti T limfocitai. Pasyvaus imuniteto atveju organizmas jau gauna specifinius antikūnus ar sensibilizuotus limfocitus prieš tam tikrus antigenus. Aktyvus ir pasyvus imunitetas gali būti skirstomas į natūralų imunitetą (įgyjamas natūraliai susidūrus su imunogenu) ir dirbtinį imunitetą (sukuriamas dirbtinai suleidus antigeną ar antikūnus).

29 I Dalis III skyrius 29 III skyrius 3. IMUNINĖ SISTEMA: FILOGENEZĖ IR ONTOGENEZĖ Organizme apsaugines funkcijas atlieka nespecifiniai apsaugos veiksniai ir imuninė sistema (3 lent.), kurie lemia organizmo gebėjimą apsisaugoti nuo svetimos genetinės informacijos. Kitaip tariant, nespecifinių ir specifinių veiksnių visuma sudaro imunitetą, t. y. neleidžia patogeniniams mikroorganizmams ar kitiems žalingiems veiksniams prasiskverbti į organizmo vidų. Skiriamos dvi apsaugos sistemos dalys: nespecializuota ir specializuota Nespecializuota apsaugos sistema Norėdami patekti į organizmą patogeniniai mikroorganizmai ar kiti žalingi veiksniai, pirmiausia susiduria su anatominiais, fiziniais ir (ar) cheminiais apsaugos barjerais (2 pav.): oda (gali dalyvauti ir imuniniame atsake); kraujo krešėjimo sistema; žarnyno mikroflora; riebalų bei prakaito liaukos; baktericidinės medžiagos (lizocimas, properdinas ir kt.); gleivinių paviršius (gleivinių imunitetas); nosies ir kitų gleivinių mikroplaukeliai; skrandžio druskos rūgštis; lytinių takų pieno rūgštis. Jeigu šių pastovių apsaugos barjerų neužtenka,,,įjungiami papildomi funkciniai mechanizmai (kosulys, čiaudulys, vėmimas, viduriavimas), kuriems padedant mechaniškai pašalinami mikroorganizmai ir kenksmingos medžiagos. Nespecifinės apsaugos elementams priskiriama uždegimo reakcija, arba uždegimas.

30 30 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 3 lentelė. Nespecifiniai humoralinės apsaugos faktoriai Faktorius Funkcija Šaltinis Lizocimas katalizuoja ląstelės sienelės mukopeptidų hidrolizę ašaros, seilės, nosies sekretai, kūno skysčiai, lizosominės granulės Laktoferinas suriša geležį ir konkuruoja su mikroorganizmais daugiabranduolių ląstelių granulės Laktoperoksidazė daugelio mikroorganizmų inhibitorius pienas ir seilės β-lizinas efektyvus prieš daugelį gramteigiamų bakterijų trombocitai, normalus serumas Chemotaktiniai faktoriai Properdinas Interferonai skatina daugiabranduolių leukocitų ir monocitų migraciją aktyvuoja komplementą, nedalyvaujant antikūnoantigeno kompleksui veikia kaip imunomoduliatoriai, padidina makrofagų aktyvumą bakterijų substancijos, ląstelių produktai ir denatūruoti baltymai normali plazma leukocitai, fibroblastai, NK ląstelės, T ląstelės Defensinai blokuoja ląstelių transportą daugiabranduolių ląstelių granulės Atsakas į virusų, mikrobų ar jų toksinų poveikį gali būti ūmus, pasireiškiantis karščiavimu, miego, apetito sutrikimu, kraujo sudėties ir hemodinamikos pokyčiais. Esant lėtinei infekcijai, ilgalaikis toksinų poveikis būna imuninės reakcijos prieš savus antigenus, kurios sukelia lėtinį uždegimą. Į audinius ir ląsteles patekus mikroorganizmams, jie intensyviai dauginasi, sekretuoja egzotoksinus arba endotoksinus, bet dar nesukelia pirmųjų uždegimo požymių. Šis periodas vadinamas inkubaciniu. Dažniausia jis trumpas (gripas, dizenterija, salmoneliozė), bet kartais gali trukti ir ilgiau (tuberkuliozė, hepatitas). Prodrominiame periode išryškėja organizmo reakcijos (karščiavimas, galvos skausmas, virškinimo sutrikimai); nors šis periodas trunka neilgai (nuo kelių valandų iki 2 3 dienų), nustatomi imuniniai pokyčiai. Ligos įkarščio laikotarpiu ne tik išryškėja ligos simptomai, bet ir pasireiškia specifinės imuniteto reakcijos: mikroorganizmai neutralizuojami, ardomi, pašalinami iš ląstelių. Prieš uždegimo sukėlėjus sintetinami IgM, IgG, IgA izotipų antikūnai. Vėliau, sveikstant, rekonvalescencijos laikotarpiu, dėl imuninės sistemos aktyvumo nyksta ligos požymiai, atkuriama homeostazė. Uždegimo eigą gali reguliuoti specialūs baltymai citokinai. Uždegimą skatinantys citokinai (interleukinai IL-1, IL-6, alfa-α, gama-γ interferonai, navikų nekrozės veiksnys, chemokinai) aktyvina uždegime dalyvaujančias ląsteles, o uždegimą slopinantys citokinai veikia ląstelių proliferaciją ir aktyvumą. Pasi-

31 I Dalis III skyrius 31 KVĖPAVIMO TAKAI a) gleivės b) epitelis c) alveoliniai makrofagai AKYS a) ašaros b) lizocimas ODA a) anatominis barjeras b) priešmikrobinis sekretas ŠLAPIMO IR LYTINIAI TAKAI a) šlapimas b) rūgšti terpė c) licocimas d) pieno rūgštis lytiniuose takuose Virškinimo sistema a) rūgšti skrandžio terpė b) žarnyno flora 2 pav. Žmogaus kūno apsaugos barjerai gaminus didesniems citokinų kiekiams, išryškėja sisteminis jų poveikis, pasireiškiantis karščiavimu, leukocitoze, ūmios fazės baltymų sinteze. Bet koks odos pažeidimas leidžia mikroorganizmams patekti į organizmą ir skatina neutrofilų bei monocitų migraciją į pažeistą vietą. Neutrofilai ir monocitai gali keisti savo formą ir įsiskverbti pro kapiliaro sieneles į audinių skystį. Neutrofilai (mikrofagai) fagocituoja, susidaro endocitinės pūslelės, kurios susijungia su vienu iš ląstelės organoidų lizosoma; prarytas bakterijas suardo hidroliziniai fermentai. Monocitai virsta makrofagais (gr. makros didelis, ilgas + gr. phagos ėdikas), didelėmis fagocituojančiomis ląstelėmis, kurios gali išgyventi prarijusios šimtus bakterijų ir virusų. Išskirdami augimo veiksnį, makrofagai gali sukelti leukocitų skaičiaus padidėjimą. Makrofaguose fagocitozė vyksta panašiai kaip ir neutrofiluose.

32 32 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Nugalėjus infekciją, dalis leukocitų žūva. Kartu su negyvais audiniais, ląstelėmis, bakterijomis ir gyvaisiais leukocitais jie sudaro balsvai gelsvą medžiagą pūlius. Aprašyta uždegimo reakcija yra apsauginė, nes ji telkia leukocitus prie mikroorganizmų įsiskverbimo vietos, juos atpažįsta, suvirškina ir pašalina iš organizmo. Organizmo apsaugai ypač svarbūs komplemento baltymai kraujo plazmos baltymai, žymimi raide C. Komplementui aktyvinti labai svarbus ir kraujo serumo baltymas properdinas, kuris alternatyviuoju būdu aktyvina komplemento sistemą, bendrai stiprindamas apsaugines jėgas. Komplementas aktyvinamas, kai mikrobai patenka į organizmą. Jis,,papildo imuninius atsakus, dalyvauja uždegimo reakcijose ir jas stiprina, nes komplemento baltymai pritraukia į veiksmo vietą fagocitus. Komplemento baltymai prisitvirtina prie jau antikūnais padengto mikrobo paviršiaus, tuomet mikrofagai ar makrofagai gali fagocituoti tuos mikrobus. Palengvinta (dalyvaujant komplemento komponentams) fagocitozė dar vadinama opsonizacija (gr. opsonin paruošti maistą). Komplemento sistemos baltymai veikia mikrobų ląstelių paviršiuje. Komplemento aktyvinimo seka užsibaigia membranos puolimo komplekso suformavimu. Šis kompleksas pažeidžia membranų ir sienelių vientisumą, suardydamas mikrobo kaip ląstelės homeostazę, ir ląstelė žūsta. Virusu užsikrėtusios ląstelės gamina kitą baltymą interferoną, kuris taip pat dalyvauja fagocitozės procesuose. Interferonas prisijungia prie neužkrėstų ląstelių receptorių ir priverčia pasigaminti medžiagų galimam užpuolimui. Šios medžiagos trukdo virusui daugintis. Interferonas yra specifinis kiekvienai žinduolių rūšiai (pvz., žmonėms naudojamas tik žmogaus interferonas). Surinkti pakankamą interferono kiekį iš ląstelių kultūrų sudėtinga, todėl jis gaminamas rekombinantiniu būdu. Nespecifinėje organizmo apsaugoje be anatominių, fiziologinių, fagocitinių ir uždegimo barjerų svarbų vaidmenį atlieka ir makromolekulės, daugiausia baltymai. Žinoma, kad pažeidus kapiliarus kai kurios ląstelės išskiria bradikininą (gr. bradys lėtas + gr. kineo judinu). Ši medžiaga stimuliuoja receptorius, atsakingus už skausmą sukeliančius nervinius impulsus, ir skatina kamienines ląsteles išskirti histaminą (gr. histos audinys). Histaminas kartu su bradikininu išplečia kapiliarus ir didina jų pralaidumą. Kapiliarams išsiplėtus, oda parausta, padidėjus jų pralaidumui, išsiskiria baltymai ir skystis, dėl to atsiranda patinimas. Žinoma, kad temperatūros pakilimas mažina mikroorganizmų skaičių ir skatina fagocitozę. Svarbi ir augalinės arba gyvūninės kilmės peptidų defensinų (angl. defense gynyba, apsauga) veikla. Daugeliui bakterijų ir grybelių citotoksiški defensinai randami neutrofilų granulėse, odos ir gleivinių ląstelėse.

33 I Dalis III skyrius Specializuota apsaugos sistema Šią sistemą sudaro organų, ląstelių ir molekulių visuma, sauganti organizmo genetinį pastovumą, ginanti nuo infekcinių ligų sukėlėjų (virusų, bakterijų, parazitų ir kt.), infekuotų ir vėžinių ląstelių bei įvairių organizmui svetimų medžiagų. Specializuotai imuninei sistemai būdinga: paplitimas visame organizme, kur išsidėstę imuninės sistemos organai; sudarančių imuninę sistemą ląstelių ir molekulių (antikūnų, citokinų, sukibimo molekulių ir kitų veiksnių) nuolatinis judėjimas; unikalus sugebėjimas atpažinti ir sintetinti antikūnus specifines molekules kiekvienam antigenui; suformuoti imuninę atmintį, suteikiančią galimybę atpažinti ligos sukėlėją pakartotinai su juo susidūrus (pvz., skiepų naudojimo principas). Stresoriai CNS Hipofizio hormonai Endokrininiai hormonai Hipofizio peptidai ir kiti neuropeptidai Endokrininė sistema Endokrininiai hormonai (steroidai, prolaktinas ir kt.) Imuninė sistema 3 pav. Sąveika tarp endokrininės sistemos, centrinės nervų sistemos ir imuninės sistemos Taigi imuninė sistema savarankiška specializuota organizmo sistema, tokia kaip širdies ir kraujagyslių, nervų, virškinimo ir kt. Daugialąsčio organizmo imuninė sistema autonominė, tačiau nervų ir endokrininės sistemos integruoja jos veiklą ir kartu reguliuoja joje vykstančius procesus (gali būti ir atvirkštinė reguliacija). Imuninės sistemos sugebėjimas reaguoti į aplinkos veiksnius, atsakyti į

34 34 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI dirgiklius apsauginėmis reakcijomis ir apsaugoti organizmą vadinamas imunine homeostaze. Jos esminė funkcija organizmo vidaus terpės sudėties ir savybių dinaminio pastovumo palaikymas. Imuninės sistemos homeostazei turi įtakos nervų, endokrininės bei kraujo sistemos (3 pav.) Imuninės sistemos filogenezė Įvairių imuniteto formų lyginamasis ir istorinis įvertinimas leidžia objektyviau spręsti apie atskirų organizmo apsaugos formų efektorines (reaguoja į išorinius arba vidinius dirgiklius) funkcijas, nustatyti jų vaidmenį, reaguojant į organizmui svetimą medžiagą. Tiriant šiuos procesus vien tik žinduolių organizme, negalima atsakyti į daugelį klausimų, susijusių su ląstelinių ar humoralinių reakcijų sudėtingumu bei įvairove. Atliekant imuniteto filogenetinius tyrimus, galima apibūdinti įvairias imuninių reakcijų išraiškos formas: fagocitozę (organizmo gebėjimas suvirškinti yrančių audinių liekanas arba patekusius svetimkūnius), alogeninį slopinimą (procesų lėtinimas arba sustabdymas), ląstelinį ir humoralinį apsaugos tipus (4 pav. ). Fagocitozė procesas, kurio metu ląstelės sučiumpa ir,,praryja kietas daleles bei sunaikina organizmui svetimas medžiagas. Ši nespecifinė reakcija būdinga visiems gyvūnams. Alogeninis slopinimas nespecifinis svetimos medžiagos atpažinimas ir nukenksminimas. Jis būdingas visiems daugialąsčiams. Evoliuciniu požiūriu tiriant sudėtingesnes gyvūnų rūšis (pvz., jūrinių pinčių, duobagyvių ir kt.), pastebėta nauja apsaugos forma specifinis ląstelinis imunitetas. Šią apsaugos formą atlieka imunokompetentinės ląstelės. Pastarosios organizmo apsauginės formos filogenezė yra progresyvinio pobūdžio, t. y. pereinant prie sudėtingesnių gyvybės formų tobulėja imuniteto išraiškos formos. Stuburiniams organizmams būdingas humoralinis imunitetas gebėjimas sintetinti specifinius antikūnus konkrečiam antigenui. Ląstelių ir organų evoliucijos duomenys atskleidė ryšį tarp imuninės sistemos išsivystymo lygio ir filogenezės etapo. Limfocitų sistemos evoliucinė filogenezė pakankamai aiški, nes jos metu histogenetiniai procesai pakartojami tiesiogine linija. Manoma, kad imunitetas atlieka ir stabilizuojantį vaidmenį ne tik organizmo individualaus vystymosi periodu, bet ir organizmo formų evoliucijos metu. Mutaciniai organizmo ląstelių pokyčiai būdingi visiems gyvūnams, nepriklausomai nuo jų organizacijos tipo, t. y. išsivystymo lygio. Progresyvi somatinių ląstelių evoliucija būtų neįmanoma be mutacinių procesų evoliucinės kontrolės, kurios funkciją atlieka imuninė sistema. Tai nustatyta palyginus atskiras gyvūnijos organizacijos formas ir imuniteto evoliuciją skirtingais filogenezės etapais.

35 I Dalis III skyrius 35 Antriniaburniai Pirminiaburniai Žinduoliai Paukščiai Ropliai Nariuotakojai B Žuvys Bekaukoliai Ig Varliagyviai T Apskritažiomeniai Moliuskai Stuburiniai Tunikatai Chordiniai Nepilnachhordžiai Pogonoforai L Žieduotosios kirmėlės Dygiaodžiai Šeriažandžiai Transplantacinis imunitetas Alotransplantacija Plokščiosios kirmėlės Duobagyviai Apvaliosios kirmėlės Alogeninė inhibicija Pintys Fagocitozė Pirmuonys L limfocitai baltieji kraujo kūneliai, priskiriami negrūdėtiems leukocitams B limfocitai vienos iš pagrindinių imuninės sistemos ląstelių, kurios po susitikimo su antigenu diferencijuojasi į plazmines ląsteles, sekretuojančias antikūnus (humoralinis imunitetas) T limfocitai užkrūčio liaukoje subręstantys limfocitai, atsakingi už ląstelinį imunitetą Ig Imunoglobulinai glikoproteinų molekulės, atliekančios antikūnų funkcijas 4 pav. Gyvūnų filogenetinis vystymasis imuniteto formų raida (brūkšniuoti rutuliukai) Visas gyvūnijos pasaulis skirstomas į vienaląsčius ir daugialąsčius. Vienaląsčiai (pirmuonių tipas) atsirado dviejų geologinių erų katarchėjaus ir archėjaus (maždaug prieš 3 mlrd. metų) sandūroje. Daugialąsčių pasaulyje viena iš seniausių ir primityviausių formų jūrinės pintys. Įvertinus šiuo metu gyvenančių gyvūnų imunines reakcijas ir jas palyginus su geologinių iškasenų metraščiu, galima daryti prielaidas apie vienų ar kitų formų atsiradimo laiką (4 lent.).

36 36 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Rūšys Reaktyvumas Procesai 4 lentelė. Gyvūnų imuniteto filogenezė Pirmuonys Jūrinės pintys Duobagyviai Apvaliosios kirmėlės Apskritažiomeniai Žuvys Varliagyviai Ropliai Paukščiai Žinduoliai fagocitozė alogeninė inhibicija transplantacinis imunitetas T ląstelės plazmocitai MHC molekulės transplantato atmetimas T ir B ląstelių kooperacija ląstelinis ir humoralinis imunitetas nespecifinė reakcija, būdinga visiems gyvūnams; sučiupimas,,,rijimas ir sunaikinimas organizmui svetimos medžiagos nespecifinis svetimos medžiagos atpažinimas būdingas visiems daugialąsčiams grūdėti ir negrūdėti leukocitai; limfinės ląstelės; imuninė atmintis užkrūčio liauka; hemopoezės židiniai; makroglobulinai (Ig pirmtakai) IgM; J grandinė; stiprėja ląstelinio imuniteto reakcijos limfocitai limfmazgiuose; limfocitų heterogeniškumas; transplantatų atmetimas išsivystę organai: užkrūčio liauka, limfamazgiai, limfinis audinys (žarnos, blužnis); greičiau atmetami transplantatai Fabricijaus maišelis; M, A, E klasių imunoglobulinai; lėtos alerginės reakcijos aukščiausias imuninės sistemos raidos lygis; T ir B limfocitų heterogeniškumas; atsiranda IgD ir IgE; padidėjęs citokinų vaidmuo; imuninės sistemos integracija Daugialąsčių organizme (maždaug prieš 2 mlrd. metų) pastebėta reakcija į svetimą medžiagą, kuriai būdingas tik alogeninio slopinimo principas. Tokios apsauginės formos tikslas sunaikinti mutacijas patyrusias somatines ląsteles, kurios neišvengiamai atsiranda daugialąsčių organizme. Neimuninis audinių atmetimas aprašytas tiriant gėlavandenių pinčių (Ephydatia fluviatilis), jūrinių pinčių (Axinella mexicana ir Cyamon argon), kai kurių duobagyvių (Anthozoa, Hydrozoa) rūšis. Imuninės atminties ar kitų imuninės reakcijos formų nepastebėta. Organizmo imuninės apsaugos formų evoliucijos tolesnis etapas transplantacinis imunitetas. Pirmosios alotransplantacinės reakcijos, turinčios imuninę atmintį, pastebėtos tiriant kai kurias pinčių (Callispongia diffusa) ir

37 I Dalis III skyrius 37 duobagyvių (Montipora verrucosa) rūšis. Transplantacinio tipo reakcijos (imuninė atmintis) aprašytos tiriant apvaliąsias kirmėles, dygiaodžius, žuvis, varliagyvius, roplius ir, žinoma, žinduolius. Filogenezės metu intensyvėja transplantacinio atmetimo reakcijos, tačiau tai neabsoliutus dėsningumas, o tik tobulėjimo formos ir krypties išraiška, pvz., ropliai silpniau reaguoja į svetimą audinį negu, filogenezės požiūriu, žemesnės organizacijos gyvūnai (žuvys, varliagyviai ir pan.). Išsamesnė informacija apie alotransplantacinį imunitetą sukaupta tiriant stuburinius gyvūnus. Greito tipo alotransplantacijos atveju paukščių ir žinduolių organizme transplantatas atmetamas per 14 dienų, o lėto tipo alotransplantacijos atveju, pvz., roplių organizme transplantatas išsilaiko ilgiau apie 30 dienų Imuninės sistemos ontogenezė Evoliucijos metu ir žinduolių, ir žmogaus organizme susiformavo sudėtinga specifinė imuninė sistema, kuri būdinga kiekvienam subrendusiam sveikam organizmui. Individualus organizmo imuninės sistemos vystymasis ontogenezė visuma imunologinių pakitimų, vykstančių nuo individo gimimo iki jo mirties. Ontogenezės procesai glaudžiai susiję su kraujodaros sistema, nes kraujodaros ir imuninės sistemos turi bendrą pirmtaką kamieninę ląstelę. Įvairių rūšių gyvūnų imuninės sistemos vystymasis skirtingas ir, pirmiausia, priklauso nuo nėštumo trukmės (5 lent.). Embrioniniu periodu kamieninės ląstelės, kilusios iš pirminės kraujo sistemos ląstelės, cirkuliuoja kraujyje ir nusėda geltonajame maišelyje, naujų kraujagyslių susidarymo vietoje. Čia ankstyvosios embriogenezės metu prasideda kraujodaros procesas paukščių ir žinduolių organizme. Vėliau, fetaliniu (lot. fetus vaisius) periodu, pagrindinis kamieninių ląstelių šaltinis kepenys. Kamieninės ląstelės iš kepenų migruoja į užkrūčio liauką, blužnį, kaulų čiulpus ir limfmazgius. Žmogaus imuninės sistemos ontogenezė geriau išnagrinėta, todėl daugiau žinoma ir apie atskirų organų bei ląstelių vystymąsi (6 lent.). Pirminio limfinio organo užkrūčio liaukos užuomazgos stebimos jau 6 nėštumo savaitę, kai kamieninės ląstelės iš geltonojo maišelio kepenyse migruoja į šio būsimo organo lokalizacijos vietą. Antrą nėštumo mėnesį atsiranda pirmieji limfocitai, kurie gali reaguoti su audinių dermės antigenais. Proliferuodami jie greitai užpildo tarpus tarp epitelinių ląstelių. Lyginant su kūno svoriu, didžiausia užkrūčio liauka vaisiaus organizme gimimo metu ir pirmuosius dvejus metus po gimimo. Organas didėja iki

38 38 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI lytinės brandos (paauglystės), o vėliau prasideda involiucija, t. y. liauka nyksta, peraugdama į riebalinį audinį. Jau antrą gemalo vystymosi mėnesį raktikauliuose pradeda vystytis kaulų čiulpai pagrindinis kamieninių ląstelių šaltinis. Vėliau, trečią mėnesį, formuojasi plokščiuosiuose kauluose, o nuo ketvirto mėnesio ir vamzdiniuose kauluose. Nuo penkto iki septinto mėnesio rezorbuojasi kaulinės pertvaros ir formuojasi kaulų čiulpų kanalai. Suaugusiame organizme kaulų čiulpuose subręsta daugelis imunokompetentinių ląstelių: B limfocitai, monocitai, NK ląstelės ir kt. 5 lentelė. Skirtingų gyvūnų rūšių imuninės sistemos organų vystymosi embrioniniu periodu trukmė (paromis) Rūšis Nėštumo trukmė Užkrūčio liauka Blužnis Limfmazgiai Fabricijaus maišelis Žarnyno limfinis audinys Višta Pelė Triušis Kiaulė Avis Penktą nėštumo savaitę nustatoma blužnies užuomazga. O septintą ir aštuntą savaitę jau randama ir makrofagų, o vėliau B limfocitų (dvyliktą savaitę). Nors blužnyje vyksta aktyvi kraujo ląstelių gamyba, prieš gimimą ji susilpnėja, o gimstant galutinai sustoja. Suaugusiame organizme blužnis turi raudonąją pulpą ir baltąją pulpą. Senstant žmogaus organizmui, ir raudonoji, ir baltoji blužnies pulpa išnyksta. Teigiama, kad limfmazgiai galutinai susiformuoja trečiaisiais gyvenimo metais. Embriogenezės metu jau trečio mėnesio pradžioje aplink besiformuojančias limfagysles ima kauptis mezenchiminių ląstelių, kurios tampa limfmazgių pirmtakais. Senatvėje gemaliniai centrai nyksta ir gali net peraugti į riebalinį audinį. Ketvirtą ir penktą nėštumo mėnesį blužnyje padidėja B limfocitų skaičius, kurie in vitro sąlygomis sintetina IgM ir IgG, blužnyje atsiranda T limfocitų, vyksta komplemento C1, C4 komponentų sintezė. Daugiau negu 30 metų buvo manoma, kad embrionas imunologiškai nekompetentingas, tačiau ši nuomonė pasikeitė, kai buvo įdiegti nauji imunologiniai metodai.

39 I Dalis III skyrius 39 6 lentelė. Žmogaus imuninės sistemos vystymasis ir funkcijos Amžius savaitėmis Pagrindiniai etapai 3 Hemopoezė geltonajame maišelyje 5 Blužnies užuomazga; kepenų ląstelės reaguoja su anti-t serumu 6 Užkrūčio liaukos užuomazga; HLA sistemos antigenai 7 Limfocitų atsiradimas periferiniame kraujyje; limfinės ląstelės reaguoja į aloantigenus 8 Užkrūčio liaukoje atsiranda limfocitų (timocitų); komplemento komponentų (C2, C4, C5) ir interferono sintezė 9 Kepenyse atsiranda limfocitų, kurių membranoje yra IgM determinantų; prasideda lizocimo sintezė 11 Kaulų čiulpų funkcionavimo pradžia; limfopoezė blužnyje; užkrūčio liaukoje formuojasi žievinis ir šerdinis sluoksniai; timocitai sudaro E-rozetes 12 IgG sintezė; limfopoezė limfmazgiuose; timocitai reaguoja į aloantigenus (tos pačios rūšies gyvūnų antigenus) 13 Blužnyje atsiranda limfocitų, kurių membranoje yra IgG ir E-rozetes sudarančių ląstelių; blužnies limfocitai reaguoja į FHA; atsiranda T limfocitų 14 Blužnies ir kraujo limfocitai įgyja citotoksinių savybių; blužnyje atsiranda EAC-rozetes sudarančių ląstelių; sintetinamas komplemento C1 komponentas 15 Kraujo limfocitai sudaro E-rozetes 16 Komplemento C7, C9 komponentų ir C3 aktyvatoriaus sintezė; timocitai įgyja citotoksinių savybių Blužnyje padidėja B limfocitų skaičius ir atsiranda T limfocitų; blužnies limfocitai in vitro sintetina IgM ir IgG; komplemento C4 komponento sintezė Taigi imuninės sistemos filogenezė ir ontogenezė sudėtingi procesai, susiję ne tik su individualiu apsauginių sistemų vystymusi, bet ir atspindintys tiriamo organizmo filogenezės pakopą.

40 40 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI SANTRAUKA Žmogaus ir įvairių rūšių gyvūnų bei paukščių organizme apsaugines funkcijas atlieka apsaugos sistema. Skiriamos nespecializuota ir specializuota apsaugos sistemos, kurių visuma ir lemia imuniteto išsivystymą svetimai genetinei informacijai, savoms infekuotoms ar transformuotoms ląstelėms. Evoliucijos metu žinduolių organizme susiformavo sudėtinga imuninė sistema. Filogenezė atskirų apsaugos formų lyginimas ir istorinis įvertinimas leidžia spręsti apie atskirų apsaugos būdų (fagocitozė, alogeninis slopinimas, transplantacinės reakcijos, specifinio imuninio atsako reakcijos) atsiradimo laiką, jų sandarą ir efektyvumą. Fagocitozė procesas, kurio metu specialios ląstelės,,sučiumpa ir,,praryja kietas daleles bei sunaikina organizmui svetimas medžiagas, yra nespecifinė apsaugos reakcija, būdinga visiems gyvūnams. Alogeninis slopinimas nespecifinis svetimos medžiagos atpažinimas ir nukenksminimas. Šis procesas būdingas visiems daugialąsčiams. Transplantacinio atmetimo reakcijos anksčiausiai filogenetiniu požiūriu pastebėtos tiriant pintis ir duobagyvius. Išsamesnė informacija apie transplantacines reakcijas sukaupta tiriant stuburinius gyvūnus. Gleivinių limfinis audinys, aptinkamas bežandžiuose (nėgėse), filogenetiniu požiūriu yra anksčiausiai pasirodantis limfinis audinys. Apskritažiomenių organizme randama ne tik užkrūčio liaukos bei hemopoezės židinių, bet ir T ląstelių. Kaulinės ir kremzlinės žuvys jau turi susiformavusią užkrūčio liauką, blužnį, T ir B limfocitus, plazmocitus, J grandinę ir IgM molekules (kaulinėse žuvyse atsiranda IgD ir IgT/Z klasių antikūnų). Varliagyvių ir roplių organizme jau aptinkama kaulų čiulpų, gemalinių centrų ar limfmazgių, IgM IgY ir IgD klasės antikūnų. Paukščių organizme IgM, IgY ir IgA antikūnų bei tik jiems būdingas imuninės sistemos organas Fabricijaus maišelis. Žinduolių imuninė sistema filogenetiniu požiūriu pasiekusi aukščiausią išsivystymo laipsnį: turi išsivysčiusius imuninės sistemos organus, limfocitų populiacijas ir subpopuliacijas, gamina penkių klasių (IgM, IgG, IgA, IgD ir IgE) antikūnus. Ontogenezė tiria individualų imuninės sistemos vystymąsi nuo individo gimimo iki jo mirties. Įvairių rūšių gyvūnų imuninės sistemos vystymasis yra skirtingas ir priklauso nuo nėštumo trukmės. Ontogenezė glaudžiai susijusi su kraujodaros sistema, nes šios sistemos turi vieną bendrą pirmtaką kamieninę ląstelę. Hemopoetinės kamieninės ląstelės, iš kurių vystosi nespecifinio ir specifinio imuniteto ląstelės, pirmiausia randamos embriono trynio maišelyje, po to pasirodo vaisiaus kepenyse ir galiausiai kaulų čiulpuose. Ankstyvos embriogenezės periodu paukščių ir žinduolių organizmuose prasideda kraujodaros procesas. Iš daugiagaliosios kamieninės ląstelės gaminasi mieloidinio tipo pirmtakai (eritroidinės, granuliocitinės, monocitinės ir megakariocitinės ląstelės), kurios vėliau tampa bazofilais, eozinofilais, neutrofilais, monocitais ir trombocitais, ir limfoidinio tipo pirmtakai, iš kurių gaminasi limfocitų populiacijos. Antrąjį žmogaus embriono vystymosi mėnesį raktikauliuose pradeda gamintis kaulų čiulpai. Vėliau kaulų čiulpai gaminasi plokščiuosiuose kauluose, o paskui ir vamzdiniuose kauluose (ketvirtas nėštumo mėnuo). Nuo 6-ojo nėštumo mėnesio kaulų čiulpai tampa svarbiausia universalia kraujo ląstelių gamybos vieta.

41 I Dalis III skyrius 41 Žmogaus užkrūčio liaukos užuomazgų randama jau 5 6 nėštumo savaitę. 8-ą nėštumo savaitę joje aptinkami ir pirmieji limfocitai. Didžiausia užkrūčio liauka pagal lyginamąjį kūno svorį būna vaisiaus gimimo metu ir kaip organas didėja iki lytinio subrendimo, vėliau prasideda jos involiucija (nykimas), nors atskiros liaukos salelės išlieka visą gyvenimą. Žmogaus embrione 5-ą nėštumo savaitę atsiranda blužnies užuomazgų, 7 8 savaitę joje randama makrofagų, o nuo 12-os savaitės B limfocitų. Dauguma žmogaus embriono limfinių mazgų pradeda formuotis 9 10 nėštumo savaitę. Nuo 16-os savaitės jie užpildomi T ir B ląstelių pirmtakais. Limfmazgiai galutinai susiformuoja žmogaus trečiaisiais gyvenimo metais. Dalis limfinio audinio ir ląstelių išsidėsto gleivinėse (žarnyno, bronchų ir t. t.) ir sąlygoja gleivinių imunitetą.

42 42 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI IV skyrius 4. IMUNINĖS SISTEMOS ORGANAI Ne tik žmogaus, bet ir visų žinduolių limfinė sistema sudaryta iš limfagyslių, limfinių audinių ir limfinių organų (5 pav.) Limfagyslės Limfagyslės glaudžiai susijusios su širdies ir kraujagyslių sistema. Limfagyslių yra gana daug, daugelyje organizmo vietų yra nemažai ir limfinių kapiliarų (6 pav.). Didesniųjų limfagyslių sandara panaši į venų. Jose taip pat yra vožtuvai. Limfagyslės atlieka 3 pagrindines funkcijas: surenka audinių skysčio perteklių ir grąžina jį į kraują; limfiniai kapiliarai sugeria riebalus plonosios žarnos gaureliuose ir perneša juos į kraują; limfinė sistema padeda organizmui apsiginti nuo ligų. Limfa skaidrus skystis, cirkuliuojantis žmogaus ir stuburinių gyvūnų limfinėje sistemoje ir tarp ląstelių esančiame audinių skystyje. Chemine sudėtimi limfa artima kraujo plazmai, nes nuolat gaminasi iš kraujo filtracijos būdu. Limfos judėjimas limfagyslėmis priklauso nuo skeleto raumenų susitraukimų. Limfa juda viena kryptimi ir prasideda limfiniais kapiliarais. Šie kapiliarai surenka skystį, kuris difuzijos būdu išsiskyrė iš kraujo kapiliarų, bet atgal nebuvo sugrąžintas. Audinių skystis, patekęs į limfagysles, jau yra limfa. Susijungę limfiniai kapiliarai sudaro limfagysles, kurios susilieja prieš įtekėdamos į vieną iš dviejų limfinių latakų: krūtininį arba dešinįjį limfinį lataką. Krūtininis latakas yra daug didesnis už dešinįjį limfinį lataką. Į jį suteka limfa iš apatinių galūnių, pilvo, kairės rankos, galvos ir kaklo kairės pusės. Į dešinįjį limfinį lataką įteka limfa iš dešinės rankos, galvos ir kaklo dešinės pusės, dešinės krūtinės dalies. Limfiniai latakai įteka į krūtinės srityje esančias širdies ir kraujagyslių sistemos venas poraktikaulines venas.

43 I Dalis IV skyrius Limfiniai organai Žmogaus limfinės sistemos organai skirstomi į pirminius ir antrinius organus (7 pav.). Pirminius organus sudaro kaulų čiulpai ir užkrūčio liauka. Pirminiuose organuose gaminasi ir bręsta limfocitai. Antriniuose organuose (limfmazgiai, blužnis, odos ir gleivinių limfiniai dariniai) susiformuoja imuninės sistemos atsakas antigenams. Limfocitų sankaupos jungiamajame audinyje ar kituose organuose, išskyrus centrinę nervų sistemą, taip pat dalyvauja imuninėse reakcijose. Tonzilės Kaklo limfmazgiai Limfinis latakas Užkrūčio liauka Pažastiniai limfmazgiai Krūties limfagyslės Blužnis Storosios žarnos Plonosios žarnos Pilvo limfmazgiai Pejerio plokštelės Kirmėlinė atauga Raudonieji kraujo čiulpai Kirkšniniai limfmazgiai Limfagyslės 5 pav. Žmogaus limfinė sistema

44 44 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Audinys Limfiniai kapiliarai Limfagyslės Aferentinės (įtekamosios) limfagyslės Limfmazgis Antrinis folikulas Eferentinės (išekamosios) limfagyslės Gemalinis centras 6 pav. Limfagyslės ir limfiniai kapiliarai Limfiniai organai Pirminiai (centriniai) organai Antriniai (periferiniai) organai Kaulų čiulpai Limfmazgiai Užkrūčio liauka Blužnis Žarnyno ir kiti limfinio audinio telkiniai 7 pav. Limfinių organų pasiskirstymas

45 I Dalis IV skyrius Pirminiai (centriniai) limfiniai organai Kaulų čiulpai tai kaulų (krūtinkaulio, stuburo, šonkaulių, dubens ir kaukolės) viduje esantis audinys, priskiriamas pirminiams limfiniams organams (8 pav.). Kaulų čiulpai sudaryti iš kraujodaros audinio, kraujagyslių (centrinė arterija, spindulinė arterija, venos, venų sinusai) tinklo, kamieninių ląstelių ir jų pirmtakų. Kaulų čiulpuose vyrauja kamieninės ląstelės, o limfocitai sudaro tik nedidelę dalį apie 10 proc. viso ląstelių skaičiaus. Kaulų čiulpuose limfocitai išsidėsto aplink spindulines arterijas. Įvairių ląstelių pirmtakų proliferaciją ir subrendimą stimuliuoja citokinai: interleukinas 7 (IL-7), granuliocitų ir makrofagų kolonijų susidarymą stimuliuojantis faktorius (GM- CSF), granuliocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (G-CSF); taip pat T limfocitai ir makrofagai, sintetindami įvairius citokinus. Visų žinduolių kaulų čiulpuose bręsta ir diferencijuojasi B limfocitai ir kitos imunokompetentinės ląstelės. Smegenys Kepenys Kaulas CNS ląstelės Skeleto raumenys Kaulų čiulpai Adipocitas Kraujo ląstelės Kraujagyslė Kaulų čiulpų stromos ląstelės Epitelio ląstelės Širdies raumuo Neuronas Gijos ląstelės 8 pav. Kaulų čiulpų vaidmuo imuniteto susidarymui

46 46 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Sergant kraujodaros ir tam tikromis onkologinėmis ligomis kaulų čiulpai gali būti persodinami. Tokios operacijos metu hemopoetinės kamieninės ląstelės perkeliamos iš vieno asmens kitam arba tam pačiam asmeniui (esant dar sveikam) iš anksčiau paimtų kamieninių ląstelių. Jei donoras ir recipientas imunologiškai suderinami (pagal leukocitų dermės antigenus), suleistos ląstelės keliauja į recipiento kaulų čiulpus ir skatina kraujo ląstelių gamybą. Manoma, kad kaulų čiulpuose iš bendrosios kamieninės ląstelės diferencijuojasi dendritinės bei putliosios ląstelės. Kitas pirminis limfinis organas užkrūčio liauka, kurioje vyksta T limfocitų vystymasis ir brendimas (5 pav.). Dėl savo panašumo į čiobrelį kartais vadinama čiobrialiauke. Anatominiu požiūriu užkrūčio liauką galima apibūdinti kaip išilgai trachėjos išsidėsčiusią belatakę liauką, esančią krūtinės ląstoje už krūtinkaulio ir susidedančią iš puraus jungiamojo audinio sujungtų kairės ir dešinės skilčių. Liauką dengia plonas jungiamojo audinio apvalkalas, o nuo apvalkalo į vidų eina pertvaros, dalijančios užkrūčio liauką į skilteles (9 pav.). Skiltelės susideda iš epitelinio audinio, tarp kurio įsiterpę timocitai T ląstelių pirmtakai. Pakraštyje esančioje žievinėje dalyje be minėtų limfocitų dar yra makrofagų, plazminių ląstelių, o viduje esančioje šerdinėje dalyje plokščių ir regeneruojančių epitelinio audinio ląstelių, vadinamų Hasalio kūneliais (šerdinėje dalyje epitelinio audinio vijos). Kaip anksčiau buvo rašyta, užkrūčio liauka pradeda funkcionuoti gemaliniu (fetaliniu) laikotarpiu. Palyginti su kūno svoriu, užkrūčio liauka yra didžiausia Besidalijantis timocitas Trabekulė Žuvusi ląstelė Timocitas Nauja ląstelė Žievės epitelinė ląstelė ŠERDIS ŽIEVĖ Kraujagyslė Dendritinė ląstelė Makrofagas Hasalio kūneliai 9 pav. Užkrūčio liaukos struktūra

47 I Dalis IV skyrius 47 naujagimio (apie 25 g), maksimalaus svorio (35 g) būna paauglystėje, pasiekus lytinę brandą (12 19 m.). Su amžiumi (20 60 m.) palaipsniui nyksta, jos masė mažėja (60 m. apie 15 g) ir šios liaukos vietą užpildo riebalinis audinys. Epitelinis audinys užkrūčio liaukoje gamina hormonus: timuliną, timoziną, timopentiną, kurie nulemia kaulų čiulpų kamieninių ląstelių vystymąsi į T limfocitus. Timocitų pirmtakai protimocitai iš kaulų čiulpų keliauja į žievinę užkrūčio liaukos dalį, kur veikiami mikroaplinkos toliau diferencijuojasi ir proliferuoja, o dalis jų žūsta. Išlikusios ląstelės įgyja timocitams būdingų savybių ir keliauja į šerdinę dalį, kur bręsta toliau. Šiam procesui svarbus timocitų kontaktas su epitelinėmis ląstelėmis, jų gaminamais hormonais. Subrendę T limfocitai per pokapiliarines venules patenka į kraują ir į T ląstelių zonas antriniuose limfiniuose organuose. Po brendimo laikotarpio naujų T limfocitų ji gamina mažiau, bet antriniuose organuose šis pokytis nenustatomas. Tiems žmonėms, kurių užkrūčio liauka nepakankamai išsivysčiusi, arba kurie gimę be jos, gali išsivystyti imuniteto nepakankamumas. Toks organizmas neatsparus aplinkos veiksniams, ligų sukėlėjams Antriniai (periferiniai) limfiniai organai Šiems limfiniams organams priskiriami visi limfiniai organai, kuriuose vyksta imuninio atsako skatinimas, išskyrus pirminius limfinius organus kaulų čiulpus ir užkrūčio liauką. Pirmiausia, tai blužnis, kuri lemia antigeno cirkuliaciją, ir limfmazgiai, kuriuose susikoncentravę T, B limfocitai, antigeną pateikiančios ir kitos ląstelės. Blužnis biologinis kraujo filtras, per kurį pašalinamos pasenusios, pažeistos ląstelės, įvairūs mikroorganizmai. Blužnis dalyvauja kai kurių medžiagų apykaitoje, pvz., geležies. Žmogaus blužnis, kurios ilgis daugiau nei 12 cm, o masė g, yra pilvo ertmės viršuje kairėje pusėje, tarp skrandžio ir dia fragmos (10 pav.). Iš visų pusių blužnį supa pilvaplėvė (kapsulė), išskyrus vartus, pro kuriuos įeina arterijos, nervai, išeina venos. Jos paviršius padengtas jungiamojo audinio kapsule, nuo kurios į blužnies vidų atsišakoja pertvaros, skaidančios blužnį į skiltis. Tarp pertvarų yra pulpa. Blužnyje vyrauja raudonoji pulpa, kur susitelkia eritrocitai, trombocitai, limfocitai, makrofagai, plazminės ląstelės. Čia ardomi pasenę ar pakitę eritrocitai, hemoglobinas verčiamas bilirubinu, atsipalaidavusi geležis grįžta į cirkuliaciją. Baltąją pulpą sudaro periarterinis limfinis apvalkalas. Vidiniame šio apvalkalo sluoksnyje daugiausia susitelkę T limfocitai. Išoriniame sluoksnyje yra T ir B limfocitų. B limfocitai šio sluoksnio pakraštyje formuoja limfinius folikulus, vadinamus Malpigijaus kūneliais. Baltojoje pulpoje yra dendritinių ląstelių, kurios sąveikauja su antigenu ir pateikia jį

48 48 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Vena Arterija Baltoji pulpa Raudonoji pulpa Blužnis Kapsulė 10 pav. Blužnis ir jos struktūra T ląstelėms. T helperiai (pagalbininkai) aktyvina antigenui specifinius B limfocitus, kurie migruoja į pirminius folikulus (limfinio audinio suformuoti sferinės formos dariniai, kuriuose susitelkę neaktyvinti B limfocitai, dendritinės ląstelės, makrofagai). Antigenui stimuliuojant susidaro antriniai folikulai (šviesesnė limfinio audinio dalis gemaliniame centre, kurį sudaro B limfocitai, atminties ir plazminės ląstelės). Subrendusios plazminės ląstelės būna arteriolių išorinėje ribinėje zonoje. Kraujui tekant per raudonąją pulpą, vyksta aktyvi fagocitozė, o kraujyje esantys antigenai baltojoje pulpoje sukelia specifinį imuninį atsaką, pasireiškiantį antikūnų sinteze. Kartais dėl ligos ar traumos blužnį tenka pašalinti. Nors blužnies funkcijas kompensuoja kiti organai, žmogus dažnai lieka jautresnis infekcijoms. Kitas antrinis limfinis organas limfmazgiai (5 pav.). Šie ovalo formos arba apvalūs dariniai sutinkami daugelyje organizmo vietų ten, kur susijungia limfą surenkančios limfagyslės. Limfmazgiai dažniausia išsidėsto grupėmis tam tikrose kūno vietose, pvz., kirkšniniai mazgai yra kirkšnyse, o pažastiniai limfmazgiai pažastyse. Žmogaus limfmazgiai yra 1 25 mm dydžio, rausvai pilkos spalvos. Jie išsidėstę beveik visame organizme, išskyrus smegenis, kaulus, kaulų čiulpus, pėdas ir plaštakas. Kiekvienas limfmazgis yra įsiterpęs į limfagyslę ir sudaro sritinius limfmazgius. Įtekančios (aferentinės) ir ištekančios (eferentinės) limfagyslės praeina pro skaidulinio jungiamojo audinio kapsulę (11 pav.). Jungiamasis audinys dalija limfmazgį į atskiras skilteles. Limfmazgiuose B limfocitai susitelkia pirminiuose ir antriniuose limfiniuose folikuluose, kurie išsidėstę limfmazgio žievėje, todėl ji vadinama B ląstelių zona. T ląstelės išsisklaidžiusios limfmazgio požievinėje srityje T ląstelių zonoje.

49 I Dalis IV skyrius 49 Aferentinės limfagyslės Gemaliniai centrai Pokapiliarinė venulė Pirminis limfinis folikulas Kapsulė Kapsulė Pokapiliarinės venulės pjūvis Gemaliniai centrai B limfocitai Limfmazgio arterija Limfmazgio vena Eferentinės limfagyslės 11 pav. Limfmazgio struktūra 4.5. Limfiniai audiniai kituose organuose Greta limfagyslių tinklo, limfinių organų yra limfiniai audiniai, kurie visi kartu ir sudaro limfinę sistemą. Šios visos sistemos uždavinys limfos gamyba, filtravimas bei judėjimas. Limfinius audinius, kaip limfinės sistemos dalį, sudaro tankūs limfocitų ir kitų leukocitų telkiniai, įsiterpę į jungiamąjį audinį. Limfinių audinių daugiausia susitelkę tose vietose, pro kurias lengviausiai į organizmą patenka patogeniniai mikroorganizmai, dažniausiai netoli epitelio, gleivinėse. Viena iš limfinio audinio sankaupų ryklėje tonzilės, kurios išsidėsčiusios burnos gale abiejose liežuvio pusėse (5 pav.). Kartu su limfiniais folikulais vyksta antigenų sužadinta B ląstelių proliferacija ir diferenciacija, formuojasi nuo T ląstelių priklausomas imuninis atsakas. Antriniams limfiniams organams priskiriami ir adenoidai limfinio audinio dalis ryklėje. Limfmazgiai, tonzilės ir adenoidai kartu sudaro limfoepitelinį ryklės Valdejerio žiedą, kuris trukdo mikrobams ir nuodingosioms medžiagoms patekti į organizmą.

50 50 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Plonųjų žarnų sienelės pogleiviniame sluoksnyje randama limfinių folikulų sankaupų Pejerio plokštelės (2 12 mm ilgio ir 1 3 mm pločio dariniai) (5 pav.). Skirtingai nuo limfmazgių, Pejerio plokštelės neturi kapsulės. Plokštelių sudėtyje vyrauja B limfocitai (iki 70 proc.), T limfocitai sudaro procentų. Sankaupų kiekis priklauso nuo amžiaus: vaikų organizme jų būna iki 50, suaugusiųjų iki 30, o senų žmonių plokštelių. Virškinimo sistemos limfinio audinio dalis kirmėlinė atauga (apendiksas) (5 pav.). Kirmėlinės ataugos pogleivyje telkiasi 0,2 0,5 mm limfiniai folikulai, kurių 10 cm ilgio ataugoje randama iki 1500 vienetų. Taigi žmogaus limfinę sistemą sudaro limfagyslių tinklas, limfiniai organai ir audiniai, išsidėstę visame organizme, palaikantys imuninę homeostazę ir apsaugantys organizmą nuo ligų sukėlėjų bei kenksmingų medžiagų Kiti imuninės apsaugos organai Oda kaip mechaninis barjeras dalyvauja nespecifinėje organizmo apsaugos sistemoje, tačiau gali dalyvauti ir imuninėje apsaugoje (12 pav.). Odos imuninė sistema sudaryta iš epidermio ir dermos (tikroji oda) sluoksnių. Imuninėje apsaugoje dalyvauja epidermio epitelinės ląstelės (keratinocitai), dendritinių ląstelių rūšis Langerhanso ląstelės, nedidelis kiekis limfocitų, įsiterpusių į epidermio ląsteles intraepiderminiai limfocitai. Visos šios ląstelės skatina leukocitų chemotaksį, sekretuoja citokinus ir chemokinus, veikia ląstelių paviršiaus molekules, aktyvina T limfocitus, saugo organizmą nuo gausaus antigenų antplūdžio, su kuriuo pirmiausia susiduria gleivinių epitelis. Gleivinių plazminės ląstelės sintetina sekrecinius IgA (siga), kurie išskiriami į gleivinių sekretą. Šie antikūnai labai svarbūs gleivinių imunitetui. Kita dalis limfocitų ir pavieniai makrofagai išsidėsto dermoje apie kraujagysles. T ląstelių paviršiuje yra molekulių, kurios būdingos aktyvintoms ir atminties ląstelėms. Gleivinių epitelinis audinys yra svarbus barjeras ligų sukėlėjams ir kitiems elementams, turintiems antigeninių savybių, patekti į organizmą (13 pav.). Prie šio barjero prisideda ir kiti anksčiau minėti nespecifinės apsaugos veiksniai. Pirma, gleivinės apsaugo nuo mikroorganizmų įsiveržimo ir jų dauginimosi. Antra, neleidžia į organizmą pakliūti įvairioms maisto ar nepatogeninių mikroorganizmų išskiriamoms medžiagoms (antigenams). Trečia, gleivinėse kiekvieną dieną IgA gaminasi žymiai daugiau negu kitų imunoglobulinų limfiniuose organuose. Gleivinių limfinis audinys MALT (angl. mucosa associated lymphoid tissue) išsisklaidęs po visą organizmą, tiksliau, po visą limfinio audinio sistemą. Tokio audinio yra virškinimo bei kvėpavimo sistemose, odoje, skydliaukėje,

51 I Dalis IV skyrius 51 Epidermis Langerhanso ląstelė Keratinocitai Intraepiderminiai limfocitai Limfocitai Oda (tikroji) Migruojanti ląstelė Audinių makrofagai Aferentiniai limfiniai takai Į lmfmazgį Limfmazgis Pirštuota dendritinė ląstelė 12 pav. Odos imuninės sistemos struktūra akyse, krūtyse, seilių ir kitose liaukose. Šiame audinyje randama T ir B ląstelių, plazminių ląstelių ir makrofagų. Visos šios ląstelės saugo organizmą nuo gausaus antigenų antplūdžio, su kuriuo pirmiausiai susiduria gleivinių epitelis. Gleivinių limfinis audinys skirstomas pagal tai, kokioje organizmo vietoje jis yra, tačiau svarbiausią gleivinių limfinį audinį sudaro: virškinimo sistemos limfinis audinys GALT (angl. gut-associated lymphoid tissue); kvėpavimo takų gleivinės limfinis audinys BALT (angl. bronchus-associated lymphoid tissue); kitų gleivinių limfinis audinys. Atskirų organų limfinis audinys turi atitinkamus pavadinimus: akių gleivinės limfinis audinys EALT, nosies gleivinės limfinis audinys NALT, gerklų gleivinės limfinis audinys LALT, odos gleivinės limfinis audinys SALT, kraujagyslių gleivinės limfinis audinys VALT.

52 52 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI M (gleivinės) ląstelė Tarpląstelinė erdvė Antigenas Limfocitai Makrofagas Gleivinės epitelis Gleivinės plokštelė Spindis Antigenas Limfoidinis folikulas M ląstelė Intraepitelinis limfocitas Plazminė ląstelė IgA IgA SANTRAUKA 13 pav. Gleivinių imuninės sistemos struktūra Visų žinduolių imuninė sistema sudaryta iš limfagyslių, limfinių audinių ir limfinių organų. Limfagyslės surenka audinių skysčių perteklių ir grąžina jį į kraują, įtekėdamos į veninę kraujotakos sistemą. Limfagyslės yra užpildytos skaidriu skysčiu limfa, kuri savo chemine sudėtimi artima kraujo plazmai, ir žmogaus, ir stuburinių gyvūnų limfinėje sistemoje cirkuliuoja viena kryptimi. Limfiniai organai skirstomi į pirminius (centrinius) ir antrinius (periferinius) organus. Pirminius organus sudaro kaulų čiulpai ir užkrūčio liauka. Pirminiuose organuose gaminasi ir bręsta T ir B limfocitai, NK ląstelės ir kitos imuninės sistemos ląstelės. Paukščių organizme Fabricijaus maišelyje bręsta ir diferencijuojasi B limfocitai. Antriniuose organuose (blužnis, limfmazgiai, odos ir gleivinių audiniai) susiformuoja imuninis atsakas antigenams. Kaulų čiulpai tai kaulų (krūtinkaulio, stuburo, šonkaulių, dubens ir kaukolės) viduje esantis audinys, priskiriamas pirminiams limfiniams organams. Žinduolių kaulų čiulpuose vyksta hemopoezė, todėl juose bręsta ir diferencijuojasi B limfocitai ir kitos imunokompetentinės ląstelės, išskyrus T limfocitus. Užkrūčio liauka, kurioje vyksta T limfocitų brendimas, išsidėsčiusi išilgai trachėjos, yra krūtinės ląstoje už krūtinkaulio ir susideda iš jungiamuoju audiniu sujungtų kairės ir dešinės skilčių. Užkrūčio liauka jungiamojo audinio pertvarų padalinta į skilteles, kurios susideda iš epitelinio audinio ir timocitų T ląstelių pirmtakų. Epitelinis audinys gamina specialius hormonus, kurie lemia T limfocitų pirmtakų vystymąsi į T limfocitus. Subrendę T limfocitai per pokapiliarines venules patenka į kraują ir sudaro T ląstelių zonas antriniuose limfiniuose organuose. Antriniams limfiniams organams (blužnis, limfmazgiai ir kt.) priskiriami visi limfiniai organai, kuriuose vystosi imuninis atsakas. Blužnis yra didžiausias limfinis organas, esantis pilvo ertmėje, po kairiuoju diafragmos kupolu. Jos paviršius padengtas jungiamojo audinio kapsule, nuo kurios atsišakoja pertvaros, dalijančios blužnį į skiltis. Skiriamos dvi blužnies dalys: raudonoji ir baltoji pulpa. Vyrauja raudonoji pulpa, kurioje susitelkia raudonosios kraujo ląstelės apsivalymo proceso metu. Be eritrocitų, trombocitų šioje blužnies dalyje daug makrofagų, kurie fagocituoja bakterijas, ląstelių liekanas ir kt. daleles. Baltoji pulpa sudaryta iš tankaus limfinio audinio, kuriame randama T, B limfocitų, plazminių ląstelių. Bal-

53 I Dalis IV skyrius 53 tojoje pulpoje limfocitai išsidėstę zonomis: T ląstelės susitelkę periarteriniuose apvalkaluose (PALS), kurių viduje yra limfinių folikulų. Folikuluose susitelkę B limfocitai. Kraujui tekant per raudonąją pulpą, vyksta fagocitozė, o kraujyje esantys antigenai baltojoje pulpoje sukelia specifinį imuninį atsaką, pasireiškiantį antikūnų sinteze. Limfmazgiai ovalo arba apvalūs limfiniai dariniai, sutinkami daugelyje organizmo vietų. Limfmazgiuose B limfocitai susitelkia limfmazgio žievėje, limfiniuose folikuluose (B ląstelių zona), o T ląstelės išsidėsčiusios limfmazgio požievinėje dalyje (T ląstelių zona). Oda kaip mechaninis barjeras dalyvauja nespecifinėje apsaugoje, tačiau gali dalyvauti ir specifinėje (imuninėje) apsaugoje. Epidermio epitelinės ląstelės keratinocitai, Langerhanso ląstelės (dendritinių ląstelių rūšis), intraepiderminiai limfocitai skatina chemotaksį ir sekretuoja citokinus bei chemokinus, veikia imunokompetentinių ląstelių paviršiaus molekules. Svarbus barjeras ligų sukėlėjams gleivinių imunitetas. Gleivinės apsaugo nuo ligų sukėlėjų įsiveržimo ir jų dauginimosi; neleidžia į organizmą patekti įvairioms mikroorganizmų išskiriamoms medžiagoms (toksinams); jose gaminasi sekreciniai IgA. Gleivinių limfinis audinys skirstomas pagal tai, kokioje organizmo vietoje yra išsidėstęs. Svarbiausi limfiniai audiniai virškinimo sistemos ir kvėpavimo takų. Organizme yra limfinių darinių, kurie taip pat svarbūs imuninei apsaugai: tonzilės, adenoidai, Pejerio plokštelės, kirmėlinė atauga (apendiksas).

54 54 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI V skyrius 5. IMUNOKOMPETENTINĖS LĄSTELĖS Žinduolių įgimtasis imunitetas daugiausia susijęs su fiziniais barjerais, ląstelėmis ir makromolekulėmis Imunokompetentinių ląstelių genezė Įgimtojo imuniteto reakcijose dalyvauja kraujo ląstelės: įvairių tipų limfocitai, granuliocitai, monocitai, pastarieji baigę cirkuliuoti kraujyje audiniuose virsta makrofagais. Imuniniame atsake dalyvaujančias ląsteles sieja keletas savybių. Pirmiausia, visos jos kilusios iš vieno pradininko daugiagaliųjų kamieninių ląstelių (14 pav.), kurios gali duoti pradžią įvairioms ląstelėms. Beje, kraujo ir imuninės sistemos ląstelių pradininkas kamieninė ląstelė. Antra, kraujodaros atveju, kad kraujo ląstelės išgyventų, proliferuotų, diferencijuotų, subręstų, visoms ląstelėms svarbi mikroaplinka, kurią sudaro kaulų čiulpų stromos ląstelės, citokinai, daugiausia augimo faktoriai. Kai kurie citokinai skatina kolonijas stimuliuojančius CSF (angl. colony-stimulating factor) faktorius. Gali susiformuoti makrofagų, granuliocitų ir mišrios kolonijos. Vėlyvose eritropoezės ir trombocitopoezės stadijose ypač svarbus inkstų ląstelių produktas eritropoetinas. Be kolonijas formuojančių veiksnių reikalingi ir citokinai (nuo IL-2 iki IL-8). Trečia, kraujo gamybos ląstelės gali egzistuoti tiek ramybės, tiek aktyvioje būsenoje. Šių ląstelių būseną galima atskirti pagal diferenciacijos antigenų molekules (CD), būdingas atskiroms ląstelėms arba jų grupėms. Šios molekulės rodo ne tik aktyvinimo laipsnį, bet ir jų funkcinę paskirtį. Šiuo metu yra nustatyta apie 350 ląstelės paviršiaus CD molekulių. Taigi imuninio atsako pradininkas daugiagalioji kamieninė ląstelė gali duoti pradžią įvairioms ląstelėms tiek per limfoidinį, tiek per mieloidinį pirmtaką. Iš vienos kamieninės ląstelės išsivysto 104 kaulų čiulpų stromos ląstelių. Labai svarbu tai, kad daugiagalioji kamieninė ląstelė sugeba ir savaime atsinaujinti (14 pav.). Bendrasis limfinis pradininkas tolimesnio brendimo ir diferenciacijos stadijose, ypač užkrūčio liaukoje, skatina įvairių T ląstelių populiacijų subrendimą, kurios gali atlikti skirtingas funkcijas. B ląstelių genezė ir subrendimas vyksta žinduolių kaulų čiulpuose. B ląstelės diferencijuojasi iki plazminių ląstelių, kurios imuninio atsako metu sintetina ir sekretuoja antikūnus. Paukščių organizme B ląstelės gaminasi ir diferencijuojasi Fabricijaus maišelyje.

55 I Dalis V skyrius 55 Kamieninė ląstelė Daugiagalioji kamieninė ląstelė Kraujo kamieninė ląstelė Kitos kamieninės ląstelės Eritrocitai Trombocitai Leukocitai Specializuotos ląstelės 14 pav. Kamieninės ląstelės ir jų vystymosi kryptys Tiesiogiai iš bendrojo limfinio pirmtako sintetinami natūralūs kileriai ir dendritinės ląstelės, nors dalis dendritinių ląstelių sintetinama ir iš monocitų (mieloidinio pradininko stadija). Iš bendrojo mieloidinio pirmtako gaminasi granuliocitai (įvairios ląstelės), monocitai, eritrocitai ir trombocitai. Manoma, kad putliosios ląstelės gaminasi ir iš bazofilų, todėl kartais ir jos vadinamos audinių bazofilais. Nors monocitai yra kraujo ląstelės, bet iš kraujagyslių patekę į jungiamąjį audinį virsta makrofagais. Visus genezės ir diferenciacijos procesus skatina citokinams priskiriami augimo, kolonijų sudarymo, diferenciacijos faktoriai. Kiekviena ląstelių vystymosi stadija vyksta dalyvaujant specifiniams citokinams. Imuninėse reakcijose gali dalyvauti makrofagai, limfocitai (T, B ląstelės, natūralūs kileriai), granuliocitai (neutrofilai, eozinofilai, bazofilai), antigeną pateikiančios (dendritinės ir kt.) ląstelės (15 pav.) Kamieninės ląstelės Daugialąsčių organizme kamieninės ląstelės yra viso organizmo,,gyvybės pamatas, nuo jų priklauso viso organizmo atsinaujinimas, jos palaiko stabilią ir pastovią audinių bei viso organizmo būklę (14 pav.). Kamieninės ląstelės turi 3 išskirtinius požymius: jos yra visų ląstelių pradininkės; kontroliuojamos dauginasi ir atsinaujina; esant tam tikroms sąlygoms gali virsti bet kuria organizmo ląstele.

56 56 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Citokinų receptorius CD8 Citoksinė T ląstelė T ląstelių receptorius MHC I klasės molekulė Prisitvirtinanti ląstelė Antigenų peptidas MHC I klasė MHC II klasė Antikūnas Antigenas Antikūnas B ląstelė MHC II klasės molekulė CD4 T pagalbinė ląstelė Nesubrendęs limfocitas T pagalbinė ląstelė Citoksinė T ląstelė Citoksinis T limfocitas NK ląstelė B ląstelė Plazminė ląstelė Kaulų čiulpų stromos ląstelė Neutrofilas Bazofilas Eozinofilas Putlioji ląstelė Dendritinė ląstelė Monocitas Makrofagas Antigeną pateikiančioji ląstelė 15 pav. Svarbiausios imunokompetentinės ląstelės

57 I Dalis V skyrius 57 Pagal kilmės šaltinį jos skirstomos į fetalines, virkštelės ir placentos kraujo bei suaugusio organizmo ląsteles. Fetalinės kamieninės ląstelės. Jos gaunamos iš vaisiaus (lot. fetus vaisius). Fetalinės kamieninės ląstelės išskiriamos iš jau susiformavusių vaisiaus audinių (9 22 nėštumo savaitę). Tokios ląstelės pasižymi labai intensyviu dauginimosi potencialu. Įprastai fetalinės kamieninės ląstelės jau yra diferencijavusios į atitinkamų audinių ląstelių pradininkes, kurias lengviau kontroliuoti ir išlaikyti tam tikrose diferenciacijos stadijose. Suleistos į organizmą fetalinės kamieninės ląstelės neformuoja teratomų (navikas, susidarantis dėl audinių vystymosi sutrikimų embriono stadijoje), jos yra pakankamai plastiškos bei lengvai paklūsta imuninės sistemos komandoms. Fetalinės kamieninės ląstelės taikomos gydant kaulų, sąnarių, nervų ir onkologines ligas, bet tai pavieniai atvejai. Šios ląstelės jau yra diferencijuotos, todėl gali būti tiesiogiai įvedamos į pažaidos vietą, kad ten atliktų regeneracijos funkciją. Vis dėl to, kad ir kaip būtų patogu ir veiksminga naudoti kito organizmo fetalines kamienines ląsteles, jos yra svetimos ląstelės organizmui, ir imuninė sistema anksčiau ar vėliau iš organizmo jas pašalins. Dėl šios priežasties geriausias šaltinis terapijai savos fetalinės kamieninės ląstelės, tiksliau, virkštelės ar placentos kraujo ląstelės. Virkštelės kraujo kamieninės ląstelės. Jų gausu placentiniame kraujyje ir placentos audiniuose; jas galima išskirti vos kūdikiui gimus, surenkant placentinį kraują arba pačią placentą. Nesant galimybės panaudoti iš karto, jas galima užšaldyti. Pasaulyje daugiau kaip 10 metų egzistuoja galimybė išsaugoti savo kūdikio virkštelės kamienines ląsteles, kurias reikiamu momentu galima atšildyti, paruošti transplantacijai. Šioms ląstelėms būdinga viena išskirtinė savybė jas galima transplantuoti esant nevisiškam donoro ir recipiento antigeniniam suderinamumui. Tokia galimybė stipriai praplečia šios medžiagos panaudojimo ribas. Virkštelės kraujyje yra aptinkami du pagrindiniai kamieninių ląstelių tipai: kraujodaros ir mezenchiminės kamieninės ląstelės. Kraujodaros kamieninės ląstelės tiesiogiai dalyvauja kraujodaroje ir yra jau eilę metų taikomos hematologijoje. Mezenchiminės kamieninės ląstelės neformuoja kraujodaros sistemos, bet gali diferencijuotis į įvairius audinių tipus. Mezenchiminės kamieninės ląstelės, išskiriamos iš virkštelės kraujo, jau yra plačiai ištyrinėtos ir pradedamos taikyti bendrojoje medicininėje praktikoje. Svarbu paminėti, jog šios ląstelės yra jaunos, ir jose esanti informacija išlieka nepakitusi daugelį metų, kol jos yra užšaldytos. Proliferacinis šių ląstelių potencialas yra artimesnis fetaliniams audiniams, o tai reiškia, kad rezervas yra gausus, ir šios ląstelės pasiruošusios ilgam gyvenimo ciklui. Suaugusio organizmo kamieninės ląstelės. Žinoma, kad kiekvienas individas vystosi nuosekliai: ląstelės > audiniai > organai > organizmas.

58 58 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Pavyzdžiui, žmogaus organizme aptinkama virš 200 skirtingų tipų ląstelių. Didžioji organų ir audinių dalis sudaryta iš somatinių ląstelių, kurios diferencijuotos,,,žino savo funkciją ir nesikeičia per visą gyvavimo ciklą. Kraujodaros sistema priversta nuolat,,dirbti, t. y. atnaujinti tokį gyvybiškai svarbų audinį kraują. Kamieninės ląstelės dalyvauja ir kituose regeneracijos procesuose: akių tinklainės, odos, nervinio audinio ir pan. Suaugusiame organizme labiausiai paplitęs kamieninių ląstelių šaltinis kaulų čiulpai. Kamieninių ląstelių rasta ir daugumoje kitų organizmo audinių, tačiau kituose audiniuose jų kiekiai yra labai maži. Kamieninių ląstelių šaltinių paieška aktuali mokslinių tyrimų kryptis. Dėl imunologinio transplantacijos barjero kamieninių ląstelių persodinimas iš kaulų čiulpų prieinamas vos 20 proc. pacientų giminingų donorų. Specialiai paruošus kaulų čiulpų ląsteles, galima persodinti ne tik giminingiems recipientams, bet ir pacientams esant didžiojo audinio dermės komplekso daliniam tapatumui. Taigi žinduolių kamieninės ląstelės yra dviejų tipų: embrioninės ir suaugusio organizmo. Embrioninės kamieninės ląstelės, išskirtos iš embriono blastocistos stadijos, gali formuoti daugelį ląstelių tipų. Alternatyva suaugusio žmogaus kamieninės ląstelės, kurios dalyvauja ne tik pažeidimų regeneracijoje, bet ir palaiko homeostazę. Šios negausios kamieninių ląstelių populiacijos savaiminio atsinaujinimo, proliferacijos ir diferenciacijos procesus reguliuoja jas supanti mikroaplinka. Skirtingų audinių mikroaplinka ir nulemia unikalias juose esančių kamieninių ląstelių savybes bei diferenciacijos kryptis. Proliferacijos ir diferenciacijos metu kamieninės ląstelės netenka sugebėjimo savaime atsinaujinti tampa konkrečių ląstelių pradininkėmis. Tokiu būdu iš mieloidinio pradininko kraujyje vystosi monocitai, granuliocitai, eritrocitai, trombocitai, o iš limfoidinio pradininko T, B limfocitai, NK ląstelės Fagocitinės ląstelės Žinoma, kad kaulų čiulpuose iš makrofagų pradininkų granuliocitų vystosi kraujo ląstelės monocitai ir neutrofiliniai leukocitai (neutrofilai), kuriems būdingos fagocitinės funkcijos. Monocitai viena iš negrūdėtųjų leukocitų rūšių, didelės, µm skersmens, ląstelės (16 pav.). Kraujyje sutinkami monocitai turi apvalų ar skiltėtą branduolį. Žmogaus organizme sudaro 2 10 proc. visų kraujo ląstelių. Organizme atlieka tris pagrindines funkcijas:

59 I Dalis V skyrius 59 būdami judrūs fagocituoja didelius mikroorganizmus, jų daleles ar ląstelių liekanas; pateikia antigenus T ląstelėms; sekretuoja citokinus ir kitas biologiškai aktyvias molekules. Kai kurios infekcijos, pvz., žmogaus imuniteto nepakankamumo virusas, tuberkuliozė, bruceliozė, maliarija, skatina monocitozę monocitų kiekio padidėjimą kraujyje. Monocitai migruoja iš kraujo į audinius, diferencijuojasi į makrofagus, kurie 5 10 kartų padidėja, sustiprėja jų gebėjimas fagocituoti, citoplazmoje atsiranda daugiau organelių, pradeda sekretuoti ne tik citokinus, bet ir kitas biologiškai aktyvias medžiagas. Nėra tokie judrūs kaip monocitai, tačiau randami visuose audiniuose. Makrofagai gali būti laisvi, migruojantys ir fiksuotieji. Gyvena net kelis mėnesius. Pagal buvimo vietą skirstomi: alveolių makrofagai, histiocitai (makrofagai jungiamajame audinyje), Kuperio ląstelės (kepenyse), osteoklastai (kauluose), mikroglijos ląstelės (smegenyse), Langerhanso ląstelės (odos audiniuose). Makrofagai kartu su neutrofilais (iš dalies ir su eozinofilais) priskiriami fagocitams, nes pagrindinė jų funkcija fagocitozė (17 pav.). Makrofagų dalyvavimas fagocitozėje svarbi nespecifinio imuniteto grandis. Fagocituodami žuvusias ląsteles, išskirdami citokinus, makrofagai padeda audiniams normaliai funkcionuoti, ypač gyjant žaizdoms. Jie gali ardyti navikines ląsteles, tiesiogiai išskirdami toksinius deguonies ir NO junginius, lizosominius fermentus arba skatindami nuo antikūnų priklausomą citotoksiškumą. 20 µm Neaktyvintas makrofagas Aktyvintas makrofagas 16 pav. Skirtingos funkcinės būklės makrofagai

60 60 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI bakterijų surišimas pseudopodijomis; 2 nesuvirškintos bakterijos formuoja fagosomą, kuri juda link lizosomos; 3 susiliejus fagosomai ir lizosomai, atsipalaiduoja lizosominiai fermentai; 4 svetimos medžiagos virškinimas; 5 suvirškintos medžiagos produktų pašalinimas iš ląstelės pav. Pagrindiniai bakterijų fagocitozės etapai Makrofagų membranoje dar yra Fc receptorių imunoglobulinams, CR1 receptorių komplementui, citokinų receptorių. Makrofagų membranose gausu ir kitų receptorių, per kuriuos organizmas valomas nuo lipoproteinų, glikoproteinų metabolitų, nuo pasenusių ląstelių, žuvusių audinių. Makrofagai sintetina didžiojo audinių dermės komplekso I ir II klasės molekules, kostimuliuojančias B7 molekules. Apibendrinant, galima teigti, kad makrofagai dalyvauja daugelyje biologinių reakcijų: fagocituoja, sekretuoja daugiau kaip 50 biologiškai aktyvių medžiagų, dalyvauja žaizdų gijimo procesuose, atlieka antigeno pateikimo funkciją CD4+ T ląstelėms, inicijuoja imuninį atsaką, naikina navikų ląsteles.,,suvirškinę patogeninį mikroorganizmą, antigeną įterpia į ląstelės membraną, kur jis susijungia su didžiojo audinių dermės komplekso II klasės molekulėmis, pristato T ląstelėms ir tokiu būdu sukelia ląstelinį ir humoralinį atsaką. Makrofagai savo paviršiuje turi diferenciacijos antigenus, CD14 molekules, sintetina įvairius baltymus, fermentus, citokinus (IL-1, IL-6, IL-12), kurie siunčia aktyvinimo signalus monocitams bei kitoms ląstelėms. Kita fagocitinių ląstelių grupė neutrofiliniai leukocitai (neutrofilai) (18 pav.). Šios daugiabranduolės ląstelės gaminasi ir bręsta kaulų čiulpuose. Neutrofilai nustatomi histologiškai pagal dažymąsi neutraliais dažais ir funkcijas, atliekamas imuninio atsako reakcijose. Neutrofilai kartu su eozinofilais ir bazofilais priskiriami grūdėtiems leukocitams granuliocitams. Neutrofilai sudaro didžiausią ne tik granuliocitų, bet ir leukocitų dalį proc. visų leukocitų. Jų skersmuo µm. Turi ezinofilines granules (serininės ir rūgštinės hidrolazės, mieloperoksidazė, defensinai ir kt.). Neutrofilams būdingos chemotaksinės savybės, jie turi receptorių imunoglobulinų Fc fragmentui, komplementui, juos aktyvinantis veiksnys IL-8.

61 I Dalis V skyrius 61 Neutrofilai fagocitinės ląstelės, todėl jos aktyviai fagocituoja mikroorganizmus, ypač esant ūmiam uždegimui (19 pav.). Kitaip tariant, neutrofilai pirmoji ląstelių gynybos linija. Esant uždegimui stebima neutrofilija, t. y. padidėjęs neutrofilų skaičius kraujyje. Gali būti ir sumažėjęs neutrofilų kiekis kraujyje neutropenija. Pagrindinės funkcijos: ląstelių migracija; fagocitozė; oksidacinės reakcijos; citoksiškumas; trigerinis aktyvumas. 18 pav. Neutrofilinis leukocitas ir pagrindinės funkcijos Išorinė pusė Plazminė membrana Fagosoma Mikroorganizmas Mikroorganizmas H2O Vidinė pusė IgG-Fc ir komplemento receptoriai Granulės MPO O2 O 2 NADPH oksidazė Neutrofilas 19 pav. Neutrofilinis leukocitas ir fagocitozė

62 62 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Eozinofiliniai leukocitai (eozinofilai) viena iš granuliocitų rūšių, kuri taip pat iš dalies sugeba fagocituoti, bet pagrindinė funkcija saugoti organizmą nuo parazitinių invazijų (20 pav.). Eozinofilai nustatomi pagal dažymąsi rūgštiniais dažais ir pagal atliekamas funkcijas. Jie turi branduolį, sudarytą iš dviejų segmentų. Turi granules su toksiniais baziniais ir katijoniniais baltymais, peroksidaze, neurotoksinu. Kraujyje sudaro 1 4 proc. visų leukocitų ligų, parazitinių invazijų, navikinių ir kitų ligų atvejais. Kartu su bazofilais ir putliosiomis ląstelėmis dalyvauja uždegimo bei alerginėse reakcijose. Eozinofilai kovoja prieš virusus, parazitus, ypač kirmėles, todėl jų skaičius padidėja sergant alerginėmis ir parazitinėmis ligomis. Šios ląstelės sintetina aktyvius deguonies radikalus, leukotrienus, fermentus, augimo veiksnius. Savo paviršiuje turi Fc receptorius IgE ir IgG, receptorius komplemento komponentams, histaminams, interleukinams IL-1, IL-3, IL-5. Kraujyje padidėjus eozinofilų skaičiui, būdinga eozinofilija. Tokia būsena nustatoma sergant alerginėmis, odos, parazitinėmis, navikinėmis ir kitomis ligomis. 16 µm 20 pav. Eozinofilinis leukocitas periferiniame kraujyje

63 I Dalis V skyrius Llimfocitai ir jų subpopuliacijos Limfocitams priskiriama dalis baltųjų kraujo kūnelių negrūdėtieji leukocitai ir jų pirmtakai. Limfocitai, kilę iš bendrojo pirmtako limfoidinės kamieninės ląstelės, sutinkami kraujotakos ir limfinės sistemos organuose. Jų dydis svyruoja 8 15 µm ribose. Pagal dydį limfocitai skirstomi į mažuosius (dauguma ląstelių) ir didžiuosius. Pagal prigimtį skirstomi į T limfocitus (subręstančius užkrūčio liaukoje) ir B limfocitus (subręstančius kaulų čiulpuose). Ląstelės, turinčios granulių, citoplazmoje sudaro natūralių kilerių (NK) populiaciją. Atskirų subpopuliacijų limfocitų funkcijos imuninio atsako metu skiriasi. Morfologiškai T ir B limfocitai nesiskiria. Jų tapatybė nustatoma tik pagal ląstelių paviršiaus membranoje esančias molekules diferenciacijos antigenus (CD molekules). Kiekviena ląstelių brendimo stadija ar jų būsena turi skirtingus diferenciacijos antigenus, todėl žinoma daugiau nei 300 šių molekulių. Anksčiau T ir B limfocitams nustatyti buvo naudojamos įvairios rozečių metodo modifikacijos. Dabar T ir B limfocitai dažniausia nustatomi tėkmės citometrijos metodu, naudojant monokloninius antikūnus prieš CD molekules. Manoma, kad ląstelinį imunitetą lemia T limfocitai, o B limfocitai humoralinį imunitetą. Pagrindinė NK funkcija yra susijusi su citotoksiniu poveikiu virusu infekuotoms ir navikinėms ląstelėms. Subrendusios imuninio atsako ląstelės (makrofagai, T, B limfocitai ir kitos imuninės sistemos ląstelės) priskiriamos imunokompetentinėms, kitaip tariant, imuninio atsako ląstelėms, turinčioms potencialių galimybių tapti konkrečiomis imuninėmis ląstelėmis. Manoma, kad jų kiekis priklauso nuo genotipo (genetiniai veiksniai), kraujo grupės, amžiaus ir ligos tipo bei stadijos (patologiniai veiksniai). Skirtingos limfocitų rūšys atskiruose limfiniuose organuose (limfmazgiuose parakortikinėje srityje, blužnyje pariarteriniame apvalkale) turi skirtingas lokalizacijos vietas ir jų kiekis skiriasi. Po kontakto su mitogenais (in vitro sąlygomis) ir antigenais (in vivo sąlygomis) mažieji limfocitai padidėja ir dėl metabolizmo suintensyvėjimo pradeda proliferuoti ir diferencijuotis į efektorines ir atminties ląsteles. Limfocitų ir jų populiacijų kiekis yra pastovus, tačiau įvairių ligų ir patologinių būsenų atvejais gali pakisti. Limfocitozės atveju limfocitų kiekis kraujyje arba kituose organizmo skysčiuose, pvz., uždegimo eksudate, pagausėja. Limfocitozė dažniausia išsivysto po infekcijų ir uždegimų. Limfocitų (ar jų subpopuliacijų) kiekio sumažėjimas limfopenija. Limfopenija būna įgimta ir įgyta, išsivysto esant imuniteto nepakankamumui.

64 64 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 5.5. T limfocitai T limfocitų pradininkų formavimasis prasideda 6 7 nėštumo savaitę. T limfocitų pradininkai hemopoetinės kaulų čiulpų ląstelės, kurios migruoja į užkrūčio liauką. T ląstelių brendimą ir diferenciaciją lemia užkrūčio liaukos hormonai. T ląstelių pradininkai (pre-timocitai), atkeliavę iš kaulų čiulpų į užkrūčio liaukos pokapsulinę dalį, neturi savo membranoje būdingų T ląstelei žymenų (CD3 / TLR, CD4, CD8) ir yra vadinami dvigubai neigiamomis ląstelėmis. Šios ląstelės intensyviai proliferuoja, pertvarkydamos T ląstelių receptorių (TLR) koduojančius genus, migruoja į užkrūčio liaukos žievinę dalį ir virsta dvigubai teigiamomis CD4 + CD8 + T ląstelėmis. Šioje stadijoje yra atliekama tokių ląstelių teigiama atranka (selekcija), kurios metu patikrinamas bręstančių T ląstelių TLR receptorių gebėjimas atpažinti MHC-peptidinio antigeno kompleksą. Be to, priklausomai nuo to, su kurio tipo MHC molekule (MHC I ar MHC II) sąveikauja dvigubai teigiama T ląstelė, ji virsta viengubai teigiama, atitinkamai CD8 + arba CD4 + T ląstele. Šios ląstelės užkrūčio liaukos šerdyje patiria neigiamą atranką, kurios metu pašalinamos autoreaktyvios (gebančios reaguoti su savais antigenais) ląstelės. Po šių pagrindinių brandos stadijų iš užkrūčio liaukos išeina naivios CD4 + ir CD8 + T ląstelės membranoje turinčios funkcionuojantį TLR-CD3. T limfocitai diferencijuojasi užkrūčio liaukoje, tačiau pagrindinę funkciją, t. y. ląstelinį imunitetą, lemia tik diferencijuoti T limfocitai, išsidėstę pirminiuose limfiniuose organuose savo lokalizacijos vietose, tačiau jų kiekis pirminiuose ir antriniuose limfiniuose organuose yra nevienodas (7 lent.). T diferencijuotų limfocitų paviršiuje gausu antigenų ir receptorių, kurie svarbūs ne tik biologinei funkcijai, bet naudojami ir T ląstelių subpopuliacijoms nustatyti. T limfocitų paviršiaus antigenai. Žinoma, kad diferencijuotų T ląstelių paviršiuje randama makromolekulių antigenų. Šios makromolekulės, dar vadinamos,,žymenimis, būdingos tik tam tikrai ląstelių subpopuliacijai, diferenciacijos stadijai ir aktyvinimo laipsniui. Kitaip tariant, tai ląstelės membranoje esantys baltymai, besiskiriantys savo struktūra ir atliekantys įvairias funkcijas: receptoriai, koreceptoriai ir jų ligandai, signalo perdavimo baltymai, sukibimo molekulės, funkciškai aktyvių membraninių baltymų subvienetai. Vieninga diferenciacijos antigenų klasifikacija pagrįsta tuo, kad šias molekules atpažįsta tik tam tikro specifiškumo monokloniniai antikūnai prieš žmogaus ar gyvūno leukocitų paviršinius antigenus. Homologiški antigenai nustatyti pelės bei kitų rūšių gyvūnų ir paukščių ląstelėse. Šie homologiniai antigenai yra ne tik panašios struktūros, bet ir atlieka panašias funkcijas, žymimi taip pat, kaip žmogaus diferenciacijos anti-

65 I Dalis V skyrius 65 Limfiniai organai 7 lentelė. Limfocitų kiekis procentais žmogaus limfiniuose organuose T limfocitai CD4 + CD8 + B limfocitai NK ląstelės Pirminiai Kaulų čiulpai 90 Užkrūčio liauka < 1 < 0,1 Antriniai Blužnis Limfmazgis < 1 Kraujas genai. Dažniausia diferenciacijos antigenų raiška ląstelėse tirama tėkmės citometru, naudojant fluorescentine žyme žymėtus monokloninius antikūnus. Nustatyta per 100 individualių molekulių, kurios atspindi ląstelės diferenciacijos laipsnį, fiziologinę būklę ir pan. Pavyzdžiui, žinoma, kad visi T limfocitai turi žymenį CD3, o atskiros subpopuliacijos turi ne tik bendrą žymenį, bet dar ir papildomus žymenis (8 lent.). T ląstelių receptoriai antigenui (TCR) disulfidiniai glikoproteinai, suformuojantys heterodimerus iš α ir β arba iš γ ir δ subvienetų (21 pav.). T ląstelių receptorių, sudarytų iš α ir β subvienetų, turi CD4 + ir CD8 + ląstelės, o iš γ ir δ subvienetų γδ T limfocitai, įeinantys į epitelinį barjerą. T ląstelės, turinčios γ ir δ receptorių, sudaro 5 proc. visų organizmo T ląstelių. TCR receptoriai atpažįsta nebaltyminės kilmės antigenus. T ląstelių αβ receptoriai atpažįsta tik baltyminius antigenus (peptidus), pateiktus su didžiojo audinių dermės komplekso molekulėmis. T ląstelių subpopuliacijos. Pasirodo, kad T ląstelių populiacija pagal savo paviršiaus žymenis, atliekamas funkcijas ir kitas savybes, labai heterogeniška. Pavyzdžiui, nesubrendusios proliferuojančios CD4 + T ląstelės (pagalbininkės), veikiant citokinams, gali diferencijuotis į skirtingas efektorines ląsteles TH1, TH2 arba TH17. TH1 ląstelės efektoriniai helperiai (pagalbininkai), kurių pagrindinė funkcija makrofagų aktyvinimas. Žinoma, jos išskiriamais citokinais (IL-2, IFN-γ, TNF-α) gali aktyvinti ne tik makrofagus, bet ir kitą limfocitų subpopuliaciją CD8 + T limfocitus, natūralius kilerius. Aktyvindamos B ląsteles, skatina plazminių ląstelių susidarymą ir IgG1 poklasio antikūnų sintezę. TH2 ląstelės taip pat efektoriniai helperiai (pagalbininkai), kurių pagrindinė funkcija citokinų (IL-4, IL-5, IL-13), reikalingų B limfocitų proliferacijai ir diferenciacijai į plazmines ląsteles, eozinofilų ir audinių bazofilų diferenciacijai, sekrecija.

66 66 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI γδ T limfocitų receptorius αβ T limfocitų receptorius β α γ (Cγ1) δ γ (Cγ2 2χ) δ γ (Cγ2 3χ) δ 21 pav. T ląstelių αß ir γδ receptorių struktūra 8 lentelė. Dažniausiai tiriami T limfocitų diferenciacijos antigenai Molekulės CD1 CD2 CD3 CD4 CD8 CD28 Funkcijos Membranos glikoproteinas, susijungęs su β 2 mikroglobulinu; sintetina timocitai ir Langerhanso ląstelės; nerandama subrendusių T limfocitų membranoje Sintetina T limfocitai ir NK ląstelės; ligandai: CD58 (LFA3), CD59 arba CD48; perduoda aktyvinimo signalą T limfocitams Susijungęs su T ląstelių receptoriaus ab arba gd grandinėmis; sintetina visi subrendę T limfocitai; perduoda aktyvinimo signalą po T ląstelių receptoriaus sąveikos su antigenu Membranos glikoproteinas; sintetina nesubrendę T limfocitai, 60 proc. periferinių T limfocitų; jungiasi prie MHC II klasės molekulės, žmogaus imunodeficito viruso gp120; stabilizuoja T ląstelių receptoriaus, peptido ir MHC kompleksą; dalyvauja perduodant aktyvinimo signalą; randama monocitų, Langerhanso ląstelių ir eozinofilų membranų paviršiuje Dimerinis glikoproteinas, sudarytas iš a ir b grandinių; sintetina nesubrendę T limfocitai ir 60 proc. periferinių T limfocitų Homodimerinis glikoproteinas; sintetina CD4 + T limfocitai ir 50 proc. CD8 + T limfocitų; po sąveikos su ligandais, esančiais B ląstelių paviršiuje, sukelia T limfocitų stimuliavimą TH17 ląstelės tai viena iš T helperių (pagalbininkų) subpopuliacijų, kuri gali sekretuoti interleukiną IL-17. Šiam interleukinui tenka svarbus vaidmuo apsaugant ląsteles nuo patogeninių mikroorganizmų. Šių ląstelių aktyvinimas gali būti susijęs su autoimuninių ligų vystymusi.

67 I Dalis V skyrius 67 Treg (T reguliacinės) ląstelės tai dalis CD4 + ląstelių, kurios anksčiau buvo vadinamos T supresinėmis ląstelėmis. T reg ląstelėms būdinga aukšta transkripcijos faktoriaus Foxp3 raiška, jos sekretuoja IL-10, transformuojantį augimo faktorių β (TGF-β) ir slopina kitų ląstelių imuninius atsakus. T reg ląstelės užtikrina toleranciją saviems antigenams, slopindamos autoreaktyvias T ląsteles. T helperiai (pagalbininkai) priskiriami T limfocitų efektorių subpopuliacijai, atliekančiai ląstelių pagalbininkių vaidmenį. Savo paviršiuje šios ląstelės turi ne tik CD4 antigeną, bet ir įvairių receptorių. Aktyvintos T H sekretuoja IL-2 ir turi receptorių šiam citokinui (IL-2R). CD4 + T ląstelės atpažįsta antigeną, pateiktą kartu su ląstelės didžiojo audinių dermės komplekso II klasės (MHC II) molekulėmis. Diferencijuotos T H ląstelės sintetina ir sekretuoja citokinus, kurie reguliuoja CD8 + ląstelių, B limfocitų ir natūralių kilerių funkcijas. T ląstelės, gebančios sunaikinti kitas ląsteles, vadinamos citotoksinėmis T ląstelėmis. Dauguma jų yra CD8 + T ląstelės, atpažįstančios tikslines ląsteles pagal antigeną, pateiktą kartu su didžiojo audinių dermės komplekso I klasės (MHC I) molekulėmis. CD8 + T limfocitų randama odos epidermio sluoksnyje. Apie 90 proc. intraepitelinių limfocitų sudaro T limfocitai ir maždaug pusė jų yra CD8 + γδ T ląstelės. Virškinamojo trakto T limfocitai saugo organizmą nuo patogeninių mikroorganizmų; be to, jie sekretuoja citokinus, reguliuojančius imunines reakcijas gleivinėse B limfocitai B limfocitai yra viena iš pagrindinių imuninės sistemos limfinių ląstelių rūšių, kurios po susitikimo diferencijuojasi į plazmines ląsteles, sekretuojančias antikūnus. Jie yra apvalūs, 6 15 µm skersmens, dydis priklauso nuo išsivystymo stadijos ir funkcinės būklės. Branduolys užpildo beveik visą ląstelę, citoplazmos yra daugiau vienoje branduolio pusėje. Santrumpa,,B pavadinime siejama su paukščių Fabricijaus maišeliu (lot. Bursa Fabricii). Žinduolių organizme B limfocitai gaminasi ir susiformuoja kaulų čiulpuose, o embrioninio periodo metu kepenyse. Anksčiausiai kaulų čiulpuose nustatomos B ląstelių linijos tai B ląstelių pradininkai (pro-b ląstelės). Šių ląstelių vystymosi stadijoje vyksta imunoglobulinų (Ig) µ sunkiosios grandinės (H) genų segmentų (V, D, J) pertvarka, savo membranose ląstelės turi CD19, CD22 ir kamieninių ląstelių antigenus CD34, CD117 ir CD10. Sąveikaudami su kaulų čiulpų stromos ląstelėmis per sukibimo molekules B ląstelių pradininkai proliferuoja ir diferencijuojasi į B ląstelių pirmtakus (pre-b ląsteles). Tokios ląstelės turi receptorių interleukinui IL-7. Šį citokiną išskiria kaulų čiulpų stromos ląstelės. IL-7 slopina sukibimo molekulių raišką B ląstelių pirmtakų membranose, todėl proliferuojantys B limfocitai gali

68 68 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI,,atsijungti nuo stromos ląstelių. IL-7 turi įtakos B ląstelių pirmtakų augimui ir brendimui. Pro-B ląstelė tampa pre-b ląstele, kai savo membranoje turi Ig sunkiąją µ grandinę, suporuotą su Ig lengvosios grandinės tipo struktūra, surogatine lengvąja grandine (φl). Šis kompleksas, asocijuotas su dar viena membranine molekule IgαIgβ dimeru, vadinamas pre-b ląstelės receptoriumi (pre-bcr, angl. pre- B cell receptor). Receptorius svarbus perduodant signalus, lemiančius pre-b ląstelių intensyvią proliferaciją ir tolesnį vystymąsi. Po receptoriaus sąveikos su dar stromos ląstelių ligandu gelektinu-1 duodamas signalas stabdyti ląstelėje kitų imunoglobulinų sunkiųjų grandinių genų pertvarką, todėl proliferuojančių B ląstelių pirmtakų paviršiuje sintetinama tik vieno specifiškumo pertvarkyta µ sunkioji grandinė. Pre-B ląstelei charakteringi CD19, CD20 membraniniai žymenys. Vėlyvosios pre-b ląstelės stadijoje Ig genų segmentų rekombinacijos mechanizmas vėl suaktyvėja ir prasideda Ig lengvosios (L) grandinės genų segmentų pertvarkymas. Pasibaigus imunoglobulinų lengvosios grandinės genų pertvarkai, suporuotų L ir H polipeptidinių grandinių pasirodymas ląstelės paviršiuje, kaip pilnos membraninės IgM molekulės (B ląstelės receptoriaus dalies), rodo, kad ji tampa nesubrendusia B ląstele (22 pav.). Kai nesubrendusi B ląstelė bręsta, ji patiria tarpinę stadiją, kurios metu slopinama Ig genų pertvarkos procesas, padidėja membraninių IgM molekulių raiška, atsiranda membraninės IgD molekulės. Šios stadijos metu vyksta neigiama B ląstelių atranka sunaikinamos autoreaktyvios ląstelės. Kaulų čiulpus palieka subrendusios naivios (nekontaktavusios su antigenu) B ląstelės, kurių tolimesnę brandą lemia susitikimas su antigenu periferiniuose limfiniuose organuose. B ląstelių antigenai ir receptoriai. B ląstelių vystymasis prasideda pirminiuose kraujodaros organuose (kaulų čiulpuose) ir vyksta nepriklausomai nuo sąveikos su antigenu (23 pav.). B ląstelių B ląstelių Nesubrendusi Subrendusi Aktyvinta pradininkas pirmtakas B ląstelė B ląstelė B ląstelė Imunoglobulinų Citoplazminis Citoplazminis ir Citoplazminis ir Citoplazminis ir sintezė IgM membraninis membraninis membraninis nevyksta IgM IgM IgM 22 pav. B ląstelių pirmtakų vystymasis

69 I Dalis V skyrius 69 Nuo antigeno nepriklausoma fazė (brendimas) B ląstelių pirmtakas Imunoglobulinų genų persitvarkymas Atranka Subrendusi B ląstelė Paviršiaus žymuo B220 Kaulų čiulpai Nuo antigeno nepriklausoma fazė (aktyvinimas ir diferenciacija) Nesubrendusi B ląstelė Antigeno nėra T H ląstelė (apie 10 proc.) Antigenas Žuvusios ląstelės (apie 90 proc.) Plazminė ląstelė Giminingumo brendimas Klasių perjungimas Atminties B ląstelės Antikūnų sekrecija Antriniai limfiniai organai 23 pav. B ląstelių brendimas, aktyvinimas ir diferenciacija

70 70 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Subrendusios B ląstelės išsidėsto antriniuose limfiniuose organuose: limfmazgio žievinėje dalyje susikaupę B limfocitai sudaro pirminius ir antrinius folikulus, kuriuose randama ne tik B limfocitų, bet ir folikulų dendritinių ląstelių, makrofagų. Dalis B ląstelių cirkuliuoja kraujyje. Subrendusios B ląstelės savo paviršiaus membranoje turi receptorius antigenui, citokinams, komplementui ir kitoms molekulėms. Specifinis B limfocitų receptorius membraninis imunoglobulinas, kurio dėka B ląstelė atpažįsta antigeną. B ląstelės receptoriaus kompleksą sudaro membraninis monomerinis imunoglobulinas IgM ir su juo nekovalentiškai susietos Igα (CD79a) ir Igβ (CD79β) molekulės, tarpusavyje sujungtos disulfidinėmis jungtimis. Dauguma subrendusių B limfocitų turi membraninius imunoglobulinus IgD ir IgM. Šios molekulės svarbios ląstelės aktyvinimui ir jos veiklos, susijusios su proliferacija, diferenciacija, apoptoze, reguliavimui (24 pav.). B ląstelių paviršiuje yra chemokinų receptorių (CXCR5, CXCR4), kurie kontroliuoja B ląstelių išsidėstymą limfiniuose organuose ir limfinio audinio folikuluose. B ląstelių paviršiuje yra įvairių antigenų, pvz., didžiojo audinių dermės komplekso molekulių (MHC). Dabar dažniausia tėkmės citometrijos metodu tiriami diferenciacijos (CD) antigenai, kartu išaiškinamos atskirų antigenų funkcijos. Tokiais tyrimais galima ne tik atpažinti B ląsteles ir jų rūšis, bet ir nustatyti jų išsivystymo stadijas, aktyvinimo laipsnį. Po sąveikos su antigenu, dalyvaujant T ląstelėms ir citokinams, B ląstelės dalijasi ir vystosi į efektorius - plazmines, gaminančias įvairių tipų antikūnus, ir atminties, turinčias paviršiaus membranos imunoglobulininius receptorius, ląsteles. B ląstelės turi papildomų receptorių molekulių (CD40, B7), kurios gali skatinti B ląstelių aktyvinimo signalą, tai ypač svarbu antrinio imuninio atsako atveju, kai pakartotinai patenka tas pats antigenas. B ląstelės pateikia antigenus MHC II klasės molekulėse ir aktyvina vieną iš limfocitų subpopuliacijų T helperius (pagalbininkus). B ląstelės panaudojamos kuriant hibridomas ir gaminant monokloninius antikūnus, kurie naudojami imunocheminės analizės ir kituose metoduose, diagnostikoje, įvairioms ligoms gydyti. Plazminės ląstelės unikalios antikūnus sekretuojančios ląstelės, kurios diferenciacijos eigoje išsivysto iš B limfocitų po jų sąveikos su antigenu (25 pav.). Plazminės ląstelės didesnės negu B ląstelės, µm dydžio, dažniausia ovalios, bet pasitaiko ir apvalių, turi nedidelį branduolį, apsuptą bazofilinės citoplazmos, kurioje išsidėstęs gausus endoplazminis tinklas su daugybe poliribosomų, Goldžio kompleksas, mitochondrijos ir kitos ląstelės organelės. Nors plazminės ląstelės, kilusios iš B limfocitų, tačiau neturi B limfocitams būdingų paviršiaus struktūrų, antigenų, receptorių ir kitų žymenų. Jų užduotis

71 I Dalis V skyrius 71 LĄSTELĖS IMUNOGLOBULINŲ RAIŠKA Nėra Pirminiuose limfiniuose organuose kaulų čiulpuose B ląstelių pradininkai B ląstelių pirmtakai B ląstelių pirmtakas su B220 žymeniu Sunkiosios grandinės genų pertvarka Lengvosios grandinės genų pertvarka Nėra (miu) sunkioji grandinė + lengvųjų grandinių surogatas Nesubrendusi ląstelė Membranos IgM Pakitęs RNR modifikavimas Subrendusi ląstelė Membranos IgM + membranos IgD Antriniuose limfiniuose organuose Aktyvinta ląstelė Stimuliavimas antigenu Imunoglobulinų klasių perjungimas ir diferenciacija Plazminės ląstelės Įvairių izotipų membraniniai imunoglobulinai Įvairių izotipų sekretuojami imunoglobulinai Atminties ląstelės Įvairių tipų membraniniai imunoglobulinai 24 pav. Membraninių imunoglobulinų susidarymas B limfocituose gaminti vieno specifiškumo antikūnus, nedalyvaujant kitose imuninėse reakcijose. Limfiniame audinyje plazminės ląstelės sudaro atskirus klonus, kurie gamina tam tikro specifiškumo antikūnus. Plazminės ląstelės gyvuoja trumpai (2 3 savaites). Daugiausia jų randama limfiniame audinyje, nors gali cirkuliuoti ir periferiniame kraujyje. Piktybinio proceso metu išsivysto plazminių ląstelių navikas plazmocitoma, kuri kartais vadinama mieloma arba net daugybine mieloma.

72 72 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Plazmocitoma sintetina ir sekretuoja monokloninius imunoglobulinus, todėl plazmocitomų ląstelių linijos naudojamos hibridomų technologijoje, monokloniniams antikūnams prieš įvairius antigenus kurti. B-1 B ląstelės negausi B ląstelių populiacija, kuri atsiranda vaisiaus vystymosi laikotarpiu prieš B-2 B ląsteles (pagrindinė B ląstelių rūšis žmogaus ir gyvūnų organizmuose). B-1 ląstelių yra limfmazgiuose, blužnyje, o ypač daug peritoniume ir krūtinplėvės srityje. Šios ląstelės savo paviršiuje turi IgM molekulių, bet mažai ar visai neturi membraninių IgD, būdingas CD5 žymuo, nors jo gali ir neturėti. Skirtingai nei B-2 ląstelės, B-1 ląstelės silpnai sąveikauja su baltyminiais antigenais, bet daug geriau su polisacharidais. Šios ląstelės dalyvauja pirminėje apsaugoje prieš patogenus, yra natūraliųjų antikūnų šaltinis, tačiau linkusios gaminti kryžmiškai reaguojančius antikūnus, todėl gali skatinti autoimunines reakcijas. B reguliacinės (Breg) ląstelės pastaraisiais metais išskirtas B ląstelių porūšis, pasižymintis reguliacinėmis savybėmis dėl jų gebėjimo išskirti IL-10 ir slopinti uždegimą. Reguliacinės šių ląstelių savybės gali pasireikšti ir TGF-β gamyba, T ląstelių apoptozės skatinimu, priešuždegiminių IgG4 antikūnų gamyba Bendros T ir B limfocitų savybės Panašiai kaip daugialąsčių organizmų kamieninėms ląstelėms, imuninei sistemai, ypač T ir B ląstelėms, būdingas ilgalaikis savaiminis atsinaujinimas. Šios ląstelės išsivysto iš limfinės kilmės kamieninės ląstelės. Toliau žinduo mm 25 pav. Plazminė ląstelė

73 I Dalis V skyrius 73 lių organizme, nedalyvaujant antigenui, jos vystosi ir bręsta pirminiuose (centriniuose) limfiniuose organuose: B ląstelės vystosi kaulų čiulpuose, o T ląstelės užkrūčio liaukoje. Pirminiuose limfiniuose organuose vyksta kamieninių limfinių pirmtakų diferenciacija, proliferacija ir brendimas, kurio metu susiformuoja membraniniai antigenai, receptoriai, kartu sunaikinamos ląstelės, atpažįstančios savus antigenus. Subrendę T ir B limfocitai, bet dar neturėję kontakto su specifiniais antigenais, vadinami T ir B naiviaisiais limfocitais. T limfocitai, tiksliau, T helperiai (pagalbininkai) (CD4 + ) ir T citotoksiniai (CD8 + ) limfocitai po stimuliacijos antigenu proliferuoja į efektorines ir atminties ląsteles. Po stimuliacijos antigenu B limfocitai diferencijuojasi į efektorines ląsteles, specifinius antigenui antikūnus gaminančias plazmines ląsteles ir atminties ląsteles. Būtina pabrėžti, kad imuninė sistema, koks antigenas bepatektų, jį prisimena, t. y. turi imuninę atmintį. Kita vertus, organizme vyksta tiek T, tiek B limfocitų neigiama atranka. Užkrūčio liaukoje pašalinami tie timocitai, kurių receptorių sąveikos giminingumas su didžiojo audinių dermės komplekso antigenais per daug didelis. Tokiu būdu netenkama autoreaktyvių limfocitų vyksta klonų atranka (selekcija). Pagrindinė neigiamos atrankos vieta šerdinės užkrūčio liaukos dalis. T limfocitų atrankai svarbios šios srities dendritinės ląstelės, makrofagai ir užkrūčio liaukos epitelio ląstelės. B ląstelių brandos kaulų čiulpuose metu pašalinamos tos B ląstelės, kurios taip pat sąveikauja su savo organizmo antigenais. Sukeliama tokių ląstelių apoptozė arba vyksta B ląstelės receptoriaus redagavimas, pakeičiant imunoglobulino lengvąją grandinę. Pirmą kartą į organizmą patekus antigenui, išsivysto pirminis imuninis atsakas. Pirmiausia aktyvinami naivieji T ir B limfocitai, kurie po antigeno atpažinimo pradeda diferencijuotis į efektorines ir atminties ląsteles. Efektorinės ląstelės atsakingos už antigeno pašalinimą, o atminties ląstelės užtikrina efektyvų imuninį atsaką, antigenui patekus į organizmą pakartotinai. Imuninio atsako metu B ir T ląstelės kontaktuoja padedant paviršinėms molekulėms. B ląstelėms pateikiant antigeną T H ląstelėms, susiformuoja ne tik MHC II klasės molekulės antigeninio peptido-tlr kompleksas, bet yra svarbi ir kostimuliacinių molekulių sąveika. B ląstelių membraninei CD40 molekulei sąveikaujant su T H ląstelių paviršine molekule CD40L (CD154), indukuojama B7 (CD80) molekulės raiška ant B ląstelių. B7 molekulė sąveikauja su membranine T H ląstelės CD28 molekule. Dėl šios priežasties TH ląstelė aktyvinama, pradeda sintetinti IL-2, proliferuoja, o taip pat išskiria citokinus, aktyvinančius B ląstelių proliferaciją ir antikūnų sintezę. B7 molekulių sutinkama ne tik B ląstelių, bet ir kitų ląstelių (dendritinių ląstelių, aktyvintų makrofagų), kontaktuojančių su T ląstelėmis, paviršiuje.

74 74 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI T ir B ląstelių savybes in vitro sąlygomis galima tirti naudojant mitogenus. Tai įvairios medžiagos, kurios aktyvina ląsteles ir sukelia jų dalijimąsi mitozę. Dažniausia naudojami lektinai augalinės kilmės glikoproteinai, surišantys angliavandenius. Mitogenai sąveikauja su ląstelės paviršiaus struktūromis ir skatina mitozę. Įvairūs mitogenai stimuliuoja skirtingas T ir B limfocitų populiacijas. T limfocitams stimuliuoti dažniausia naudojamas fitohemagliutininas, konkanavalinas, o iš gramneigiamų bakterijų išskirtas lipopolisacharidas (LPS) B limfocitams. Mitogeninis aktyvumas būdingas ir kai kuriems citokinams. Klinikinėje praktikoje mitogenai naudojami pirminiam ląstelinio ir humoralinio imuniteto vertinimui Natūralūs naikintojai, arba NK ląstelės Šios ląstelės sudaro proc. visų limfocitų, randamų kraujyje ir limfiniame audinyje (pėdsakai) (7 lent.). NK ląstelės neturi T ir B limfocitams būdingų žymenų. Ši ląstelių grupė savo paviršiuje turi receptorių IgG Fc sričiai (CD16 žymuo) ir kitų žymenų (CD56, CD7). Morfologiškai šios ląstelės heterogeniškos. Limfocitų citoplazmoje (didelėse granulėse) yra dviejų tipų citotoksinių substancijų perforinas ir granzimai. Perforinas suformuoja poras ir sukelia osmosinę ląstelės žūtį. Veikiant granzimams taip pat sukeliama ląstelės žūtis. NK ląstelės svarbios įgimtam imunitetui, citotoksiškai veikia virusu infekuotas ir vėžines ląsteles. Šios ląstelės gali produkuoti citokinus (γ interferoną, navikų nekrozės faktorių, granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantį faktorių) ir chemokinus. Dar viena limfocitų subpopuliacija NKT ląstelės. Jos turi T ląstelių ir NK ląstelių paviršiaus žymenų ir savybių. Randamos užkrūčio liaukoje ir blužnyje, bet didžiausias jų kiekis kepenyse. Jos ekspresuoja CD3 / TCRαβ, CD16, produkuoja citokinus, pasižymi citotoksiniu aktyvumu, gali dalyvauti imuniniame atsake, ypač prieš mikobakterijas, plazmodijas, listerijas Antigeną pateikiančios ląstelės Šios ląstelės geba paruošti antigeną bei pateikti jį T ląstelėms kartu su MHC molekulėmis. Profesionaliosiomis antigeną pateikiančiomis ląstelėmis vadinamos dendritinės ląstelės, kuriose nuolat vyksta MHC II klasės molekulių ir bendrų kostimuliuojančių molekulių (CD40, CD80, CD86) raiška. Šių ląstelių yra odoje (Langerhanso ląstelės), gleivinėse, limfiniuose organuose. Profesionalioms antigeną pateikiančioms ląstelėms priskiriami ir makrofagai bei B ląstelės, kurios po aktyvinimo padidina MHC II klasės ir bendrų

75 I Dalis V skyrius 75 kostimuliuojančių molekulių raišką. Neprofesionaliomis antigeną pateikiančiomis ląstelėmis gali tapti ir kai kurios kitų tipų ląstelės, pvz., fibroblastai (odoje), glijos ląstelės (smegenyse), kasos beta ląstelės, thymus epitelinės ląstelės, kraujagyslių endotelio ląstelės, skydliaukės epitelinės ląstelės. Kaip antigeną pateikiančios ląstelės jos funkcionuoja trumpai ilgalaikio uždegiminio atsako metu. SANTRAUKA Įgimtojo imuniteto reakcijose dalyvauja daug kraujo sistemos ląstelių: kamieninės ląstelės, monocitai, įvairių tipų limfocitai, plazminės ir antigeną pateikiančios ląstelės. Visoms ląstelėms svarbi mikroaplinka, kurią sudaro kaulų čiulpų stromos ląstelės, citokinai, chemokinai bei augimo faktoriai. Šių ląstelių būseną, t. y. aktyvinimo laipsnį, funkcinę paskirtį galima atskirti pagal diferenciacijos antigenų molekules (CD), būdingas atskiroms ląstelėms ir jų grupėms. Kamieninės ląstelės visų ląstelių pradininkės, kurios gali daugintis ir atsinaujinti, esant palankioms sąlygoms, bei virsti bet kuria organizmo ląstele. Pagal kilmės šaltinį jos skirstomos į fetalines, placentos ir virkštelės kraujo bei suaugusio organizmo kamienines ląsteles. Fetalinės kamieninės ląstelės išskiriamos iš jau susiformavusių vaisiaus audinių. Virkštelės kraujo kamieninių ląstelių gausu placentos audinyje ir placentiniame kraujyje. Virkštelės kraujyje aptinkami 2 ląstelių tipai: kraujodaros ir mezenchiminės kamieninės ląstelės. Pastarosios gali diferencijuotis į įvairius audinių tipus. Suaugusio žmogaus kamieninės ląstelės dalyvauja pažeidimų regeneracijoje, palaiko homeostazę. Fagocitinėms kraujo ląstelėms priklauso iš mieloidinio pirmtako kaulų čiulpuose išsivystantys ir ten subręstantys monocitai, neutrofilai ir eozinofilai. Monocitai migruoja į audinius ir diferencijuojasi į makrofagus, kurie būdami judrūs fagocituoja mikroorganizmus ir ląsteles, pateikia antigenų peptidus (kartu su MHC II molekulėmis) T ląstelėms, sekretuoja citokinus ir kitas biologiškai aktyvias molekules. Neutrofilai fagocituoja mikroorganizmus, ypač esant ūmiam uždegimui; turi citoplazmines granules, kuriose yra serininės ir rūgštinės hidrolazės, mieloperoksidazė, defensinai; jiems būdingos chemotaksinės savybės. Eozinofilai sugeba fagocituoti, bet pagrindinė jų funkcija saugoti organizmą nuo parazitinių invazijų; kartu su bazofilais ir putliosiomis ląstelėmis dalyvauja uždegimo ir alerginėse reakcijose. Limfocitai yra kilę iš bendrojo limfoidinio pirmtako, išsivystę iš kraujodaros kamieninės ląstelės kaulų čiulpuose. T limfocitų pirmtakai, kurie susidaro kaulų čiulpuose, migruoja į užkrūčio liauką, o jų brendimą ir diferenciaciją lemia užkrūčio liaukos hormonai ir gebėjimas atpažinti MHC-peptidinio antigeno kompleksą. Pagrindinę funkciją ląstelinį imuninį atsaką lemia tik diferencijuoti T limfocitai, išsidėstę limfiniuose organuose savo lokalizacijos vietose. T limfocitų paviršiuje gausu antigenų, receptorių, kurie reikalingi jų biologinei funkcijai atlikti ir naudojami jų subpopuliacijoms nustatyti. T ląstelės pagal savo paviršiaus žymenis, sintetinamus citokinus ir atliekamas funkcijas yra skirstomos į šias pagrindines populiacijas ir subpopuliacijas: CD4 + T ląstelės pagalbininkės (TH) ir jų subpopuliacijos (TH1, TH2, TH17); CD8 + T citotoksinės ląstelės (TC); CD4 + Foxp3 + T reguliacinės ląstelės (Treg).

76 76 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Svarbiausia T ląstelių paviršiaus molekulė yra T ląstelių receptorius (αβtcr arba γδtcr), į kurio sudėtį įeina T ląstelių linijos žymuo CD3; MHC I, CD4, CD8, CD25, CD28, CD40L. B limfocitai vienos iš pagrindinių imuninės sistemos ląstelių, kurios po susitikimo su antigenu diferencijuojasi į plazmines ląsteles, sintetinančias antikūnus. Žinduolių organizme B limfocitai gaminasi ir subręsta kaulų čiulpuose per eilę tarpinių brandos stadijų su charakteringais paviršiniais diferenciacijos antigenais. Po sąveikos su antigenu, dalyvaujant T ląstelėms ir citokinams, B ląstelės dalijasi ir vystosi į efektorines (plazmines ir atminties) ląsteles. Svarbiausios B ląstelių paviršiaus molekulės yra B ląstelių receptorius (BCR), kurio sudėtyje yra membraninė IgM (ar kitos klasės) molekulė ir Igα / Igβ heterodimeras; CD19, CD21, MHC I ir MHC II, CD40, CD45, CD80. Plazminės ląstelės unikalios antikūnus sekretuojančios ląstelės, kurios diferenciacijos būdu išsivysto iš B limfocitų po jų sąveikos su antigenu. Plazminės ląstelės jau neturi B limfocitams būdingų paviršiaus struktūrų receptorių antigenui ir kitų žymenų. Jų užduotis gaminti vieno specifiškumo antikūnus (specifinius antigenui). NK ląstelės limfocitų populiacija, neturinti T ir B limfocitams būdingų paviršiaus žymenų. NK ląstelės citotoksiškai veikia virusu infekuotas ir vėžines ląsteles, nes citoplazmoje turi toksines substancijas: perforiną ir granzimus. Šios ląstelės gali produkuoti citokinus ir chemokinus. Ląstelės, gebančios paruošti antigeną ir jį pateikti T ląstelėms kartu su MHC II molekulėmis, vadinamos antigeną pateikiančiomis ląstelėmis. Skiriamos profesionalios ir neprofesionalios antigeną pateikiančios ląstelės. Profesionalioms priskiriamos dendritinės ląstelės, makrofagai bei B ląstelės. Neprofesionaliomis antigeną pateikiančiomis ląstelėmis gali tapti kai kurios kitų tipų ląstelės: endotelio, skydliaukės epitelio, fibroblastai ir kt.

77 I Dalis 77 VI skyrius 6. IMUNINĖS SISTEMOS MAKROMOLEKULĖS Imuninės sistemos veikla susijusi su limfinės sistemos (limfiniai organai, audiniai ir kiti dariniai) išsivystymu, imuninės sistemos ląstelėmis ir molekulėmis. Imuninė sistema funkcionuoja darniai, nes visų jos grandžių veikla glaudžiai susijusi ir griežtai reguliuojama. Ypatingas vaidmuo čia atitenka imuninės sistemos molekulėms. Šis skyrius skirtas tik svarbiausioms imuninės sistemos makromolekulių grupėms, jų savybėms ir esminėms funkcijoms aptarti; kituose skyriuose (atskirai) nagrinėjama konkrečių makromolekulių (antigenų, antikūnų, komplemento, sukibimo molekulių, citokinų, chemokinų) veikla ir funkcijos Makromolekulės, susijusios su įgimtuoju imunitetu Dalis molekulių yra neatsiejamos nuo imuninės sistemos, ypač nespecifinio arba įgimto imuniteto atveju. Žinoma, kad pirmiausia patogenams patekti į ląstelę ir joje vystytis neleidžia anatominis, fiziologinis ir (arba) cheminis organizmo apsaugos barjeras. Kitas apsaugos mechanizmas ląstelinis, t. y. fagocitinių ir citolitinių ląstelių kompleksas, skirtas į organizmą patekusiems patogenams pašalinti. Pirma, epitelio ląstelės savaime sudaro fizinį barjerą infekcijai, be to, jose gaminasi antimikrobiniai peptidai, trukdantys patogeniniams mikroorganizmams prisitvirtinti prie šių ląstelių paviršiaus. Dažnai sutinkami, tačiau labai konservatyvūs filogenetiniu požiūriu, antimikrobiniai peptidai defensinai ir katelicidinai. Be antimikrobinio poveikio šios molekulės pasižymi chemotaktinėmis savybėmis fagocitiniams leukocitams, nesubrendusioms dendritinėms ląstelėms ir limfocitams. Pagrindinė jų funkcija,,aptikti pavojų, mobilizuoti ir sustiprinti įgimtojo ir įgytojo imuniteto veiksnius. Prakaito liaukų išskiriamas baltymas dermicidinas transportuojamas į epiderminių ląstelių išorę, kur proteolitiniai fermentai jį suskaldo iki antimikrobiniu veikimu pasižyminčių peptidų. Įgimtajam imunitetui atstovaujančioms molekulėms priklauso ir melaninas epidermio ląstelėse esantis pigmentas, apsaugantis nuo ultravioletinių spindulių poveikio. Antra, audinių ir kraujo ląstelių mikrobicidiniai faktoriai nukenksmina bet kokį mikroorganizmą, praėjusį fizinį epitelio ląstelių barjerą. Tai gali būti įvairūs baziniai baltymai, pvz., sperminas, spermidinas, histonai, protaminas ir

78 78 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI kt., besigaminantys pažeistuose audiniuose, kraujo ląstelėse ir pasižymintys baktericidinėmis savybėmis. Kitas nukenksminantis baltymas lizocimas hidrolazių klasės fermentas, ardantis bakterijų sieneles. Komplemento yra kraujyje, svarbus įgimtojo imuniteto ląstelėms (makrofagams) aktyvinti, opsonizuoti, dalyvauja uždegimo reakcijose ir kt. Ypatingas tuo, kad padeda fagozitozės procesui, imobilizuodamas mikroorganizmus makrofago paviršiuje ir skatindamas jų patekimą į ląstelę bei suardymą. Nespecifinei apsaugai svarbus ir properdinas, galintis aktyvinti komplementą, pasižymintis hemolizinėmis, baktericidinėmis ir priešvirusinėmis savybėmis. Interferonai (alfa (α), beta (β) ir gama (γ) formos) tai potencialūs imunomoduliaciniai citokinai, labai svarbūs ląstelių gynyboje prieš virusus. Pagaliau, igimtojo imuniteto išsivystymui reikšmingi įvairūs receptoriai ir molekulės. Sekretuojamas reaktyvusis C baltymas jungiasi prie pneumokokų C baltymo, todėl ir buvo taip pavadintas. Šis baltymas atpažįsta daugybės bakterijų ir grybų ląstelės sienelėje esančias makromolekulių grupes, pvz., fosfocholiną, lipoproteinus, monofosfatų esterius ir histonus, ir jungiasi prie jų. Be to reaktyvusis C baltymas gali aktyvinti komplemento kaskadą. Pagrindinis gramneigiamų bakterijų paviršiaus membranos komponentas lipopolisacharidą prijungiantis baltymas. Jis prijungia lipopolisacharidą. Toks kompleksas keliauja prie makrofagų ir B ląstelių paviršiaus receptoriaus CD14. Prisijungimas prie šio receptoriaus skatina uždegimo reakcijas. Kai kurios audinių ląstelės sekretuoja mindiną, kuris jungiasi prie bakterijų sienelėse esančių angliavandenių grandinių ir tokiu būdu skatina jų agliutinaciją ir opsonizaciją. Kolektinai tai atpažinimo molekulių grupė, kuri labai panaši į komplemento komponentą C1q. Kolektinai atpažįsta manozės ir kitų angliavandenių ligandus, esančius mikrobinių ląstelių sienelėse. Be sekretuojamų atpažinimo receptorių ląstelės turi endocitinių atpažinimo receptorių, pvz., fagocitų paviršiaus receptoriai, atpažinę tam tikras makromolekules, mikroorganizmų paviršiuje padeda jiems patekti į ląsteles; ląstelės viduje jie nukreipiami į lizosomas sunaikinimui. Tokio receptoriaus pavyzdys manozės receptorius, atpažįstantis mikroorganizmus, savo paviršiuje turinčius angliavandenių, kurių sudėtyje gausu manozės ir fukozės. Trečia receptorių rūšis signaliniai receptoriai, atpažįstantys tam tikras molekules mikroorganizmo paviršiuje ir aktyvinantys imuninės sistemos ląstelėms perduodamus signalus. Vienas iš jų yra CD14, kurį sintetina fagocitinės ląstelės; jis atpažįsta gramneigiamų ir gramteigiamų ląstelių sienelių lipopolisacharidus. Įgimtajam imunitetui labai savarbūs TLR receptoriai (angl. Toll-like receptors). Manoma, kad tai yra seniausios ir konservatyviausios imuninės sistemos molekulės. Šie nekataliziniai membraniniai baltymai atpažįsta koservatyvias mikrobines PAMP molekules (angl. pathogen-associated molecular patterns)

79 I Dalis VI skyrius 79 ant patogenų. Fizikinius barjerus (odą, gleivines) įveikusius mikrobus TLR receptoriais atpažįsta imuninės ląstelės aktyvinamas imuninis atsakas. Įvairius TLR receptorius turi monocitai / makrofagai, dendritinės ląstelės, neutrofilai, B ląstelės. Yra žinoma 13 TLR receptorių (TLR1, TLR2 ir t. t.) 6.2. Makromolekulės, susijusios su įgytuoju imunitetu Įgytoji imuninė sistema pradeda funkcionuoti, kai specifiškai sąveikaujantys T ir B limfocitų receptoriai susijungia su atitinkamais ligandais. B ląstelių sąveikos mechanizmas mažiau komplikuotas nei T ląstelių. Pastarųjų ligandai egzistuoja ant antigeną pateikiančiųjų ląstelių (makrofagų, dendritinių ląstelių, B ląstelių) paviršiaus. Būtent šios paviršiaus molekulės yra MHC molekulės, kurias koduoja pagrindinis audinių dermės kompleksas MHC (angl. major histocompatibility complex). Skirtingų organizmų MHC vadinamos specifiniais pavadinimais: žmogaus organizme HLA (angl. human leukocyte antigen) kompleksu (genų rinkinys yra 6-oje žmogaus chromosomoje); pelių organizme H-2 kompleksu (genų rinkinys yra 17-oje pelės chromosomoje). MHC sudaro daugiau kaip 100 koduojančių sekų, kurios skirstomos į 3 regionus, koduojančius 3 molekulių klases: MHC I klasės molekulės glikoproteinai, sintetinami beveik visų, turinčių branduolį ląstelių paviršiuje; pagrindinė jų funkcija peptidinių antigenų pateikimas citotoksinėms T ląstelėms; MHC II klasės molekulės glikoproteinai, pirmiausia sintetinami antigeną pateikiančiųjų ląstelių (makrofagų, dendritinių ląstelių, B ląstelių) paviršiuje; pagrindinė jų funkcija peptidinių antigenų pateikimas T helperiams (pagalbininkams); MHC III klasės molekulės baltymai, sudarantys komplemento sistemą (C2, C4 ir B faktorius), ir uždegime dalyvaujančios molekulės (citokinai, pvz., TNFα) bei terminio šoko baltymai. MHC padeda ląstelei atskirti,,savą nuo,,svetimo ; MHC yra aktyvus humoralinio ir ląstelinio imuninio atsako dalyvis. Antikūnai su antigenu sąveikauja savarankiškai, o T ląstelės gali atpažinti antigeną tik tuomet, jei šiame atpažinime dalyvauja MHC molekulės. MHC I klasės molekulės sudarytos iš sunkiosios grandinės (45 kda), nekovalentiškai susijungusios su neglikozilinta 12 kda β2 mikroglobulino molekule. α glikoproteino grandinė įtvirtinta plazminėje membranoje savo transmembraniniu hidrofobiniu segmentu (apie 25 aminorūgščių), kuris kerta membraną ir turi hidrofilinę (apie 30 aminorūgščių) citoplazminę uodegą.

80 80 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI α grandinė (II tipo membraninis baltymas) organizuota tokiu būdu, kad didžioji dalis yra išorėje. Ekstraląstelinė molekulės dalis formuoja išorinius (apytiksliai 90 aminorūgščių ilgio) α1, α2, α3 domenus (kilpas). α3 domenas glaudžiai susijęs su β2 mikroglobulinu ir turi CD8 koreceptoriaus prisijungimo vietą. β2 mikroglobulinas neįsitvirtinęs ląstelės membranoje, nes manoma, kad jo vienintelė funkcija sąveika su α grandine. α1, α2 domenai yra būtini antigeninio peptido prijungimo grioveliui formuoti. MHC II klasės molekulės būtinos imuninės sistemos funkcionavimui, todėl jas sintetina daugiausia tik antigeną pateikiančios ląstelės. Raiškos lygis priklauso ne tik nuo ląstelių tipo, bet ir nuo ląstelių subrendimo bei aktyvinimo. Pvz., MHC II klasės molekulių neekspresuoja nesubrendusios dendritinės ląstelės, tačiau subrendusiose jų raiškos lygis labai aukštas. Panašiai šias molekules sintetina ir subrendusios B ląstelės. Interferonas γ (IFNγ) gali skatinti šių molekulių raišką daugelyje ląstelių tipų ir netgi tose, kuriose įprastai jos nesintetinamos. II klasės molekulės yra heterodimerai, sudaryti iš dviejų glikozilintų polipeptidinių grandinių (33 35 kda α ir kda β), sujungtų tarpusavyje nekovalentiniais ryšiais. Abi grandinės įsitvirtinusios citoplazmoje COOH galu. Jos turi trumpą, aminorūgščių, citoplazminį domeną ir ląstelės išorėje esantį aminorūgščių ilgio domeną. Hidrofobinė membraną kertanti sritis yra 30 aminorūgščių ilgio. Abi α ir β grandinės sudarytos iš dviejų domenų α1, α2, ir β1, β2. CD4 prijungimo sritis yra β2 domene. Labiausiai nuo membranos nutolę α1 ir β2 suformuoja peptido prijungimo griovelį. Šis griovelis suformuotas tokiu būdu, kad būtų atviras iš abiejų galų. MHC II klasės ligandas paprastai esti aminorūgščių ilgio. Jis įsiterpia išilgai viso peptido prijungimo griovelio, jo galai kyšo. Čia ir yra esminis abiejų molekulių struktūrinis skirtumas, nes MHC I klasės molekulių atveju peptidas yra įsiterpęs giliai į molekulės vidų. MHC III klasės molekulės nedalyvauja antigeno pateikimo reakcijose. Jų funkcijos iki šiol nėra pakankamai aiškios. Įdomu tai, kad MHC III klasės molekulių genų klasteriai yra konservatyvūs visose rūšyse. Be to MHC III klasės genų produktai yra susiję su įvairiomis imuninės ir neimuninės sistemos ligomis. SANTRAUKA Dalis makromolekulių susijusios su įgimtuoju imunitetu ir neatsiejamos nuo imuninės sistemos, ypač nuo nespecifinio arba įgimto imuniteto. Pirmiausia ligos sukėlėjams patekti į ląstelę neleidžia anatominiai, fiziologiniai, cheminiai barjerai. Svarbūs ir kiti apsaugos būdai ląsteliniai, t. y. fagocitinis ir ląstelės lizės metodas, kai į organizmą patekę ligų sukėlėjai lizuojami ir pašalinami.

81 I Dalis VI skyrius 81 Jau epitelio ląstelės savaime sudaro fizinį barjerą, be to jose gaminasi antimikrobinės medžiagos ir tai trukdo ligų sukėlėjams prisitvirtinti prie šių ląstelių paviršiaus. Filogenetiniu požiūriu konservatyvesni antimikrobiniai peptidai defensinai ir katelicidinai. Šios molekulės pasižymi chemotaksinėmis savybėmis, kurios būdingos fagocitinėms ląstelėms ir iš dalies limfocitams. Svarbus ir dermicidinas, išskiriamas iš prakaito liaukų. Šis baltymas transportuojamas į epidermio ląstelių išorę, kur jis, padedant proteolitiniams fermentams, suskaldomas iki antimikrobinių peptidų. Nuo ultravioletinių spindulių apsaugo melaninas, kurio yra epidermio ląstelėse. Kai kurios audinių ląstelės sekretuoja mindiną, kuris jungiasi prie bakterijų sienelėse esančių angliavandenių grandinių ir tokiu būdu skatina jų agliutinaciją ir opsonizaciją. Kolektinai molekulių grupė, atpažįstanti manozės ir kitų angliavandenių ligandus, esančius mikroorganizmų sienelėse. Be kolektinų atpažinimo receptoriais gali būti endocitiniai atpažinimo receptoriai (pvz., fagocitų paviršiaus receptoriai, kurie patenka į ląstelės vidų, o ląstelės viduje lizosomas nukreipia sunaikinti). Kita rūšis signaliniai receptoriai, atpažįstantys mikroorganizmo paviršiaus molekules ir aktyvinantys imuninės sistemos ląstelėms perduodamus signalus. Dalis makromolekulių, susijusių su įgytuoju imunitetu, pradeda funkcionuoti, kai specifiškai sąveikaujantys T ir B limfocitų receptoriai susijungia su atitinkamais ligandais. Tokioms paviršiaus molekulėms priklauso didysis audinių dermės kompleksas MHC. MHC I klasės molekulės glikoproteinai, sintetinami beveik visų ląstelių, turinčių branduolį, paviršiuje ir jų randama visur. Pagrindinė jų funkcija peptidinių antigenų pateikimas citotoksinėms T ląstelėms. MHC II klasės molekulės glikoproteinai, sintetinami antigeną pateikiančių ląstelių (dendritinės ląstelės, makrofagai, B limfocitai). Pagrindinė jų funkcija peptidinių antigenų pateikimas T ląstelėms pagalbininkėms (TH). MHC III klasės molekulės baltymai, įeinantys į komplemento sistemą (C2, C4 komponentai ir B faktorius), uždegime dalyvaujantys baltymai ir terminio šoko baltymai. MHC III klasės genų produktai susiję su imuninės ir neimuninės sistemos ligomis. Šios molekulės nedalyvauja antigeno pateikimo reakcijose.

82 82 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI VII skyrius 7. ANTIGENAI Antigenais vadinamos visos genetiškai svetimos medžiagos, kurios patekusios į organizmą sukelia imunines reakcijas: sąveiką su ląstelių receptoriais, jų atpažinimą ir perdirbimą, ląstelių diferenciaciją ir proliferaciją, ypač antikūnų sintezę, atminties ląstelių atsiradimą (26 pav.). Antigenais gali būti ir įvairios rūšies makromolekulės. Antigeninių savybių neturi pavieniai cheminiai elementai, neorganiniai junginiai, pvz., druskos, rūgštys, kai kurie organiniai junginiai, (gliukozė, aminorūgštys). Prijungus šias molekules prie baltymų ar kitų nešiklių, jos tampa antigeniškomis. Kai kurie monomerai, sujungti į polimerines grandines, įgauna įvairaus laipsnio antigeniškumą, pvz., antigeninių savybių neturinčios aminorūgštys ir monosacharidai virsta stipriais antigenais baltymais ir mažiau antigeniškais polisacharidais Antigenų rūšys Antigenai skirstomi: egzogeniniai, patenkantys į organizmą iš išorės įkvepiant, pro virškinimo sistemą, injekcijos būdu; endogeniniai, susidarantys organizme dėl natūralių metabolizmo reakcijų ar užsikrėtus patogeniniu mikroorganizmu; autogeniniai, priklausantys tam pačiam organizmui; juos nustoja toleruoti dėl imuninės sistemos pakitimų, dažniausia dėl įvairių autoimuninių ligų. Antigenais gali būti baltymai, polisacharidai, fosfolipidai, hormonai, įvairūs metabolitai. Skirtingų rūšių makromolekulių antigeninės savybės nėra vienodos; stipriausi antigenai baltymai. Nustatyta, kad minimali baltyminės kilmės antigeno molekulinė masė 10 kda. Toks yra vienas iš mažos molekulinės masės antigenų kiaušinio albuminas, kurio masė sudaro 40 kda. Imuninį atsaką gali sukelti ir mažesnės molekulinės masės antigenai: ribonukleazė (14 kda), insulinas (6 kda) ir kt., tačiau šiuo atveju imuniniam atsakui sužadinti būtinas imunostimuliatorius (dažniausia naudojamas pilnasis ir nepilnasis Freundo adjuvantas).

83 I Dalis VII skyrius 83 ANTIGENAI Glu 836 Asn 838 Tyr 855 Svetimi baltymai Virusai Bakterijos Parazitai Grybeliai Transformuotos ląstelės Autoantigenai ANTIKŪNAI 26 pav. Antigenų rūšys ir imuninis atsakas Pastebėta, kad polipeptidai, į kurių sudėtį įeina ne mažiau kaip 8 9 aminorūgštys, jau pasižymi antigeninėmis savybėmis. Molekulinės masės dydis nulemia ir antigenų valentingumą epitopų, sąveikaujančių su antikūnais, skaičių. Ypatinga antigenų rūšis yra stafilokokų, streptokokų, mikoplazmų ir kitų patogeninių mikroorganizmų toksinai, vadinami superantigenais. Jie geba stimuliuoti daugelį T limfocitų populiacijų, kurios po aktyvinimo išskiria didelį kiekį citokinų. Haptenai nevisaverčiai antigenai, nes nesugeba sukelti antikūnų sintezės, gali tik sąveikauti su tokiais antikūnais. Norint, kad haptenai įgytų visaverčių antigenų savybių, būtina juos konjuguoti su baltymais, polisacharidais ar kitomis makromolekulėmis (nešikliais). Antigenai, gauti prie baltymo ar kitos makromolekulės prijungus haptenus, lemiančius imuninį atsaką, vadinami konjuguotais antigenais. Hapteno ir nešėjo konjugavimui nebūtinas kovalentinis ryšys, pavyzdžiui, nukleorūgščių ir baltymo kompleksas susidaro dėl elektrostatinių ryšių. Konjuguoto antigeno gavimo schema pateikta 27 pav. Modifikuoti antigenai gaunami cheminės modifikacijos būdu keičiant gamtinių biopolimerų, dažniausia tos pačios rūšies rūšies gyvūnų arba to paties recipiento baltymus. Šitaip galima suteikti biopolimerui naujų antigeninių savybių. Sintetiniai antigenai, naudojami kaip baltyminių antigenų analogai, geba indukuoti imuninį atsaką. Sintetiniai antigenai pagal pirminę ir erdvinę struktūrą turi būti panašūs į kurį nors konkretų baltymą, ypač priklausantį ligos sukėlėjui. Svarbiausias reikalavimas atsiradimas molekulėje pastovios ir pasikartojančios struktūros, lemiančios antigenines savybes. Sintetiniai peptidai dažnai naudojami naujoms fundamentaliosios imunologijos kryptims plėtoti,

84 84 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Haptenas (Diazoarsanilo rūgštis) Baltymas Baltymas Baltymas Baltymas Haptenas + nešiklis (Diazohapteno konjuguotas baltymas) Nešiklis (Tirozino turintis baltymas) 27 pav. Hapteno konjugatas su baltymu bet kartais taikomi ir šiuolaikinės praktinės imunologijos uždaviniams spręsti. Pvz., sintetiniai peptidai buvo naudojami kuriant diagnostines sistemas prieš ypač pavojingo įgyto imunodeficito sindromo (AIDS) sukėlėją žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV). Kartais antigenais vadinamos gyvulinės, augalinės ar bakterinės kilmės ląstelės, nors cheminiu požiūriu toks apibrėžimas netikslus, nes ląsteles sudaro daugybė baltymų, polisacharidų, nukleorūgščių ir kitų molekulių. Kiekvienas šių polimerų gali savaip sukelti imuninį atsaką. Pvz., salmonelių rūšies bakterijų žiuželius sutraukiantis baltymas flagelinas gali būti monomerinės (molekulinė masė 40 kda) ir polimerinės formos. Abiem atvejais šis individualus antigenas geba indukuoti antikūnų susidarymą, nors imuninis atsakas vyksta skirtingai. Monomerinės formos flagelinas indukuoja imunines reakcijas, priklausomas nuo T limfocitų, o šio baltymo polimeras (pasikartojančios sekos) geba aktyvinti B limfocitus, t. y. sukelia imuninį atsaką ir nedalyvaujant T limfocitams. Ypatingą reikšmę medicinoje turi eritrocitų antigenai, nulemiantys skirtingas žmonių kraujo grupes. Po ABO kraujo grupių sistemos svarbiausia yra rezus sistema, priklausanti nuo rezus antigenų įvairovės. Rezus antigeno pavadinimas kilęs nuo beždžionės Macacus rhesus, kurios kraujyje pirmą kartą surastas eritrocitų antigenas. Jį turi 85 proc. žmonių. Yra nustatyti 52 rezus sistemos antigenai, kurie žymimi Rh. Kliniškai svarbiausi penki Rh sistemos antigenai: D, C, c, E, e. D antigenas yra stipriausias imunogenas. Šie penki antigenai sudaro Rh formulę. Asmenys turintys D antigeną, vadinami rezus teigiamais, o asmenys neturintys D antigeno rezus neigiamais.

85 I Dalis VII skyrius 85 RhD molekulė tai iš 417 aminorūgščių sudarytas eritrocitų membranoje esantis baltymas. D antigenas yra genetiškai nulemtas, paveldimas autosominiu dominantiniu būdu. Rezus antigenai nustatomi agliutinacijos metodu, naudojant antikūnus prieš minėtus antigenus Antigenų savybės Imuninis atsakas priklauso nuo pagrindinių antigeno savybių: svetimumo, antigeniškumo, imunogeniškumo, specifiškumo. Svetimumas savybė, neatskiriama nuo paties antigeno sąvokos. Kitaip tariant, kuo filogenetiškai tolimesnis imunizuojamas organizmas, tuo imuninis atsakas bus intensyvesnis, pvz., triušio albuminas tam pačiam triušiui nebus visaverčiu antigenu, nes neturės svetimos genetinės informacijos, t. y. svetimų epitopų tai rūšiai; tuo tarpu jūros kiaulytei tas pats triušio albumino baltymas bus antigenu, nes šios rūšies gyvūnams jis yra svetimas. Antigeniškumas antigeno kokybės matas, t. y. sąveika su imuninio atsako metu susidariusiais antikūnais. Antigeniškumas būdingas ir haptenams, kurie in vivo sąlygomis negali sukelti imuninio atsako, tačiau in vitro sąlygomis gali reaguoti su antikūnais, gautais prieš šiuos konjuguotus antigenus. Imunogeniškumas medžiagų, kurios in vivo sąlygomis gali sukelti specifinį humoralinį ir (arba) ląstelinį imuninį atsaką, savybė. Tos medžiagos, kurios sužadina imuninį atsaką (antigenai) dar gali būti vadinamos imunogenais. Antigeno imunogeniškumo laipsnis priklauso nuo jo svetimumo organizmo imuninei sistemai, molekulinės masės, cheminės sudėties ir struktūros bei galimybės jį pateikti su audinių dermės komplekso molekulėmis ant antigeną pateikiančių ląstelių paviršiaus. Išreikštu imunogeniškumu pasižymi baltymai, polisacharidai ir kitos medžiagos. Specifiškumas antigenų (ligos sukėlėjų) savybės, kuriomis jie skiriasi vienas nuo kito. Pvz., virusai ŽIV-1 ir ŽIV-2, sukeliantys tą pačią ligą, AIDS, skatina skirtingo specifiškumo antikūnų sintezę, panaudojant šiuos antikūnus galima nustatyti du virusų tipus. Egzistuoja įvairios antigenų specifiškumo formos: rūšinis, grupinis, embrioninis, funkcinis, patologinis ir kt. Rūšinis specifiškumas lemia tai, kad vienos rūšies organizmas antigeniniu atžvilgiu skiriasi nuo kitos rūšies. Kuo organizmai vienas nuo kito filogenetiškai tolimesni, tuo imuninis atsakas intensyvesnis, labiau išreikštas specifiškumas. Pvz., žmogaus kraujo pėdsakus lengva atskirti nuo šuns. Tuo tikslu atliekama precipitacijos reakcija, ypač dažnai naudojama teismo medicinoje.

86 86 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Manoma, kad daugeliui kiekvieno, t. y. to paties, organizmo makromolekulėms būdingas rūšinis specifiškumas. Baltymų rūšinis specifiškumas svarbus ir biologine prasme. Evoliucijos metu kiekvienas baltymas funkciškai tobulėja ir kartu kinta jo individualios (antigeninės) savybės, kurios nulemia šeimininko baltymų ir, tarkime, prarazituojančio organizmo baltymų skirtumą. Taigi baltymų rūšinis specifiškumas, jų antigeninės savybės atlieka ir apsauginę funkciją, nes, pvz., šeimininko organizmas sugeba atskirti savus ir svetimus baltymus. Grupinis specifiškumas leidžia atskirti vienos grupės individų baltymus nuo kitos grupės individų tos pačios rūšies baltymų. Tai antigeninis specifiškumas tos pačios rūšies viduje. Pirmą kartą grupiniai antigenai buvo nustatyti 1900 m., kai K. Landšteineris aprašė žmogaus kraujo grupes 0, A, B, ir AB, t. y. eritrocitų antigenus (28 pav.). Dabar egzistuoja apie 30 grupių antigenų sistemų. Donorai 0 A B AB B A 0 Recipientai AB 28 pav. ABO kraujo grupių suderinamumas Antigeno molekulės, randamos tos pačios rūšies atskirų individų arba skirtingų genetinių linijų gyvūnų organizme, vadinamos aloantigenais, arba izoantigenais. Jiems priskiriami audinių dermės, arba transplantaciniai antigenai, kurie lemia antigeninius skirtumus tarp atskirų individų tos pačios rūšies viduje. Audinių ar organų atmetimo reakcijos po audinių ar organų transplantacijos vyksta dėl transplantacinių antigenų skirtumo tarp organizmo-donoro ir organizmo-recipiento. Dėl šios priežasties leukocitų transplantacinių antigenų identifikavimas labai aktualus medicinos praktikai, ypač persodinant audinius ar organus, nes populiacijos yra labai heterogeniškos. Antigenų heterospecifiškumas susijęs su tuo, kad skirtingų rūšių atstovai turi tuos pačius antigenus, heteroantigenus. Pvz., tas pats Forsmano

87 I Dalis VII skyrius 87 antigenas randamas avių, arklių šunų, kačių, pelių, vištų eritrocituose, tačiau jo nėra žmogaus, beždžionės, triušių, žiurkių organizme. Heteroantigenų egzistavimo galimybė ir prasmė yra neaiškios. Viena galimybė atsitiktinumas biosintezės metu. Heteroantigenų buvimas žinduolių organizme ir juos atakuojančiuose mikroorganizmuose gali būti antigeninės mimikrijos (angl. mimicry pamėgdžiojimas) rezultatas. Manoma, kad dėl mimikrijos ligos sukėlėjai gali lengviau patekti į organizmą, įveikti imuninės sistemos barjerus ir sukelti ligą. Evoliucijos metu vyksta tokia ligos sukėlėjų atranka, kuri padeda vis geriau prisitaikyti prie šeimininko organizmo ir jie tampa imunologiškai nematomais. Funkcinis antigenų specifiškumas susijęs su molekulių funkcija, pvz., organizmo baltymai (kraujo serumo albuminas, insulinas ir kt.), įvairiuose organizmuose atliekantys tą pačią funkciją, panašūs ir antigeninėmis savybėmis. Tuo tarpu tame pačiame organizme esantys baltymai, tačiau atliekantys skirtingas funkcijas, skiriasi ir antigeninėmis savybėmis, pvz., kraujo serumo albuminas ir globulinas imunologiškai skiriasi. Embrioninis antigenų specifiškumas susijęs su audinių antigenų kitimu embriogenezės metu. Nustatyta, kad įvairiose embrioninio vystymosi stadijose gyvūnų ar žmogaus organizmuose pasirodo baltymų, kurių nėra suaugusiame organizme. Pvz., vienas iš tokių baltymų α fetoproteinas, kuris sintetinamas embriono kepenyse. Vėliau paaiškėjo, kad šis baltymas (antigenas) sintetinamas ir suaugusiame organizme, tačiau tik tuomet, kai kepenyse vystosi piktybinis procesas. Dar vėliau α fetoproteinas nustatytas ir kepenų detoksikacijos atveju. Vis dėlto ankstyvioji kepenų vėžio diagnostika tik iš dalies remiasi α fetoproteino nustatymu žmogaus kraujo serume. Hapteninis (gr. hapto pritvirtinu) antigeninis specifiškumas siejamas su vienos ar kitos haptenų grupės atsiradimu. Tokie haptenai sudaro kompleksus su organizmo baltymais. Dažniausia hapteninį specifiškumą įgyja baltymai po sąveikos su vaistinėmis medžiagomis, pvz., alerginės reakcijos antibiotikams, nors antibiotikai neturi antigeninių savybių. Organizmo sensibilizacija penicilinu būdinga tik apie 1 proc. ligonių, kurie vartojo šį antibiotiką. Nustatyta, kad hapteninį kompleksą sudaro ne pats penicilinas, o jo skilimo produktai, dažniausiai benzilpenicilino rūgštis. Dalis vaistinių medžiagų yra giminingos ląsteliniams elementams, todėl, sąveikaudamos su jais, vaistinės medžiagos gali paskatinti imuninius pokyčius, sukeliančius mažakraujystę, leukopeniją ir kitus sveikatai kenksmingus reiškinius. Patologinis specifiškumas yra susijęs su audinių antigenų pokyčiais organizme vystantis patologiniams procesams. Šiai grupei priskiriami nauji antigenai, atsiradę pasikeitus baltymų konformacinėms savybėms, pvz., vystantis piktybiniam procesui, spindulinei ligai, nudegimo atveju ir pan.

88 88 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 9 lentelė. Dažniausiai tiriami imuninės sistemos ląstelių diferenciacijos antigenai Antigenas Ligandas Antigeną nešanti ląstelė T limfocitų žymenys CD1 Užkrūčio liaukos T limfocitai CD2 LFA-3 T limfocitai ir NK ląstelės CD3 T limfocitai CD4 HLA II klasės T limfocitai, monocitai CD5 CD72 T ir B limfocitai CD7 T limfocitai CD8 HLA I klasės T limfocitai ir NK ląstelės CD25 IL-2 T ir B limfocitai, NK ląstelės, monocitai CD28 CD80 T limfocitai CD29 Fibronektinas T limfocitai CD38 T ir B limfocitai CD43 ICAM-1 T ir B limfocitai, granuliocitai, monocitai CD45 Visi leukocitai CD71 Transferinas T limfocitai, monocitai B limfocitų žymenys CD10 B limfocitai CD19 B limfocitai CD20 B limfocitai CD21 CD23, C3d B limfocitai CD23 IgE B ir T limfocitai, monocitai, eozinofilai CD32 IgG B limfocitai, granuliocitai CD40 gp39 B limfocitai CD72 CD5 B limfocitai HLA-DR Antigenas, CD4 B ir T limfocitai, monocitai Monocitų ir makrofagų žymenys CD11a ICAM-1 Visi leukocitai CD11b Fibronektinas Monocitai, granuliocitai, NK ląstelės CD11c C3bi Monocitai, granuliocitai, B limfocitai, NK ląstelės CD18 Visi leukocitai NK ląstelių žymenys CD16 IgG Fc-fragmentas NK ląstelės, monocitai, granuliocitai CD56 NK ląstelės ir T limfocitai CD57 NK ląstelės ir T limfocitai

89 I Dalis VII skyrius 89 Diferenciacijos antigenai, arba ląstelių paviršiaus žymenys, nustatomi monokloniniais antikūnais. Šie antigenai būdingi tik tam tikrai ląstelių subpopuliacijai, jų diferenciacijos stadijai ar aktyvinimo laipsniui. Ląstelių membranoje esantys baltymai (antigenai) skiriasi savo struktūra ir atlieka įvairias funkcijas (receptoriai, koreceptoriai ir jų ligandai, signalo perdavimo baltymai, sukibimo molekulės, funkciškai aktyvių membraninių baltymų subvienetai). Dažniausiai diferenciacijos antigenų raiška tiriama tėkmės citometrijos metodu, naudojant fluorescentine žyme pažymėtus monokloninius antikūnus. CD (angl. cluster of differentiation leukocitų diferenciacijos antigenai) molekulės leukocitų diferenciacijos antigenai žymimi trumpiniu CD ir skaičiumi, apibūdinančiu ląstelės diferenciacijos laipsnį, jos būseną ir funkcijas. Nustatyta per 350 CD molekulių (individualių žymenų). Pvz., visi T limfocitai turi CD3 + žymenį, T helperiai (pagalbininkai) CD4 +, T (citoksinės) CD8 + ; B ląstelės CD19 + ir kt. Dažniausiai tiriami diferenciacijos antigenai, būdingi atskiriems ląstelių tipams (9 lent.). SANTRAUKA Antigenais gali būti įvairios makromolekulės, turinčios genetiškai svetimos medžiagos. Patekusios į organizmą jos sukelia atitinkamą imuninį atsaką: sąveikauja su ląstelių receptoriais, juos atpažįsta, skatina ląstelių diferenciaciją ir proliferaciją, antikūnų sintezę, atminties ląstelių atsiradimą. Antigenų savybių turi svetimi baltymai, bakterijos, virusai, parazitai, grybeliai, užkrėstos ir transformuotos ląstelės ir net autoantigenai (jeigu pakitusi struktūra ar cheminė sudėtis). Antigeninių savybių neturi pavieniai cheminiai elementai, neorganiniai junginiai ir monomeriniai organiniai dariniai (gliukozė, amino rūgštys ir t. t.). Antigeno imunogeniškumas, t. y. gebėjimas sukelti specifinį imuninį atsaką, priklauso nuo jo svetimumo organizmo imuninei sistemai, molekulinės masės, cheminės sudėties ir struktūros, galimybės pateikti antigeną su audinių dermės komplekso (MHC) molekulėmis. Medžiagos, kurios turi svetimos genetinės informacijos, bet yra mažos molekulinės masės, vadinamos nevisaverčiais antigenais arba haptenais. Tokie antigenai nesugeba sukelti antikūnų sintezės, gali tik sąveikauti su prieš juos gautais antikūnais. Paprastai po jų konjugacijos su baltymais, polisacharidais, fosfolipidais ar kitais nešikliais atsiranda galimybė sukelti imuninį atsaką. Ypatinga antigenų rūšis yra patogeninių mikroorganizmų toksinai superantigenai, kurie gali stimuliuoti daugelį T subpopuliacijų. Šios po jų aktyvinimo išskiria didelį kiekį citokinų. Antigenai, priklausomai nuo jų kilmės, skirstomi į atskiras rūšis: egzogeniniai antigenai (patenka į organizmą iš išorės); endogeniniai antigenai (susidarantys organizme dėl natūralių metabolizmo reakcijų ar vykstančių procesų, užsikrėtus patogeniniais mikroorganizmais ir pan.); autogeniniai antigenai (priklauso tam pačiam organizmui, tačiau organizmas nustoja juos toleruoti, vyksta įvairūs imuninės sistemos pakitimai).

90 90 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Eritrocitų antigenai lemia skirtingas žmonių kraujo grupes (ABO sistema). Antigenai, randami tos pačios rūšies, bet atskirų individų arba skirtingų genetinių linijų gyvūnų organizme, vadinami aloantigenais arba izoantigenais. Jiems priskiriami ir didžiojo audinių dermės komplekso antigenai, kurie lemia antigeninius skirtumus tarp atskirų individų tos pačios rūšies viduje. Tokių pačių antigenų buvimas žinduolių organizme ir juos atakuojančiuose mikroorganizmuose gali būti antigeninės mimikrijos rezultatas. Dėl mimikrijos ligų sukėlėjai gali lengviau patekti į organizmą ir sukelti ligą. Embrioninis antigenų specifiškumas susijęs su audinių kitimu embriogenezės metu. Įvairiose embrioninio vystymosi stadijose gyvūnų ar žmogaus organizmuose pasirodo baltymų (antigenų), kurių nėra suaugusiame organizme. Ląstelių diferenciacijos antigenai arba ląstelių paviršiaus žymenys CD antigenai. Diferenciacijos antigenai būdingi tam tikrai ląstelių subpopuliacijai, jų diferenciacijos stadijai ar aktyvumo laipsniui. Žinoma per 350 CD molekulių (individualių žymenų).

91 I Dalis 91 VIII skyrius 8. IMUNOGLOBULINAI (ANTIKŪNAI) 8.1. Imunoglobulinų struktūra Imunoglobulinai (Ig) tai grupė baltymų, kuriems būdinga panaši molekulinė organizacija ir gebėjimas sąveikauti su antigenu. Dėl žinomo specifiškumo antigenams imunoglobulinai vadinami antikūnais. Visi Ig yra glikoproteinai, turintys nuo 2 iki 14 proc. angliavandenių. Ig molekulę sudaro keturios polipeptidinės grandinės, sujungtos tarpusavyje kovalentiniais disulfidiniais ir nekovalentiniais ryšiais (29 pav.). Ig molekulėje yra dvi mažesnės, lengvosios L (angl. light lengvas) grandinės (25 kd), kurios skirstomos į du tipus κ ir λ. Jos būdingos visiems Ig. Tuo tarpu dvi didesnės, sunkiosios H (angl. heavy sunkus) grandinės (50 77 kd) yra specifinės kiekvienai Ig klasei, t. y. γ grandinė būdinga IgG, µ, α, δ ir ε, atitinkamai IgM, IgA, IgD ir IgE klasėms. Žmogaus IgA ir IgG klasės dar skirstomos į poklasius. Vieną Ig molekulę sudaro 2 identiškos L (κ arba λ) ir 2 identiškos H grandinės. Abi L ir H grandinės turi keletą pasikartojančių homologiškų atkarpų. Kiekvieną jų sudaro apie 110 amino rūgščių, kurios formuoja globulę, vadinamąjį domeną. L ir H grandinių N galiniai domenai skiriasi daugelyje Ig, todėl jie vadinami kintamais (angl. variable kintamas) V domenais (VL ir VH). Kintamuose domenuose yra ypatingai besiskiriančios amino rūgščių sekos, kurios vadinamos hipervariabiliomis sritimis (angl. complementarity determing regions, CDR). Jų yra po tris kiekviename V domene. CDR sekos dalyvauja antigeno surišime, tiksliai kontaktuodamos su antigeninėmis determinantėmis. Ig molekulėje L ir H grandinės hipervariabilios sritys sudaro aktyvų, antigeną surišantį centrą (paratopą). Hipervariabilias sritis skiria karkasinės sritys (angl. framework regions, FR), kurios kinta rečiau. Tokių sričių yra keturios ir sudaro proc. viso V domeno. Karkasinė dalis palaiko tokią Ig molekulės tretinę struktūrą, kad ji geriau kontaktuotų su antigenu. Be kintamųjų domenų, kurių L ir H grandinės turi po vieną, Ig molekulėje yra pastovieji C (angl. constant pastovus) domenai. L grandinė turi vieną, o H grandinė, priklausomai nuo klasės, turi 3 4 C domenus. Nuo H grandinės pastovių domenų priklauso Ig efektorinės funkcijos. Visos sunkiosios grandinės, priklausomai nuo to, ar Ig yra tirpus ar membraninis, gali turėti skirtingas C galines amino rūgštis. Tirpios formos Ig

92 92 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Sunkioji grandinė (H) Antigeno surišimas NH2 NH2 V H S S S Lanksto sritis S S S V H NH2 NH2 S Lengvoji grandinė (L) S V L Fab fragmentas S S C L S S S S S S C H2 CH2 κ arba λ S S Angliavandenių S komponentas S Fc fragmentas C H3 C H3 S S S S C H4 C H4 S S COOH COOH 29 pav. Apibendrinta žmogaus imunoglobulinų struktūra S C H1 COOH S S CH S S COOH C L1 S S S VL Hipervariablios sritys sunkiųjų grandinių C gale yra hidrofilinių amino rūgščių, o membraninėse hidrofobinių amino rūgščių. γ, α ir δ H grandinėse tarp CH1 ir CH2 domenų yra neglobulininis regionas lanksto sritis, sudaryta iš 10 (α1, α2, γ1, γ2, γ4) ar daugiau kaip 60 (γ3, δ) amino rūgščių. IgM ir IgE molekulės neturi lanksto srities ir jų H grandinėse yra keturi C domenai, o ne trys, kaip IgG, IgA ir IgD H grandinėse. Lanksto sritis suteikia Ig molekulės šakoms paslankumą, o tai svarbu, kad antigeną surišantys centrai pasiektų labiau nutolusias antigenines determinantes. Ig yra jautrūs (ypač lanksto sritis) proteolitiniams fermentams: papainui, pepsinui, tripsinui. Papainas skaldo IgG molekulę į 3 dalis: 2 identiškas (apimančias L grandinę ir H grandinės VH-CH1 domenus, Fab fragmentus (angl. fragment, antigen binding antigeną surišantis fragmentas) ir trečią dalį (apimančią abiejų L grandinių CH2-CH3 domenus, Fc fragmentą (angl. fragment, crystallizable kristalinis fragmentas) (29 pav.). Pepsinas atskelia F(ab )2, o Fc dalis degraduoja. Į visų Ig molekulių sudėtį įeina angliavandeniai, kurie prisijungia prie Ig polipeptidinės grandinės kovalentinėmis jungtimis. Tai nedideli

93 I Dalis VIII skyrius 93 oligosacharidai, kurių kiekis Ig molekulėje gali būti įvairus ir priklauso nuo Ig klasės ir poklasio. Angliavandeniai gali būti išsidėstę visoje Ig molekulėje: prie H grandinės, prie Fab fragmento bei molekulės lanksto dalies. Angliavandeniai palaiko domenų struktūrą Ig molekulėje; saugo nuo proteolitinių fermentų poveikio; dalyvauja išskiriant ir pernešant Ig; perduoda signalą iš antikūno aktyviojo centro Fc fragmentui; dalyvauja Ig molekulei prisijungiant komplementą Imunoglobulinų genai Imunoglobulino molekulę koduojantys genai apima tris genų lokusus, esančius skirtingose chromosomose. Šios trys genų grupės atskirai koduoja lengvąsias (L κ ir Lλ) ir sunkiąsias (H) Ig molekulės grandines. Žmogaus Lκ grandinę koduojantys genai yra 2 chromosomoje, L λ 22 chromosomoje ir H grandinę 14 chromosomoje (pelės atitinkamai 6, 16 ir 12 chromosomose). Ig molekulės L ir H polipeptidines grandines koduojančios DNR sekos yra vadinamos genų segmentais ir yra organizuotos grupėmis (30 pav.). Koduojančias sekas (genų seg mentus) skiria nekoduojančios (introninės) sekos. Lengvąsias κ ir λ grandines koduojantys genai organizuoti į V (angl. variable kintantis), J (angl. joining jungiantis) ir C (angl. constant pastovus) genų segmentų grupes, o sunkiąją grandinę koduojantys genai V, D (angl. diversity įvairovė), J ir C genų segmentų grupes. L grandinių kintančią (V) dalį koduoja V ir J genų segmentai, o pastovią (C) dalį C genų segmentai. Žmonių organizme λ grandinę koduoja apie 80 V λ, 6 J λ ir 6 Cλ genų segmentai (pelėse 2 Vλ, 4 Jλ ir 4 Cλ). κ grandinę koduojančius genus sudaro 80 V κ, 5 Jκ ir 1 Cκ genų segmentai (pelėse 200 Vκ, 4 Jκ ir 1 Cκ). Į funkcionuojantį geną (transkribuojamą seką), nuo kurio sintetinama ištisa L polipeptidinė grandinė, jungiasi tik po vieną genų segmentą iš kiekvienos genų segmentų grupės, t. y. po vieną V, J ir C genų segmentą. Kiekvieno Vλ ir Vκ genų segmento 5 gale yra egzonas, kuris koduoja amino rūgščių seką, vadinamą lyderiniu (L), arba signaliniu peptidu. Signalinė seka nukreipia peptidus į endoplazminį tinklą. Ši seka endoplazminiame tinkle greitai atskeliama (atsipalaiduojantys iš plazminės ląstelės imunoglobulinai jos neturi). H grandinių kintančią (V) dalį koduoja V, D ir J genų segmentai, o pastovią (C) dalį C genų segmentai. D genų segmentas yra atsakingas už amino rūgščių seką trečiojoje hipervariabilioje srityje (CDR3). Žmogaus H grandinės genams priklauso: 90 V H, 30 DH, 6 JH ir keli CH (Cµ, Cδ, Cγ (1, 2, 3, 4), Cα (1, 2), Cε) genų segmentai, atskirti introninėmis sekomis. Prieš kiekvieną V H geną yra lyderinis peptidas.

94 94 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Segmentinė Ig genų struktūra būdinga gemalinei ląstelės DNR. Tokioje būsenoje ji nėra transkribuojama ir transliuojama, kol neįvyksta genų segmentų persitvarkymai (angl. rearrengements) (31 pav.). Persitvarkant L grandinę koduojantiems genų segmentams, vyksta DNR rekombinacija, kurios metu vienas V genų segmentas yra sujungiamas su vienu J genų segmentu. H grandinės atveju vyksta dvi rekombinacijos: pirmiausia, D genų segmentas jungiasi su J segmentu, o po to DJ prijungiamas prie V genų segmento. Sujungiamus genų segmentus skiriančios sekos dažniausiai iškerpamos (angl. deletion), rečiau vyksta inversija, priklausomai nuo V ir J segmentų išsidėstymo. Gemalinės DNR sekos, esančios kiekvieno VL ar VH genų segmento 3 galuose, kiekvieno DH genų segmento 5 ir 3 galuose ir kiekvieno JL ar JH genų segmento 5 galuose, yra vadinamos DNR rekombinacijos signalinėmis sekomis (RSS, angl. recombination signal sequences). Šios sekos Lambda L grandinės genų segmentai L V λ1 L V λ2 L V λn J λ1 C λ1 J λ2 C λ2 J λ3 C λ3 J λ4 C λ4 P P P E E E E Kappa L grandinės genų segmentai L Vκ1 L Vκ2 L Vκn Jκ1 Jκ2 Jκ3 Jκ4 Jκ5 Cκ P P P E H grandinės genų segmentai L V L V2 L Vn D1 D2 D3 Dn J1 J2 J3 J4 J5 P P P E Cµ Cδ Cγ3 Cγ1 Cγ2 Cγ4 Cε Cα1 Cα2 C H1 H C H2 C H3 C H4 30 pav. Imunoglobulinų L ir H grandinių genų struktūra

95 I Dalis VIII skyrius 95 V1 Vn D1-Dn J1-6 Cµ 5' 3' Somatinė rekombinacija (D-J sujungimas) V1 Vn D1 / Dn Cµ 3' 5' V1 Vn D3J2 Cµ 3' V1 D1 J1 Cµ V1 D1 J1 Cµ AAA 3' Somatinė rekombinacija (V-DJ sujungimas) Transkripcija / RNR branda VnD3J2 Cµ 5' VnD3J2 Cµ AAA 3' V Cµ Transliacija V Cµ CDR3 CDR3 Ig klasių persijungimo rekombinacija H grandinės genai IgM ekspresuojančioje ląstelėje VDJ Cµ Cδ Cγ3 Cγ1 Cγ2b Cγ2a Cε Cα µ mrna δ mrna Cγ1 Gemalinis transkriptas Switch rekombinacija Cγ3 Cδ Cµ Cγ2b Cγ2a VDJ Cε Cα H grandinės genai IgE ekspresuojančioje ląstelėje VDJ Cε Cα 31 pav. V(D)J rekombinacijos ir Ig klasių perjungimo rekombinacijos schema

96 96 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI padeda kontroliuoti DNR imunoglobulinų genų segmentų persitvarkymus. RSS yra komplementarios sekos, kurios susijungia, suformuodamos kilpos formos struktūrą, kurią sudaro V ir J genų segmentai ir intronai, kuriuos reikia iškirpti. Šios kilpinės struktūros yra katalizuojamos grupės fermentų, vadinamų V(D)J rekombinaze. Ig genų rekombinacijos indukcijai yra svarbūs 2 genai, vadinami rekombinacijos aktyvinimo genais, 1 ir 2 (RAG-1 ir RAG-2, angl. recombination activation genes). Jie koduoja baltymus (RAG-1 ir RAG 2), kurie yra svarbūs rekombinazės komponentai ir dalyvauja V(D)J rekombinacijos procese. RAG-1 ir RAG-2 aktyvumas ir reguliacinės savybės koreliuoja su specifinių transkripcijos faktorių (pvz., EBF, E2A) raiška, kurie dalyvauja ankstyvojoje B ląstelių diferenciacijoje. Ig genų segmentų persitvarkymui taip pat yra svarbi fermento galinės deoksinukleotidil-transferazės (TdT, angl. terminal deoxynucleotidyl transferase) veikla. Šis fermentas įterpia nešabloninius (angl. non-templated) arba N nukleotidus, į genų segmentų susijungimo vietą ir taip prisideda prie antikūnų įvairovės kūrimo. Pasibaigus V(D)J rekombinacijai, pirminiuose RNR transkriptuose V(D)J genų segmentai nuo C genų segmentų yra atskirti nekoduojančių sekų, todėl vyksta RNR branda, kurios metu yra pašalinamos šios introninės sekos bei vyksta poliadenilinimas (prie C genų segmento pridedama poly-a uodega). Šios subrendusios irnr transliacija lemia imunoglobulino molekulės L (κ arba λ tipo) ar H (µ tipo) grandinės sintezę. Ig genų rekombinaciją reguliuoja genų segmentų persitvarkymo procesų produktai: µ grandinę koduojančių genų segmentų susijungimas lemia H grandinę koduojančių genų segmentų tolimesnio persitvarkymo sustabdymą, o L grandinės genų segmentų sujungimas (pvz., λ) stabdo kito tipo (pvz., κ) L grandinės genų segmentų pertvarką. Viena iš svarbių šio proceso pasekmių yra ta, kad ląstelėje vyksta tik vienos chromosomos persitvarkiusių Ig genų (H ir L grandinės) raiška ir yra išjungiamas produktyvus Ig genų persitvarkymas homologiškoje chromosomoje. Taigi gaunama tik po vieną produktą tiek iš H, tiek ir iš L grandines koduojančių genų lokusų alternatyvių alelinių regionų, t. y. vyksta arba mamos, arba tėvo imunoglobulinų genų alelių raiška. Šis fenomenas yra vadinamas aleliniu pašalinimu (išimtimi) (angl. allelic exclusion) ir yra unikalus imunoglobulinų (ir T ląstelių receptorių) genams. Svarbi alelinės išimties pasekmė yra ta, kad dažniausia pavienė B ląstelė sintetina antikūnus, kurie turi identiškas H ir L grandinių V sritis, t. y. vieno specifiškumo (angl. monospecific) antikūnus. Ig genų segmentų persitvarkymai, kurie lemia H ir L grandines koduojančių genų raišką, vyksta B ląstelių pro-b ir pre-b brandos stadijose kaulų čiulpuose. Kai subrendusias naivias B ląsteles periferiniuose limfoidiniuose organuose stimuliuoja antigenas, vyksta tolimesnis H grandinės C genų segmentų persitvarkymas. Subrendusi B ląstelė, esant tokiai pačiai

97 I Dalis VIII skyrius 97 H grandinės pertvarkytų V srities genų raiškai, gali perjungti C srities genų segmentus ir šis procesas vadinamas klasės (izotipo) persijungimu (angl. class (isotype)-switching) arba switch rekombinacija (angl. class switch recombination (CSR)). Šis procesas vyksta antrinių limfoidinių organų gemaliniuose centruose, papildomus signalus teikiant folikulinėms dendritinėms ląstelėms ir T ląstelėms. Nors imunoglobulinų klasių perjungimo genetiniai pagrindai nėra gerai išaiškinti, yra žinoma, kad vyksta genetinė rekombinacija tarp specializuotų perjungimo (angl. switch (S)) sričių (jose yra G- turtingos pasikartojančios sekos), esančių prieš kiekvieną C genų segmentą (išskyrus Cδ) (31 pav.). Antikūnų klasių perjungimo procese taip pat dalyvauja fermentas perjungimo rekombinazė (angl. switch), izotipui specifiniai citokinai (pvz., IL-4 ir IL-13 dalyvauja perjungiant antikūnų sintezę iš IgM klasės į IgE klasę), fermentas aktyvacijos indukuota citidino deaminazė (angl. activation-induced cytidine deaminase (AID)). Imunoglobulinų klasių perjungimas vyksta antrinio imuninio atsako metu (pirminio imuninio atsako metu gaminami IgM klasės antikūnai). Tai lemia antikūnų afiniškumo brandą tam pačiam antigenui. Periferiniuose imuninės sistemos organuose be klasių perjungimo, subrendusiose B ląstelėse gali vykti Ig genų somatinės hipermutacijos (angl. somatic hypermutation (SHM)). Tai taškinės mutacijos kintančioje (V) srityje (dažniausiai hipervariabiliose srityse), nulemiančios antikūnų su didesniu afiniškumu tam tikram antigenui susidarymą. SHM inicijuoja fermento AID vykdomas citidino deamininimas, pakeičiant jį į uridiną. Imunoglobulinų genų persitvarkymas ir mutacijos sukuria didelę B ląstelių receptorių (BCR) struktūros bei sintetinamų antikūnų įvairovę, o imuninei sistemai gebėjimą reaguoti į daugybę skirtingų antigenų. Taigi antikūnų įvairovę lemia: V, D ir J genų segmentų daugybinės kopijos (gemalinė įvairovė). VJ ir VDJ genų segmentai gali rekombinuoti įvairiomis kombinacijomis (kombinacinė įvairovė). Pvz., 30 V κ ir 5 Jκ segmentai sudaro 30 5 = 150 skirtingų žmogaus κ lengvųjų grandinių su skirtingomis kintančiomis sritimis. Jungiant V geno segmentą su pertvarkytu DJ segmentu pridedami ar atskeliami nukleotidai (jungimo įvairovė). Daugybinės lengvųjų ir sunkiųjų grandinių kombinacijos. Somatinės hipermutacijos.

98 98 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 8.3. Imunoglobulinų klasės ir jų savybės Atsižvelgiant į H grandinių ypatumus, skiriamos 5 imunoglobulinų klasės: IgG sunkioji grandinė γ, IgM µ, IgA α, IgE ε, IgD δ (32 pav.). Ig savybės ir funkcijos priklauso nuo jų kiekio organizme (10 lent.). Kita vertus, atskiruose žinynuose šios funkcijos (molekulinė masė, įtaka komplemento aktyvumui, sąveika su kitais komponentais) pateikiamos skirtingai. IgG tai dažniausiai serume sutinkama Ig klasė. Apie 75 proc. bendro Ig kiekio žinduolių serume sudaro IgG. Kiekviena molekulė yra sudaryta iš 2H γ tipo ir 2 L (κ ar λ tipo) grandinių. Žmogaus IgG klasė yra skirstoma į 4 poklasius: IgG1, IgG2, IgG3 ir IgG4 (33 pav.) Struktūriškai visi poklasiai yra panašūs. Visi IgG CH2 domene turi angliavandeninį komponentą, kuris turi įtakos erdvinei IgG struktūrai. Šis komponentas neleidžia glaudžiai sąveikauti abiems γ grandinėms CH2 domene. Poklasiai skiriasi H grandine, o kartu ir savo fizikocheminėmis ir biologinėmis savybėmis. Didžiausi skirtumai tarp poklasių yra lanksto srityje: skiriasi disulfidinių jungčių skaičiumi (2 γ1, γ4; 4 γ2 iki 11 γ3) ir lanksto srities ilgiu. IgG klasės antikūnai daugiausia sintetinami antrinio imuninio atsako metu. Atsižvelgiant į tai, kad IgG receptoriai yra ant placentos sincitiotrofoblastų, IgG praeina per placentą ir apsaugo organizmą pirmąsias gyvenimo savaites. IgG, lyginant su kitais Ig, lengvai pasiskirsto audinių skysčiuose, o tai labai svarbu neutralizuojant bakterijų toksinus. Surišus mikroorganizmus, aktyvuojamas komplementas, sukeliamas leukocitų chemotaksis. IgG sąveikauja su daugelio ląstelių (neutrofilų, monocitų, makrofagų) receptoriais IgG Fc sričiai (FcγR) ir palengvina fagocitozę (opsonizacijos reiškinys), o sąveikaudami su FcγR ant NK ląstelių nuo antikūnų priklausantį citotoksiškumą. Atsakas į įvairius antigenus būna skirtingų IgG poklasių. Polisacharidiniai antigenai daugiausia indukuoja IgG2, IgG4 antikūnų gamybą, kurie blogai aktyvuoja komplementą klasikiniu keliu, nesuriša FcγR ant fagocitinių ląstelių. Prieš virusus ir RNR dažniausiai susidaro IgG1, prieš dvispiralę DNR IgG1, IgG3; prieš baltyminius antigenus IgG1, IgG3 poklasių antikūnai. IgM sudaro apie 10 proc. žmogaus kraujo serumo Ig. Penki IgM monomerai yra išsidėstę radialiai, kur Fc fragmentai nukreipti į rato centrą ir sujungti tarpusavyje disulfidinėmis jungtimis (CH3 domene) bei J (angl. joining) grandine (32 pav.). Visos sunkiosios (µ tipo) ir lengvosios grandinės (κ arba λ tipo) pentamerinėje IgM molekulėje yra identiškos ir šios struktūros valentingumas yra lygus 10. IgM turi apie proc. angliavandenių, o bendra molekulės masė yra didesnė nei 900 kda. Kraujo plazmoje IgM cirkuliuoja daugiausiai pentametro pavidalu (tik nežymi dalis monomeras), B ląstelių membraninis IgM yra monomeras ir BCR dalis, kuri sąveikauja (prisijungia) su antigenu. IgM klasės antikūnai gaminami pirmieji imuninio

99 I Dalis VIII skyrius 99 IgG IgD IgE VL V H VL VH V L VH C L Cγ1 CL Cδ1 CL Cε1 Cγ2 Cγ3 C δ2 C δ3 Cε3 Cε4 Cε2 IgA (dimeras) IgM (pentameras) VH VL V L V H C α1 C L Lankstas Disulfidinė jungtis CL C µ2 C µ1 J grandinė C α2 C α3 Cµ3 C µ4 J grandinė 32 pav. Atskirų klasių (IgG, IgD, IgE, IgA ir IgM) žmogaus imunoglobulinų struktūros ypatumai atsako metu. Šios klasės antikūnai taip pat pirmieji sintetinami naujagimių organizme. IgM gerai fiksuoja ir aktyvuoja komplementą klasikiniu keliu, efektyviai sulipdo mikroorganizmus ir dalyvauja jų lizėje. Pentamerinė antikūno struktūra įgalina šiuos procesus atlikti labai efektyviai. Dėl didelės molekulinės masės IgM antikūnai per placentą nepraeina. Pentamerinis IgM J grandine gali prisijungti prie sekrecinių epitelio ląstelių, kurios jį perneša per gleivines į sekretą, todėl gleivinių sekretuose ir motinos piene aptinkama sekrecinių IgM (sigm), tačiau žymiai mažesnis kiekis nei sekrecinių IgA (siga).

100 100 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Savybės 10 lentelė. Skirtingų klasių žmogaus imunoglobulinų struktūra ir funkcijos Imunoglobulinai IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgA1 IgA2 IgD IgE Sunkiosios grandinės γ 1 γ 2 γ 3 γ 4 µ α 1 α 2 δ ε Molekulinė masė (kda) Sekretuojama forma Gyvavimo pusperiodis serume (dienos) Klasikinis komplemento aktyvinimas Alternatyvus komplemento aktyvinimas IgM padidėjęs kiekis aptinkamas sergant makroglobulinemija, tripanosomoze, aktinomikoze, maliarija, infekcine mononukleoze, sistemine raudonąja vilklige, disgamaglobulinemija bei reumatoidiniu artritu. Kadangi IgM antikūnai pasirodo pirminio kontakto su infekcija metu, padidėję jų kiekiai gali būti naujos infekcijos rodiklis. Sumažėję IgM kiekiai stebimi sergant daugybine mieloma, lėtine limfoblastine leukemija, IgG ir IgA mieloma, esant agamaglobulinemijai. Monomeras Monomeras Monomeras Monomeras Monomeras Monomeras Mono-, di-, trimeras Monomeras Monomeras / Perėjimas per placentą /+ Sąveika su makrofagais ir kt. fagocitais Sąveika su bazofilais ir putliosiomis ląstelėmis alergijos metu + +/ + /+ /+ /+ /+ +++ FcR surišimas Sąveika su A baltymu IgA yra kraujo serume apie proc., tačiau dominuoja sekreciniuose skysčiuose: seilėse, ašarose, prakaite, piene, virškinimo trakto gleivėse, tulžyje, nosies ir bronchų sekretuose. Didelė dalis IgA molekulių (65 96 proc.), esančių įvairių gleivių sekretuose, yra polimerai (daugiausia dimerai, rečiau trimerai ir tetramerai) ir vadinami sekreciniais IgA (siga). Monomerinis IgA vyrauja kraujo serume, sekretuose yra nedaug: priešpienyje yra 14 proc., tulžyje

101 I Dalis VIII skyrius 101 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 V L VH V L VH V L VH VL VH C L Cγ1 C L Cγ1 C L Cγ1 C L Cγ1 Cγ2 Cγ3 Disulfidinė jungtis Cγ2 Cγ3 Lanksto sritis Cγ2 Cγ3 Cγ2 Cγ3 33 pav. Žmogaus IgG poklasių struktūra 30 proc., bronchų gleivinėje 56 proc., plaučių alveolių skystyje 9,4 proc. Nepriklausomai kiek monomerų įeina į polimerinę IgA formą, randama tik viena J grandinė. J grandinė tai ypatingas polipeptidas, reikalingas IgA (taip pat ir IgM) polimerizacijos iniciacijai. J grandinės molekulinė masė yra apie 15 kd, susideda iš 129 amino rūgščių ir vieno oligosacharido. J grandinę, kaip ir Ig, sintetina plazminės ląstelės ir IgA dimerizacija vyksta ląstelės viduje. Retais atvejais IgA gali dimerizuotis ir po sekrecijos. Polimerinis IgA sekretuose dar turi glikozilintą polipeptidą 70 kd sekrecinį komponentą (angl. secretory component), kuris apsaugo IgA dimerą nuo proteolizės ir padeda transportuoti IgA per endotelį į gleivinės paviršių. Savo struktūra sekrecinis komponentas panašus į Ig domenus. Sekrecinis komponentas pririštas prie IgA tik viena disulfidine jungtimi. Sekrecinį komponentą sintetina gleivinės egzokrininių liaukų endotelio ląstelėse, o jo pirmtakas yra poly-ig receptorius (pigr) (34 pav.). Šis receptorius prisijungia prie polimerinio IgA J grandinės ir toks kompleksas įtraukiamas į ląstelės vidų endocitozės būdu. Receptorius kartu su antikūnu yra transportuojamas į epitelio ląstelės apikalinį paviršių, kur endocitozinė pūslelė susilieja su ląstelės paviršiumi, pigr atskelia fermentai, atsipalaiduojant antikūnui kartu su pigr fragmentu, vadinamu sekreciniu komponentu. Nors kai kurios, ypač monomerinės IgA formos, gali difunduoti pasyviai (dažniausiai aktyviai šis procesas vyksta uždegimo metu), bet didžioji dalis IgA patenka į gleivinių paviršių aktyvaus transporto dėka, dalyvaujant poly-igr receptoriui. Žinomi du IgA izotipai IgA1 ir IgA2, kurie skiriasi antigeninėmis, biocheminėmis ir biologinėmis savybėmis. Didžiausi struktūriniai skirtumai tarp α 1 ir α2 grandinių yra lanksto srityje. α1 grandinės lanksto sritis sudaryta iš neįprastų pasikartojančių sekų, turtingų prolino, serino ir treonino. Taip pat

102 102 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI siga Epitelinės ląstelė pigr IgA pigr kompleksas Lamina propria Plazminė ląstelė IgA (dimeras) 34 pav. IgA transportas per epitelį, kuris priklauso nuo polimerinės formos receptorių, esančių ant gleivinės epitelio ląstelių šioje srityje yra 5 serinai, O-glikozidinėmis jungtimis susijungę su galaktozamininiais oligosacharidais. α2 grandinė šiame segmente neturi 13 amino rūgščių, o O-glikozidinėmis jungtimis sujungtas gliukozamininis oligosacharidas yra biologiškai svarbus: α2 grandinė dėl to yra atspari proteazėms, kurias sintetina kai kurios patogeninės bakterijos. Be to, oligosacharidai reikalingi glikozilintų baltymų transportui ir sekrecijai. Sveikų žmonių kraujo serume rasta IgA1 antikūnų prieš kai kuriuos maisto produktus, bakterinius, virusinius antigenus ir IgA2 klasės antikūnų prieš dekstraną, kazeiną, stafilokokų sienelės teicho rūgštį. IgA antikūnai gali konkuruoti su IgG, IgM antikūnais ir taip klasikiniu būdu slopinti komplemento aktyvaciją, fagocitozę, chemotaksį ir nuo antikūnų pirklausantį citotoksiškumą. IgA slopina monocitų TNFα ir IL-6 produkciją, kartu stabdo ir uždegiminius procesus. Gleivinėse siga sudaro imuninį barjerą. Antigenams, prieš patenkant į endotelio ląsteles, visų pirma reikia prisijungti prie jų paviršiaus. Tokiai adhezijai trukdo siga, esantis organizmo sekretuose. Prisirišdamas prie biologiškai aktyvių antigenų (virusų, fermentų, toksinų), siga neutralizuoja jų biologinį aktyvumą. Jungiamojo audinio plokštelėse IgA suriša antigeną be komplemento aktyvinimo, dėl to nekyla uždegiminių reakcijų. Imuniniai kompleksai per endotelio ląsteles transportuojami į gleivinės paviršių ir į kraują nepatenka. Tyrimai parodė, kad fagocitinės baltosios kraujo ląstelės turi receptorius IgA Fc fragmentui (FcαR). siga, sąveikaudamas su šiais receptoriais, sukelia metabolinę aktyvaciją, degranuliaciją, superoksidų išsiskyrimą iš graniuliocitų ir monocitų. Su motinos pienu gaunamas siga apsaugo kūdikį pirmaisiais gyvenimo metais. Kūdikio žarnyno ląstelės siga neįsiurbia, jis pasilieka virškinamajame trakte, apsaugo-

103 I Dalis VIII skyrius 103 damas nuo infekcijos. Įdomu tai, kad šie IgA yra nukreipti prieš bakterijas ir virusus, kurie dažnai patenka į virškinamąjį traktą. Yra manoma, kad ląstelės, kurios produkuoja antikūnus prieš virškinamojo trakto antigenus, migruoja į pieno liaukas, iš kur jų sekretuojami antikūnai patenka į pieną. IgD sudaro tik 0,2 1 proc. visų kraujo serumo imunoglobulinų. IgD (molekulinė masė 185 kda) yra monomeras, kurį sudaro dvi identiškos sunkiosios delta (δ) ir dvi identiškos lengvosios kapa (κ) arba lambda (λ) grandinės. IgD kraujo serume yra nestabilus (gyvavimo pusperiodis 2 3 dienos), jį greitai degraduoja serumo plazminas. IgD funkcijos kraujo serume yra neaiškios. Nedidelis IgD kiekis randamas nosies sekretuose ir piene. Tyrėjų duomenimis IgD aktyvuoja komplementą alternatyviu, bet ne klasikiniu būdu. B limfocitų paviršiuje randamas membraninis imunoglobulinas IgD, kuris, kaip ir IgM, yra asocijuotas su Ig-α ir Ig-β membraninėmis molekulėmis, įeinančiomis į BCR sudėtį. Membraninis IgD yra pagrindinis subrendusių B ląstelių BCR komponentas, jo raiška stebima ant B ląstelių membranų, kai jos palieka kaulų čiulpus ir įsikuria antriniuose limfoidiniuose organuose. Vis dėlto nėra tiksliai žinoma, kokia IgD reikšmė B ląstelių funkcijoms. Padidėjęs seruminio IgD kiekis nustatomas įvairių infekcinių procesų metu: esant ŽIV infekcijai, infekcinei mononukleozei, suaugusiųjų ūminiam virusiniam hepatitui, salmoneliozei, įvairioms parazitinėms ligoms, alerginei plaučių aspergiliozei. Piktybinių procesų metu didelis IgD kiekis nustatytas Hodžkino limfomos, IgD mielomos atvejais. IgE imunoglobulinų koncentracija kraujo serume yra mažiausia ir sudaro mažiau nei 1 proc. visų kraujo serumo imunoglobulinų. IgE dominuoja kaip monomeras, sudarytas iš dviejų identiškų epsilon (ε) sunkiųjų ir dviejų identiškų kapa (κ) arba lambda (λ) lengvųjų grandinių. Molekulinė masė 188 kda. Gyvavimo pusperiodis yra 2 5 dienos. IgE sintetina gleivinių plazminės ląstelės bei limfinių organų ląstelės alergeno patekimo vietoje. IgE gali jungtis su FcεR receptoriais, esančiais ant bazofilų, putliųjų ląstelių, eozinofilų. Prie receptoriaus prisijungęs IgE yra labai stabilus, taip pailgėja jo išlikimo laikas. Savo Fc fragmentu IgE fiksuojasi, o Fab fragmentu jungiasi su antigenu. Kai šių ląstelių paviršiuje IgE sukimba su antigenu, kryžminiu būdu sujungiamos daugybinės IgE molekulės ir ląstelės aktyvuojasi, atpalaiduodamos iš citoplazminių granulių uždegiminius mediatorius (histaminą, leukotrienus, prostaglandinus ir kt.). Šie mediatoriai gali lemti anafilaksiją ir kitas alergines reakcijas. Padidėjusi bendrojo IgE ir specifinių alergenams IgE gamyba yra charakteringas padidėjusio jautrumo reakcijų, kurias lemia IgE, požymis. Pagrindinė IgE funkcija, manoma, dalyvauti imuniniame atsake prieš tam tikrus parazitus nematodus, todėl IgE gamyba padidėja parazitinių infekcijų metu, o prie putliųjų ląstelių ir eozinofilų, prisijungusių IgE, kryžminis sujungimas skatina šių ląstelių toksinių mediatorių atsipalaidavimą.

104 104 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Taigi be antigeno surišimo antikūnams būdingos šios efektorinės funkcijos: Dalyvavimas opsonizacijos (palengvintos fagocitozės) procese. Fagocituojančios ląstelės, padedant FcR receptoriams, esantiems membranose, tvirtai prisijungia prie antikūnų (susijungusių su patogenu ar antigenu) Fc sričių. Tokiu būdu stimuliuojama antigeno-antikūno komplekso fagocitozė. In vitro tyrimais nustatyta, kad, pagausėjus specifinių antikūnųopsoninų, antigeno fagocitozės greitis padidėja daugiau nei 4000 kartų. Komplemento fiksacija ir aktyvinimas. Pasekmė ląstelių lizė ir išskiriamos biologiškai aktyvios medžiagos. Su antigenu susijungę antikūnai gali sąveikauti su komplemento sistemos baltymu C1, kuris pradeda komplemento sistemos aktyvinimą klasikiniu būdu. Antikūnai, kurie gali paleisti komplemento aktyvinimą šiuo būdu (žmogaus IgM, IgG1, IgG2 ir IgG3) kartais vadinami komplementą fiksuojančiais antikūnais. Dalyvavimas nuo antikūnų priklausomose citotoksiškumo reakcijose. Kai antigenas padengtas antikūnais, tačiau yra per didelis, kad būtų prarytas fagocitozės būdu, tampa svarbus nuo antikūnų priklausomas citotoksiškumo mechanizmas. Jis būdingas ląstelėms, turinčioms FcR ir gebančioms vykdyti citolizę: NK ląstelėms ir eozinofilams, silpniau neutrofilams, monocitams ir makrofagams. Šios ląstelės tiesiogiai suardo antikūnais padengtus taikinius: tam tikras bakterijas ir virusus, auglių ląsteles, transplantuotas ląsteles (viena iš transplantanto atmetimo reakcijų), savas ląsteles (autoimuninių reakcijų atveju). Citolizę vykdančių ląstelių membranose esantiems FcR susijungus su antikūnų Fc sritimis, ląstelių citoplazminėse granulėse stimuliuojama hidrolizinių fermentų (perforino, proteazių granzimų ir kt.) sintezė ir atsipalaidavimas šalia taikinio, suardoma pastarojo membrana ir jis lizuojamas. Transcitozė perėjimas per gleivinių epitelį ir placentą. Alerginio uždegimo reakcijų indukcija, charakteringa IgE klasės antikūnams. SANTRAUKA Imunoglobulinai (Ig) grupė baltymų, kuriems būdinga panaši molekulinė organizacija ir gebėjimas sąveikauti su antigenu. Ig sąveika su žinomu specifiškumu antigenams vadinama antikūnais. Ig molekulėje yra dvi identiškos lengvosios (L) ir dvi identiškos sunkiosios (H) polipeptidinės grandinės, sujungtos disulfidiniais ryšiais. Kiekvienos grandinės N galo 110 amino rūgščių formuoja kintamą (V H ir VL) domeną (aktyvų centrą). Likusioji kiekvienos L grandinės dalis turi vieną pastovųjį domeną (C L ), o likusioji kiekvienos sunkiosios grandinės dalis turi 3 arba 4 pastoviuosius domenus (CH).

105 I Dalis VIII skyrius 105 Konkrečioje antikūno molekulėje H grandinės pastovioji sritis gali būti tik vieno tipo iš penkių pagrindinių amino rūgščių sekų tipų (µ, γ, δ, α ar ε), vadinamųjų izotipais; o L grandinės pastovioji sritis tik vieno tipo iš dviejų pagrindinių sekų tipų (κ arba γ). H grandinės izotipas lemia antikūno klasę (µ IgM; γ IgG; δ IgD; α IgA ar ε IgE). Kiekvienos H ir L grandinės kintamajame domene yra 3 ypatingai besiskiriančios amino rūgščių sekos, kurios vadinamos hipervariabiliomis sritimis (CDR). Šios sritys antikūno molekulėje formuoja antigeną surišantį centrą, t. y. paratopą, ir lemia antikūno specifiškumą. Ig molekulės κ ir γ lengvąsias grandines ir sunkiąją grandinę koduoja trys skirtingos genų grupės, sudarytos iš genų segmentų ir esančios skirtingose chromosomose. Ig genams būdinga egzoninė-introninė struktūra. Funkcionuojantys lengvosios ir sunkiosios grandinės genai susiformuoja atsitiktine tvarka, persitvarkant kintančiosios srities genų segmentams (V(D)J) gemalinėje DNR. Šis persitvarkymas vadinamas V(D)J rekombinacija, kurią reguliuoja rekombinacijos aktyvinimo genai (RAG-1 ir RAG-2), dalyvaujant fermentams ir kitiems baltymams. Genų segmentų susijungimą kontroliuoja DNR rekombinacijos signalinės sekos (RSS), t. y. konservatyvios DNR sekos, kurios išsidėsčiusios kiekvieno V, D ir J geno segmento galuose. Ig genų persitvarkymas vyksta nuoseklia tvarka, pirmiausia pertvarkomi sunkiąją grandinę koduojantys genai, o vėliau lengvosios grandinės genai. Pertvarkomi tik vienos tėvinės chromosomos Ig molekulę koduojantys genai. Šis fenomenas vadinamas alelio išimtimi (alelio pašalinimu). Tokiu būdu užtikrinama, kad subrendusi B ląstelė savo membranoje turi tik vieno antigeninio specifiškumo Ig molekulę. Pagrindiniai antikūnų įvairovę lemiantys veiksniai: daugybinių gemalinių V, D, J genų segmentų atsitiktinis jungimasis; atsitiktinės lengvųjų ir sunkiųjų grandinių kombinacijos; jungimo įvairovė; nukleotidų pridėjimas P- ir N- regionuose; somatinės mutacijos. Po antigeno stimuliacijos subrendusiose B ląstelėse vykstantis Ig klasių perjungimas lemia skirtingų klasių (IgG, IgA ir IgE), bet to paties specifiškumo antigenui antikūnų susidarymą. Penkių skirtingų klasių Ig skiriasi efektorinėmis funkcijomis, koncentracija serume ir skilimo pusperiodžiu. IgG gausiausia Ig klasė serume, ypatingai svarbūs pašalindami antigenus (padedant įvairiems mechanizmams), pereina per placentą; serumo IgM yra pentameras, todėl dėl aukšto valentingumo efektyviau nei kitų klasių Ig neutralizuoja virusus, agliutinuoja bakterijas ir aktyvina komplementą. IgA yra vyraujanti klasė gleivinių išskyrose, įskaitant motinos pieną. Šiose išskyrose sekrecinis IgA yra kaip dimeras ar tetrameras, turintis sekrecinį komponentą. IgD ir IgE koncentracijos serume yra mažiausios nei kitų klasių Ig. IgD (kartu su IgM) yra pagrindinis membraninis Ig ant subrendusių B ląstelių. IgE dalyvauja putliųjų ląstelių degranuliacijoje alerginių reakcijų metu. Ig gali būti dviejų pagrindinių formų: išskiriami antikūnai, kuriuos gamina plazminės ląstelės, ir membraniniai antikūnai, kurie jungiasi su Igα / Igβ heterodimerais ir formuoja B ląstelės antigeninį receptorių (BCR) ant B ląstelės membranos. Pagrindinės efektorinės savybės, kurios įgalina antikūnus pašalinti antigeną ir sunaikinti patogeną: opsonizacija, kuri palengvina makrofagų ir neutrofilų vykdomą antigeno fagocitozę; komplemento aktyvinimas, kuris lemia grupės baltymų, perforuojančių ląstelių membranas, susidarymą; nuo antikūnų priklausomas ląstelių citotoksiškumas, lemiantis antikūnais padengtų ląstelių-taikinių sunaikinimą.

106 106 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI IX skyrius 9. KOMPLEMENTAS Komplementas pradėtas tirti m., kai J. Bordetas, dirbęs L. Pastero institute, nustatė, kad avių antiserumas prieš Vibrio cholerae sukelia bakterijų lizę, o antiserumą pakaitinus dingsta bakteriolizinis aktyvumas. Komplemento terminą įvedė P. Erlichas, apibrėždamas jį kaip kraujo serumo aktyvumą, kuris užbaigia antikūnų veikimą Komplemento sistema Komplemento sistemą sudaro grupė (apie 35 40) organizmo apsaugai svarbių baltymų ir glikoproteinų, kurių vieni cirkuliuoja kraujyje, o kiti yra ląstelių plazminėse membranose. Beveik visus tirpius (plazmos) komplemento baltymus sintetina hepatocitai (kepenų ląstelės), tačiau yra komplemento baltymų, kuriuos gamina kitų tipų ląstelės: monocitai / makrofagai, virškinimo trakto ir lytinių bei šlapimo takų epitelio ląstelės. Tirpūs komplemento baltymai paprastai cirkuliuoja kaip proteazės-zimogenai (profermentai) arba neaktyvios, bet galinčios aktyvintis, formos. Pagrindinė šių baltymų biologinė funkcija yra atpažinti svetimas daleles ir makromolekules bei skatinti jų pašalinimą opsonizacijos (palengvintos fagocitozės) arba lizės būdu. Aktyvinantis signalas skirtingus komplemento baltymus jungia į vieną sistemą (35 pav.). Po aktyvacijos proteazės gali paeiliui skaldyti specifinius baltymus-taikinius ar sąveikauti su kitais baltymais, inicijuodamos reakcijų kaskadas ir anafilatoksinų atsipalaidavimą. Komplemento sistema aktyvinama grandininės reakcijos būdu, t. y. vienas aktyvuotas baltymas veikia kitą visuomet ta pačia tvarka. Dauguma komplemento baltymų yra žymimi raide C (angl. complement) ir skaičiumi, kiti turi specifinius pavadinimus (pvz., D faktorius). Kai kurie komplemento baltymai po aktyvinimo hidrolizuojasi į du skirtingos molekulinės masės ir biologinio aktyvumo fragmentus: mažesnį a ir didesnį b. Mažesni nuo aktyvinto paviršiaus difunduoja į tarpląstelinį skystį, o didesni fragmentai turi du aktyvius centrus, kurių vienas prisitvirtina prie ląstelės-taikinio membranos ar antigeno-antikūno komplekso, o antrasis sąveikauja su kitu komplemento sistemos baltymu ir taip tęsia aktyvinimo grandinę.

107 I Dalis IX skyrius 107 Būdai Alternatyvusis Lektininis Klasikinis Aktyvinimas Bakterijų paviršius Bakterijos paviršiaus angliavandeniai Antikūnai C3b B faktorius MSL Antigeno-antikūno kompleksas Pagrindiniai komponentai D faktorius Properdinas MASP C1 C4 C2 C3 konvertazė C3bBb C4b2a Pagrindinis įvykis C3 C3b C3a Biologinis efektas (su fagocitais) Fagocitozė Antigeno-antikūno komplekso pašalinimas C5b C6 C7 C8 C9 C5 C5a su putliosiomis ląstelėmis (audinių bazofilai) Uždegimas Lizė 35 pav. Komplemento sistemos aktyvinimo būdai: alternatyvusis, lektininis, klasikinis 9.2. Komplemento aktyvinimo būdai Skiriami 3 komplemento aktyvinimo būdai (35 pav.): alternatyvusis, kai komplemento sistemą aktyvuoja tiesioginis sąlytis su įvairiais baltymais, lipidais ar angliavandeniais ant mikroorganizmų ar kitų svetimų struktūrų paviršiaus; lektininis, kurį inicijuoja manozę surišantis lektinas (MSL) ir trys fikolinai (tirpūs oligomeriniai baltymai, pasižymintys lektinams būdingu aktyvumu), skirtingu specifiškumu sąveikaudami su angliavandenių struktūromis ant mikroorganizmų paviršiaus; klasikinis, kai komplemento baltymus aktyvuojantis signalas yra antigeno-antikūno kompleksai ar kai kurios kitos molekulės, kaip pvz., C-reaktyvinis baltymas (CRB).

108 108 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Nepaisant to, kad skiriasi atpažinimo molekulės, nulemiančios skirtingus komplemento sistemos aktyvinimo būdus, tačiau yra naudojami panašūs aktyvinimo mechanizmai, kurie generuoja fermentus C3 konvertazes, skaldančias gausiausią komplemento baltymą C3 ir membraną atakuojančio komplekso (MAC) (angl. membrane attack complex) susidarymą, kuris sąlygoja ląstelės lizę. Be to, komplemento aktyvinimo padarinys yra baltymų fragmentų nusėdimas ant ląstelių-taikinių paviršiaus, o tai lemia, kad šias ląsteles geriau fagocituoja makrofagai. Alternatyvusis aktyvinimo būdas. Šiuo būdu komplemento sistema aktyvinama tiesiogiai kontaktuojant su angliavandenių molekulėmis, esančiomis ant bakterijų, mielių ar net daugialąsčių parazitų paviršiaus. Yra duomenų, kad šiuo būdu komplementą gali aktyvinti ir antikūno-antigeno kompleksai, kurių sudėtyje yra IgG, ar polimeriniai IgA, o taip pat daugelis sintetinių junginių. Iki šiol nėra duomenų, kad alternatyvusis aktyvinimo būdas prasidėtų nuo specifinių atpažįstančiųjų komplemento molekulių, ekvivalentiškų C1q ar MSL / fikolinams, kaip yra klasikiniame ar lektininiame komplemento aktyvinimo būduose. Šis aktyvinimo kelias grindžiamas spontanine, lėta C3 komplemento komponento hidrolize plazmoje, susiformuojant C3(H 2 O). Šis procesas vyksta, kai vanduo ar amoniakas atakuoja neaktyvuoto C3 komponento tioesterines jungtis. Susidariusi C3(H 2 O) molekulė savo funkcijomis ir konformacija yra panaši į C3b komplemento komponentą. Ji formuoja kompleksą su B faktoriumi, o šį kompleksą skaldo D faktorius. Atsipalaiduoja Ba fragmentas, o Bb fragmentas (aktyvi serino proteazė) lieka prisijungęs prie C3(H 2 O) ir susiformuoja C3(H 2 O)Bb kompleksas. Šis kompleksas veikia kaip C3 konvertazė alternatyviajame komplemento aktyvinimo būde ir skaldo C3 į C3b fragmentus, kurie kovalentiškai jungiasi prie greta esančių ląstelių paviršių. Tuomet B faktorius gali jungtis prie ant paviršiaus fiksuoto C3b ir susiformuoja C3bB, kurį jau gali skaldyti D faktorius. Ant ląstelės paviršiaus susiformuoja fiksuota C3 konvertazė (C3bBb). Ši konvertazė gali skaldyti daugiau C3 molekulių, sudarydama alternatyvaus aktyvinimo būdo C3 amplifikacijos kilpą. C3bBb konvertazė yra homologiška klasikinio aktyvinimo būdo C4b2a konvertazei, kaip ir C4 atitinka C3, o C2 B faktorių. C3bBb yra gana nestabilus, todėl Bb fragmentas disocijuoja nuo C3b (skilimo pusperiodis 2 3 min.). Šio komplekso disociaciją lėtina properdinas, todėl jis veikia kaip komplemento aktyvintojas. Manoma, kad properdinas gali pirmasis jungtis su C3b, fiksuotu ant ląstelės paviršiaus, paspartinti B faktoriaus prisijungimą prie C3b ir C3bBP komplekso susiformavimą. Tuomet D faktorius gali skaldyti B faktorių ir susiformuoja stabili C3 konvertazė (C3bBbP). Kitų C3b prisijungimas formuoja C3bBbP3b, kuri yra C5 konvertazė. Skaldant C5, susidaro anafilatoksinas C5a ir C5b fragmentas. C5a lemia uždegimą ir yra

109 I Dalis IX skyrius 109 chemotaksio veiksnys, pritraukiantis neutrofilus, monocitus, Treg ląsteles į komplemento aktyvacijos vietą (pvz., žaizdas, infekcijos vietas). C5b formuoja kompleksą su C6 ir C7, įvyksta struktūriniai persitvarkymai C7 molekulėje, kurie leidžia C5b67 kompleksui prisijungti prie plazminių membranų. Šis kompleksas prisijungia C8 komplemento baltymą, kuris patiria struktūrinius pasikeitimus ir į ląstelės-taikinio membraną įterpiama alfa (α) grandinė. Taip į membraną įterptas C5b678 kompleksas gali prisijungti 1 18 C9 molekulių ir ląstelės-taikinio membranoje susiformuoja pora (C5b6789 (1-18) ). Šių molekulių kompleksas dar vadinamas membraną atakuojančiu kompleksu (MAK). MAK susiformavimas pažeidžia protonų gradientą per membraną, lemia ląstelės lizę ir mirtį. Naujausi tyrimai rodo, kad properdinas galėtų būti alternatyvų komplemento aktyvinimo būdą inicijuojanti molekulė, nes gali tiesiogiai jungtis prie taikinio paviršiaus ir stiprinti C3b prisijungimą. Nustatyta, kad properdinas gali tiesiogiai jungtis prie zimozano ir triušio eritrocitų (abu yra gerai žinomi alternatyvaus būdo aktyvintojai), Neisseria gonorrhoeae, apoptotinių ir nekrotinių ląstelių. Nors properdino struktūra nėra panaši į C1q struktūrą, jis yra multimerinis baltymas, pasižymintis funkciniu panašumu, nes turi daugybines surišimo vietas. Klasikinis aktyvinimo būdas. Šis komplemento sistemos aktyvinimo kelias prasideda nuo C1 komplekso, kuris sudarytas iš atpažinimo molekulės C1q ir serino proteazių (proenzimų), C1r ir C1s (po 2 molekules). C1q gali jungtis prie IgG ir IgM antikūnų, surištų su antigenu, o taip pat ir prie įvairių neimunoglobulininių molekulių-aktyvintojų (CRB, serumo amiloido P ar kai kurių polisacharidų). Po prisijungimo C1q molekulė patiria struktūrinį pasikeitimą, kuris aktyvuoja C1r zimogeną. C1r molekulės skaldo ir aktyvuoja dvi C1s molekules ir formuoja aktyvią C1s serino proteazę. Aktyvuota C1s proteazė skaldo C4 ir C2 komplemento baltymus ir susidaro C3 konvertazė C4b2a. Ši konvertazė skaldo C3 baltymą į 2 komponentus anafilatoksiną C3a ir fragmentą C3b. Didysis C3b fragmentas kovalentine jungtimi gali rištis prie ląstelės-taikinio paviršiaus arba prie C4b baltymo, esančio C4b2a komplekse. Pastarasis prisijungimas lemia C5 konvertazės C4b3b2a susidarymą. Tuomet komplemento sistemos aktyvinimas tęsiasi toliau: skaldomas C5, C6 ir t. t., kaip alternatyviajame komplemento aktyvinimo būde (35 pav.). Jeigu C3b jungiasi prie taikinio paviršiaus, gali būti aktyvuojamas alternatyvusis komplemento aktyvinimo būdas: formuojasi C3b-B faktoriaus kompleksas, kuris veikiamas D faktoriaus aktyvuojasi ir virsta C3 konvertaze C3bBb. Tai lemia didelio skaičiaus C3b molekulių susidarymą. Jos nusėda ant ląstelių taikinių paviršiaus ir lemia opsonizaciją, palengvintą šių taikinių fagocitozę. Fagocituojančios ląstelės turi šimtus receptorių, reikalingų baltymui C3b, todėl jungiasi prie C3b baltymu aplipusios ląstelės taikinio ir ją lengviau fagocituoja.

110 110 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Lektininis aktyvinimo būdas. Šį komplemento aktyvinimo būdą inicijuoja manozę surišantis lektinas (MSL) arba fikolinai (M-, L-, ir H-), o taip pat neseniai aprašytas plazmoje esantis kolektinas 11. Šių molekulių koncentracija kraujyje yra žymiai mažesnė nei C1q baltymo, todėl komplementas lektininiu būdu aktyvinamas daug silpniau nei klasikiniu būdu. Lektininis komplemento aktyvinimo būdas yra nukreiptas į kitus taikinius. Jį inicijuojančios molekulės atpažįsta angliavandenius (manozę, fukozę) ir kitas pasikartojančias struktūras, kurių yra ant daugelio į organizmą patenkančių mikroorganizmų (bakterijų, virusų, grybų) ir ant apoptotinių / nekrotinių ląstelių. Cirkuliuojantys serume MSL ir fikolinai jungiasi su serino proteazėmis, kurios vadinamos su MSL asocijuotomis serino proteazėmis (MASP). Proteazės MASP (-1, -2, -3) savo struktūra ir funkcijomis yra panašios C1r ir C1s. Tačiau C1q jungiasi su proteazių tetramerais (2C1r, 2C1s), o MSL ir fikolinai vienu metu prisijungia tik vienos rūšies proteazę (dimerą MASP-1, MASP-2 arba MASP-3). Šių kompleksų prisijungimas prie aktyvinto paviršiaus lemia konformacinius pasikeitimus, indukuoja MASP proteazių autoaktyvinimą. Nustatyta, kad MASP-1 ir MASP-2 autoaktyvuojasi, o MASP-3 ne. Aktyvuota MASP-2 gali skaldyti C4 ir C2. Susidaro klasikinio ir lektininio aktyvinimo būdo C3 konvertazė C4b2a (35 pav.). MASP-1 ir MASP-2 funkcija nėra iki galo išaiškinta. Priešingai nei C1r ir C1s, MASP proteazės, manoma, viena kitos neaktyvuoja. Tačiau MASP-1 ir MASP-2 aktyvuoja kai kuriuos baltymus koaguliacijos būdu, todėl gali dalyvauti chemotaktinių fibrinopeptidų ir mažų krešulių susidaryme. MASP-1 ir (arba) MASP-3, kartu su kolektinu 11 dalyvauja augimo ir vystymosi procesuose Komplemento sistemos reguliavimas Trys komplemento sistemos aktyvinimo būdai yra aukšto amplifikacijos laipsnio reakcijos, todėl reikia efektyvių mechanizmų, kurie užtikrintų, kad komplemento sistema neišsektų ir nebūtų pažeistos šeimininko ląstelės. Komplemento sistemos veikla reguliuojama pasyviai ir aktyviai. Pasyvios kontrolės pagrindą sudaro didelis labilumas, būdingas daugeliui aktyvių komplemento komponentų, kurie praranda aktyvumą, jei nesureaguoja su tolesniu komponentu. Aktyvią komplemento aktyvinimo kontrolę atlieka kraujyje ir šeimininko ląstelių membranose esanti reguliuojančių baltymų sistema. H faktorius yra pagrindinis tirpus komplemento sistemos reguliavimo baltymas, kuris stabdo pernelyg intensyvų C3 baltymo skaidymą, reguliuodamas aktyvinimą. Ir aktyvumą alternatyvaus komplemento aktyvinimo būdo. Tai 155 kda glikoproteinas, sudarytas iš 20 komplementą kontroliuojančių domenų. H faktoriuje skiriamos trys skirtingos surišimo sritys C3b ar C3d

111 I Dalis IX skyrius 111 fragmentams. Jungdamasis su C3b, šis faktorius trukdo C3bBb formavimuisi ir tolesniam komplemento aktyvinimui. Neseniai nustatyta, kad H faktorius gali slopinti ir klasikinį aktyvinimo būdą. H faktorius taip pat gali tiesiogiai jungtis su patogeninių bakterijų (lot. Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Yersinia enterocolitica, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis) ląstelių paviršiumi. Kadangi šis faktorius lėtina komplemento aktyvaciją, jo prisijungimas prie bakterijų padeda joms apsisaugoti nuo komplemento atakų. Kiti tirpūs komplementą reguliuojantys baltymai yra C1 inhibitorius, I faktorius, C4b surišantis baltymas (C4bBP), S baltymas / vitronektinas ir klasterinas. Membraniniams komplementą reguliuojantiems baltymams priklauso membraninis kofaktorinis baltymas (MCP, CD46), irimą spartinantis faktorius (DAF, CD55), komplemento receptorius 1 (CR1, CD35) ir membraninis reaktyvios lizės inhibitorius (MIRL, CD59). MCP (angl. membrane cofactor protein) yra ant daugelio ląstelių, sujungia C3b ar C4b ir palengvina I faktoriaus degradaciją. DAF (angl. decay-accelerating factor) taip pat yra ant daugelio ląstelių ir jungiasi su C3b, perkeldamas Bb fragmentą iš alternatyvaus kelio C3 konvertazės C3bBb. Šis faktorius gali atskelti C2a nuo klasikinio ir lektininio kelio C3 konvertazės C4b2a. CR1 yra polimorfonuklearinių limfocitų, monocitų, eritrocitų, B limfocitų, inkstų podocitų ir folikulinių dendritinių ląstelių membranose ir veikia panašiai kaip MCP ir DAF. CR1 yra pagrindinis receptorius C3b baltymui. MIRL (CD59) (angl. membrane inhibitor of reactive lysis) yra ant daugelio ląstelių ir dalyvauja vėliausiose komplemento aktyvinimo kaskados reakcijose. Jis slopina C9 komplemento baltymų susitelkimą, todėl ląstelės membranoje nesusiformuoja pora. CD59 apsaugo šeimininko ląsteles nuo komplemento tarpininkaujamos lizės Komplemento receptoriai Daugelis komplemento sistemos funkcijų priklauso nuo aktyvių komplemento komponentų sąveikos su komplemento receptoriais CR (angl. complement receptor). Ši sąveika stimuliuoja CR turinčių ląstelių funkcijas, o kai kurie CR (pvz., CR1) gali reguliuoti komplemento kaskadą, reaguodami su komplemento baltymais ir slopindami jų funkcijas. Skiriami šie komplemento baltymus sujungiantys receptoriai: CR1 (CD35), CR2 (CD21), CR3 (CD11b / 18), CR4 (CD11c / 18), C3a / C4a baltymų receptorius, C5a baltymo receptorius. CR1 receptorius yra ant eritrocitų, neutrofilų, monocitų / makrofagų, eozinofilų, folikulinių dendritinių ląstelių, B ląstelių, T ląstelių membranų. Prie jo rišasi C3b ir C4b komplemento komponentai, todėl šis receptorius

112 112 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI blokuoja C3 konvertazės susidarymą, o taip pat prijungia prie ląstelių imuninius kompleksus. CR2 savo membranose turi B ląstelės ir T ląstelės. Šis receptorius prisijungia C3d, C3dg, ic3b komplemento baltymus. CR2 yra B ląstelės koreceptoriaus dalis; gali jungtis prie Epsteino-Barro viruso. CR3 ir CR4 komplemento receptoriai jungiasi su ic3b komplemento baltymu, o taip pat gali jungtis su sukibimo (adhezijos) molekulėmis ant neutrofilų, palengvindami jų ekstravazaciją. Šie receptoriai prijungia imuninius kompleksus ir sustiprina jų fagocitozę. CR3 ir CR4 receptorius turi monocitai / makrofagai, neutrofilai, NK ir kitos ląstelės. Ant putliųjų ląstelių, bazofilų, granuliocitų esantys C3a / C4a receptoriai gali prisijungti C3a ir C4a. Tai indukuoja putliųjų ląstelių ir bazofilų degranuliaciją. C5a receptorius prisijungia C5a komplemento baltymą. Šis receptorius yra ant putliųjų ląstelių, bazofilų, granuliocitų, monocitų / makrofagų, trombocitų, endotelio ląstelių. C5a prijungimas indukuoja putliųjų ląstelių ir bazofilų degranuliaciją Komplemento sistemos funkcijos Komplemento sistema atlieka šias funkcijas: vykdo bakterijų, virusų, ląstelių lizę; dalyvauja opsonizacijos (palengvintos fagocitozės) reakcijose; rišasi prie CR receptorių, esančių ant imuninių ląstelių ir dalyvauja uždegimo sužadinime, imuninį atsaką reguliuojančių molekulių sintezėje; dalyvauja imuninio klirenso, apsivalymo nuo imuninių kompleksų ir savų irimo produktų procese ir taip užtikrina organizmo homeostazę. Genetiniai komplemento sistemos komponentų deficitai padidina imuninių kompleksų sukeltų ligų riziką (sisteminės raudonosios vilkligės, vaskulitų, glomerulonefritų, reumatoidinio artrito), neatsparumą piogeninių bakterijų (streptokokų, stafilokokų, meningokokų) ir grybelių sukeltoms infekcijoms. Komplemento baltymų genetiniai variantai pasižymi subtiliais funkciniais skirtumais, o tai gali lemti polinkį sirgti kai kuriomis ligomis (pvz., su amžiumi susijusia raumenų degeneracija (AMD), inkstų ligomis). Perdėtas ar užsitęsęs komplemento aktyvavimas gali kilti dėl nuolatinio (ar didelių dozių) komplemento aktyvatorių (pvz., imuninių kompleksų, bakterijų, mieliagrybių, pažeistų savų audinių) veikimo, o taip pat dėl sumažėjusios komplemento slopintojų raiškos. Pagrindiniai komplemento tyrimai yra jo funkcinio aktyvumo, komplemento komponentų ir jo aktyvinimo produktų analizės tyrimai. Įvertinant komplemento funkcinį aktyvumą, dažniausia atliekami CH50 (klasikiniam ak-

113 I Dalis IX skyrius 113 tyvinimo būdui įvertinti) ir AH50 (alternatyviam aktyvinimo būdui įvertinti) hemolizės testai bei po aktyvacijos susidarančių komplemento komponentų (C1q, C1s, C4, C3, faktoriaus B, faktoriaus P, C4b sujungiančio baltymo ir kt.) kiekių tyrimai imunofermentinės analizės (IFA) metodu. Dažnai tiriami C3 ir C4 komplemento komponentai, kurių kiekio įvertinimas gali atspindėti komplemento sistemos deficitus. SANTRAUKA Komplemento sistemą sudaro grupė organizmo apsaugai svarbių baltymų ir glikoproteinų, kurių dauguma yra neaktyvūs. Komplementas aktyvinamas fermentų kaskados principu 3 būdais: klasikiniu, alternatyviu ir lektininiu keliu. Kiekvienas iš šių kelių prasideda skirtingai ir jame dalyvauja skirtingi komplemento baltymai. Klasikinis aktyvinimo būdas, kuris paeiliui įjungia C1, C4, C2 ir C3 komponentus, prasideda, kai IgM ir tam tikrų poklasių IgG prisijungia prie tirpaus ar ląstelės paviršinio antigeno. Alternatyvųjį ir lektininį kelią, nepriklausomai nuo antikūnų, paprastai tiesiogiai inicijuoja komplemento baltymų sąveika su įvairių mikroorganizmų (bakterijų, grybų, kai kurių virusų ir parazitų) paviršiaus struktūromis, nors alternatyviu būdu komplementą gali aktyvinti ir IgG-, IgA- ir IgE- antigeno kompleksai. Trys komplemento aktyvinimo keliai susieina į bendrą galutinių reakcijų seką: C5b komponentas nuosekliai reaguoja su C6, C7, C8, C9 ir susidaro membraną atakuojantis kompleksas (MAC), suformuojantis ląstelės membranoje porą ir sukeliantis ląstelės lizę. Dėl galimybės pažeisti šeimininko organizmą komplemento sistemą kompleksiškai reguliuoja aktyvūs ir pasyvūs mechanizmai. Pasyvios kontrolės pagrindas daugelio aktyvių komplemento komponentų didelis labilumas (aktyvumas prarandamas, jei nesureaguojama su tolesniu komponentu). Aktyvią komplemento aktyvinimo kontrolę atlieka reguliuojančių baltymų (H faktoriaus, C1-inhibitoriaus, membraninio kofaktorinio baltymo (MCP), irimą spartinančio faktoriaus (DAF) ir kt.) sistema, esanti kraujyje ir šeimininko ląstelių membranose. Daugelis komplemento sistemos funkcijų priklauso nuo aktyvių komplemento komponentų sąveikos su komplemento receptoriais (CR), esančiais ant imuninės sistemos ląstelių. Be pagrindinio vaidmens, t. y. ląstelių lizės, komplemento baltymai dalyvauja bakterijų opsonizacijos procese, aktyvina uždegimą, padeda pašalinti imuninius kompleksus. Genetiniai komplemento sistemos komponentų deficitai padidina imuninių kompleksų sukeliamų ligų riziką, imlumą piogeninių bakterijų ir grybelių sukeltoms infekcijoms.

114 114 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI X skyrius 10. CITOKINAI IR CHEMOKINAI Citokinai mažos molekulinės masės (8 30 kda) imuninę sistemą reguliuojantys baltymai ar glikoproteinai, kuriuos sintetina beveik visos organizmo ląstelės kaip atsaką į stimulą (36 pav.) Iš pradžių citokinų pavadinimas buvo vartojamas atskirti imunomoduliuojančiomis savybėmis pasižyminčių baltymų grupei, dar vadinamų imunotransmiteriais, nuo kitų augimo faktorių ir peptidinių reguliavimo veiksnių, kurie moduliuoja ir neimuninių ląstelių proliferaciją ir aktyvumą. Kaupiantis žinioms apie citokinus ir jų veikimo mechanizmus, tokia griežta terminologija nebeteko prasmės, nes citokinus gali gaminti ne tik imuninės, bet ir neimuninės ląstelės, o ir patys citokinai reguliuoja ne tik imuninės sistemos veiklą, bet veikia ir kitas organizmo sistemas bei audinių ląsteles Citokinai ir jų rūšys Citokinų nomenklatūra yra gana paini. Pirmą kartą citokinų aktyvumas buvo nustatytas 1960 metais. Buvo manoma, kad jie veikia nuo antigeno priklausomu būdu, skatina T ląstelių proliferaciją ir buvo dar vadinami T ląstelių augimo faktoriais. Limfocitų sintetinami T ląstelių augimo faktoriai buvo pavadinti limfokinais, o monocitų / makrofagų sintetinami monokinais. Tolimesni tyrimai parodė, kad limfokinai ir monokinai nėra išskirtinai tik limfocitų ir monocitų / makrofagų produktai, todėl šiems glikoproteinams apibūdinti sukurtas tinkamesnis citokinų pavadinimas m. priimtas bendras tarptautinis sutarimas dėl citokinų pavadinimų. Dauguma jų sutartinai vadinami bendraisiais vardais pagal jiems būdingą biologinį aktyvumą, nustatytą jų atradimo metu: interferonai, navikų nekrozės faktoriai, kolonijas stimuliuojantys faktoriai ir pan. Citokiną produkuojanti ląstelė Citokinai Ląstelė taikinys Stimulas Citokino genas Genų persitvarky mas Signalas Biologinis efektas Receptorius 36 pav. Citokinų biologinis veikimas

115 I Dalis X skyrius 115 Kiti citokinai yra vadinami interleukinais (IL), nes juos sintetina ir jie patys veikia leukocitus. Jiems priskiriamas numeris (pvz., IL-1, IL-2, IL-3 ir t. t.), nes jie patys veikia leukocitus ir yra sintetinami. Žmogaus genome išskiriama apie 180 genų, koduojančių baltymus, kuriems būdingos citokinų savybės Pagrindiniai citokinai: veikimo būdai ir jų funkcijos Visus citokinus galima suskirstyti į 4 šeimas: interleukinai; hemopoetinai; interferonai; navikų nekrozės faktoriai; chemokinai. Pagrindiniai citokinai ir jų funkcijos pateiktos 11 lentelėje. Citokinus gamina tik aktyvuotos ląstelės. Citokinų sekrecija yra trumpalaikė, nuo keletos valandų iki kelių dienų. Nors įvairios organizmo ląstelės gali sintetinti citokinus, tačiau pagrindiniai jų gamintojai yra T ląstelės helperiai (pagalbininkai) ir makrofagai. Citokinai, atsipalaiduojantys iš šių ląstelių, aktyvuoja visą tinklą sąveikaujančių ląstelių. Citokinams būdingos ir kitos bendros savybės. Vienas citokinas gali veikti įvairių tipų ląsteles ir pasižymėti keliais biologiniais poveikiais. Tai vadinama citokinų pleotropiniu veikimu (pleotropija (gr. pleoh daugiau + gr. trophe mityba) vieno geno poveikis keliems organizmo požymiams) (37 pav.). Pvz., IL-2, kurį gamina aktyvintos T ląstelės, reguliuoja T ląstelių veiklą, taip pat valdo kaulų čiulpų stromos ląstelių diferenciaciją į osteoblastus. Priešingai, keletas citokinų gali daryti tokį pat poveikį, t. y. veikti redundantiškai (lot. redundacija pertekliai) (pvz., IL-2, IL-4 ir IL-5 skatina B ląstelių proliferaciją). In vivo citokinai labai retai veikia pavieniui. Ląsteles veikia citokinų mišinys, kuriame jie veikia sinergistiškai (gr. sinergia bendras veikimas), t. y. papildo vienas kito veikimą, ar antagonistiškai (gr. antagonistes priešininkas), t. y. slopina vienas kito veikimą ar sintezę. Be to, citokinai dažnai indukuoja kitų citokinų sintezės kaskadą, t. y. pasižymi kaskadiniu veikimu. Citokinai veikia labai mažu atstumu ir daugelio jų poveikis pasireiškia šalia jų sekrecijos vietos, todėl citokinas gali veikti ir jį sekretuojančią ląstelę (autokrininis (gr. autos pats) veikimas) ar šalia esančias ląsteles (parakrininis (gr. para šalia) veikimas). Citokinai labai dažnai veikia tas ląsteles, kurios glaudžiai susijusios su juos sintetinančiomis ląstelėmis. Jei citokinų kiekis yra didelis, jie gali patekti į kraujo cirkuliaciją ir veikti labiau nutolusiose nuo jų gamybos vietose (endokrininis (gr. endon viduje) veikimas) (38 pav.). Kadangi citokinai gali veikti ir trumpais, ir didesniais atstumais, jie labai svarbūs imuninio atsako plėtojimuisi.

116 116 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI 11 lentelė. Citokinai ir jų funkcijos Procesas Skatina Slopina Uždegimas IFN-γ, IL-1, -6, -8, -12, -17, -18, -19, -20, -22, -24, -27, TNF, LTα IL-4, -10, -11, -13, TGF-β Ląstelių atsakas į išorinius patogenus Hemopoezė Ląstelių atsakas į vidinius patogenus IL-2, -3, -4, -5, -6, -9, -10, -11, -13, -15, -16, -25, -27, TNF IL-1, -3, -7, -9, -11, -12, -14, -15, -17, -25, OPGL, SCF,GM-CSF, G-CSF, M-CSF, BAFF IFN-α/β, IFN-γ, IL-2, -4, -12, -13, -15, -18, -21, -23, -27, IL-28A, IL-28B, IL-29, TNF, LTα IFN-γ, IL-10, -12, -27, TGF-β IL-10, IL-11, TGF-β Kaulų modeliavimas OPGL, M-CSF, IL-1, IL-6, IL-11 OPG, IL-18, GM-CSF Priešvėžinis procesas TNF, LTα, IL-27 Antrinių limfinių organų vystymasis LTαβ, OPGL Leukocitų chemotaksis IL-8, Il-15, IL-16, TGF-β, chemokinai Paaiškinimai: IFN interferonas IL interleukinas TNF navikų nekrozės veiksnys (angl. Tumor necrosis factor) LTα limfotoksinas α TGF-β transformuojantis augimo veiksnys β (angl. transforming growth factor β) OPGL arba TRANCE TNF aktyvacijos citokinas SCF kamieninių ląstelių veiksnys (angl. stem cell factor) G-CSF granuliocitų kolonijas stimuliuojantis veiksnys (angl. granulocyte-colony stimulating factor) M-CSF monocitų kolonijas stimuliuojantis veiksnys (angl. monocyte-colony stimulating factor) GM-CSF granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis veiksnys (angl. granulocyte-macrophage stimulating factor) BAFF B ląsteles aktyvuojantis veiksnys (angl. B-cell activating factor) LTαβ limfotoksinas αβ Citokinų išsiskyrimas iš kelių antigenu aktyvuotų ląstelių aktyvina daugelio tipų ląsteles, kurios nebūtinai yra antigenui specifinės ar esančios artimiausiose vietose. Dėl šios priežasties ir terapinis poveikis imuninei sistemai, panaudojant rekombinantinius citokinus ar citokinų antagonistus, gali paveikti daugelį fiziologinių sistemų. Nors antigenai, stimuliuodami limfocitus, indukuoja citokinų gamybą ar receptorių, specifinių citokinams, raišką, tačiau citokinai nėra antigenui specifiški. Limfines ląsteles gaminti citokinus gali stimuliuoti ir mitogenai (augalinės kilmės medžiagos, sukeliančios ląstelių dalijimąsi). Kai kurie citokinai (IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-α ir IFN-β) palengvina įgimto imuniteto gynybinius mechanizmus, kuriuos stimuliuoja virusai ir mikrobiniai patogenai. IL-1, IL-6 ir TNF-α, kuriuos daugiausia gamina fagocitai (makrofagai, neutrofilai), dar vadinami endogeniniais pirogenais, nes sukelia karščiavimą. Citokinai, panašiai kaip polipeptidiniai hormonai, palengvina bendravimą tarp ląstelių. Jie savo funkcijas vykdo jungdamiesi prie specifinių receptorių, esančių ant ląstelių-taikinių. Ši sąveika yra didelio afiniškumo, todėl pakanka

117 I Dalis X skyrius 117 PLEOTROPINIS B ląstelė Aktyvacija, proliferacija diferenciacija IL-4 Proliferacija Aktyvuota TH ląstelė Timocitas Proliferacija Tapatus Putlioji ląstelė IL-2 IL-4 IL-5 Proliferacija Aktyvuota T H ląstelė B ląstelė Sinerginis IL-4 + IL-5 Klasių perjungimas į IgE Aktyvuota TH ląstelė B ląstelė ANTAGONISTINIS IL-4 Blokuoja klasių perjungimą į IgE Aktyvuota T H ląstelė IFN-γ B ląstelė 37 pav. Citokinų veikimo būdai

118 118 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI AUTOKRININIS PARAKRININIS Šalia esanti ląstelė ENDOKRININIS Cirkuliuoja 38 pav. Citokinų aktyvumas Toli esanti ląstelė labai mažo (pikomolinių, nanomolinių) citokinų kiekio biologiniam efektui gauti. Reaguojančios į citokiną ląstelės aktyvumas gali priklausyti nuo citokinų kiekio ir tipo arba nuo citokinų receptorių aktyvinimo ar slopinimo, kurį atlikti gali kiti citokinai. Interferonai (IFN) taip pat priskiriami citokinams, kuriuos pradeda gaminti ir išskirti ląstelės, kai į organizmą patenka patogeniniai virusai, bakterijos, parazitai ar formuojasi augliai (39 pav.). IFN gali būti įvedami į organizmą ir dirbtiniu būdu kaip vaistai. Savo funkcijas IFN atlieka slopindami daugelio virusų dauginimąsi ląstelėse, blokuodami virusų replikaciją, aktyvindami imunokompetentines ląsteles (NK ląsteles, makrofagus), skatindami užkrėstų ar auglio ląstelių atpažinimą ir didindami neužkrėstų, sveikų ląstelių atsparumą naujai infekcijai. IFN skirstomi į 3 pagrindinius tipus: α interferonams priskiriama apie 20 baltymų, kurių molekulinė masė artima 20 kda; šiuos pagrindinius antivirusinius baltymus sintetina leukocitai ir kitos imuninės ląstelės; β interferonus (molekulinė masė 20 kda) daugiausia sintetina fibroblastai, bet gali sintetinti ir kitos imuninės sistemos ląstelės; kaip vaistai naudojami išsėtinei sklerozei gydyti; γ interferonas (molekulinė masė 25 kda) kartais vadinamas T limfocitų imuniniu interferonu, nes skirtingai nei kiti interferonai sintetinamas tik T limfocitų. Interferonams labiau negu kitiems citokinams būdingas rūšinis specifiškumas. Genų inžinerijos metodais sukurtas rekombinantinis α interferonas gaminamas ir Lietuvoje. Navikų nekrozės veiksniai (TNF) citokinai, sukeliantys vėžinių ląstelių žūtį ir skatinantys uždegimą. TNF sudaro atskirą citokinų grupę, kuriai priskiriama apie 20 įvairių citokinų su panašia struktūra ir funkcijomis. Dažniausia vartojamas ne pilnas jų pavadinimas, o santrumpa TNF. Geriausiai žinomi TNF-α ir TNF-β, kurių struktūrinė homologija siekia 30 proc.

119 I Dalis X skyrius 119 Virusas mrnr Interferonas mrnr Interferonas mrnr Fermentai Indukcija Produkcija Perdavimas Atsparumas virusams Ląstelės atsakas 39 pav. Interferono biologinis poveikis Navikų nekrozės veiksnys α (TNF-α) citokinas, kurį sekretuoja aktyvinti monocitai ir makrofagai, NK ląstelės, T ląstelės bei įvairios kilmės vėžinės ląstelės. Naudojami sinonimai: kacheksinas, TNF ligandų superšeimos 2-asis narys. TNF-a sudarytas iš 3 vienodų polipeptidinių grandinių, molekulinė masė yra 17 kda. Jo receptorių randama visose ląstelėse, išskyrus eritrocitus. Yra 2 tipų receptoriai: TNF R1 (p55) ir TNF R2 (p75). Jie yra bendri TNF-α ir TNF-β. Ląstelės gali sekretuoti ir tirpias šių receptorių formas. Šiam citokinui būdingas plataus spektro biologinis veikimas. Šis citokinas sukelia ląstelių apoptozę, todėl yra citotoksiškas daugeliui vėžinių ląstelių, aktyvina įvairias imuninės sistemos ląsteles, skatina kitų citokinų bei chemokinų raišką, dalyvauja uždegimo reakcijose, sukelia endotelio pokyčius. Žymiai padidėjusi jo koncentracija kraujyje sukelia sunkias organizmo būkles, pvz., kacheksiją, endotoksinį šoką. Navikų nekrozės veiksnys β (TNF-β) citokinas, kurį dažniausia sekretuoja mitogenu aktyvintos T ląstelės, bet gali sekretuoti ir fibroblastai, endotelio, epitelio ląstelės, įvairios transformuotos ląstelės. TNF-β glikozilintas baltymas, turintis bendrą receptorių su TNF-α. Jo biologinis veikimas kai kuriais aspektais turi panašumų su TNF-α, bet paprastai yra silpniau išreikštas ar net priešingas. TNF-β citotoksiškas vėžinėms ląstelėms, slopina angiogenezę, skatina kai kurių citokinų raišką ir metabolinius pokyčius ląstelėse Citokinų receptoriai Visiems citokinų receptoriams būdinga receptoriui tipinė struktūra: ekstraląstelinė dalis; membraną perskrodžianti dalis; citoplazminė dalis.

120 120 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Citokinų receptoriai gali būti ne tik membraniniai, bet ir tirpios molekulės. Daugelis citokinų receptorių, išskyrus chemokinų receptorius, veikiami fermentų gali nusišerti nuo ląstelės membranos, toliau vykstant arba nevykstant jų naujai sintezei. Priklausomai nuo citokino receptoriaus rūšies, tirpios jo molekulės gali veikti kaip inhibitoriai (pvz., tirpus IL-1 receptorius, tirpus TNF receptorius) ir trukdyti citokinui prisijungti prie membraninio receptoriaus. Tirpūs receptoriai gali būti nešėjai, apsaugantys citokiną komplekso viduje ir prailginantys jų gyvavimą plazmoje ar kituose biologiniuose skysčiuose. Antra vertus, tirpaus citokino receptoriaus komplekso disociacija sudaro sąlygas citokinui atsipalaiduoti šalia jo membraninio receptoriaus. Citokinai atlieka šias funkcijas: reguliuoja ląstelių funkcijas (proliferaciją, sekreciją, migraciją, apoptozę, indukciją, inhibiciją, skatinimą / slopinimą ir kt.); dalyvauja imuninėse reakcijose (uždegimo, antikūnų gamybos, alerginėse, autoimuninėse ir kt.); reguliuoja hemopoezę ir palaiko jos pastovumą; svarbūs embriogenezei, organogenezei ir reprodukcijos audiniams atsinaujinti; svarbūs organizmo audinių struktūrai palaikyti; palaiko ryšį tarp imuninės sistemos ir nervų sistemos; kai kurie citokinai gali modeliuoti elgsenos ypatumus (jaudulį, anoreksiją, miegą ir kt.); kai kurių citokinų ar jų receptorių genų polimorfizmas gali būti susijęs su polinkiu sirgti tam tikromis ligomis (pvz., astma IL-4R α grandinės, IL-10, IL-15, IL-18; krūties vėžiu IL-6; išsėtine skleroze IL-2 promotoriaus, TNF; sistemine raudonąja vilklige IL1α, TNFα; vainikinių arterijų liga IL-1Rα). Kai kurių citokinų buvimas ar padidėjusi ir (arba) sumažėjusi gamyba gali būti patologijos diagnostiniu kriterijumi. Pvz., reumatoidiniu artritu (RA) sergančių ligonių sinovijos skystyje dažnai nustatomas IL-1, todėl intervencija, panaudojant anti- IL-1 antikūnus ar tirpų IL-1 receptorių, galėtų būti viena iš terapinių RA priemonių. Šio interleukino gamyba svarbi ir kitų autoimuninių ligų (išsėtinės sklerozės, I tipo diabeto) raidai. Padidėjusi IL-2 ir IL-7, bet sumažėjusi IFN-α ir IFN-γ gamyba stebima limfinės leukemijos atveju; IL-6 daugybinės mielomos, o IL-10 B mielomos (Burkito limfomos) atvejais. Citokinai dėl savo biologinių savybių yra naudojami ir terapijoje. Interferonai buvo vieni pirmųjų citokinų, sėkmingai pritaikytų gydymo tikslais.

121 I Dalis X skyrius 121 IFN-α taikomas leukemijų, genitalijų papilomos sukeltos viruso infekcijos, hepatito B, hepatito C, su AIDS susijusios Kaposi sarkomos, odos vėžio gydymui. IFN-β taikomas išsėtinės sklerozės gydymui. IFN-γ lėtinės granuliomatomos ligos, piktybinės osteoporozės terapijai ir pan Chemokinai Chemokinai didelė šeima savo struktūra panašių citokinų, kurie stimuliuoja leukocitų (neutrofilų, monocitų, limfocitų) judėjimą ir reguliuoja jų migraciją iš kraujo į audinius. Chemokinų pavadinimas yra chemotaktinių citokinų santrumpa. Efektyviam imuniniam atsakui gauti būtina, kad leukocitai būtų reikiamoje vietoje ir optimaliu laiku, todėl reikalinga sistema, kuri reguliuotų ląstelių migraciją ir išsidėstymą limfiniuose ir nelimfiniuose audiniuose. Chemokinų sistema teikia signalus efektorinių ir reguliuojančių ląstelių telkimuisi ir yra svarbi uždegiminių ligų patogenezei. Chemokinai yra labai mažos molekulinės masės (8 12 kda) polipeptidai, kurių struktūrai būdingos dvi vidinės disulfidinės kilpos. Žmogaus organizme nustatyta apie 50 chemokinų. Priklausomai nuo konservatyvių NH 2 galinių cisteino liekanų skaičiaus ir padėties, chemokinai skirstomi į 4 šeimas: CC (arba β) chemokinai, kurių molekulėje 2 cisteino liekanos yra viena šalia kitos; nustatyti 24 CCL-1-28 (išskyrus CCL-6, -9, -10) šiai šeimai priklausantys chemokinai (CCL3, MIP-1α), (CCl4, MIP-1β), CCL2 (MCP-1), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL11 (eotaksinas), CCL13 (MCP-4), CCL18 (DC-CK1), CCL21 (SLS) ir kt.); CXC(1-16) (arba α) chemokinai, kurių molekulėje šios liekanos atskirtos viena amino rūgštimi, pvz., CXCL8 (IL-8), CXCL-1 (GRO-α), CXCL12 (SDF-1), CXCL13 (BCA-1); C chemokinai (turi tik 2 narius), kurių molekulėje yra vienas cisteinas (XCL1 (limfotaktinas), XCL2 (limfotaktinas β)); CX3C chemokinai (vienas narys), kurių cisteino liekanos atskirtos 3 amino rūgštimis (CX3CL1 (fraktalkinas)). Dauguma chemokinų priklauso pirmai ir antrai chemokinų šeimoms. CC ir CXC šeimų citokinus gamina leukocitai ir kai kurios audinių ląstelės (endotelio, epitelio ląstelės, fibroblastai). Gaminti chemokinus šias ląsteles skatina mikroorganizmų sąveika su įvairiais įgimto imuniteto ląstelių receptoriais. Be to chemokinų gamybą indukuoja ir uždegiminiai citokinai (TNF ir IL-1). Kai kuriuos CC chemokinus sekretuoja antigenu stimuliuotos T ląstelės, taip susiedamos įgytą imunitetą ir uždegiminių leukocitų susitelkimą.

122 122 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Vienų chemokinų sintezė yra indukuojama, o kiti sintetinami pastoviai. Pagal funkcijas chemokinai ir jų receptoriai skirstomi į uždegimo chemokinus (jie indukuojami ir dalyvauja įvairiose imuninio atsako reakcijose, pvz., CCL-3, -4, -5, -7, -13, -14, -15; CXCL-9, -10, -11 ir kt.), homeostatinius chemokinus (palaiko homeostazę, pvz., CCL-1, -4, -27, -28; CXC3L1 ir kt.), atipiškus chemokinų receptorius (Duffy, D6, kurie paprastai yra tylintys ir veikia kaip neigiami reguliatoriai, mažindami chemokinų kiekį), virusų indukuotus chemokinus ir jų receptorius (KSHV, E1, UL12 ir kt., kurie leidžia patogenams moduliuoti imuninį atsaką). Anksčiau chemokinų pavadinimai buvo sudaromi atsižvelgiant į tai, kaip chemokinai buvo nustatyti ir kokį atsaką iššaukė. Pastaruoju metu naudojama standartinė nomenklatūra, paremta receptorių, prie kurių jungiasi chemokinai, rūšimi, t. y. CC chemokinai jungiasi prie CC chemokinų receptorių, CXC prie CXC receptorių ir t. t Chemokinų receptoriai Priklauso membraną perskrodžiančių guanozintrifosfatą (GTP) prijungiančio G baltymo formuojamų receptorių (GPCR, angl. guanosine triphosphate-binding G protein-coupled receptor) šeimai. Šie receptoriai inicijuoja viduląstelinius atsakus per asocijuotus trimerinius G baltymus. Besiilsinčioje ląstelėje G baltymai formuoja neaktyvų kompleksą, kuriame guanozindifosfatas (GDP) prisijungia prie subvieneto Ga. Ligando prisijungimas prie receptoriaus lemia GDP pasikeitimą į GTP. GTP-G baltymo forma aktyvina daugelį ląstelės fermentų, įskaitant ir fosfatidilinozitolio specifinę fosfolipazę C, kuri lemia proteinkinazės C aktyvinimą ir viduląstelinio kalcio padidėjimą. G baltymas stimuliuoja citoskeleto pasikeitimus ir aktino bei miozino siūlų polimerizaciją, o tai padidina ląstelės judrumą. Chemokinų receptoriai iškart užslopinami, kai susijungia su chemokinais, ir taip užbaigiamas atsakas. Ant įvairių leukocitų yra aptinkama daugiau nei 17-a skirtingų chemokinų receptorių derinių. Jie nulemia skirtingą leukocitų migracijos pobūdį. Yra 10 skirtingų CC chemokinų receptorių (nuo CCR1 iki CCR10), 6 CXC receptoriai (nuo CXCR1 iki CXCR6) ir vienas chemokinas CX3CL1, kurio receptorius vadinamas CX3CR1. Chemokinų receptorių raiška nustatyta ant visų leukocitų, o didžiausias jų skaičius ir įvairovė yra ant T ląstelių. Chemokino prisijungimas prie savo receptoriaus lemia aktyvinimo procesus, receptoriaus įtraukimą vidun ir signalo perdavimą. Tai aktyvina integrinus, kurie sukelia ląstelių sukibimą, citoskeleto aktino poliarizaciją ir kitus pasikeitimus ląstelėje, veikiančius ląstelės migraciją.

123 I Dalis X skyrius 123 Chemokinai atlieka šias funkcijas: chemokinai svarbūs cirkuliuojančių limfocitų perėjimui iš kraujagyslių į ekstravaskulines vietas; įvairūs chemokinai veikia ir įvairias ląsteles, koordinuodami sukibimo molekulių raišką, kontroliuoja leukocitų uždegiminį susitelkimą audiniuose; ekstravaskuliniai chemokinai stimuliuoja leukocitų judėjimą ir jų migraciją pagal sekretuojamų baltymų cheminį gradientą, šis procesas vadinamas chemokineze; jo metu leukocitai yra nukreipiami prie infekuotų ląstelių ir į tam tikras limfinių organų vietas; chemokinai ir jų receptoriai labai svarbūs stuburinių embriono vystymuisi; chemokinai, perduodami signalus tarp trofoblasto ir endometriumo, lemia sėkmingą embriono implantaciją; chemokinai svarbūs organogenezės procesui; jie nukreipia kamienines ląsteles į organų vystymosi vietas, skatina angiogenezę, palaiko kamienines ląsteles nišose tol, kol jos reikalingos pirmtakams gaminti; chemokinai svarbūs limfinių organų vystymuisi ir reguliuoja limfocitų ir kitų leukocitų judėjimą periferiniuose limfiniuose audiniuose; ypatingai reikalingi CCR7 ir jo ligandai CCL19 ir CCL21; CXCR5 ir CXCL13. CCR7 yra reikšmingas naiviųjų T ląstelių, o CXCR5 B ląstelių telkimuisi limfmazgiuose; kiti chemokinų receptoriai nukreipia įvairius leukocitus į skirtingas imuninės sistemos vietas: CCL25 nukreipia CCR9 + T ląsteles pirmtakes į užkrūčio liauką, o α4b7 + CCR9 + T ląsteles į žarnyną; CCL27 nukreipia CCR10 + T ląstelių populiaciją į odą. Chemokinai reikalingi dendritinių ląstelių migracijai iš infekcijos vietų į limfinius mazgus. Ši migracija priklauso nuo CCR7 receptoriaus aktyvinimo ant dendritinių ląstelių, joms atpažįstant mikrobus. CCR7 įgalina dendritines ląsteles sąveikauti su CCL19 ir CCL21 chemokinais, kurie gaminami limfmazgiuose. Chemokinų receptorius CCR7 yra ir ant naiviųjų T ląstelių, o tai paaiškina, kodėl dendritinės ląstelės ir naivieji T limfocitai yra lokalizuoti toje pačioje limfmazgių vietoje ir susidaro palankios sąlygos dendritinėms ląstelėms antigenus pateikti T ląstelėms. Įdomu paminėti, kad daugelis stambesnių virusų turi chemokinų ar į chemokinų receptorius panašių molekulių, kurios padeda apsisaugoti nuo šeimininko imuninio atsako, pvz., sergant vėžiu, chemokinai ir jų receptoriai yra svarbūs ląstelių judėjimui į ir (arba) iš auglio mikroaplinkos bei metastazavimo procesams.

124 124 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI SANTRAUKA Citokinai mažos molekulinės masės (< 30 kda) imuninę sistemą reguliuojantys baltymai ar glikoproteidai, kuriuos sintetina beveik visos organizmo ląstelės kaip atsaką į stimulą, t. y. aktyvuotos ląstelės. Įvairios organizmo ląstelės gali sintetinti citokinus, tačiau pagrindiniai jų gamintojai yra TH ląstelės ir makrofagai. Citokinų sekrecija yra trumpalaikė. Citokinams gali būti būdingas pleotropinis, tapatus, sinergistinis, kaskadinis ir antagonistinis biologinis veikimas, lemiantis citokinų tinklo veikimo kompleksiškumą. Yra daugiau nei 200 citokinų, kurie skirstomi į šeimas: hemopoetinai, interferonai, navikų nekrozės faktoriai ir chemokinai. Citokinai savo biologines funkcijas realizuoja sąveikaudami su atitinkamais receptoriais, esančiais ant ląstelių. Citokinus surišantys receptoriai skirstomi į imunoglobulinų superšeimos receptorius, I klasės citokinų receptorius, II klasės citokinų receptorius, TNF receptorių šeimą ir chemokinų receptorius. Citokinas gali veikti tik tą ląstelę, kuri turi jam receptorių. Tam tikro citokino poveikis specifinei ląstelei yra nukreipiamas reguliuojant citokinų receptorių raišką. Citokinų ar jų receptorių sutrikimai gali lemti įvairias patologijas: bakterinį toksinį šoką, limfinius ir mieloidinius navikus, kai kurias autoimunines ligas ir kt. Citokinai (interferonai, GM-CSF ir kt.) ir jų receptoriai pritaikomi gydymo tikslams. Chemokinai labai mažos molekulinės (8 12 kda) masės citokinai, stimuliuojantys leukocitų (neutrofilų, monocitų, limfocitų) judėjimą ir reguliuojantys jų migraciją iš kraujo į audinius (ekstravazaciją). Chemokinai skirstomi į keturias šeimas (CC, CXC, C, CX3C), kurių standartinė nomenklatūra, paremta receptorių, prie kurių jungiasi chemokinai, rūšimi, t. y. CC chemokinai jungiasi prie CC chemokinų receptorių, CXC prie CXC receptorių ir t. t. Vienų chemokinų sintezė yra indukuojama, o kiti sintetinami nuolat. Be leukocitų judėjimo reguliavimo chemokinai svarbūs embriono vystymuisi, organogenezės procesui, dendritinių ląstelių migracijai į limfinius mazgus, auglio metastazavimo procesams.

125 I Dalis 125 XI skyrius 11. SUKIBIMO (ADHEZIJOS) MOLEKULĖS Šios imunokompetentinių ląstelių molekulės dalyvauja sukibime su kitomis ląstelėmis tarpininkėmis Sukibimo (adhezijos) molekulės ir jų rūšys Imuninėje sistemoje šios molekulės yra labai svarbios daugeliui leukocitų funkcijų: limfocitų recirkuliacija limfiniuose organuose; leukocitų susitelkimas uždegimo vietose; specifinis antigeno atpažinimas; žaizdų gijimas. Ląstelių sukibimo molekulės dalyvauja ne tik tarpusavy sukimbant ląstelėms ar ląstelei sąveikaujant su tarpląsteline medžiaga, bet ir gali moduliuoti tokių molekulių kaip tirozinkinazės receptorius aktyvinimą, ląstelės išgyvenamumą, migraciją. Nustatyta, kad sukibimo molekulės gali būti substratas proteazėms ir lemti difunduojančių fragmentų, gebančių perduoti signalą nepriklausomai nuo sukibimo molekulių, susidarymą. Kiekviena sukibimo molekulė turi savo originalų pavadinimą, tačiau daugelio šių molekulių raiška yra stebima ant leukocitų, todėl dalis sukibimo molekulių turi ir CD (angl. cluster of differentiation) nomenklatūrą Sukibimo (adhezijos) molekulių šeimos Pagal sandarą skiriamos 5 sukibimo molekulių šeimos: selektinai; mucinai; integrinai; imunoglobulinų superšeimos molekulės; kadherinai.

126 126 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Selektinai yra grupė sukibimo (adhezijos) molekulių, kurios svarbios cirkuliuojančių ląstelių ryšiams su endoteliu. Tai ląstelės membraną perskrodžiantys glikoproteinai, turintys 3 atskirus struktūrinius motyvus: N-galinį (esantį ląstelės išorėje) lektininį motyvą, epiderminio augimo faktoriaus seką ir įvairaus ilgio vienodų sekų homologinius vienetus. Selektinai svarbūs limfocitų migracijai. Šie angliavandenius surišantys baltymai dalyvauja leukocitų sukibime su endotelio ląstelėmis. Šią sąveiką nulemia selektinų lektininis motyvas. Išskiriami trys selektinai: L-selektinas (CD62L), E-selektinas (CD62E) ir P-selektinas (CD62P). L-selektino (leukocitų) pastovi raiška nustatyta ant daugelio leukocitų. E-selektinas (endotelio) yra ant endotelio ląstelių odoje ir kaulų čiulpuose. Daugelyje kitų audinių uždegiminiai citokinai, kaip TNF-α, laikinai indukuoja šio selektino raišką ant pokapiliarinių venulių endotelio ląstelių. P-selektiną (trombocitų) nuolat sintetina megakariocitai ir yra inkorporuojamas į trombocitus ir endotelio ląstelės. Šis selektinas kaupiasi trombocitų α granulėse ir endotelio ląstelių Weibel-Palade kūneliuose. Po stimuliacijos trombinu ar histaminu šių organelių membranos greitai susilieja su plazmine membrana ir P-selektinas pasiskirsto ant ląstelės paviršiaus. P- ir L-selektinai pirmiausia jungiasi su specifiniais glikoproteinais, kurie privalo savo struktūroje turėti sulfato, o taip pat sialo ar fukozės liekaną. Toks yra P-selektino glikoproteininis ligandas-1 (PSGL-1) transmembraninis homodimerinis mucinas, esantis ant leukocitų ir kai kurių aktyvuoto endotelio ląstelių. PSGL-1 yra pagrindinis P-, E- ir L- selektinų ligandas. Jo susijungimas su P- ir E-selektinu lemia leukocitų sąveiką su endoteliu, o prisijungimas prie L-selektino įgalina leukocitų tarpusavio sąveiką. L-selektinas taip pat jungiasi su mucinais, esančiais ant endotelio ląstelių limfmazgių aukštojo endotelio venulėse ir kai kuriose uždegimo vietose. Šie mucinai (CD34, GlyCAM-1, podokaliksinas) dar bendrai vadinami periferinių limfinių mazgų adresinais. E-selektinas, buvo manoma, dalyvauja tik leukocitų ritimosi endoteliu procese, šiam selektinui sąveikaujant su glikoproteinais, turinčiais sle x (sialyl Lewis x struktūra) glikanų. Vėlesni tyrimai parodė, kad PSGL-1 ir CD44 yra pagrindiniai E-selektino glikoproteinai-ligandai. Mucinai yra stipriai glikozilinti serinu ir treoninu turtingi baltymai. Jie yra selektinų ligandai. CD34 molekulė randama ant įvairių endotelio ląstelių, o glikozilintos ląstelių sukibimo molekulės-1 (GlyCAM-1 (angl. glycosylated cell adhesion molecule-1)) raiška stebima tik ant aukštojo endotelio venulių. MadCAM-1 molekulės raiška stebima tik ant gleivinių endotelio. Integrinai yra membraniniai glikoproteinai, heterodimerai, sudaryti iš α ir β nekovalentiškai sujungtų grandinių. Abi grandinės perskrodžia membraną. Nustatyta 16 α ir 8 β skirtingų grandinių, kurios formuoja 24 skirtingas kombinacijas. Integrinai yra evoliuciškai senos ląstelių sukibimo (adhezijos)

127 I Dalis XI skyrius 127 molekulės svarbios vystymosi ir patologiniuose procesuose. Tai svarbiausios sukibimo molekulės ląstelių migracijos procese. Grandinių skirtumai lemia, kad integrinai skirstomi į 3 kategorijas. Pirmajai kategorijai priklauso 95 kd β grandinę turintys integrinai: su limfocitų funkcijomis susijęs antigenas 1 (LFA 1 (angl. lymphocyte function-associated antigen)), p150, 95 ir komplemento receptorius 3 (CR3). 130 kd β grandinę turi integrinai: vėlyvasis antigenas 1 (VLA-1 (angl. very late antigen)), VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5 ir VLA kd β grandinę turi integrinai: vitronektino receptorius ir trombocitų glikoproteinas IIb / IIIa. Pagrindinė integrinų funkcija susieti citoskeletą su ekstraląsteliniais ligandais. Šios sąlyčio molekulės yra labai paplitusios: kiekviena organizmo branduolinė ląstelė turi joms specifines integrinų molekules. Daugelis integrinų ligandų yra didelės ekstraląstelinio matrikso molekulės, kurios be integrinų dar jungiasi su kitais baltymais: augimo faktoriais, citokinais, matriksą skaldančiomis proteazėmis. Jie taip pat dalyvauja žaizdų gijimo, ląstelių migracijos, fagocitozės procesuose. Tarpląsteliniai kontaktai, kuriuos formuoja integrinai, labai svarbūs imuninio atsako metu antigeno prezentacijai, leukocitų citotoksiškumui, mieloidinių ląstelių fagocitozei. Integ rinai yra svarbi sukibimo (adhezijos) receptorių kaskados dalis, nukreipianti leukocitus iš kraujo per endotelį į audinius, reguliuojant šį procesą chemokinams. Šios molekulės sąveikauja su imunoglobulinų superšeimos sukibimo molekulėmis. Tam, kad integrinai maksimaliai atliktų sukibimo funkciją, reikia, kad įvyktų jų konformacijos pasikeitimai. Imunoglobulinų superšeimos sukibimo (adhezijos) molekulės tai grupė membraninių baltymų, kurių molekulėse yra įvairus skaičius Ig (panašių) tipo domeninių struktūrų ( amino rūgščių). Tai pagrindiniai integrinų ligandai. Šioms adhezijos molekulėms priklauso: tarpląstelinė ląstelių sukibimo molekulė-1 (ICAM-1 (CD54), angl. intercellular cell adhesion molecule), ICAM-2 (CD102), ICAM-3 (CD50), LFA-2 (CD2), LFA-3 (CD58), kraujagyslinė ląstelių sukibimo molekulė-1 (VCAM-1, angl. vascular cell adhesion molecule-1), CD44, MAdCAM-1 (angl. mucosal addressin cell adhesion molecule-1) ir kt. Kadherinai tai sukibimo (adhezijos) molekulės, kurios padeda ląstelėms sąveikauti su savo aplinka. Kadherinai evoliuciniu požiūriu yra seniausios plačiai paplitusios sąlyčio molekulės, kurių stuburiniuose nustatyta daugiau nei 100 skirtingų molekulių. Jos padeda ląstelėms bendrauti su kitomis ląstelėmis imuninės priežiūros, ekstravazacijos, judėjimo, auglių metastazavimo, žaizdų gijimo procesuose. Kadherinai ypatingai svarbūs morfogenezės procesuose. Šių sukibimo molekulių, kurios yra glikoproteinai, veikla priklauso nuo Ca jonų koncentracijos. Priklausomai nuo amino rūgščių sekos ir struktūros ypatumų, kadherinai skirstomi į pošeimius: klasikinius I-ojo tipo (E-, N-, P-, R- kadherinai) ir II-ojo tipo kadherinai (VE-kadherinas), dezmosominiai kadherinai, protokadherinai, Flamingo / CELSR ir FAT kadherinai. Yra

128 128 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI kadherinų (T-kadherinas, LI-kadherinas, RET-protoonkoproteinas), kurių negalima griežtai priskirti kuriam nors pošeimiui. Klasikiniai ir dezmosominiai kadherinai yra griežtai apibrėžiami kaip sukibimo molekulės, tačiau daugelis kitų kadherinų nebūtinai pasižymi stipriomis sukibimo savybėmis. Jų funkcijos: dalyvauti audinių struktūros formavimesi ir morfogenezėje, įskaitant ląstelių rūšiavimą, pertvarų audiniuose formavimąsi, struktūrinio ir funkcinio ląstelių ir audinių poliškumo indukciją ir palaikymą, citoskeleto organizaciją, ląstelių fenotipo moduliavimą, ląstelių migraciją, proliferaciją ir išgyvenamumą. Šias įvairias funkcijas kadherinai gali atlikti dėl jų savybės sukelti signalo transdukciją ląstelės citoplazmoje ir branduolyje, kurią lemia sąveika tarp kadherino viduląstelinės srities ir citoskeleto reguliatorių, proteinkinazių, fosfatazių ir transkripcijos kofaktorių. Be to, kadherinai gali daryti poveikį ląstelių signalams ir funkcijoms, transmembranine dalimi sąveikaudami su augimo faktorių receptoriais ir kitomis plazminėje membranoje išsidėsčiusiomis signalinėmis molekulėmis Leukocitų ekstravazacija Svarbiausias imuninio atsako procesas yra leukocitų ekstravazacija (išsiliejimas į aplinkinius audinius), arba transendotelinė migracija, kurioje reikšmingas vaidmuo tenka sukibimo (adhezijos) molekulėms. Šis procesas vyksta ne tik uždegiminio atsako metu, bet ir limfocitams judant į antrinius limfinius organus. Ekstravazacija yra daugiapakopis procesas, kuriame išskiriami atskiri etapai (40 pav.): ritimasis, kurio metu leukocitai ritasi endoteliu, tarpininkaujant selektinams ir jų ligandams; selektinų ir jų ligandų sąveika yra įvairaus afiniškumo, dažniausia susijusi su asociacija-disociacija, todėl tokios jungtys tarp leukocitų ir endotelio yra labilios ir trumpalaikės; jos sulėtina leukocitų judėjimo greitį ir sudaro jiems sąlygas ristis endotelio paviršium aktyvinimas leukocitai, risdamiesi endotelio paviršiumi, jaučia prie endotelio paviršiaus prisijungusius chemokinus; jų sekreciją stipriai indukuoja uždegiminiai mediatoriai; uždegiminėje aplinkoje sekretuojami chemokinai transcitozės būdu pereina endotelį ir jų raiška stebima ant endotelio ląstelių paviršiaus; tokie chemokinai ir yra prezentuojami besiritantiems leukocitams; ant leukocitų esančių chemokinų receptorių G baltymas sąveikauja su šiais chemokinais ir indukuoja viduląstelinius signalus, kurie nulemia integrinų aktyvaciją, nes kraujyje cirkuliuojančių leukocitų integrinams yra būdinga neaktyvi struktūra;

129 I Dalis XI skyrius 129 Endotelis Limfocitas Ritimasis Aktyvinimas Areštas (tvirta adhezija) Diapedezė Audinys Selektinai Chemokinai LFA 1 ir integrinai 40 pav. Limfocitų sukibimas (adhezija) su endotelio ląstelėmis CD31 CD99 JAM1 sukibimas (areštas), kurio metu leukocitų aktyvuoti integrinai tvirtai susijungia su savo ligandais (dažniausia su imunoglobulinų superšeimos molekulėmis), indukuoja leukocituose daug signalinių kaskadų ir lemia tvirtą leukocitų areštą; integrinų sukibimo aktyvumas priklauso nuo integrinų afiniškumo (lemia konformaciniai pakitimai) ir valentingumo (lemia pasiskirstymas ant ląstelės paviršiaus) pokyčių; transmigracija (diapedezė), kurios metu leukocitai pereina kraujagyslių endotelį. Šiame procese svarbi homofilinė ir heterofilinė sąveika tarp sukibimo (adhezijos) molekulių ant leukocitų ir endotelio. Svarbiausias vaidmuo tenka ant endotelio esančioms ir Ig superšeimai priklausančioms molekulėms JAM (JAM-A, JAM-B, JAM-C), PECAM-1, ICAM-1, kurios sąveikauja su leukocitų integrinais (LFA-1, VLA-4, Mac-1). Ląstelių migracijos ir ekstravazacijos proceso molekulinių mechanizmų išaiškinimas leidžia nustatyti sukibimo (adhezijos) molekules kaip molekulinius taikinius uždegiminių ir (arba) autoimuninių ligų anti-adhezinei terapijai. Pvz., humanizuoti anti-vla-4 monokloniniai antikūnai davė gerą terapinį efektą užkertant kelią išsėtinės sklerozės ir Crohno ligos recidyvams. Yra pateikiama daug tyrimų, kuriose lėtinių autoimuninių ar uždegiminių ligų gydymas pagrįstas anti-tnf, anti-vcam-1 ar anti-icam-1 terapija. Organizme yra aptinkama natūralių endogeninių leukocitų sukibimo (adhezijos) inhibitorių. Neseniai atrastas glikoproteinas Del-1 (angl. developmental endothelium locus-1), kuris yra leukocitų sukibimo (adhezijos) kaskados endogeninis

130 130 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI inhibitorius. Tirpus ICAM-5 veikia kaip LFA-1 inhibitorius ir gali slopinti T ląstelių ir mikroglijos aktyvumą. Galektinas-1 slopina T ląstelių ritimąsi ir sukibimą su aktyvinto endotelio ląstelėmis. SANTRAUKA Sukibimo (adhezijos) molekulės yra ląstelių sukibimo su kitomis ląstelėmis tarpininkės. Šios molekulės yra svarbios daugeliui leukocitų funkcijų: recirkuliacijai limfiniuose organuose, susitelkimui uždegimo vietose, specifiniam antigeno atpažinimui, žaizdų gijimui. Pagal sandarą sukibimo molekulės skirstomos į šeimas: selektinai, mucinai, integrinai, imunoglobulinų superšeimos molekulės, kadherinai. Sukibimo molekulės, priklausančios pirmoms keturioms šeimoms, yra svarbiausios leukocitų migracijai. Sukibimo molekulės, lemiančios kryptingą limfocitų judėjimą, vadinamos adresinais. Selektinai membraniniai glikoproteinai turi lektininį motyvą, kuris gali prisijungti prie specifinių angliavandenių grupių. Selektinai dažniausiai sąveikauja su mucinais. Mucinai yra stipriai glikozilinti, serinu ir treoninu turtingi baltymai. Šios molekulės yra selektinų ligandai. Integrinai heterodimeriniai baltymai (sudaryti iš α ir β grandinių), esantys ant leukocitų ir tarpininkaujantys šių ląstelių sąveikai su endoteliu ir kitomis ląstelėmis. Integrinai jungiasi su imunoglobulinų superšeimos sukibimo molekulėmis. Imunoglobulinų superšeimos sukibimo molekulės turi įvairų skaičių motyvų, panašių į imunoglobulinų domenus. Šių molekulių raiška stebima ant endotelio ląstelių. Jos sąveikauja su integrinais. Leukocitų migracijai į uždegimo vietą ar limfinius organus yra svarbi sąveika ant kraujagyslių endotelio esančių sukibimo molekulių su sukibimo molekulėmis, esančiomis ant cirkuliuojančių ląstelių. Neutrofilų ir limfocitų transendotelinės migracijos (ekstravazacijos) procese skiriami keturi etapai: ritimasis, aktyvinimas, sukibimas (areštas) ir transmigracija (diapedezė). Įvairios limfocitų populiacijos pasižymi skirtinga ekstravazacija į įvairius audinius. Limfocitų judėjimo kryptingumą nulemia ant jų esančių homing receptorių sąveika su sukibimo molekulėmis adresinais, esančiomis ant aukštojo endotelio venulių. Sukibimo molekulės gali būti molekuliniais taikiniais uždegiminių ir (arba) autoimuninių ligų antiadhezinei terapijai.

131 I Dalis 131 XII skyrius 12. IMUNINIS ATSAKAS Imuninį atsaką sudaro dvi pagrindinės fazės: antigeno atpažinimas; antigeno sunaikinimas Antigeno atpažinimas Daugelį imuninių atsakų prieš infekcinius organizmus vykdo įvairūs įgimto ir įgyto imuniteto komponentai: ankstyvosiose infekcijos stadijose vyrauja įgimtojo imuniteto mechanizmai; vėliau limfocitai sukelia įgytąjį imuninį atsaką; pasveikus, lieka imuninę atmintį saugančios limfocitų populiacijos (B ir T atminties ląstelės), kurios gali sukelti daug greitesnį ir efektyvesnį imuninį atsaką, jei yra reinfekcija tuo pačiu patogenu. Specifinis imuninis atsakas į antigeną apima humoralinį (nulemtą antikūnų) ir ląstelinį (sąlygojamą T ląstelių) imuninį atsaką. Sąveika tarp humoralinio ir ląstelinio imuninio atsako lemia bendrą imuninį atsaką. Humoralinis ar ląstelinis imuninis atsakas priklauso ir nuo antigeno prigimties (41 pav.). Patogenas gali išvengti tiek įgimtojo (nespecifinio), tiek įgytojo (specifinio) imuniteto gynybinių mechanizmų tam, kad sukeltų infekciją. Šeimininko imuniniam atsakui išvengti patogenai panaudoja įvairius mechanizmus (nusimeta arba nuolat keičia membraninius antigenus; mėgdžioja šeimininko antigenus; selektyviai slopina imuninį atsaką ir kt.). Tipingo specifinio imuninio atsako metu, kad specifiniai T limfocitai atpažintų antigeną, reikia antigeną paruošti ir jį pateikti. Antigeną pateikia tam tikra grupė ląstelių antigeną pateikiančios ląstelės (APL): profesionalios (dendritinės ląstelės ir B ląstelės, makrofagai) ir neprofesionalios (fibroblastai, glijos ląstelės, kasos β ląstelės ir kt.). Antigeniniai fragmentai yra pateikiami patalpinti į MHC I ar MHC II molekulių antigeną surišantį plyšį.

132 132 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI MHC I klasės molekulės pateikia antigeninius peptidus, kurie yra sintetinami endogeniškai, pvz., virusiniai baltymai infekuotose ląstelėse, auglių baltymai MHC I arba citozolinis antigeno pateikimo kelias; MHC II klasės molekulės pateikia peptidus, kilusius iš išorinių baltymų, pvz., ekstraląstelinių mikroorganizmų, kuriuos APL įsitraukia į vidų fagocitozės arba endocitozės būdu ir suskaldo iki peptidų MHC II arba endocitozinis antigeno pateikimo kelias. Pagrindinius imuninio atsako etapus po antigeno pateikimo žiūrėkite schemoje (42 pav.). ANTIGENAS (Įsiskverbimas) Pirminė apsauga (oda, gleivinės, sekretai ir kt.) (Dalyvauja nespecifiniai imuniniai veiksniai: fagocitozė, karščiavimas ir kt.) Lokalus mikrobo dauginimasis (Sukelia uždegimą, neutrofilų susitelkimą, pūlinio susidarymą ir kt.) Sisteminė infekcija; Toksinų gamyba Lokalizuota infekcija; ekstraląsteliniai mikrobai viduląsteliniai mikrobai, tipingų granuliomų formavimasis Dominuoja humoralinis Humoralinis Dominuoja ląstelinis imuninis atsakas, imuninis atsakas imuninis atsakas, dalyvaujant ląstelinio dalyvaujant humoralinio imuniteto mechanizmams imuniteto mechanizmams Antigenas gali įveikti specifinius imuninius atsakus 41 pav. Šeimininko imuninė apsauga prieš patogeną

133 I Dalis XII skyrius 133 Limfmazgiai ar blužnis APL paruošimas ir pateikimas Viduląsteliniai mikroorganizmai Baltymai Ag sintetinami APL citoplazmoje ir apdorojami iki peptidų Ag apdorojami iki peptidų APL fagocitinėse vakuolėse Formuojasi Ag-MHC I kompleksas ir migruoja į APL membraną Formuojasi Ag-MHC II kompleksas ir migruoja į APL membraną CD8 + TCR jungiasi prie Ag-MHC I komplekso ant APL CD4 + TCR jungiasi prie Ag-MHC II komplekso ant APL DL sekretuoja IL-12 IL-2 indukuoja Tc ląstelių klono vyravimą T H1 ląstelės T H2 ląstelės Tc klonas kontaktuoja su infekuotomis ląstelėmis Atsipalaiduoja perforinas ir citokinai IL-2 gamyba TNF-α, IFN-γ išsiskyrimas Makrofagų aktyvinimas IL-2 indukuota proliferacija IL-4, -5, -10, -13 išsiskyrimas B ląstelių aktyvinimas Ag Mikroorganizmas ir ląstelė sunaikinami IL-12 gamyba B ląstelių diferenciacija ir dalijimasis NK ir Tc proliferacija Plazminių ląstelių linija Ląstelinis imuninis atsakas IgM antikūnų gamyba Persijungimas į IgA, IgG gamybą Ag-Ak kompleksai Fagocitozė Mikroorganizmo lizė Komplemento fiksavimas Mikroorganizmo lizė 42 pav. Humoralinis ir ląstelinis imuninis atsakas

134 134 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Be MHC I ir MHC II kelio antigenai gali būti pateikiami CD1 keliu, superantigenų keliu ir nuo T nepriklausomu keliu. CD1 kelio paskirtis nepeptidinių antigenų (bakterinių patogenų angliavandenių, lipidų) pateikimas T ląstelėms. CD1 baltymas nėra MHC komplekso molekulė, tačiau sandara panaši į MHC I. Jo raiška stebima ant timocitų, Langerhanso ląstelių, vienabranduolių fagocitų, dendritinių ląstelių ir B ląstelių. Superantigenų pateikimo keliu pateikiami superantigenai (toksinai) bakterinės ar virusinės kilmės imunostimuliuojančios molekulės, galinčios organizme sukelti įvairių sindromų (pvz., apsinuodijimą maistu, toksinio šoko sindromą ir kt.). Superantigenų nereikia paruošti, jie savitai sąveikauja su T limfocitų TCR (už aktyvaus centro ribų) ir MHC II (už plyšio ribų). Gali sąveikauti tiesiogiai su TCR ir nedalyvaujant MHC II. Nuo T nepriklausomi (TN) antigenai (kiti antigenai priklausomi nuo T ląstelių) aktyvina B limfocitus, nedalyvaujant T ląstelėms. Tokie antigenai yra nebaltyminės kilmės molekulės (lipopolisacharidai, glikolipidai, polisacharidai), kurios negali būti suskaidytos ir sujungtos su MHC molekulėmis bei pateiktos T ląstelėms. Atsakas į TN antigenus yra reikšmingas humoralinio imuninio atsako komponentas. Tai svarbus apsaugos nuo daugelio ekstraląstelinių bakterijų mechanizmas. Pvz., bakterijų sienelių polisacharidai leidžia išvengti fagocitozės. Tuo tarpu prieš polisacharidus, kaip TN antigenus, pasigaminę antikūnai padengia šias bakterijas ir garantuoja jų fagocitozę bei sunaikinimą Antigeno sunaikinimo efektorinės sistemos Imuninė sistema patogenus gali sunaikinti įvairiais būdais, priklausomai nuo infekcijos tipo ir stadijos. Šie gynybiniai mechanizmai dar vadinami efektorinėmis sistemomis. Viena iš paprasčiausių šių sistemų yra neutralizavimas antikūnais. Antikūnai kovoja su tam tikrais patogenais paprasčiausiai prie jų prisijungdami. Pvz., antikūnai, prisijungdami prie kai kurių rinovirusų apvalkalo baltymų, trukdo viruso dalelėms prisitvirtinti ir infekuoti šeimininko ląsteles. Kitas antigeno sunaikinimo mechanizmas yra fagocitozė, kurią skatina komplementas ir opsoninai. Dažnai antikūnai aktyvina komplementą ar veikia kaip opsoninai, skatindami fagocitų vykdomą fagocitozę. Antigenai sunaikinami ir padedant citotoksinėms reakcijoms. Citotoksinės reakcijos yra efektorinės sistemos, nukreiptos prieš ląsteles, kurios yra per didelės, kad būtų sunaikintos fagocitozės būdu. Ląsteles-taikinius gali atpažinti arba specifiniai antikūnai, prisijungę prie jų paviršiaus, arba T ląstelės savo specifiniais receptoriais (TCR). Citotoksines reakcijas vykdančios ląstelės (T citotoksiniai limfocitai, NK) atpalaiduoja mediatorius (perforinus) šalia

135 I Dalis XII skyrius 135 ląstelės-taikinio, kurie pažeidžia taikinio membraną arba siunčia signalus, indukuojančius ląstelių-taikinių apoptozę Imuninio atsako reguliavimas Nors labai svarbu greitai pradėti imuninį atsaką, taip pat svarbu ir atitinkamai jį užbaigti vos tik baigiasi antigeno grėsmė. Baigiantis imuniniam atsakui, dažnai dalyvauja masinės pajėgos: milijonai aktyvuotų limfocitų; proliferuoja dideli specifinių T ir B limfocitų klonai; aktyvuojasi didžiulis skaičius uždegiminių ląstelių. Jei šie procesai liktų nesustabdyti, būtų pažeisti šeimininko audiniai. Lėtinant ar užbaigiant imuninį atsaką dalyvauja daug mechanizmų. Vienas iš jų yra pasyvus procesas paprasčiausias antigeno išsivalymas, kuris lemia imuninio atsako silpnėjimą, nes nebestimuliuojami limfocitai. Imuninė sistema panaudoja ir aktyvius mechanizmus imuniniam atsakui slopinti. Vienos iš jų apoptozė. Tai yra svarbus reguliacinis mechanizmas, reikalingas imuninių ląstelių, atlikusių savo funkciją, apsivalymui. Antikūnų funkcijas moduliuoja ir blokuoja anti-idiotipiniai antikūnai antikūnai, nukreipti prieš kitų antikūnų molekulės fragmento (Fab) kintamą (V) sritį. Imuninį atsaką, sekretuodamos citokinus, aktyviai reguliuoja įvairios T reguliacinių (Treg) ląstelių subpopuliacijos, pasižyminčios supresiniu poveikiu. SANTRAUKA Imuninį atsaką prieš patogeninius organizmus vykdo įvairūs įgimto ir įgyto imuniteto komponentai. Ankstyvosiose infekcijos stadijose vyrauja nespecifiniai įgimtojo imuniteto mechanizmai, vėliau limfocitai sukelia įgytąjį specifinį imuninį atsaką. Specifinis imuninis atsakas į antigeną apima humoralinį (nulemtą antikūnų) ir ląstelinį (sąlygojamą T ir kitų ląstelių) imuninį atsaką. T ląstelės atpažįsta antigeną, patalpintą į plyšį savos MHC molekulės, esančios ant antigeną pateikiančios ląstelės membranos. Kompleksai tarp antigeninių peptidų ir MHC molekulių susiformuoja degraduojant baltyminį antigeną vienu iš dviejų antigeno paruošimo keliu MHC I (citozoliniu) arba MHC II (endocitoziniu). Vidiniai (endogeniniai) antigenai yra paruošiami ir pateikiami MHC I keliu: suskaldomi į peptidus citozolyje didelių fermentinių kompleksų (proteosomų) pagalba; susijungia su MHC I molekulėmis šiurkščiajame endoplazminiame tinkle. Išoriniai (egzogeniniai) antigenai yra paruošiami ir pateikiami MHC II keliu: įtraukiami fagocitozės arba endocitozės būdu, suskaldomi hidrolizinių fermentų; susijungia su MHC II molekulėmis. CD4 + TH atpažįsta antigeną su II klasės MHC molekulėmis ant antigeną pateikiančių ląstelių.

136 136 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI CD8 + Tc ląstelės atpažįsta antigeną su I klasės MHC molekulėmis ant ląstelių-taikinių. Nepeptidiniai antigenai (lipidai, glikolipidai), kilę iš bakterijų, T ląstelėms pateikiami dalyvaujant CD1 molekulei. Tai antigeno pateikimas CD1 keliu. Superantigenai (toksinai) savitai sąveikauja su T limfocitų TCR (už aktyvaus centro ribų) ir MHC II (už plyšio ribų); jų nereikia paruošti. Tai superantigenų pateikimo kelias. Subrendusių B ląstelių aktyvinimas antigenu ir diferenciacija į plazmines ląsteles lemia antikūnų gamybą (humoralinį imuninį atsaką). Antikūnų nulemtame imuniniame atsake baltyminiams ir daugeliui kitų antigenų būtinas TH ląstelių dalyvavimas. Tai nuo T priklausomas imuninis atsakas. Atsakui į kai kuriuos antigenus, pavyzdžiui, bakterijų sienelių komponentus ir polimerines molekules su pasikartojančiais epitopais, TH ląstelių dalyvavimas nebūtinas. Tai atsakas į nuo T nepriklausomus antigenus. Pagrindiniai antigeno sunaikinimo mechanizmai: fagocitozė, neutralizavimas antikūnais, citotoksinės reakcijos. Lėtinant ar užbaigiant imuninį atsaką, dalyvauja pasyvūs (antigeno išsivalymas) ir aktyvūs (apoptozė, anti-idiotipiniai antikūnai, Treg ląstelės) mechanizmai.

137 I Dalis 137 XIII skyrius 13. IMUNINĖS SISTEMOS PAKITIMAI Organizmo apsauga mechanizmų visuma, neleidžianti patogeniniams mikroorganizmams ar žalingiems veiksniams prasiskverbti į organizmo vidų. Kaip jau buvo minėta, yra dvi apsauginės sistemos dalys nespecializuota ir specializuota. Norėdami patekti į organizmą patogeniniai mikroorganizmai susiduria su anatominiais, fiziniais ar cheminiais apsaugos barjerais: oda, kraujo sistema, įvairiomis liaukomis, biologinių skysčių baktericidinėmis savybėmis, gleivinių membranomis, skrandžio druskos rūgštimi, lytinių takų pieno rūgštimi ir kt. Visa tai sudaro nespecializuotą apsaugos sistemą, o kai organizmo apsaugai įjungiamas imuninis atsakas, vadinama specializuota apsaugos sistema Pirminiai pakitimai Imuniteto susidarymą lemia organizmo būklė, pvz., anergija (gr. a priešdėlis, reiškiantis neigimą, prieš balsį virsta an) imuninio atsako nebuvimas, nejautrumas antigenams. Reaktyvumo susilpnėjimas gali būti susijęs su kraujodaros pažeidimais, infekcijomis, navikais ir kitomis ligomis. Antigenai gali sukelti autoreaktyvių T ir B limfocitų funkcinį neveiklumą arba žūtį. Konkrečiai tariant, išsivysto periferinė T limfocitų tolerancija (lot. tolerantia imunologinio reaktyvumo nebuvimas) tiems specifiškiems audinių antigenams, kurie nepateikiami bręstantiems T limfocitams užkrūčio liaukoje. Tolerancijos mechanizmai gali sukelti ląstelių klonų anergiją ar žūtį, slopina reguliuojančių T ląstelių poveikį; B limfocitai negauna signalo iš T limfocitų helperių (pagalbininkų), todėl B limfocitai gali prarasti sugebėjimą aktyvinti tirozino kinazę ar diferencijuotis į plazmines ląsteles. Neigiamai veikia imuninį atsaką ir streso baltymai (angl. stress įtampa), kurie aptinkami visuose gyvuose organizmuose. Tokių baltymų padaugėja po laisvųjų radikalų poveikio, vykstant sveikų ląstelių transformacijai į navikines ląsteles, esant karščiavimui, uždegimui ar kitoms stresinėms situacijoms organizme. Neabejotina, kad streso baltymai svarbūs ir imuniteto susidarymui. Įprastai, veikdami ląstelės viduje, pvz., makrofaguose, jie padeda pernešti antigeną ir jį apdorotą pristatyti į ląstelės membraną. Šie procesai nulemia antigeno

138 138 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI prisijungimą prie didžiojo audinių dermės komplekso molekulių ir pateikimą imunokompetentinėms ląstelėms. Ląstelės išorėje atsiranda baltymų, kurie siunčia neprogramuotos ląstelės žūties (nekrozės),,pavojaus signalus imuninei sistemai apie ląstelės pažeidimus. Streso baltymų sintezę skatina fiziologiniai veiksniai ir patologiniai procesai, ypač uždegimai, bakterinės, virusinės infekcijos ir kt. Pasitaiko ir molekulinės mimikrijos reiškinys (angl. mimicry mėgdžiojimas), kurio esmė patogeninių mikroorganizmų antigeninių determinantų arba epitopų panašumas į šeimininko imunokompetentinių ląstelių antigenines struktūras. Šis reiškinys padeda išvengti imuninės kontrolės. Molekulinės mimikrijos pagrindu išsivysto autoimuninės ligos, pvz., persirgus streptokokų sukelta infekcija, gaminasi specifiniai antikūnai pirmiausiai prieš bakterijų antigenus. Tačiau šie antigenai dėl mimikrijos atpažįsta širdies raumens antigenus ir paskatina reumato vystymąsi. Liga gali neišsivystyti ir dėl lizocimo ( gr. lysis tirpdymas + gr. zyme raugas) veiklos. Tai hidrolazių klasės fermentas, ardantis bakterijų sieneles. Šis fermentas veikia kaip nespecifinė bakterijas sulaikanti medžiaga. Lizocimą sudaro grupė baltymų, kurie labiausiai veikia gramteigiamus, o silpniau gramneigiamus mikroorganizmus. Lizocimo yra fagocitų lizosomose, kur naikinamos fagocituotos dalelės. Šio fermento gausu vištos kiaušinio baltyme, žmogaus ir gyvūnų seilėse, ašarose, limfiniuose audiniuose. Svarbiausias kraujo plazmos (skystoji kraujo dalis) lizocimo šaltinis leukocitai. Gali pasitaikyti intoksikacijų (lot. in į vidų, gr. toxikon nuodai) dėl nuodingų medžiagų toksinų, kuriuos gamina mikroorganizmai ir kai kurie augalai bei gyvūnai. Toksinais gali būti mažos molekulės, peptidai ar baltymai. Toksinai imunogeniški ir stimuliuoja T limfocitus ir antikūnų sintezę. Jie skirstomi į bakterinės kilmės toksinus (stafilokokų, stabligės, difterijos, botulizmo ir kt.), augalų fitotoksinus (ricinos, pupelių, arbatos iš saldymedžio sėklų ir kt.), zootoksinus (gyvačių, vorų, vapsvų ir bičių nuodai ir kt.), pvz., Staphylococus aureus bakterijų išskiriamos nuodingos medžiagos. Toksinai serologiškai skirstomi į kelias grupes. Dažniausi yra maisto toksinai ir infekcijų sukėlėjai. Giminingas jiems toksinas sukelia toksinio šoko sindromą, kuris pavojingas organizmo gyvybei. Paprastai toksinio šoko sindromą sukelia virulentiškų stafilokokų ir streptokokų kamienai, kurie produkuoja peptidinės kilmės toksinus. Kai kurie iš jų yra superantigenai ir tiesiogiai aktyvina T limfocitus, kurie po aktyvinimo išskiria citokinus. Superantigenai aktyvina iki 10 proc. T limfocitų, todėl kraujyje susidaro didelė citokinų koncentracija, nuo kurios priklauso toksinio šoko sindromo klinikinių požymių išsivystymas. Šį sindromą gali sukelti maisto toksinė infekcija, ligoninių (hospitalinė) infekcija, tamponų vartojimas ir pan.

139 I Dalis XIII skyrius 139 Pasitaiko ir anafilaksijos (gr. ana priešdėlis, reiškiantis sustiprinimą, + phylaxis apsauga) atvejų tai grėsmingai išplitusi alerginė reakcija į pakartotiną alergeno patekimą. Putliųjų ląstelių ir bazofilų tarpininkai sukelia bronchų lygiųjų raumenų spazmus, masyvų ir ryškų audinių paburkimą bei ūminį širdies kraujagyslių nepakankamumą. Gali išsivystyti ir anafilaksinis šokas, kuris dažniausia būna nuo vaistų, ypač juos švirkščiant į veną, arba imunizacijos metu (paprastai išsivysto imunizacijai naudojant baltyminius antigenus). Anafilaksinį šoką gali sukelti ir alergenai, kai jais gydoma alergija. Tokiu atveju, alergenui patekus į organizmą ir jam jungiantis su prieš jį pasigaminusiais antikūnais, iš putliųjų ląstelių atsipalaiduoja biologiškai aktyvios medžiagos, kurios veikia ne tik kraujagysles, bet ir nervines galūnes, raumenis ir kitus audinius. Pagrindiniai šoko simptomai: krinta kraujospūdis, dėl bronchų spazmų ir gerklų paburkimo atsiranda dusulys, pilvo skausmai, silpnumas, sąmonės pritemimas arba net jos praradimas. Šie požymiai gali pasireikšti drauge, bet vienas iš jų gali dominuoti. Sutinkama ir anafilatoksinų nedidelių aktyvių komplemento baltymų fragmentų (C5a, C3a ir C4a), kurie susidaro komplemento aktyvinimo metu. Juos atpažįsta specifiniai receptoriai, jie aktyvina putliąsias ląsteles ir lemia uždegimą artimiausioje aplinkoje. Apskritai, uždegimas kompleksinė apsauginė organizmo reakcija į žalingo veiksnio sukeltą pažeidimą. Dažniausia jį sukelia mikroorganizmai, ypač bakterijos. Uždegimą gali sukelti visi audinius pažeidžiantys veiksniai: mechaninis sužalojimas, fiziniai veiksniai (nudegimas, nušalimas, jonizuojanti radiacija), cheminės medžiagos ir, žinoma, įvairūs imuniniai procesai. Uždegimą vertinant kaip nuoseklų procesą, išskiriamos atskiros stadijos: pažeidimas, ultrastruktūros pokyčiai, pasikeitęs metabolizmas, cheminių tarpininkų aktyvinimas, hemodinaminiai pokyčiai, kraujagyslių pralaidumo pokyčiai, leukocitų migracija, fagocitozė. Uždegimas yra daugelio tarpusavyje susijusių procesų visuma, tačiau imunologiniu požiūriu svarbiausia uždegimo mechanizmo grandis fagocitozė. Iš kraujagyslių į uždegimo vietą keliauja kraujo ir imuninės sistemos ląstelės, iš kurių aktyviausi fagocitai (neutrofilai, makrofagai), ardantys mikroorganizmus, virškinantys ląstelių liekanas bei negyvus audinius ir apgaubiantys kapsule parazitus. Biologiškai aktyvios medžiagos uždegimo tarpininkai skatina įvairias uždegimo reakcijas, kurios gali būti sukauptos ląstelių granulėse arba gali būti naujai sintetinamos aktyvintose ląstelėse. Jiems priskiriami kraujagysles veikiantys aminai (histaminai, serotoninas), kraujo plazmos baltymai, krešėjimo faktoriai, komplemento komponentai (kininai), arachidono rūgšties metabolitai (prostaglandinai, leukotrienai), citokinai (kai kurie), chemokinai, navikų nekrozės faktorius (alfa), laisvieji radikalai (deguonies, anglies, azoto).

140 140 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Svarbiausi yra uždegimą skatinantys citokinai, kurie susitelkia pažeidimo vietoje ir aktyvina uždegime dalyvaujančias ląsteles. Pagrindiniai citokinai, dalyvaujantys uždegimo procese, interleukinai (IL-1, IL-6), navikų nekrozės faktorius (alfa), interferonas (gama) ir chemokinai. Pasigaminus didesniems minėtų citokinų kiekiams, pasireiškia sisteminis jų poveikis (karščiavimas, leukocitozė, ūmios fazės baltymų sintezė, suintensyvėjusi kortikosteroidų sintezė). Gali būti ir uždegimą slopinančių citokinų, kurių pagrindinė funkcija slopinti uždegime dalyvaujančių ląstelių proliferaciją ir aktyvumą. Organizme gali vykti ir nekrozė (lot. necrosis mirtis, vietinė žūtis) (neprogramuota žūtis), kurios metu vyksta morfologiniai, biocheminiai ir patofiziologiniai pakitimai, sukeliantys ląstelių ar net audinių žūtį: pažeidžiamas membranų vientisumas, vyksta nereguliuojama jonų difuzija, nėra energijos poreikio, vyksta DNR fragmentacija, susidaro netolygiai kondensuotas chromatinas, ląstelės išbrinksta ir vyksta jų lizė; ląstelės žūsta grupėmis, išsivysto uždegimas. Nekrozę sukelia patologiniai pokyčiai organizme arba išoriniai veiksniai, tuo ji skiriasi nuo natūraliai vykstančios apoptozės (programuota ląstelių žūtis), pasireiškiančios tam tikrais pakitimais. Vykstant apoptozei, membrana išsigaubia, bet nepraranda vientisumo, ląstelės susitraukia, formuojasi membranų apsuptos pūslelės apoptotiniai kūneliai, vyksta DNR fragmentacija. Visi procesai griežtai reguliuojami. Ląstelės suyra po vieną, jų mirtį sukelia fiziologiniai veiksniai. Apoptozės metu palaikoma audinių homeostazė (dinaminis pastovumas). Aprašyti procesai turi vienokios ar kitokios įtakos imuniniam procesui, gali sąlygoti imuniteto nepakankamumą (iš dalies imuninės sistemos patologinius pakitimus) ir net imuninės sistemos ligų išsivystymą Imuniteto nepakankamumas Imuninės sistemos būsena, kuriai esant visai ar iš dalies organizme nesusidaro imunitetas, kitaip tariant, organizmas nepajėgia kovoti su infekcijomis. Toks imuniteto nepakankamumas skirstomas į pirminį ir antrinį. Pirminis nepakankamumas atsiranda dėl įgimtos imuninės sistemos būklės, tokia būklė nėra genetinis defektas, o išsivysto gyvenimo eigoje. Toks imuniteto nepakankamumas gali išsivystyti dėl įvairių priežasčių. Būdingi ir dažni požymiai: pvz., žmogaus odos pažeidimai, sinusitai, viršutinių kvėpavimo takų infekcijos, pokyčiai kraujyje, limfmazgių ir tonzilių sumažėjimas, viduriavimas, medžiagų pasisavinimo sutrikimas ir pan. Rečiau pasitaiko svorio kritimas arba limfmazgių, kepenų ir blužnies padidėjimas, sąnarių skausmai, smegenų uždegimas, komplikacijos po skiepijimo ir pan. Antrinio nepakankamumo požymiai: imuniteto slopinimas, kūdikių neišnešiotumas, infiltracinės ir medžiagų apykaitos ligos, traumos, operaci-

141 I Dalis XIII skyrius 141 jos ir kt. Svarbiausią vietą užima infekcinės ligos (raudonukė, tymai, vėjaraupiai, parotitas, toksoplazmozė, trichineliozė, leišmaniozė, žmogaus ir gyvūnų imunodeficitai), ūmios ir lėtinės virusinės mikobakterinės ir grybelinės infekcijos ir pan. Antriniai nepakankamumo požymiai dažniausia būna laikini ir išnyksta, jei pavyksta išgydyti pagrindinę ligą, sukėlusią imuninės sistemos pažeidimus. Atsižvelgiant į tai, kurios imuninės grandies pažeidimai vyrauja, imuninės sistemos trūkumai skirstomi į: T limfocitų arba B limfocitų (arba antikūnų), mišraus tipo (T ir B limfocitų), fagocituojančių ląstelių, komplemento sistemos imuniteto nepakankamumus. Viena iš susilpnėjusio imuninio atsako priežasčių gali būti ir hipogamaglobulinemija (gr. hypo priešdėlis, reiškiantis sumažėjimą, gr. gama trečioji graikų abėcėlės raidė, lot. globulus baltymų grupė), kitaip tariant, kraujo serume vienos (gama) baltymų frakcijos sumažėjimas. Hipogamaglobulinemija gali būti įgimta, bet dažniau įgyta. Jos atsiradimo priežastys susijusios su kai kurių vaistų vartojimu (pvz., priešmaliarinių vaistų), su genetinėmis, infekcinėmis ir navikinėmis ligomis. Šis gamaglobulinų trūkumas gali būti sukeltas sisteminių sutrikimų arba netekus kurio nors imunoglobulino. Dažnai pasitaiko IgG klasės imunoglobulinų nepakankamumas, kuriam būdingas vieno ar daugiau imunoglobulinų poklasių trūkumas, bet normalus ar tik padidėjęs kitų poklasių kiekis. Žinoma, kad IgG1 sudaro apie 70 proc. bendro IgG kiekio, tad selektyvus IgG1 trūkumas dažnai pasireiškia padidėjusiu imlumu infekcijoms. Selektyvus IgG2 ar IgG3 nepakankamumas vienas dažniausių IgG poklasių nepakankamumų. Selektyvus IgG4 poklasio nepakankamumas kliniškai nereikšmingas (IgG2 poklasio nepakankamumas dažnai pasireiškia esant IgA trūkumui). Aprašyta ir priešinga gamaglobulinų būklė kraujo serume hipergamaglobulinemija (gr. hyper pirmoji sudėtinių žodžių dalis, rodanti normos viršijimą), t. y. gamaglobulinų kiekio kraujo serume padidėjimas. Padidintas gamaglobulinų kiekis susijęs su intensyvia antikūnų produkcija po aktyvinimo antigenu.paraproteinemijos (gr. para prie, šalia, nuo, gr. protos pirmas, baltymas) atveju sintetinami dideli monokloninės kilmės globulinų kiekiai, kurių randama kraujo serume, tiriant in vitro. Žinomas hiper-igm sindromas, kuris įgimtas. Tai genetinės prigimties imuniteto nepakankamumas, kuriam būdinga sutrikusi T limfocitų gp39 ir CD40 ligando raiška. B limfocitai (po stimuliavimo antigenu), virsdami plazminėmis ląstelėmis, nesugeba perjungti IgM sintezės į kitų izotipų (IgA, IgG, IgE) antikūnų sintezę. Mutavęs genas yra Xq27 chromosomoje. Todėl šiam sindromui būdingas padidėjęs IgM kiekis ir sumažėjusi IgG, IgA koncentracija, padidėjęs imlumas gramteigiamiems patogeniniams mikroorganizmams, galima neutropenija (sumažėjęs neutrofilų kiekis). Hiper-IgM sindromą lydi autoimuninė liga, nes dalį IgM sudaro autoantikūnai. Kartais kraujo plazmoje cirkuliuoja anomalūs imunoglobulinai paraproteinai (didelis kiekis monokloninių imunoglobulinų), kuriuos sintetina naviko (plazmocitomos

142 142 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI ir kt.), plazminių ląstelių klonai. Norint įsitikinti, ar kraujo serume yra paraproteinų, reikia atlikti elektroforezę, kurios metu išryškėja atskira intensyviai nusidažiusi homogeniška baltymų juosta. Imuniteto nepakankamumas gali išsivystyti dėl kraujo ląstelių kiekio kitimų. Galima leukocitozė (gr. leukos baltas, gr. kytos ląstelė), t. y. baltųjų kraujo kūnelių arba leukocitų skaičiaus pagausėjimas periferiniame kraujyje (daugiau kaip 8000 leukocitų 1 mm 3 kraujo). Leukocitozė būna fiziologinė, kai padidėja leukocitų gamyba, pailgėja leukocitų gyvavimo trukmė, arba patologinė leukocitozė išsivysto patekus į organizmą bakterijoms, virusams, pirmuonims ir kitiems ligų sukėlėjams, veikiant kai kuriems hormonams (adrenalinui, kortikosteroidams), esant metabolinei ar cheminei intoksikacijai, alergijai, sergant kai kuriomis lėtinėmis ligomis. Sumažėjus leukocitų skaičiui periferiniame kraujyje, išsivysto leukopenija (gr. penia skurdas), kai leukocitų yra mažiau negu 4000 vienetų 1 mm 3 kraujo. Leukopenija atsiranda kaulų čiulpuose sumažėjus leukocitų gamybai arba kraujyje leukocitams intensyviai yrant dėl cheminių medžiagų poveikio, jonizuojančios radiacijos, veikiant kai kuriems vaistams. Šie pakitimai dažnai išsivysto lygiagrečiai su virusinėmis ar parazitinėmis infekcijomis. Toks leukocitų skaičiaus sumažėjimas, aišku, susilpnina ir organizmo apsaugines reakcijas.kaip žinia, vyksta ir vienos didžiausių (15 25 µm) kraujo ląstelių monocitų pakitimai. Monocitai, patekę į infekcijos židinį ar pažeidimo vietą, virsta makrofagais. Nors žmogaus organizme monocitai sudaro tik apie 2 10 proc. visų kraujo negrūdėtų leukocitų, tačiau jie atlieka tris svarbias funkcijas: fagocituoja mikroorganizmus; pateikia antigenus T limfocitams; sekretuoja citokinus (monokinus), kurie slopina uždegimą. Monocitozės metu padidėja monocitų kiekis kraujyje. Šis padidėjimas stebimas sveikstant po infekcijų arba ligų, susijusių su uždegimu, sergant piktybinėmis ligomis. Dalis infekcijų (žmogaus imunodeficito virusas, tuberkuliozė, bruceliozė, maliarija) stimuliuoja monocitozę. Monocitų ar makrofagų kiekio kitimas turi įtakos imuniniam atsakui. Kitos baltosios kraujo ląstelės neutrofilai gali judėti ir dėl chemotaksio greitai migruoti į uždegimo ar pažeidimo vietą. Jie ypač svarbūs esant ūmiam uždegimui, nes fagocituoja mikroorganizmus. Neutrofilai sintetina citokinus, kurie sustiprina kitų tipų ląstelių atsaką į uždegimines reakcijas. Neutrofilai ypač svarbi ląstelinės apsaugos grandis pačioje infekcijos pradžioje. Neutropeniją (neutrofilų skaičiaus sumažėjimą) sukelia įvairūs veiksniai: kai kurios virusinės infekcijos, vaistai, cheminės medžiagos, jonizuojanti radiacija, kaulų čiulpų ligos, mitybos sutrikimai ir t. t. Neutropenijos atveju susilpnėja imuninis atsakas, padidėja tikimybė susirgti infekcinėmis ligomis. Eozinofilai baltieji kraujo kūneliai,

143 I Dalis XIII skyrius 143 arba grūdėtieji leukocitai, kartu su bazofilais (leukocitais) ir putliosiomis ląstelėmis dalyvauja uždegimo bei alerginėse reakcijose, kovoja prieš virusus, parazitus, ypač kirmėles, todėl jų skaičius didėja sergant alerginėmis ir parazitinėmis ligomis. Eozinofilija (kraujyje padidėja eozinofilų skaičius) stebima ne tik alerginių ligų (astmos, dilgėlinės, vaistų sukeltos alergijos), parazitinių infekcijų (ankilostomozės, askaridozės, trichineliozės, toksokarozės), bet ir odos ligų (egzemos, psoriazės, herpinio dermatito), navikinių (Hodžkino ligos, leukemijos), histiocitozės ir kitų ligų atvejais. Limfocitai (baltieji kraujo kūneliai) priskiriami negrūdėtiesiems leukocitams, tačiau svarbiausia, kad jie sudaro vieną iš svarbiausių imunokompetentinių ląstelių populiacijų. Morfologiškai nesiskiria, jų tapatybė nustatoma pagal paviršiaus membranoje esančius diferenciacijos antigenus ir atliekamas funkcijas. Trumpai sakant, T limfocitai lemia ląstelinį imunitetą, o B limfocitai humoralinį imunitetą. Dar viena subpopuliacija natūralūs kileriai (naikintojai), citotoksiškai veikiantys virusais infekuotas ir navikines ląsteles. Limfocitozės atveju pagausėja limfocitų kiekis ne tik kraujyje, bet ir kituose organizmo skysčiuose, pvz., uždegimo eksudate. Limfocitopenija, kuriai būdingas limfocitų skaičiaus sumažėjimas, gali būti nustatyta įgimtojo ar įgytojo imuniteto nepakankamumo atvejais, nekalbant apie atskirų subpopuliacijų limfocitopenijas Imuninės sistemos ligos Šiame skyriuje trumpai aprašomos tik imuninės sistemos ar jos organų ligos, kadangi imuniniai sutrikimai gali būti nustatyti daugelio ligų atvejais. Organizmui reaguojant į autoantigenus, susidaro autoantikūnai arba efektorinės ląstelės, nukreiptos prieš to paties organizmo struktūras. Išsivysto imuniteto nepakankamumas, organizmas tampa neatsparus ligos sukėlėjams, vyksta nepalankūs vidiniai pažeidimai. Autoantigenai tai to paties organizmo antigenai, prieš kuriuos išsivysto imuninis atsakas. Jų gali atsirasti, kai organizmą paveikia biologiniai veiksniai, pvz., mikrobai, jų toksinai, fiziniai veiksniai (aukšta ar žema temperatūra), įvairios cheminės medžiagos. Natūralūs autoantigenai yra žmogaus organizmo baltymai, pvz., pieno, spermos, lęšiuko baltymai, kurie individualaus organizmo vystymosi metu sintetinami vėliau, negu susiformuoja imuninė sistema, todėl prieš juos gali susidaryti autoantikūnai. Autoimuninės hemolizinės anemijos atveju sumažėja eritrocitų skaičius, pastebimas hemoglobino koncentracijos trumpalaikis padidėjimas, o vėliau mažėjimas, nes kraujyje yra eritrocitai, šį procesą sukelia autoantikūnai prieš eritrocitų membranos antigenus. Kitas ligos pavyzdys autoimuninė trombocitopeninė purpura, nors liga lėtinė, tačiau trombocitų skaičius kraujyje mažėja pirmiausia dėl

144 144 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI autoantikūnų prieš trombocitų membranos antigenus, be to trombocitai, padengti autoantikūnais, lemia trombocitopeniją (trombocitų sumažėjimas kraujo serume). Trūkstant vieno iš imuninės sistemos komponentų imunoglobulinų, gali išsivystyti laikinoji kūdikių hipogamaglobulinemija, kuri atsiranda dėl vėluojančios imunoglobulinų sintezės pradžios, nors B limfocitų kiekis yra normalus. Tokia hipogamaglobulinemija pasireiškia ankstyvoje (3 6 mėn. amžiaus) kūdikystėje, didesnė pasireiškimo rizika ir neišnešiotiems naujagimiams. Autoantikūnai gali susidaryti prieš skeleto raumenų ląstelių receptorius. Tuomet sutrinka nervinių impulsų perdavimas į raumenis, stebimas raumenų silpnumas ar net paralyžius. Tokia liga vadinama sunkiąja miastenija (angl. Myasthenia gravis) autoimuninis susirgimas, paliečiantis jauno amžiaus žmones. Liga gali pažeisti regėjimo funkciją, gali sutrikti rijimas, atsiranda skeleto raumenų silpnumas. Antikūnų susidaro prieš įvairius savų ląstelių komponentus branduolio, citoplazmos bei membranų autoantigenus. Raudonoji vilkligė (lot. Lupus erythematosus), kitaip tariant, lėtinė sisteminė autoimuninė liga, kurios metu atsiranda antikūnų prieš įvairius savų ląstelių komponentų (branduolio, citoplazmos, membranų) antigenus. Patogenezei, ypač jos diagnostikai, svarbūs antikūnai prieš branduolio antigenus. Dauguma klinikinių šios ligos požymių susiję su uždegimu, kurį sukelia imuniniai komplemento kompleksai. Pasitaiko įgimtas polinkis sirgti alerginėmis ligomis (alerginė astma, alerginė sloga ir kt.), lydimomis IgE padidėjimo, nes gaminami alergenui specifiški IgE antikūnai, dėl to tokiems individams gali išsivystyti tipiški astmos, nosies gleivinės, akių junginės arba egzemos požymiai. Alergija tai ne tik pakitęs organizmo imuninis atsakas į alergeną, kartu jis lydimas ir IgE antikūnų, įjautrintų limfocitų kiekio padidėjimo. Daugeliu atvejų antikūnai, sukeliantys alergines reakcijas, kaip jau buvo minėta, priklauso IgE izotipui. Kita vertus, gali išsivystyti ir alerginis kontaktinis dermatitas bei kitos limfocitų sąlygotos alerginės ligos. Dažniausia vyrauja ląstelės, atliekančios efektorių funkcijas, kontaktinio dermatito atveju T H 1 ir jų sutelkti bei aktyvinti makrofagai.kartais šlapime randama laisvų imunoglobulinų lengvųjų grandinių, ypač sergant plazminių ląstelių navikais. Sveikų žmonių šlapime lengvųjų grandinių nebūna, bet pvz., sergant daugybine mieloma, proc. žmonių organizme aptinkama šių grandinių. Bence-Jones baltymai (angl. Bence-Jones proteins). Kaip žinia, mieloma kaulų čiulpų plazminių ląstelių liga. Jai progresuojant, pradeda vešėti plazminės arba mielominės ląstelės, kurios ir gamina monokloninius imunoglobulinus arba lengvųjų grandinių molekules. Susidaro plazmocitomos (plazminių ląstelių navikas), sintetinančios ir sekretuojančios vieno klono imunoglobulinus. Šių plazmocitomų ląstelių linijos kartais naudojamos hibridomų technologijoje, t. y. gaunant monokloninius antikūnus prieš įvairius antigenus.

145 I Dalis XIII skyrius 145 Imuninių ląstelių vystymuisi ir brandai ypač svarbūs pirminiai limfiniai organai. Pvz., viena iš priežasčių įgimtam imuniteto nepakankamumui užkrūčio liaukos neišsivystymas Di Džordžo sindromas (angl. Di George syndrome) (užkrūčio liaukos aplazija). Šiam sindromui būdingas T limfocitų brendimo sutrikimas, pasireiškiantis padidėjusiu jautrumu infekcijoms, ypač pirmomis dienomis po gimimo. Kartu gali pasitaikyti ir kitų organų (širdies, kraujagyslių, priešskydinių liaukų) anomalijų. Navikinis imuninės sistemos sutrikimas Hodž kino liga (angl. Hodkin, s disease) viena iš limfomų. Ši liga pažeidžia imuninės sistemos ląsteles limfocitus. Dažniausiai pradeda vystytis limfmazgiuose. Sergant šia liga, limfmazgiuose, blužnyje, kepenyse, kaulų čiulpuose susidaro daug granuliomų. Jų priežastys ir atsiradimo sąlygos nežinomos. Odos paraudimai ar kiti odos pažeidimai (odos limfoma) siejami su Sezario sindromu (angl. Sézary syndrome). Cirkuliuojančios T ląstelių limfomos ląstelės turi netaisyklingą branduolio formą. Susidaro Sezario sindromo ir mikozės (gr. mykes grybas) fungoidas. Jo kilmė siejama su CD4 + T limfocitais, retai su CD8 + T limfocitais. Limfomos limfinio audinio navikinės ligos. Joms būdingas greitas limfinės sistemos ląstelių dauginimasis, pagal kilmės šaltinį skirstomos į tris kategorijas: B ląstelių, T ląstelių ir natūralių kilerių (naikintojų) limfomas. Sergant Burkito limfoma (angl. Burkitt lymphoma), kilusia iš B ląstelių, piktybinėse ląstelėse randama Epšteino Baro viruso DNR (makrofagų citoplazmoje matyti ląstelių liekanų). B ląstelių vystymasis sutrikdomas ir pirminio humoralinio imuniteto nepakankamumo metu, sergant Brutono ligos (angl. Bruton's agammaglobulinemia, Bruton's tyrosine kinase), nes, įvykus mutacijai tirozino kinazės gene, sutrikdomas B ląstelių brendimas, pvz., stebima pre-b limfocitų stoka, sergantieji neturi subrendusių B limfocitų, kurie nesidiferencijuoja į ląsteles, sintetinančias antikūnus. Tokie asmenys serga bakterinėmis, virusinėmis, alerginėmis ligomis. Nedideli imunokompetentinių ląstelių (makrofagų, T H 1 ir kitų) židiniai susidaro audiniuose ir tuomet išsivysto granulioma (angl. granuloma), kitaip tariant, imuninė sistema negali pašalinti šios sankaupos, tad siekia ją nors,,apriboti. Aplink granuliomų židinius susidaro fibrozinė kapsulė. Tokios granuliomos išsivysto sergant infekcinėmis ligomis: tuberkulioze, raupsais, brucelioze, listerioze, tuliaremija, jersinioze. Viena iš tipiškiausių pirminio nepakankamumo formų sunkus mišraus tipo imuniteto nepakankamumas (angl. severe combined immunodeficiency). Sergant šia liga negali išsivystyti nei humoralinis, nei ląstelinis imuninis atsakas. Tokio pažeidimo priežastis T ir B limfocitų brendimo ir funkcijų sutrikimai, atsirandantys dėl genetinių defektų. Liga pasireiškia įvairiomis formomis, kurios priklauso nuo to, kuriame gene yra defektas.

146 146 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Autoimuniniai mechanizmai aprašyti daugelio ligų atveju, bet tokie pažeidimai būna skirtingi. Artiuso reakcijos (angl. Arthus reaction) atveju smulkių arterijų sienelėse susiformuoja imuniniai kompleksai, sukeliantys odos kraujagyslių uždegimą ir audinių nekrozę. Greivso ligos (angl. Graves' disease) metu padidėja skydliaukės hormonų sintezė. Išskirtinis Krono ligos (angl. Crohn's disease) bruožas granuliomos žarnyno gleivinėje ar pogleivyje, nekalbant apie tai, kad uždegimas gali pažeisti visą virškinimo sistemą, pradedant burna ir baigiant išange. Žinomas reumatoidinis artritas (angl. Rheumatoid arthritis) lėtinė autoimuninė liga, sukelianti sąnarių uždegimą ir jų deformaciją. Susirgimo patogenezėje svarbi ir autoimuninė reakcija į sąnario komponentus. Pažeisto sąnario dangale telkiasi CD4 + T ląstelės, B limfocitai, plazminės ląstelės. Be to, sąnaryje kaupiasi ir uždegimą skatinantys citokinai (IL-1, auglių nekrozės veiksnys (alfa), kurie lemia kremzlės destrukciją). Gudpasčerio sindromo (angl. Goodpasture's syndrome) metu vyksta kraujavimas iš plaučių audinio, sukeliamas inkstų uždegimas. Autoantikūnai jungiasi su inkstų kanalėlių ir plaučių alveolių bazalinių membranų antigenais, suformuodami imuninius kompleksus. Labai pavojingos įgimtos (genetinės) imuniteto nepakankamumo ligos ar sindromai. Pavyzdžiui, Viskoto Aldricho sindromas (angl. Wiskott-Aldrich syndrome) rececyvinis susirgimas, kuriam būdingas mišraus tipo imuniteto nepakankamumas. Pirmiausia nustatomas padidėjęs imlumas įvairioms infekcijoms, lydimas trombocitopenijos ir atopinio dermatito. Imunologiniu požiūriu svarbu, kad vėliau sutrikusi įvairių molekulių (CD43, glikoproteinų) sintezė stebima ir leukocitų membranose. Dažnai aptinkama išplitusi (odoje, plaučiuose, sąnariuose ir kitose vietose) stafilokokinė infekcija, ypač per pirmąsias gyvenimo savaites. Esant Jobo sindromui (angl. Job's syndrome), stebimas ir padidėjęs IgE kiekis, sutrikęs neutrofilų chemotaksis, kartais nustatoma ir eozinofilija, gali pasireikšti alergijos simptomai. Reta įgimta imuniteto nepakankamumo forma Čediak Higaši sindromas (angl. Chédiak-Higashi syndrome), kurio metu sutrinka fagosomų ir lizosomų susiliejimas, leukocitų citoplazmoje susidaro gigantiškos granulės, pakinta baktericidinis aktyvumas ir chemotaksis. Tokie ligoniai linkę sirgti bakterijų sukeliamomis kvėpavimo takų ir odos pūlingomis infekcijomis. Visų imuniteto nepakankamumo ligų ar sindromų aprašyti neįmanoma, tačiau svarbu pabrėžti, kad ypač pavojingos tos genetinės ligos, kurių atsiradimo mechanizme nedalyvauja ligos sukėlėjai iš išorinės aplinkos (bakterijos, virusai ar kiti mikroorganizmai), o pati liga yra paveldima. Kai imuninė sistema pažeista ar nusilpusi, gali išsivystyti oportunistinės infekcijos (lot. opportunus patogus, neprincipingas, neprisitaikymas) tai patogeninių mikroorganizmų sukeliamos ligos, kurios įprastai nepasireiškia individams, turintiems

147 I Dalis XIII skyrius 147 normaliai funkcionuojančią imuninę sistemą. Oportunistines infekcijas dažniausia sukelia virusai, bakterijos, grybai, pirmuonys ir kiti ligų sukėlėjai, kurie pasižymi žemu virulentiškumu, t. y. susilpnintu gebėjimu užkrėsti žmogaus ar gyvūno organizmą. Reikia pabrėžti, kad virulentiškumas nėra tapatus,,patogeniškumui, nes patogeniniai mikroorganizmai ne tik sukelia infekcines ligas, bet ir patologinius organų ir audinių pokyčius, sutrikdančius jų fiziologines funkcijas. Virulentiškas mikroorganizmas, patekęs į organizmą, gali net,,susigyventi su juo (nesukelti ligos). Virulentiškumo matas yra infekcinio agento (bakterijų ar virusų vienetų skaičius) kiekis, reikalingas organizmui užkrėsti. Pvz., virulentiški mikrobai pasižymi invaziškumu, agresyvumu, toksiškumu ir medžiagų apykaitos sutrikimu. Mikrobai slopina fagocitozę, apsaugo bakterijas nuo antikūnų. Virulentiškumas nėra pastovus, jis priklauso nuo genų mutacijų ir rekombinacijų. Retrovirusai ypatingi tuo, kad vietoj dezoksiribonukleorūgšties (DNR) turi ribonukleorūgštį (RNR) ir atvirkštinę transkriptazę, perrašančią informaciją iš RNR į DNR. Kai kurie retrovirusai pažeidžia ir imuninės sistemos veiklą, nes tiesiogiai sąveikauja su imuninės sistemos ląstelėmis, slopindami imuninį atsaką. Retrovirusai sukelia imuniteto nepakankamumą, kai kurias leukemijos, limfomos formas. Tipiškiausias sindromas įgyto imuniteto nepakankamumas (daugiau žinomas AIDS pavadinimu). Tai liga, kurią sukelia Žmogaus imunodeficito virusas (ŽIV), pažeisdamas ląstelinio imuniteto funkcijas (43 pav.). Retrovirusai, patekę į kraują, infekuoja CD4 + T ląsteles (imuninio atsako pagalbininkes), ima daugintis ir jas sunaikina. Retrovirusai gali infekuoti ir kitas imunokompetentines ląsteles antigeną pateikiančias ląsteles, fagocitus, CD8 + T ląsteles (citotoksinius limfocitus). Šį sindromą sukeliantys virusai perduodami per kraują, dažniausiai užsikrečiama naudojant intraveninius narkotikus, bet ne buitiniu keliu Imuninės sistemos stimuliacija ir gydymas Imunitetui skatinti gali būti naudojami globulinai. Globulinai sferinės formos didelės molekulinės masės baltymai, kurių randama ne tik kraujyje, limfoje, piene, bet ir kituose biologiniuose skysčiuose. Globulinai skirstomi į alfa, beta ir gamaglobulinus. Imunologijoje vieną iš svarbiausių vietų užima gamaglobulinų tyrimai, jų gydomoji ir profilaktinė vertė. Kitos medžiagos, skatinančios imuninį atsaką arba atskirų imuniteto grandžių ar komponentų veiklą, vadinamos imunostimuliatoriais (vaistai, skatinantys organizmo imuninės sistemos veiklą). Šiai medžiagų grupei priklauso užkrūčio liaukos preparatai (timomodulinas, timopentinas, timopoetinas, timozinas, timulinas), vaistas nuo kirmėlių levamizolis arba vaistas prieš virusus (vienas iš citokinų) interferonas. Imuniniam atsakui sustiprinti naudojami adjuvantai

148 148 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Glikoproteinas gp 120 Glikoproteinas gp 41 Viruso apvalkalas Baltymas p17 Baltymas p24 Proteazė Atvirkštinė transkriptazė RNR 43 pav. Žmogaus imunodeficito viruso struktūra (imunizacijos metu), įvairūs peptidai, skiepai, pvz., nuo tuberkuliozės BCG (angl. Bacillus Calmette Guerin), kurios sudėtyje yra susilpnintų mikobakterijų. Tokios bakterijos nesukelia ligos, bet skatina apsaugines organizmo reakcijas. Dabar BCG, kaip nespecifinis imuniteto stimuliatorius, naudojama imuniniam atsakui aktyvinti ir skatinti, sergant onkologinėmis ligomis. Vienas iš imunostimuliatorių timomodulinas. Tai preparatas, pagamintas iš veršiuko užkrūčio liaukos lizato, kurio sudėtyje yra keletas 1 10 kda molekulinės masės peptidų. Šis preparatas skatina didžiojo audinių dermės komplekso II klasės molekulių receptorių raišką makrofaguose, T ląstelių proliferaciją, atskirų faktorių sekreciją limfocituose. Šis preparatas slopina klinikinius simptomus, sergant infekcinėmis, alerginėmis ar onkologinėmis ligomis, atstato imuninės sistemos sutrikimus, dažniausia kylančius dėl senėjimo proceso.kitas užkrūčio liaukos epitelio sekretuojamas pentapeptidas timopentinas, skatina imunines reakcijas tiek in vitro, tiek in vivo sąlygomis. Šis polipeptidas padidina NK ląstelių aktyvumą, pagreitina jų pirmtakų brendimą, IL-2 ir jo receptoriaus raišką T ląstelėse. Naudojamas Sezario sindromui gydyti. Timopoetinas taip pat užkrūčio liaukos epitelio hormonas, skatinantis kamieninių ląstelių virsmą, timocitų brendimą ir IL-2 raišką. Kitas užkrūčio liaukos epitelio sekretuojamas hormonas timozinas gali būti ir kituose audiniuose, bet jo veikla susijusi su T ląstelių brendimu, antigeno pateikimu

149 I Dalis XIII skyrius 149 makrofaguose, be to jis stabdo vėžinių ląstelių proliferaciją in vitro sąlygomis ir atlieka eilę kitų funkcijų. Imuninei sistemai slopinti naudojami kortikosteroidai. Vienas iš dažniausiai vartojamų gliukokortikoidai (gaunami iš antinksčių žievės išskiriamų steroidinių hormonų), kurie slopina imuninės sistemos veiklą ir uždegimus. Gliukokortikoidai, kaip imunosupresinės medžiagos, naudojami tais atvejais, kai yra per didelis imuninės sistemos aktyvumas: pasireiškia alergijos, autoimuninės ligos, kraujo užkrėtimas ir kt. Gliukokortikoidai naudojami ir po transplantacijų, norint išvengti transplantato atmetimo reakcijos. Dabar daugiau dėmesio skiriama imuniteto susidarymo mechanizmams, todėl vis plačiau taikoma imunoterapija. Tai ligų prevencijos ir gydymo metodas imunoterapiniais preparatais, kurie sukelia, sustiprina ar slopina paciento imuninius atsakus. Tokie preparatai yra vakcinos, imuniniai serumai, citokinai, imunotoksinai, monokloniniai antikūnai. Pvz., infekcinių ligų gydymas serumais (skystoji kraujo dalis, atsiskirianti kraujui sukrešėjus), gautais iš imunizuotų gyvūnų kraujo. Imuninis serumas, gautas prieš difterijos sukėlėjo egzotoksiną, plačiai naudojamas vaikų difterijai gydyti. Tiesa, kartais atsiranda simptomų kompleksas (po 7 9 parų gydymo imuniniais serumais), nes prieš baltymus pasigamina antikūnai ir susiformuoja imuniniai kompleksai, kurie atsideda kraujagyslių sienelėse, aktyvina komplementą ir sukelia uždegimą. Gali būti ir kitų požymių: bėrimai ant odos, sąnarių ir inkstų pažeidimai, limfmazgių padidėjimas. Visas šis simptomų kompleksas būdingas seruminei ligai. Beje, panašių simptomų gali atsirasti ir gydant antibiotikais. Galima seroprofilaktika tai įvairių priemonių visuma, kuri padeda išvengti infekcinių ligų. Pagrindinė seroprofilaktikos priemonė imuninio serumo arba jo grynesnės frakcijos gamaglobulinų injekcijos, skatinančios pasyvų imunitetą. SANTRAUKA Imuninės sistemos sutrikimai gali būti susiję su bendra organizmo būsena, imuninės sistemos organų funkcijomis ar ligomis bei įvairiomis infekcijomis. Imuninio atsako susilpnėjimas ar nebuvimas, (anergija), dažniausiai susijęs su T ir B limfocitų funkciniu neveiklumu ar jų žūtimi. Imuninį atsaką neigiamai veikia stresas, jo metu susidarantys streso baltymai. Toksinai organizme sukelia intoksikacijas, gali lemti toksinio sindromo išsivystymą.

150 150 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Imuninį atsaką gali slopinti įvairios medžiagos: aminai (histaminas, serotoninas), kraujo plazmos baltymai, krešėjimo veiksniai, komplemento komponentai, arahidono rūgšties metabolitai, citokinai, chemokinai, laisvieji radikalai (deguonies, anglies, azoto) ir kt. Imuninės sistemos būsena, kai visai ar iš dalies organizme nesusidaro imunitetas, vadinama imuniteto nepakankamumu, arba imunodeficitu. Imunodeficitai gali būti pirminiai (įgimti) arba antriniai (įgyti). Pirminiai imuniteto nepakankamumai atsiranda dėl genetinių imuninės sistemos elementų defektų. Antriniai imuniteto nepakankamumai pasitaiko dažniau negu pirminiai. Jie atsiranda dėl imuninės sistemos pokyčių, bet nėra genetinio defekto rezultatas. Autoimuninės reakcijos imuninės reakcijos prieš savus antigenus (autoantigenus), turinčios patogeninių pasekmių, lemia autoimunines ligas. Galimi autoimuninių reakcijų mechanizmai: sekvestruotų antigenų patekimas į cirkuliaciją, molekulinė mimikrija, polikloninis B limfocitų aktyvinimas, netinkama MHC molekulių raiška, Treg ląstelių vykdomos reguliacinės veiklos sutrikimai. Imuninių mechanizmų sukelta padidėjusio jautrumo reakcija yra vadinama alergija, o antigenai, sukeliantys alergines reakcijas, alergenais. Alergija gali būti sąlygota antikūnų arba ląstelių. Priklausomai nuo imunologinio mechanizmo, vyraujančio alerginių reakcijų metu, alergines reakcijas galima suskirstyti į atskirus tipus (P. Gell ir R. Coombs klasifikacija): I tipo (sukeltos IgE, anafilaksijos, greito tipo), II tipo (citotoksinės, priklausomos nuo antikūnų), III tipo (imuninių kompleksų), IV tipo (lėto tipo, nulemtos T limfocitų). Galimi navikiniai imuninės sistemos pakitimai, pažeidžiantys plazmines ląsteles, limfocitus, limfmazgius ar visą limfinę sistemą. Medžiagos, skatinančios imuninį atsaką arba atskirų imuniteto grandžių veiklą, vadinamos imunostimuliatoriais.

151 II Dalis 151 II dalis XIV skyrius 14. Imunotechnologija Imunotechnologija tai imunologijos ir kartu biotechnologijos šaka, besiremianti įvairiausių imuninės sistemos molekulių ir ląstelių panaudojimu, kuriant žmogui naudingus produktus. Didžiausią sukurtų biologinės rinkos produktų dalį sudaro antikūnai; jų apyvarta siekia iki 12,8 mlrd. JAV dolerių, o kasmetinis augimas iki 30 proc. Ženkliai didesnę dalį sudaro monokloniniai antikūnai, kurie naudojami ne tik moksliniuose tyrimuose, diagnostikoje, bet ir gydymo tikslams. Imunotechnologija kaip mokslo sritis apima visumą metodų, skirtų darbui su imunologijos tyrimo objektais ląstelėmis bei molekulėmis. Sprendžiant iškylančias problemas dar naudojami senieji arba jų pagrindu sukurti naujieji serologiniai metodai, taip pat kuriami ir visiškai nauji imunologiniai metodai. Imunotechnologijos pasiekimai visapusiškai diegiami ir medicininėje praktikoje tiek gydymui, tiek ir diagnostikai Antigenai Antigenų ir haptenų (aprašyti anksčiau) molekulės dydis, agregacijos laipsnis, natyvios formos išlaikymas turi labai daug reikšmės antikūnų gamyboje. Maži polipeptidai (< 10 kda) haptenai, arba nebaltyminės kilmės antigenai, imunogeniškumui padidinti sujungiami su baltymais nešikliais. Dažniausia naudojami šie baltymai nešikliai: moliusko Megathura crenulata hemocianinas, jaučio serumo albuminas, poli-l-lizinas ir kt. Didelio antigeno, bet mažesni kiekiai duoda stipresnį imuninį atsaką, lyginant su mažomis molekulėmis. Kartais imunizavimui naudojami maži organinės sintezės būdu gauti peptidai, kurie paprastai sujungiami (konjuguojami) su didesniais baltymais. Sintetiniai peptidai parenkami pagal kelis kriterijus. Vienas iš pagrindinių kriterijų optimalus sintetinio peptido ilgis turi būti ne mažesnis nei aminorūgščių. Mažesni peptidai nesuformuoja natyvios baltymo struktūros, o aminorūgščių peptidų tretinė struktūra jau panaši į baltymo molekulės struktūrą.

152 152 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Be to, dažniausiai naudojami N ar C galiniai peptidai, nes didesnis baltymas jungiamas atitinkamai prie C ar N peptido galo. Kartais imunizavimui naudojami ne baltyminės kilmės antigenai, o tiesiog antigeno DNR. Šiuolaikiniai biotechnologijos metodai leidžia mus dominančius genus įvesti į viruso ar bakterijos genomą, o po infekcijos šie genai sėkmingai sintetinami šeimininko ląstelėje. Tokia imunizavimo technologija naudojama skiepijant nuo įvairių ligų (44 pav.). DNR imunizavimo privalumai: greitai paruošiamas naujas antigenas; antigenas pateikiamas didžiojo audinių dermės komplekso I ir II klasės molekulėms; stimuliuojamos CD4 +, CD8 + T ląstelės ir B ląstelės. DNR imunizavimo trūkumai: antigenu gali būti tik baltyminės kilmės molekulės; šio tipo imunizavimas visiškai netinka antikūnams prieš bakterinius baltymus gauti, nes skiriasi susintetintų baltymų modifikavimas; imuninis atsakas gali būti silpnas (priklauso nuo DNR ir baltymo struktūros); labai dažnai patenkinamam imuniniam atsakui gauti reikalingas pakartotinas imunizavimas baltymu (naudojamos sudėtingesnės schemos) Adjuvantai Imuniniam atsakui sustiprinti naudojami adjuvantai, kurie prieš injekcijas atitinkamu santykiu sumaišomi su imunizavimui paruoštu antigenu. Adjuvantai pagalbinės įvairios kilmės ir sudėties medžiagos, skatinančios imuninį atsaką. Yra paprastieji adjuvantai, kuriems priskiriami negyvi mikrobai, pvz., mikobakterijos, korinebakterijos; organiniai adjuvantai organiniai junginiai, pvz., cholesterolis, krakmolas; neorganiniai adjuvantai neorganiniai junginiai, pvz., aliuminio hidroksidas, kalcio chloridas; sintetiniai adjuvantai sintetinės medžiagos; sudėtiniams adjuvantams priskiriami lipidų ir mineralinių sorbentų, aliejų ir lipopolisacharidų mišiniai. Sudėtiniai adjuvantai lėtina antigeno įsisavinimą ir pratęsia imuninės sistemos skatinimą, stiprina antigeno imunogeniškumą. Gyvūnų imunizacijai dažnai naudojami dviejų tipų Freundo adjuvantai: pilnasis Freundo adjuvantas bei nepilnasis Freundo adjuvantas, kurio sudėtyje nėra tuberkuliozės mikobakterijų. Kiekvienas adjuvantas formuoja

153 II Dalis XIV skyrius 153 Tikslinio baltymo genas Plazmidė Ląstelė Antigeną pateikiančioji ląstelė DNR imunizavimas Antigenas T ląstelės B ląstelė 44 pav. DNR imunizacija antigeno sankaupą audiniuose, iš kurios pamažu atsipalaiduoja antigenas. Freundo adjuvantai pritraukia didelį skaičių imunokompetentinių ląstelių, kurios sustiprina imuninį atsaką į antigeną. Dauguma adjuvantų skatina imuninį atsaką nespecifiškai, tačiau kai kurie adjuvantai, pvz., bakterinis lipopolisacharidas, tiesiogiai gali veikti B limfocitus. Daugiau informacijos apie adjuvantus pateikta 12 lentelėje. Detaliau aprašant skiriami keturi stimuliuojančio adjuvantinio efekto mechanizmai: depo efektas: adjuvantas sudaro savotišką saugyklą, kurioje antigenas galėtų išsilaikyti tarpląstelinėje erdvėje arba makrofagų viduje ilgesnį laiką; toks veikimo mechanizmas neleidžia šeimininkui pašalinti antigeno; depo efektas prailgina antigeno pristatymo laiką antigeną pateikiančiosioms ląstelėms; antigeno pateikimo ir (ar) pristatymo efektas: antigeno pristatymą antigeną pateikiančiosioms ląstelėms reguliuoja adjuvantas; sulėtintas pateikimas užtikrina nepertraukiamą antikūnus gaminančių ląstelių stimuliavimą;

154 154 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI moduliacinis efektas: adjuvanto moduliacinis veikimas pasireiškia aktyvuojant makrofagus; antigenas, adsorbuotas makrofagų paviršiuje, tampa labiau antigeniškas, nes veiksmingiau pristatomas limfocitams, be to suaktyvina limfocitų aktyvumą skatinančius signalus; citotoksinių limfocitų aktyvinimas: mikobakterijų komponentas, esantis adjuvantų sudėtyje, aktyvina T ląsteles, skatindamas T helperių (pagalbininkų) funkcijas bei lėtinio tipo hiperjautrumo reakcijas; kai kurie adjuvantai turi priešnavikinį poveikį. Adjuvantai skirstomi į kelias grupes, priklausomai nuo adjuvanto prigimties. Tai gali būti aliejaus emulsijos, aliuminio druskų adjuvantai, lipopolisacharidai, saponinai, imunostimuliaciniai kompleksai, liposomos, bakteriniai toksinai, polimerai ir kt. 12 lentelė. Imuninį atsaką skatinantys adjuvantai Adjuvanto pavadinimas Nepilnasis Freundo adjuvantas Pilnasis Freundo adjuvantas Freundo adjuvantas su muramildipeptidu Alūnas (aliuminio hidroksidas) Alūnas su Bordetella pertussis Imunitetą skatinantys kompleksai ISCOM Sudėtis Aliejinė emulsija vandenyje Aliejinė emulsija vandenyje su negyvomis mikobakterijomis Aliejinė emulsija vandenyje su muramildipeptidu sudėtine mikobakterijų dalimi Aliuminio hidroksido gelis Aliuminio hidroksido gelis su negyvomis kokliušo lazdelėmis (Bordetella pertussis) Qui A matrica, kurios sudėtyje yra virusinių baltymų Veikimo mechanizmas Uždelstas antigeno atpalaidavimas, sustiprintas makrofagų įsisavinimas Uždelstas antigeno atpalaidavimas, sustiprintas makrofagų įsisavinimas, bendrųjų skatintojų makrofaguose sužadinimas Panašus kaip ir pilnojo Freundo adjuvanto Uždelstas antigeno atpalaidavimas, sustiprintas makrofagų įsisavinimas Uždelstas antigeno atpalaidavimas, sustiprintas makrofagų įsisavinimas, bendrųjų skatintojų makrofaguose sužadinimas Pristato antigeną į citozolį, vyksta citotoksinių T ląstelių sužadinimas Antikūnai Antikūnai skirstomi į polikloninius, kuriuos sintetina skirtingi ląstelių klonai, ir monokloninius vieno hibridomų klono sekretuojamus antikūnus, atpažįstančius tik vieną epitopą. Monokloninių antikūnų gavimas yra sudėtingesnis ir ilgesnis procesas už polikloninių, be to, praktiniu požiūriu, abiejų rūšių antikūnams būdingos skirtingos savybės (13 lent).

155 II Dalis XIV skyrius 155 Polikloniniai antikūnai gaunami imunizuojant žinduolius ir kitus gyvūnus (tik IgY klasės antikūnams gauti imunizuojami paukščiai). Imunizavimui naudojami tam tikri antigenai dažniausiai baltymai, tačiau gali būti naudojamos ir kitokios prigimties molekulės (polisacharidai, lipidai, nukleorūgštys), jas atitinkamai modifikavus. Iš imunizuotų gyvūnų kraujo serumo gaunamas polikloninių antikūnų mišinys, sąveikaujantis su daugybe to antigeno epitopų. Imunotechnologijoje svarbu, kad gautuose serumuose būtų aukštas specifinių antikūnų kiekis, o idealiausi antikūnai kuo didesnio giminingumo. Polikloninių antikūnų gavimas pateiktas atskiroje schemoje (45 pav.). 13 lentelė. Esminiai polikloninių ir monokloninių antikūnų skirtumai Skirtumai Polikloniniai Monokloniniai Kilmė Savybės Reikšmingumas Skirtingos B limfocitų linijos proliferuoja į plazmines ląsteles Gaunamų antikūnų aktyvumas ir titrai po kiekvieno imunizavimo yra skirtingi Ne pati efektyviausia klinikinės diagnostikos priemonė Vienas B ląstelių klonas proliferuoja į plazmines ląsteles Atgaminamos nekintančios, numatomos, ypatingo specifiškumo antikūnų savybės Ypatingai patikima imuninės analizės priemonė Monokloninių antikūnų gavimas. Polikloniniai antikūnai ne visuomet atitinka tyrėjų poreikius, todėl dažnai drauge su polikloniniais antikūnais, o neretai ir vietoj jų, naudojami monokloniniai antikūnai, sąveikaujantys tik su vienu antigeno epitopu. Monokloninių antikūnų produkcija daug sudėtingesnė nei polikloninių, nes reikalauja hibridomų technologijos žinių (46 pav.). Monokloninių antikūnų gavimo etapai: gyvūnų imunizavimas ir polikloninių antikūnų gavimas; hibridizacija: blužnies ląstelių suliejimas su mielominėmis ląstelėmis; selekcija ir antikūnus produkuojančių ląstelių atranka; hibridinių ląstelių klonavimas, hibridomų linijų gavimas; antikūnų produkcija in vivo ar in vitro; antikūnų savybių įvertinimas; antikūnų gryninimas. Hibridizacija blužnies ląstelių suliejimas su mielominėmis ląstelėmis. Imunizuoto gyvūno B ląstelės, tiksliau, plazminės ląstelės, gaminančios antikūnus, negali neribotai dalintis. Tačiau plazminės ląsteles galima priversti

156 156 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Antigeno injekcija Atminties B ląstelių klonas Polikloniniai antikūnai išskiriami iš kraujo serumo Imunizavimui pasirenkami gyvūnai Antigenas B ląstelė Antigenas aktyvina B ląsteles Plazminių ląstelių klonas Antikūnų sekrecija B ląstelės sintetina polikloninius antikūnus 45 pav. Polikloninių antikūnų gavimas neribotai dalintis suliejant su mielominėmis ląstelėmis. Mielominės ląstelės tai vėžinės plazminės ląstelės, galinčios dalintis neribotą laiką. Suliejimui naudojamos mielominių ląstelių linijos, kilusios iš BALB/c linijos pelių ir nesekretuojančios imunoglobulinų (gali būti ir kitos pelių linijos ląstelės, bet turi nesiskirti nuo mielominių ląstelių kilmės). Suliejus plazminę ląstelę su mielomine ląstele, hibridinė ląstelė iš plazminės ląstelės paveldi antikūnų sintezės ir sekrecijos galimybę, o iš mielominės ląstelės neriboto dalijimosi potenciją. Suliejimui dažniausia naudojamas polietileno glikolis, skatinantis ląstelių membranų susiliejimą. Branduolių susiliejimas įvyksta vėliau ir tik tuo atveju, jei sulietos ląstelės yra toje pačioje mitozės fazėje. Chromosomos po dviejų skirtingų branduolių susiliejimo į vieną, sudaro tetraploidinį rinkinį 4n. Po suliejimo ląstelės perkeliamos į 96 šulinėlių plokšteles. Nesusiliejusios blužnies ląstelės neaugs; augti gali tiek susiliejusios blužnies ir mielomos ląstelės (ląstelės, kurias reikia atrinkti), tiek ir nesusiliejusios mielominės ląstelės bei tarpusavyje susiliejusios mielominės ląstelės. Hibridizacijai naudojamos mielominės ląstelės turi mutavusius (dėl to neveiklius) timidino kinazę (TK) ar hipoksantinguaninfosforiboziltransferazę (HGPRT) koduojančius genus. TK ir HGPRT tai nukleotidų alternatyviojo biosintezės kelio fermentai. Ląstelės nukleotidus gali sintetinti dviem keliais: tiek de novo, tiek alternatyviu keliu iš timidino ir hipoksantino. Pridėjus į ląstelių kultūrų terpę selekcinę HAT (hipoksantinas + aminopterinas + timidinas) terpę, aminopterinas blokuoja purinų sintezės de novo kelią, tačiau terpėje, esant timidinui ir hipoksantinui, nukleotidai bus sintetinami alternatyviu keliu. Jeigu mielominėse

157 II Dalis XIV skyrius 157 Antigenas Mielomos ląstelės (HGPRT, Ig ) Pirminės B ląstelės (HGPRT +, Ig + ) Nesusiliejusios B ląstelės Polietileno glikolis Nesusiliejusios mielomos ląstelės Heterokarionai (ląstelės, turinčios du ir daugiau genetiškai nevienodų branduolių) HAT atranka (auga tik B ląstelių ir mielomos ląstelių hibridomos) Hibridoma (HGPRT+, Ig+) Antikūnų tyrimas ląstelių kultūros supernatantuose Tikslinius antikūnus gaminančių hibridomų reklonavimas Atrinktų klonų dauginimas Ląstelių kultūros Ascitinis skystis Monokloniniai antikūnai Monokloniniai antikūnai 46 pav. Monokloninių antikūnų gavimas hibridomų technologijos būdu HGPRT hipoksantino-guanino fosforiboziltransferazė, timidino kinazė HAT hipoksantinas, aminopterinas, timidinas ląstelėse pažeisti HGPRT ar TK genai, alternatyvus nukleotidų sintezės kelias jose bus užblokuotas. Tokiu būdu, mielominės ląstelės ir jų (homo-) hibridai negali augti HAT terpėje (šiomis sąlygomis išgyvena ir dauginasi tik plazminės ir mielominės ląstelių hibridai).

158 158 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Antikūnus produkuojančios ląstelės turi būti klonuojamos, t. y. iš vienos ląstelės išauginama jai identiškų ląstelių linija (klonas). Klonavimas būtinas, nes: viename šulinėlyje augančios ląstelės gali būti kilusios iš skirtingų susiliejusių ląstelių (kitaip tariant, po hibridizacijos tame pačiame šulinėlyje gali augti keli hibridomų klonai), todėl jų sintetinami antikūnai gali būti skirtingo specifiškumo (net ne visos ląstelės sintetina antikūnus); po suliejimo ląstelės yra nestabilios, todėl turi būti atrenkami stabilūs, gerai augantys ir antikūnus produkuojantys klonai. Hibridomos ląstelės, kilusios iš vieno klono, padauginamos ir kriokonservuojamos, t. y. užšaldomos, ir laikomos skystame azote 80 C temperatūroje net kelerius metus. Hibridomų auginimas ir antikūnų produkcija gali vykti in vitro (ląstelių kultūroje, kai antikūnai sekretuojami į ląstelių kultūros terpę) ir in vivo pelių (dažniausia) ascitiame skystyje. Antikūnų produkcija in vitro sąlygomis: augdamos ląstelių kultūrų terpėje, hibridomos gamina ir į terpę sekretuoja monokloninius antikūnus; hibridomų kultūros yra suspensinės, t. y. ląstelės difuziškai pasiskirsčiusios terpėje; hibridomų technologija apima eilę metodų, naudojamų monokloniniams antikūnams gauti. Antikūnų produkcija in vivo sąlygomis: antikūnus gaminant in vivo, juos produkuojančios hibridomos auginamos ascitiniame skystyje; jeigu hibridomos buvo gautos suliejant BALB/c pelės blužnies ląsteles su mielominėmis ląstelėmis, kurios kilusios iš tos pačios pelių linijos, tai tokias ląsteles organizmas priims kaip savo ir atmetimo reakcijos nebus; jei tokiu būdu gautas hibridomas suleisime į pelių pilvo ertmę, tai ten formuosis piktybinis navikas (tam, kad nesiformuotų navikas, 1 2 savaites prieš hibridomų suleidimą į pelių pilvo ertmę suleidžiama mineralinio aliejaus pristano); hibridomos auga pilvo ertmėje ir formuoja ascitinį skystį, kuriame yra didelis kiekis ląstelių ir antikūnų: praėjus 8 20 dienų, kai susikaupia daug ascitinio skysčio, šis skystis surenkamas.

159 II Dalis XIV skyrius 159 Tai pigiausias būdas gauti didelį kiekį antikūnų. Tačiau kai kuriose šalyse (pvz., Vokietijoje) jis neleidžiamas. Be to, šis būdas netinka terapinių antikūnų produkcijai. Hibridomine technologija gautų antikūnų savybes būtina ištirti ir įvertinti. Kokios antikūnų savybės tiriamos, priklauso nuo jų naudojimo tikslų bei antigeno savybių. Gali būti tiriamos šios antikūnų savybės: antikūnų specifiškumas (nespecifinės reakcijos, pvz., su serumo baltymais, reakcijos su panašios struktūros antigenais, kryžminės reakcijos su kitų gyvūnų rūšių atitinkamais antigenais); antikūnų gebėjimas pakeisti baltymo (antigeno) biologinį aktyvumą; antikūnų izotipai (antikūnų klasės ir poklasiai); antikūnų reakcija su antigenu naudojant įvairius metodus (ELISA, imunoblotingas, imunoprecipitacija, imunofluorescencija, tėkmės citometrija); epitopinė analizė: atlikus vieną hibridizaciją, atrenkama keletas nepriklausomų hibridinių ląstelių linijų. Epitopinė analizė atliekama tam, kad būtų nustatyta, ar gauti antikūnai atpažįsta tą patį epitopą, persidengiančius epitopus ar skirtingus epitopus; antikūnų giminingumas. Atsižvelgiant į tikslus, antikūnus galima naudoti negrynintus, iš dalies išgrynintus ar grynus. Tuo atveju, kai būtina dirbti su antikūnų preparatais, kurių koncentracija turi būti tiksliai žinoma (pvz., prieš jų cheminę modifikaciją, įvairios prigimties žymių įvedimą ar Fc galo pašalinimą, prieš panaudojimą ląstelių stimuliacijai, in vivo tyrimuose ir kt.), jie įvairiais metodais gryninami. Gryninant antikūnus dažnai naudojamas baltymų išsodinimas (amonio sulfatas, kaprilinė rūgštis, polietileno glikolis, etanolis), o po jo kokia nors chromatografijos rūšis gelfiltracija, jonų mainų chromatografija ar giminingumo chromatografija. Polikloniniams antikūnams gryninti iš biologinių skysčių dažnai naudojama giminingumo chromatografija pati efektyviausia, lyginant su kitomis, nes grindžiama specifinės antikūno ir antigeno sąveikos principu. Antigenas kovalentinėmis jungtimis tvirtinamas prie sorbento, o antikūnai, esantys judrioje fazėje, specifiškai sąveikauja su antigenu. Nekovalentiniais, bet pakankamai patvariais ryšiais antikūnams prisitvirtinus prie sorbento, visas balastas lengvai nuplaunamas. Parinkus tinkamas sąlygas (tirpalus su didele jonine jėga ar stipriai rūgštine ph reikšme), antigeno ir antikūno sąveika suardoma ir nuo sorbento nuplaunami išgryninti specifiniai antikūnai (47 pav.). Remiantis tuo pačiu principu galima išgryninti ir antigeną, skirtumas tik toks, kad prie sorbento jungiamas ne antigenas, o specifiniai antikūnai.

160 160 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI a) b) c) d) 47 pav. Antikūnų gryninimas giminingumo chromatografijos metodu a) chromatografinė kolonėlė pripildoma sorbento su imobilizuotu antigenu ar kitais giminingais ligandais (pvz., baltymu A, G ar L); b) ant kolonėlės paviršiaus pilamas mišinys, iš kurio reikia išgryninti antikūnus; c) išplaunami baltymai, nesusirišantys su antigenu ar ligandu; d) didelės druskų koncentracijos ar ekstremalios ph reikšmės tirpalais suardoma antigeno ir antikūno sąveika, išplaunami antikūnai. Anti kūnams gryninti taip pat naudojama savita giminingumo chromatografijos rūšis, kai prie sorbento prijungtas baltymas A, G arba L sąveikauja su antikūnais, esančiais judrioje fazėje. Šis būdas tinkamas ne tik polikloniniams, bet ir monokloniniams antikūnams gryninti. Baltymai A ir G jungiasi prie IgG klasės antikūnų Fc dalies, o baltymas L prie visų antikūnų, turinčių kapa tipo lengvąsias grandines. Dėl šios sąveikos, baltymai A, G ir L naudojami antikūnams gryninti iš įvairių biologinių skysčių, priklausančių skirtingoms gyvūnų rūšims. Monokloniniams antikūnams valyti naudojami šie ir kiti metodai: precipitacija, baltymų A, G ar L afininė chromatografija, DEAE jonų mainų chromatografija. Išgryninti antikūnai gali būti modifikuojami įvairiais metodais: fragmentuojami (skaldomi pepsinu, papainu, tripsinu), jei norima gauti Fab ar (Fab) 2 fragmentus; konjuguojami su tam tikromis žymėmis biotinu, fermentais (peroksidaze, šarmine fosfataze), fluorescenciniais dažais (pvz., FITC, fiko eritrinu, akridino oranžu), cheminių elementų izotopais (pvz., radioaktyviu jodu).

161 II Dalis XIV skyrius 161 Kai kuriomis technologijomis, pavyzdžiui, klonuojant, naudojant transgenines peles, fagų, ribosomų, bakterijų ir mielių paviršiaus displėjus gaunami rekombinantiniai monokloniniai antikūnai. Naudojamos įvairios antikūnų raiškos sistemos: bakterijos, mielės, žinduolių ląstelės, augalai. Rekombinantiniai antikūnai, lyginant su įprastu būdu gaunamais monokloniniais, turi nemažai privalumų: bakterijų auginimas yra žymiai pigesnis ir paprastesnis nei hibridomų; galima kurti žmogaus antikūnus, skirtus gydymui; nenaudojami gyvulinės kilmės produktai, todėl išvengiama potencialių patogeninių mikroorganizmų, virusų rizikos; genų inžinerijos metodais galima įvairiai modifikuoti antikūno molekulę, suteikti jai norimų savybių. Atsižvelgiant į tai, kad rekombinantiniai antikūnai yra dirbtiniai, tokie, kurių neįmanoma rasti gamtoje, jie skiriasi nuo hibridomine technologija gautų monokloninių antikūnų ir be aukščiau minėtų privalumų turi ir eilę trūkumų: įprastai jų tirpumas būna labai ribotas; nepakankamai stabilūs; nepakankamas giminingumas antigenui. Šių trūkumų stengiamasi išvengti tobulinant rekombinantinių antikūnų gavimo technologijas. Rekombinantiniai antikūnai gali būti skirstomi: antikūnų fragmentai, bispecifiniai antikūnai, bifunkcionaliniai antikūnai, humanizuoti (angl. humanised) ir žmogaus monokloniniai antikūnai. Rekombinantiniai antikūnai gali būti kuriami skirtingais būdais: panaudojant antikūnų fragmentus, jų sujungimo būdus, trumpas polipeptidines jungiančiąsias grandines (48 pav.). Bispecifiniai antikūnai gali surišti du antigenus (pvz., dvi ląsteles, turinčias atitinkamus receptorius, du baltymus arba ląstelę su baltymu). (49 pav.). Bispecifiniai antikūnai gaminami: cheminiu būdu, surišant du skirtingo specifiškumo Fab fragmentus; suliejus dvi hibridomines ląsteles, gaminančias skirtingo specifiškumo antikūnus; genų inžinerijos metodais: prie ekspresuojamų antikūnų prijungiami du skirtingo specifiškumo Fab fragmentai arba du skirtingo specifiškumo scfv fragmentai.

162 162 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Bispecifiniai antikūnai sėkmingai taikomi navikų terapijoje. Žinoma, kad piktybiniai augliai gali būti aptinkami ir naikinami padedant antikūnams. Tačiau antikūnai turi patekti į auglį ir, atpažinę specifinius receptorius, prisirišti. Difuzija užima daug laiko, be to, didelė antikūnų koncentracija turi būti leidžiama ligoniui ilgą laiką, kol pasiekiama aukšta antikūnų koncentracija pačiame auglyje. Tuo atveju, kai antikūnas yra žymėtas radioaktyvia žyme, ilgalaikis tokios molekulės poveikis gali sukelti šalutinių nepageidaujamų efektų ląstelėse. Bispecifiniai antikūnai yra sukonstruoti tokiu būdu, kad atpažintų vėžines ląsteles ir haptenus (jų sudėtyje nėra radioaktyvios žymės, todėl ligonio organizmui nekenkia ir gali būti naudojami ilgą laiką). Po visų reikalingų antikūnų injekcijų, suleidžiamas radioaktyviu izotopu žymėtas haptenas. Mažos hapteno molekulės, skirtingai nei antikūnų, difunduoja greitai ir leidžia lengvai nustatyti vėžinių ląstelių lokalizacijos vietas. Nesusirišusios molekulės greitai pašalinamos per inkstus. VH СH1 Jungtis VL CL CH2 Jungtis Jungtis CH3 scfv fragmentas Sudvejintas scfv Sudvejintas antikūnas Fab Vienas domenas VH Fv dsfv scfv Sudvejintas antikūnas VL1 VH2 VH1 Toksinas VL2 Bispecifinis sudvejintas antikūnas Trigubas antikūnas scfv su dimerizacijos domenais Imunotoksinas 48 pav. Rekombinantinių antikūnų kūrimo strategijos

163 II Dalis XIV skyrius 163 Antigenas A Antigenas B Antigenas A Antigenas B Fab Fv Monospecifinis IgG Bispecifinis IgG 49 pav. Bispecifinių antikūnų kūrimo principas Chimeriniai ir humanizuoti antikūnai naudojami biologinės kilmės vaistų gamybai. Jie gaunami genų inžinerijos metodais, genetiniame lygmenyje sujungiant imunoglobulinų molekulių dalis, kai antikūnai yra skirtingos kilmės (dažniausiai pelės ir žmogaus). Tokių sujungtų genų raiškai naudojamos eukariotinės ląstelės. Pagrindinę chimerinių antikūnų dalį sudaro žmogaus IgG pastovioji sritis, prie kurios prijungti pelės IgG sunkiųjų ir lengvųjų grandinių Fab fragmentai. Šiuolaikiniams vaistams naudojamas tobulesnis chimerinių antikūnų variantas humanizuoti antikūnai. Jų variabiliojoje dalyje įterpti ne ištisi Fab fragmentai, o tik viena jų dalis arba kelios dalys (CDR), padedančios išlaikyti molekulės savitumą, sąveikaujant su antikūnais (50 pav.). Abu šių rekombinantinių antikūnų tipai skiriasi žmogaus ir pelių antikūnų sekų santykiu: chimeriniuose antikūnuose 25 proc. sudaro pelių sekos ir 75 proc. žmogaus sekos, humanizuotuose 5 proc. pelių sekos ir 95 proc. žmogaus sekos. Dar vienas šiuolaikinės imunotechnologijos metodas antikūnų molekulėms gauti yra fagų displėjus. Genų segmentai, koduojantys variabiliuosius (V) imunoglobulinų domenus, sujungiami su bakteriofagų paviršiniais baltymais. Kai tokie bakteriofagai įvedami į ląsteles, ląstelės pradeda gaminti į antikūnus panašius baltymus, kurių sekoje yra antigeną atpažįstantis ir prijungiantis domenas. Tokių fagų, kuriems padedant galima gauti įvairių antigeną surišančių sekų variantų, kolekcija sudaro fagų displėjų biblioteką. Tam, kad gautas genotipas atitiktų reikalingą fenotipą, atliekama fagų atranka, kuri remiasi antigeno ir antikūno sąveikos principu. Panašus principas taikomas giminingumo chromatografijoje. Po daugkartinių atrankos ciklų lieka tik labai specifiški, dideliu giminingumu antigenui pasižymintys fagai. Jie gali būti naudojami kaip antikūnų molekulės arba rekombinantinių antikūnų konstravimui. Ši monokloninių antikūnų gavimo technologija gali papildyti ar net pakeisti hibridominę technologiją.

164 164 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Rekombinantiniai antikūnai gali būti produkuojami tiek prokariotinėse (organizmai, neturintys tikro branduolio), tiek eukariotinėse (aukštesnieji organizmai, turintys branduolį) sistemose. Dažniausia naudojama eukariotinė gramneigiama bakterija Escherichia coli, sintetinanti neglikozilintus antikūnų fragmentus, kurie gali būti sekretuojami kaip tirpios molekulės arba netirpios molekulės, sekretuojamos įterptinių kūnelių forma. Taip pat naudojamos gramteigiamos bakterijos Bacillus brevis, Bacillus subtilis ir kitos. Jos neturi išorinės membranos, todėl baltymai sekretuojami tiesiai į terpę, be to, jų sekrecijos intensyvumas didesnis nei gramneigiamų bakterijų. Eukariotai naudojami antikūnų ekspresijai (gali būti mielės, pelėsiniai grybai, vabzdžių, žinduolių ląstelės, transgeniniai gyvūnai ir augalai). CDR Pelių antikūnai Chimeriniai antikūnai Sužmoginti Žmogaus antikūnai (humanizuoti) antikūnai 50 pav. Rekombinantinių antikūnų tipai Priešingai nei prokariotuose, eukariotinėse ląstelėse vyksta glikozilinimas, tačiau glikozilinimas skirtinguose organizmuose vyksta skirtingai. Baltyminės kilmės molekulių glikozilinimas yra labai svarbus, nes glikozilintų molekulių struktūra yra tokia pati arba labai panaši į gamtinių, o nuo struktūros priklauso biologinės molekulių funkcijos. SANTRAUKA Pagrindinis imunotechnologijos kaip mokslo, biofarmacinės pramonės ir medicinos srities objektas yra antikūnai. Antikūnų skirstymas gali būti labai įvairus (pagal klases, poklasius, specifiškumą ir kt.), tačiau imunotechnologijos požiūriu aktualus skirstymas į polikloninius antikūnus, sintetinamus skirtingų ląstelių klonų, ir monokloninius antikūnus, sintetinamus vieno ląstelių klono ir atpažįstančius tik vieną epitopą. Polikloniniai antikūnai gaunami imunizuojant žinduolius, gyvūnus arba paukščius. Imunizuojant naudojamos specialios medžiagos adjuvantai, sustiprinančios imuninį atsaką ir skatinančios antikūnų gamybą. Yra keturi skatinančių adjuvantų veikimo mechanizmai: depo efektas, antigeno pateikimo ir (arba) pristatymo efektas, moduliacinis efektas, citotoksinių limfocitų aktyvinimas.

165 II Dalis XIV skyrius 165 Antikūnų gamyboje labai svarbu ne tik imunizavimo būdas, bet ir koks antigenas naudojamas, kokios prigimties ir kokio dydžio molekulė. Dažniausiai imunizavimui naudojami baltyminės kilmės molekulės, kurių ilgis turi būti ne trumpesnis nei aminorūgščių, bet gali būti naudojama ir antigeno DNR. Monokloniniams antikūnams gauti naudojama hibridomų technologija, kuri be gyvūnų imunizavimo apima dar šešis etapus: hibridizaciją (plazminių ląstelių suliejimas su mielominėmis ląstelėmis); selekciją ir antikūnus produkuojančių ląstelių atranką; hibridinių ląstelių klonavimą; hibridomų linijų gavimą; antikūnų produkciją in vitro (ląstelių kultūroje, kai antikūnai sekretuojami į ląstelių kultūros terpę) ir in vivo (ascite) sąlygomis; antikūnų savybių įvertinimą ir gryninimą. Rekombinantiniai monokloniniai antikūnai gaunami genų inžinerijos būdu, fagų ar mielių displėjaus pagalba, naudojant transgeninius gyvūnus. Fagų displėjaus pagalba gaunamiems monokloniniams antikūnams būdingas didesnis specifiškumas, stabilumas įvairiomis sąlygomis, geresnis terapinis efektas ir galimybės panaudoti diagnostikoje. Rekombinantiniai antikūnai gali būti įvairių rūšių; jų skirstymas į atskiras kategorijas priklauso nuo to, kokie antikūnų fragmentai buvo klonuoti, kokiu būdu gauti antikūnų fragmentai buvo modifikuoti (sudvejinti, bispecifiniai, trigubi ir pan.). Genų inžinerijos būdu gaunami chimeriniai ir humanizuoti antikūnai, kurių atskiros molekulių dalys yra skirtingos kilmės. Chimerinių antikūnų dalį sudaro žmogaus IgG pastovioji sritis, prie kurios prijungti pelės IgG sunkiųjų ir lengvųjų grandinių Fab fragmentai. Humanizuotų antikūnų sudėtyje žmogaus imunoglobulinų sekų yra žymiai daugiau nei chimeriniuose; vos kelis procentus siekiantis pelių imunoglobulinų sekų (dažniausiai CDR sritys) kiekis sumažina nepageidautinų nespecifinių reakcijų tikimybę, naudojant šiuos antikūnus kaip vaistus.

166 166 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI XV skyrius 15. IMUNOLOGINIAI METODAI: IMUNINIO SERUMO TYRIMAI 15.1 Agliutinacija Agliutinacija (angl. agglutination) tai bakterijų, kraujo ląstelių ir kai kurių medžiagų dalelių, pvz., latekso dalelių, padengtų antigenu ar antikūnais, sukibimas ir nusėdimas. Šis procesas vyksta dėl antikūno ir antigeno sąveikos (51 pav.). Kai su agliutininais (antikūnais) sąveikauja eritrocitai, savo paviršiuje turintys agliutinogenus, įvyksta eritrocitų agliutinacija hemagliutinacija (angl. hemagglutination) (52 pav.). Panaudojant hemagliutinacijos reakciją su įvairiais antikūnais galima nustatyti skirtingus eritrocitų membranos antigenus; tai tiesioginės hemagliutinacijos reakcijos variantas. Eritrocitus galima naudoti kaip antigenų nešėjus tuo atveju, kai prie jų paviršiaus dėl cheminių modifikacijų prijungiami įvairūs antigenai ar haptenai; tai pasyvios hemagliutinacijos variantas. Agliutinacijos reakcija anksčiau buvo plačiai naudojama kai kurių infekcinių ligų sukėlėjams nustatyti, tačiau dabar šis metodas dažnai pakeičiamas tikslesniais. Iki šiol hemagliutinacijos reakcija naudojama kraujo grupėms nustatyti. Agliutinacija naudojama: kraujo grupių nustatymui; rezus veiksnio nustatymui; kai kurių bakterinių infekcijų diagnostikai (nustatomas bakterijai specifinių antikūnų titras); reumatoidinio veiksnio kraujo serume nustatymui; nėštumo testui.

167 II Dalis XV skyrius Precipitacijos reakcija Precipitacijos reakcija (lot. praecipitatio numetimas plačiąja prasme suvokiama kaip nusodinimo reakcija) viena iš imuninių reakcijų, per kurią medžiagos nusėda. Imunologijoje ji vadinama imunoprecipitacija ir suprantama kaip tirpių antigeno makromolekulių sąveika su homologiniais antikūnais elektrolito tirpale, kai susidaręs antigeno ir antikūno kompleksas įgyja drumzlių ar dribsnių (skystyje) arba nuosėdų (agaro gelyje) pavidalą. Šiuo atveju yra labai svarbus antigeno ir antikūno kiekybinis santykis; esant antigeno ar antikūnų pertekliui gaunami rezultatai gali būti netikslūs Antigenas NH 2 Antikūnas CH 2 OH O = C CH 2 CH 2 Vandenilinės jungtys CH 2 CH2 NH3 + O O C CH 2 CH2 Joninis ryšys CH2 CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH CH2 CH CH3 CH3 CH Hidrofobinė sąveika Van der Valso jėgos CH CH 3 CH 2 C O O +H3N CH 2 Joninis ryšys 51 pav. Antigeno ir antikūno sąveikos jėgos

168 168 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Eritrocitas Agliutinogenas + Agliutininai (antikūnai) 52 pav. Hemagliutinacijos reakcija Hemagliutinacija (53 pav.). Tai klasikinės imunoprecipitacijos variantas. Atliekant mokslinius tyrimus naudojamas modernizuotas imuprecipitacijos variantas. Prie mikrorutuliukų cheminio modifikavimo būdu pritvirtinamas baltymas A arba G, kuris, sumaišius su atitinkamais antikūnais, juos suriša. Taip paruošti mikrorutuliukai sumaišomi su ląstelių lizatais ar įvairių biologinių skysčių supernatantais ir tokiu būdu juose esančias antigeno molekules pagauna ant mikrorutuliukų esantys antikūnai. Nuplovus su antikūnais nesąveikavusias molekules bei kitas balastines medžiagas ir suardžius antigeno ir antikūno sąveiką, išskiriamos grynos antigeno molekulės, kurios gali būti tiriamos jau kitais metodais. Imunoprecipitacijai gali būti naudojami agarozės mikrorutuliukai, kurie išskiriami iš mišinio ir plaunami centrifuguojant, arba magnetiniai mikrorutuliukai, kuriems atskirti naudojamas magnetas. Imunoprecipitacija kaip metodas naudojama antigeno molekulėms išskirti iš biologinių skysčių, mikroorganizmų ar ląstelių lizatų. Imunoprecipitacijos metodas paprastai taikomas baltyminės kilmės molekulių išskyrimui, bet pastaruoju metu vis dažniau šis metodas naudojamas ir chromatinui išskirti, kai tiriama DNR ir baltymų sąveika. Praktikoje imunoprecipitacija taikoma bakterijų ir virusų sukeltų ligų diagnostikai, baltyminės kilmės medžiagų nustatymui maisto pramonėje, kriminalistikoje Komplemento sujungimo reakcija Komplemento sujungimo reakcija (angl. complement binding assay) tai imunologinis metodas, naudojamas specifiniams antikūnams arba antigenams nustatyti kraujo serumuose. Komplemento sistemą sudaro eilė serumo baltymų, reaguojančių su antigeno ir antikūno kompleksu. Tuo atveju, kai komplemento sistemos baltymų šis kompleksas nesuriša, laisvi baltymai ląs-

169 II Dalis XV skyrius 169 Antikūnų pertekliaus zona Ekvivalentinė zona Antigeno pertekliaus zona Supernatantas Antikūnų perteklius Antigeno perteklius Precipituoti antikūnai Antigeno koncentracija 53 pav. Precipitacijos reakcija telės paviršiuje suformuoja poras membranoje, suardoma jos homeostazė ir ląstelė žūsta (54 pav.). Tuo atveju, kai serume yra antikūnų prieš tiriamąjį antigeną, pridėjus į serumą antigeno, jis suformuoja kompleksą su antikūnais, prie kurio tuoj pat prisijungia komplemento sistemos baltymai; įdėjus į tokį reakcijos mišinį avino eritrocitų, hemolizė, priklausanti nuo komplemento sistemos, nevyksta, nes komplemento sistemos baltymai jau surišti. Tuo atveju, kai serume antikūnų prieš tiriamąjį antigeną nėra, komplemento sistemos baltymai lieka laisvi, gali prisitvirtinti prie eritrocitų, padengtų antikūnais, paviršiaus ir juos hemolizuoti. Anksčiau komplemento sujungimo reakcija buvo plačiai taikoma diagnozuojant įvairias infekcines ligas, ypač, kai nebuvo galima panaudoti ląstelių kultūrų metodo, taip pat diagnozuojant reumatines ligas. Šiuolaikinėse klinikinės diagnostikos laboratorijose šis metodas naudojamas retai; vietoje jo naudojami kiti šiuolaikiniai serologiniai metodai, pvz., imunofermentinė analizė, polimerazės grandininė reakcija.

170 170 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI TEIGIAMAS SERUMAS HEMOLIZĖ NEVYKSTA Ak Ag Komplementas Ak ir Ag kompleksas Fiksuotas komplementas Ak nėra NEIGIAMAS SERUMAS Ag Komplementas ERITROCITŲ HEMOLIZĖ Ak ir Ag kompleksas nesusidaro Komplementas nefiksuotas 54 pav. Komplemento sujungimo reakcija Imunofermentinės analizės metodas Sukurtas ir pradėtas taikyti praktikoje praėjusio amžiaus septintajame dešimtmetyje. Kaip ir daugelis imunologinių metodų, jis pagrįstas antikūno ir antigeno sąveikos principu. Lyginant su kitais metodais, turi akivaizdų privalumą antigeno ir antikūno reakcija vertinama ne pagal tokius antrinius požymius kaip agliutinacija, precipitacija, hemolizė, o tiesiogiai pagal fermento, prijungto prie vieno iš komponentų, aktyvumą. Imunofermentinės analizės metodu gali būti nustatomi ir antigenai, ir antikūnai; analizė gali būti

171 II Dalis XV skyrius 171 ir kokybinė, ir kiekybinė. Imunofermentinės analizės metodai skirstomi į dvi pagrindines grupes: sistemos, nereikalaujančios reakcijos komponentų atskyrimo, homogeninė imunofermentinė analizė; sistemos, kuriose reakcijos komponentų atskyrimas būtinas, heterogeninė imunofermentinė analizė. Homogeninės imunofermentinės analizės metodai praktikoje dažniausiai taikomi mažų molekulių (vaistų, metabolitų, hormonų) detekcijai. Heterogeninės imunofermentinės analizės metodai yra labai plačiai taikomi įvairiausiuose biologiniuose tyrimuose, ypač nustatant baltymus ar specifiškus antikūnus įvairiuose biologiniuose skysčiuose (kraujo serume, ląstelių lizatuose ir kt.). Toks heterogeninės analizės variantas, kai surištiems ir laisviems reakcijos komponentams atskirti naudojama kieta fazė, vadinamas ELISA (angl. enzyme-linked immunosorbent assay). Kieta faze gali būti pasirinkta polimerinė medžiaga (dažniausiai polistirenas ar jo analogai), gebanti savo paviršiuje adsorbuoti įvairias molekules. Priklausomai nuo eksperimento sąlygų arba dirbant su molekulėmis, kurių adsorbcija labai ribota, molekules prie kieto paviršiaus tenka tvirtinti kovalentiniais ryšiais. Adsorbuojant molekules ant kieto paviršiaus būtina atsižvelgti ne tik į molekulės prigimtį, bet taip pat į polimero gebėjimą adsorbuoti konkrečią molekulę; sorbcijos sąlygos kiekvienu atveju parenkamos individualios. Techniniu požiūriu ELISA atliekama specialiose plokštelėse, turinčiose 96 šulinėlius (55 pav.), o rezultatams registruoti reikalingas daugiakanalis spektrofotometras, pritaikytas darbui su tokiomis plokštelėmis. ELISA esmę galima apibūdinti paprastai: plokštelės paviršiuje absorbuotas antigenas sąveikauja su specifiniais antikūnais; ši sąveika registruojama prie antikūnų kovalentiškai prijungus aktyvųjį fermentą; fermentinio aktyvumui įvertinti naudojami kolorimetriniai, chemiliuminescenciniai ir chemifluorescenciniai registravimo metodai (kolorimetriniam metode naudojami spalvą keičiantys fermentų substratai ir chromogenai); chemiliuminescenciniame metode naudojami substratai, kurie fermento katalizuojamos reakcijos metu išsiskiriančią energiją išspinduliuoja šviesos fotonų pavidalu (pvz., liuminolas, dalyvaujant peroksidazei, virsta 3-aminoftalatu, tuo metu spinduliuojama 425 nm ilgio šviesos banga);

172 172 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI chemifluorescentiniame metode naudojami nefluorescuojantys fluorogeniniai substratai, fermentinės reakcijos metu virstantys į fluorescuojančius junginius. Chemiliuminescentinio ir chemifluorescentinio metodų jautrumas daugiau nei dešimt kartų viršija kolorimetrinio metodo jautrumą; Antigeno-antikūno sąveika vertinama spektrofotometriniu principu: daugiakanaliu spektrofotometru matuojamas spalvos pokytis; liuminometru santykinis šviesos pokytis; fluorimetru atsiradusi fluorescencija. TIESIOGINĖ ELISA ANTIGENAS plokštelės paviršiuje NETIESIOGINĖ ELISA PIRMINIAI ANTIKŪNAI specifiškai atpažįstantys antigeną PIRMINIAI ANTIKŪNAI specifiškai atpažįstantys antigeną žymėti fermentu ANTRINIAI ANTIKŪNAI rūšiai specifiniai žymėti fermentu Kolorimetriškai registruojama fermento ir substrato reakcija 55 pav. Tiesioginis ir netiesioginis ELISA metodas

173 II Dalis XV skyrius 173 Polikloniniai arba monokloniniai antikūnai Ak1 Antigenas Polikloniniai arba monokloniniai antikūnai Ak2 Antriniai antikūnai rūšiai specifiniai žymėti fermentu Kolorimetriškai registruojama fermento ir jo substrato reakcija 56 pav. Sumuštinio tipo ELISA Sumuštinio tipo ELISA eiga: Tobulėjant technikai pradėti gaminti daugiakanaliai spektrofotometrai, suderinantys du ar net visus tris matavimo būdus, taip pat galintys matuoti ne tik standartines 96 šulinėlių, bet ir kitokių formatų (6, 24, 48, 384 šulinėlių) plokšteles. Realiai egzistuoja dešimtys ELISA variantų, leidžiančių nustatyti ir antikūną, ir antigeną. Pateikti paprasčiausi ir dažniausiai naudojami ELISA variantai (50 51 pav.). Abiem atvejais plokštelės paviršiuje absorbuojamas antigenas. Tiesioginės ELISA atveju antigenas tiesiogiai sąveikauja su fermentu žymėtais specifiniais pirminiais antikūnais. Šiuo metodu nustatomas antigenas. Netiesioginės ELISA atveju plokštelės paviršiuje absorbuotas antigenas sąveikauja su pirminiais antikūnais, o pastarieji atpažįstami antrinių, rūšiai specifinių antikūnų, žymėtų fermentu. Netiesioginiu metodu galima nustatyti ne tik antigenus, bet ir specifinius antikūnus. Vienas iš dažniausiai naudojamų ELISA metodų Sumuštinio tipo ELISA (angl. Sandwich ELISA); (56 pav.). plokštelė padengiama polikloniniais arba monokloniniais antikūnais (Ak1); antikūnai prisitvirtina prie polimero paviršiaus veikiant fizikinės prigimties jėgoms; kiekvienam plokštelių tipui parenkama individuali dengimui naudojamų antikūnų koncentracija ir skiedimo buferinis tirpalas; po kiekvieno ELISA inkubavimo plokštelė plaunama tam, kad būtų pašalintas reagentų perteklius, nesusirišusios molekulės, įvairios specifiškai sąveikai trukdančios molekulės (plovimui gali būti naudojami įvairūs buferiniai tirpalai ar net vandentiekio vanduo); labai svarbi yra blokavimo procedūra: tuščios, antikūnų neužimtos ELISA plokštelės vietos padengiamos kokiomis nors imunologiniu požiūriu inertiškomis molekulėmis (tai leidžia išvengti tariamai teigiamų rezultatų);

174 174 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI dažniausia blokavimui naudojami jaučio serumo albumino, ovalbumino, embrioninio veršelio serumo, želatinos, kazeino, nuriebalinto pieno miltelių ir kt. tirpalai; po to inkububuojama su antigenu; specifiški antikūnai, atpažinę antigeną, jį suriša, o neatpažintos molekulės nuplaunamos; pridedami kiti antikūnai (Ak2) (jei plokštelė buvo padengta polikloniniais antikūnais, tai parenkami monokloniniai antikūnai prieš bet kurį antigeno epitopą); dengiant plokštelę monokloniniais antikūnais, Ak2 gali būti polikloniniai arba monokloniniai, bet pastaruoju atveju monokloninių antikūnų Ak1 ir Ak2 pora turi būti specialiai parenkama prieš skirtingus, erdviniu požiūriu tolimus antigeno epitopus; pridedami antriniai antikūnai, atpažįstantys Ak2 antikūnus; tai gali būti rūšiai specifiški antikūnai, žymėti fermentu (peroksidaze, šarmine fosfataze, β-galaktozidaze, ureaze, β-laktamaze ir kt.), atpažįstantys Ak2 Fc fragmentą; specifiška antigeno ir antikūno sąveika išryškinama padedant fermentinei reakcijai, kurios pobūdis priklauso nuo prijungto prie antrinių antikūnų fermento rūšies ir pasirinkto substrato. Dažniausiai sutinkamo fermento krienų peroksidazės substratas yra bespalvis vandenilio peroksidas. Reakcijos vaizdinimui bei detekcijos palengvinimui į fermento ir substrato mišinį pridedamas chromogenas spalvinis reakcijos indikatorius; tai gali būti OPD (o-fenilendiaminas), ABTS (2,2 -azino-bis (3-etilbenztiazolino-6-sulfoninė rūgštis)) ir kt. Imunofermentinėje analizėje naudojamas ir defosforilinantis fermentas šarminė fosfatazė, kurios substratas yra 4-nitrofenilfosfatas. Šarminės fosfatazės reakcija, lyginant su peroksidazės, vyksta žymiai lėčiau, bet šis fermentas, skirtingai nei peroksidazė, neinaktyvuojamas plačiai vartojamo natrio azido. Be to, gali būti naudojami ir jautresni chemiliuminescenciniai bei chemifluorescenciniai registravimo metodai ELISPOT metodas Aštuntajame dešimtmetyje buvo pasiūlyta sėkminga ELISA modifikacija ELISPOT (angl. enzime-linked immunosorbent spot assay). Naudojant šį metodą galima nustatyti atskirų ląstelių sekretuojamus specifinius antikūnus ir kiekybiškai įvertinti sekretuojamų ląstelių skaičių. Pirmiausia šis metodas buvo pritaikytas B ląstelių, sekretuojančių tam tikram antigenui specifinius antikūnus, kiekiui nustatyti, o vėliau ir kitiems tikslams. Sudarius tam tikras sąlygas,

175 II Dalis XV skyrius 175 ELISPOT tyrimu galima vaizdinti atskirų ląstelių sekrecijos produktus kaip atsaką į šių ląstelių aktyvinimą. Dažniausiai šis metodas naudojamas T ląstelių citokinų sekrecijos tyrimams. ELISPOT tyrimas labai panašus į Sumuštinio tipo ELISA eigą: plokštelė padengiama antikūnais, atpažįstančiais dominantinį antigeną; blokuojama inertiškais baltymais; po to į plokštelę dedamas atitinkamas kiekis tiriamųjų ląstelių kartu su antigenu ar mitogenu; plokštelės inkubuojamos atitinkamomis sąlygomis, užtikrinant ląstelių gyvavimą; po tam tikro laiko ląstelės nuplaunamos, pasilieka tik prie antikūnų prisitvirtinęs antigenas; antikūno ir antigeno sąveika išryškinama taip pat kaip ELISA atveju pridėjus kitų antikūnų ir vaizdinimui ar rezultatų registravimui būtinų reagentų. Po reakcijos vaizdinimo matyti, kad sekrecijos produktai išsidėsto ratu aplink kiekvieną ląstelę, taigi kiekviena aktyvinta ląstelė atrodo kaip taškas ar maža dėmelė (iš čia ir kilo metodo pavadinimas). Visas tokias ląsteles kaip atskirus taškus galima suskaičiuoti ir kiekybiškai įvertinti atsako į tam tikrą mitogeno ar antigeno lygį. Pasiūlyta FluoroSpot metodo modifikacija leidžia vienu metu tirti kelis ląstelių sekrecijos produktus, nes vietoje fermentinės vaizdinimo sistemos naudojami skirtingais fluoroforais žymėti antikūnai Radioimuninis metodas Radioimuninis (angl. radial immudiffusion), arba izotopinis imuninis metodas, kaip ir imunofermentinis remiasi antigeno ir antikūno sąveikos principu, tik dažniausiai atliekamas homogeninėje sistemoje (57 pav.). Radioimuniniu metodu atliekami kiekybiniai biologiškai aktyvių medžiagų tyrimai įvairiuose biologiniuose skysčiuose remiasi konkurencinės antigeno ir antikūno sąveikos principu: į tiriamojo antigeno sudėtį įvedama radioaktyvi žymė (dažniausiai jodo 125 I), izotopas prijungiamas prie aminorūgšties tirozino (kartais naudojamas tritis 3 H); žymėtas antigenas sumaišomas su žinomų antikūnų kiekiu; susidaro antikūnų ir žymėtų antigenų kompleksas;

176 176 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI pridedamas biologinis skystis (pvz., kraujo serumas), kuriame yra nežinomas to paties antigeno (nežymėto) kiekis; nežymėtas antigenas konkuruoja su žymėtu antigenu dėl sąveikos su antikūnu vietos; nusistovėjus reakcijos pusiausvyrai, su antikūnais surišti antigenai atskiriami nuo tirpale likusių laisvų (nusodinant amonio sulfatu, precipituojant antriniams antikūnams, baltymams A ar G, surištiems su sorbentu); specialiu prietaisu (radiospektrometru) išmatuojamas tirpale esančio laisvo antigeno radioaktyvumas (naudojant standartines kreives ir žinomus standartus), apskaičiuojamas tiriamo antigeno kiekis biologiniame skystyje; kuo didesnis nežymėto antigeno kiekis, tuo didesnį žymėto antigeno kiekį jis išstums iš susidariusio antigeno ir antikūno komplekso ir gautas radioaktyvumo lygis tirpale bus didesnis. a) tiesioginis + + b) konkurentinis Imunoglobulinas Žymėtas Nepažymėtas Surištas Laisvas haptenas haptenas haptenas haptenas 57 pav. Radioimuninis metodas Šis imunologinis metodas buvo atrastas anksčiau nei imunofermentinė analizė ir ilgą laiką buvo vienas iš populiariausių mokslo tyrimuose ir medicininėje praktikoje, nes turi daug privalumų: universalus metodas, nes galima nustatyti bet kokią molekulę, jei tik yra specifinių antikūnų; labai specifiškas ir tikslus metodas; dėl įvestos žymės labai jautrus metodas; galima nustatyti pikogramines antikūnų koncentracijas viename mililitre skysčio; paprasta atlikimo technika ir rezultatų interpretavimas.

177 II Dalis XV skyrius 177 Dabar, lyginant su imunofermentine analize, jis taikomas rečiau, dažniausiai naudojamas hormonų kiekiui kraujyje nustatyti, nes be minėtų privalumų radioimuninis metodas turi ir trūkumų: gana trumpas radioaktyvių izotopų, skleidžiančių gama spindulius gyvavimo laikas; pavojingos darbo sąlygos, dirbant su radioaktyviomis medžiagomis, reikalaujančios ypatingo darbuotojų pasiruošimo; žymėtų molekulių struktūros pažeidimai, sukeliami spinduliuotės; būtinybė atskirti su antikūnais surištus antigenus nuo laisvų; ribotos tyrimo automatizavimo galimybės Imunodifuzija ir jos variantai Imunodifuzija (angl. immunodiffusion) imuninės analizės metodas, pagrįstas difuzijos ir precipitacijos reakcijos gelyje principu. Biologiniai mėginiai, turintys antigenų ir antikūnų, difunduodami agaro gelyje, susitinka ir ekvivalentinių koncentracijų vietoje sudaro plonos linijos pavidalo precipitatą. Yra keli imunodifuzijos variantai. Dažniausiai naudojami du imunodifuzijos variantai: žiedinė imunodifuzija pagal Mančinį ir dviguba imunodifuzija pagal Ouchterlonį (14 lent.). Kartais prie imunodifuzijos, kaip vienas iš variantų, priskiriama ir imunoelektroforezė. 14 lentelė. Imunodifuzijos variantų klasifikacija Imunodifuzija Linijinė Žiedinė Kampinė Paprasta Viena kryptimi difunduoja tik vienas komponentas Visomis kryptimis (žiedu) difunduoja tik vienas komponentas (pagal Mančinį) Dviguba Vienas priešais kitą difunduoja du komponentai Visomis kryptimis (žiedu) difunduoja du komponentai (pagal Ouchterlonį) Difunduoja du komponentai, vienas kito atžvilgiu išdėstyti statmenai Paprastos žiedinės imunodifuzijos metodu serume, šlapime ir kituose biologiniuose skysčiuose nustatoma: visų klasių imunoglobulinai; komplemento baltymai; transferinas ir kiti serumo baltymai.

178 178 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Žiedinės imunodifuzijos (pagal Mančinį) metodo principas: paruošiamas agarozės gelis su antikūnais; į gelyje padarytas duobutes supilamas antigenas; antigeno molekulės visomis kryptimis difunduoja į gelį, kuriame tolygiai pasiskirsčiusios antikūnų molekulės; kaip ir precipitacijos atveju ekvivalentinėje zonoje formuojasi precipitacijos žiedai. Norint padidinti tyrimo jautrumą, iš gelio išplaunami neprecipitavę baltymai, o likę precipitatai dažomi baltymams skirtais dažais, pvz., Coomassie Brilliant Blue. Nustatant antigeno koncentraciją, laikomasi standartų (įvairūs žinomos koncentracijos baltymo praskiedimai), pagal kuriuos paruošiamos kalibracinės kreivės (skersmuo, pakeltas kvadratu, yra tiesiog proporcingas antigeno koncentracijai). Tiriamo antigeno suformuoto precipitacijos žiedo skersmuo lyginamas su standartų precipitacijos žiedų skersmeniu ir pagal kalibracinę kreivę apskaičiuojama antigeno koncentracija. Anksčiau imunodifuzija pagal Ouchterlonį buvo naudojama kokybiniams ir kiekybiniams antigenų bei antikūnų tyrimams, infekcinių ligų diagnostikai. Šiuo metu dėl nepakankamo jautrumo naudojama rečiau. Dvigubos imunodifuzijos (pagal Ouchterlonį) metodo principas yra labai panašus į žiedinės imunodifuzijos, skiriasi tik tuo, kad antikūnai ne įmaišomi į agarozę, o taip pat kaip antigenas supilami į paruoštas duobutes; susitikusios antigeno ir antikūno molekulės suformuoja precipitacijos linijas (58 pav.) Imunoelektroforezė Imunoelektroforezė (angl. immunoelectrophoresis) yra mišraus tipo metodas elektroforezės ir imunodifuzijos metodų kombinacija. Kaip ir imunoprecipitacijos atveju reikia, kad antikūnai būtų dvivalenčiai (pvz., IgG) arba daugiavalenčiai (kaip IgM); monovalentiniai Fab fragmentai antigeno neprecipituoja. Prieš imunoprecipitaciją atliekama tiriamo mišinio, kuriame yra vienas ar keli antigenai, elektroforezė mišinio komponentų pasiskirstymas elektros lauke pagal molekulės krūvį. Imunoelektroforezė atliekama tokia tvarka (59 pav.): elektroforezinis tiriamojo mišinio išskirstymas į atskirus komponentus; vienos ar kelių rūšių antikūnai (priklauso nuo siekiamų tikslų) įpilami į griovelį, paruoštą taip, kad jis būtų lygiagretus antigeno judėjimo krypčiai;

179 II Dalis XV skyrius 179 vyksta antikūnų difuzija gelyje (šiuo atveju be elektros lauko); ir, pasiekę antigeno ekvivalentinę zoną, formuoja precipitacijos linijas; norint padidinti tyrimo jautrumą, precipitatai dažomi kaip ir imunodifuzijos atveju. a AB b a a a b A AB 1 abi precipitacijos linijos sutampa: antigenai (a, a) identiški 2 precipitacijos linijos susikerta: antigenai (a, b) skirtingi 3 precipitacijos linijos iš dalies sutampa, tačiau turi pentiną : vienas antigenas (a) turi daugiau epitopų 4 abi precipitacijos linijos susilieja ir susikerta: antigenai (a, b, c) turi vienodus ir skirtingus epitopus A, B, C skirtingo specifiškumo antikūnai: a, b, c skirtingi antigenai a 1 AA 1 3 a1 ab 2 AB C 4 ac 58 pav. Dvigubos radialinės imunodifuzijos pagal Ouchterlonį principas (I) ir precipitacijos linijų išsidėstymas (II) 1 ETAPAS Kraujo serumo elektroforezė šalia paruošto griovelio (+) Elektroforezės kryptis ( ) Serumas 2 ETAPAS Antikūnai supilami į griovelį, vyksta difuzija Albuminas IgM IgA IgG α2 makroglobulinas 59 pav. Žmogaus kraujo serumo imunoelektroforezė

180 180 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Imunoelektroforezė dar vadinama gama globulinų elektroforeze arba imunoglobulinų elektroforeze, nes, nežiūrint į tai, kad įprastai imunoglobulinai atlieka antikūnų vaidmenį, jie gali būti traktuojami kaip antigenai. Metodas naudojamas baltymų tapatybei nustatyti biologiniuose skysčiuose (kraujo serumas, įvairūs ekstraktai) bei monokloninių imunoglobulinų kloniškumo tyrimuose. Imunoelektroforezė yra santykinai senas metodas, kurį vis labiau išstumia tokie metodai, kaip imunofermentinė analizė, imunoblotingas, tačiau ji turi vieną privalumą elektroforezinis tiriamojo mišinio pasiskirstymas į atskirus komponentus vyksta neredukuojančiomis sąlygomis (skirtingai nei imunoblotingo atveju), todėl suteikia galimybę išlaikyti natyvią antigeno struktūrą Imunoblotingas Imunoblotingas (angl. immunoblotting), Western blotting yra labai populiarus imunofermentinės analizės metodas, naudojamas baltymų tapatybei nustatyti įvairiose biologinėse sistemose (biologiniuose skysčiuose, ląstelių lizatuose, virusiniuose baltymuose ir t. t.). Nustatant baltymo tapatybę, įvertinama jo molekulinė masė, kiekis, sąveika su specifiniais antikūnais. Imunoblotingas yra daugiapakopis metodas, susidedantis iš kelių etapų (60 pav.): tiriamo pavyzdžio paruošimas denatūruojamos ir redukuojamos baltyminės struktūros; elektroforezinis baltymų mišinio pasiskirstymas pagal molekulinę masę; baltymų pernaša ant membranos; baltymų tapatybės nustatymas ir vaizdinimas. Tiriamas pavyzdys prieš elektroforezę specialiai paruošiamas virinant jį su natrio dodecilsulfatu (SDS). Šis detergentas aukštoje temperatūroje denatūruoja baltymus, jo molekulės apsupa baltymo molekules tokiu būdu, kad aplink baltymo molekules susidaro tankus neigiamas krūvis. Krūvio dydis, o kartu ir molekulės judėjimo greitis elektros lauke priklauso nuo molekulės dydžio. Dirbant su sudėtingos ketvirtinės ir tretinės struktūros baltymais ar baltymų kompleksais, reikia juos suardyti, todėl, ruošiant tiriamus mėginius, naudojami redukuojantys reagentai (2-merkaptoetanolis arba ditiotreitolis), kurie pirmiausia, suardydami disulfidines jungtis, išskaido sudėtingas baltymų struktūras. Tokiu būdu paruoštuose mėginiuose baltymų molekulės įgyja panašią formą, vientisą krūvį, todėl jų judėjimas elektros lauke priklauso tik nuo molekulės dydžio. Elektroforezė vyksta poliakrilamidiniuose geliuose, kurie ruošiami polimerizuojant poliakrilamidą; polimerizacijos procesas valdomas, todėl galima

181 II Dalis XV skyrius 181 Baltymų mišinys Poliakrilamido gelis Elektroforezė Baltymai pasiskirsto pagal molekulinę masę į atskiras juostas Nitroceliuliozės membrana Poliakrilamido gelis Pagrindas Filtrinis popierius Antigenas išryškinamas specifinių antikūnų ir vaizdinimo sistemų pagalba Pernaša Išryškinimas 60 pav. Pagrindiniai imunoblotingo etapai paruošti įvairių koncentracijų gelių. Gelio koncentracija parenkama pagal tiriamų baltymų molekulinės masės diapazoną: jei manoma, kad dominantys baltymai yra mažos molekulinės masės, paruošiamas didesnės koncentracijos gelis, nes smulkesnėms molekulėms lengviau prasiskverbti pro mažesnes poliakrilamidinio gelio poras; jei dirbama su stambiamolekuliniais baltymais, ruošiamas mažesnės koncentracijos gelis su didesnėmis poromis tam, kad didelės molekulės galėtų judėti. Elektroforezės metu neigiamai įkrauti baltymai juda anodo link, bet, turėdami skirtingą krūvį, pasiskirsto nevienodai į atskiras juosteles. Kuo toliau geliu nukeliauja baltymo juostelė, tuo mažesnį krūvį ji turi, o tai reiškia, kad pati baltymo molekulė yra mažesnė. Naudojant specialius elektroforezei skirtus žymenis (žinomos molekulinės masės baltymų mišinius), su kuriais lyginamos tiriamų baltymų pasiskirstymo juostos, galima nustatyti jų molekulines mases. Kitame etape gelyje atskiromis juostomis pasiskirstę baltymai perkeliami ant specialios membranos, kad vėliau juos būtų galima išryškinti. Dažniausia naudojamos membranos, pagamintos iš nitroceliuliozės ar polivinilideno difluorido. Pernašos esmė glaudus gelio ir membranos kontaktas, kurio metu baltymai difunduoja iš gelio į membraną. Pernaša gali vykti pasyviai, kai procesą lemia pasyvi difuzija, arba aktyviai, kai ją pagreitina elektros laukas. Dažniausia atliekama aktyvi pernaša, nes šiuolaikiniai gamintojai siūlo įvairių šlapios ir pusiau sausos pernašos sistemų. Po perkėlimo ant membranos

182 182 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI baltymai būna pasiskirstę vienoje plonos membranos paviršiaus pusėje, taip pat kaip ir gelyje. Norint sumažinti nespecifinių sąveikų su tuščiu membranos paviršiumi galimybę ir sustiprinti signalo ryškumą, membrana su perkeltais baltymais turi būti blokuojama buferiniu tirpalu, į kurio sudėtį įeina imuniniu požiūriu neutralūs baltymai išgryninti arba esantys serumų sudėtyje, detergentai ar nuriebalinto pieno milteliai. Baltymų tapatybė gali būti nustatoma panašiai kaip ir imunofermentinės analizės atveju : tiesioginiu būdu, naudojant specifinius žymėtus antikūnus; netiesioginiu būdu, naudojant pirminius (tiriamajam baltymui specifiškus) ir antrinius (pirminiams antikūnams specifiškus) antikūnus. Imunoblotingui gali būti naudojami antikūnai, konjuguoti su įvairiais žymenimis: fermentais (krienų peroksidazė, šarminė fosfatazė); fluorochromais; radioaktyviais izotopais. Antigeno ir specifinio antikūno sąveika vaizdinama: padedant įvairiems chromogeniniams ir chemiliuminescenciniams substratams, kai naudojami fermentu žymėti antikūnai; fluorescencinio vaizdinimo prietaisais, kai naudojami fluorochromu žymėti antikūnai; rentgeno juostoje, kai naudojami radioaktyviais izotopais žymėti antikūnai. Imunoblotingas labai dažnai taikomas moksliniuose tyrimuose; kiek rečiau naudojamas medicininėje diagnostikoje: Laimo ligai nustatyti, žmogaus imunodeficito viruso baltymams tirti, kad būtų patvirtinti teigiami specifinių virusui antikūnų testo rezultatai. SANTRAUKA Dauguma imunologinių metodų pagrįsti antikūno ir antigeno sąveikos principu. Įvairūs agliutinacijos, imunodifuzijos ir precipitacijos reakcijos variantai remiasi antikūnų savybe keisti antigenų fizinį būvį po sąveikos su juo; šiuo atveju iškrenta nuosėdų. Reakcijos gali būti atliekamos tiek mėgintuvėlyje, tiek tirpale, tiek gelyje. Daugeliu atvejų tai: kokybiniai tyrimo metodai. Hemagliutinacijos reakcija pagrįsta eritrocitų agliutinacija, nustatomos kraujo grupės, parenkamos donoro ir recipiento poros kraujo perpylimui.

183 II Dalis XV skyrius 183 Radioimuninė analizė (RIA) didelio jautrumo kiekybinis metodas, kuriame naudojami radioaktyvia žyme žymėti antigenai ar antikūnai. Tyrimo rezultatas įvertinamas pagal radioaktyvios spinduliuotės intensyvumą. Vienas dažniausiai naudojamų imunologinių metodų imunofermentinė analizė (ELISA), kurios yra daug variantų (tiesioginė, netiesioginė, sumuštinio tipo ir kt.). Naudojami antigenai ar antikūnai, prie kurių yra prijungta fermentinė žymė. Tyrimo rezultatai priklauso nuo fermento-substrato reakcijos, kurios metu susidaro spalvotas produktas. ELISA tyrimo varianto, chemoliuminescentinės analizės atveju, kur chromogeninė reakcija pakeista į chemoliuminescentinę, jautrumas labai padidėja. ELISPOT metodas remiasi tokiais pačiais principais kaip ir imunofermentinė reakcija, tačiau dažniausiai naudojamas ląstelių tyrimams. Imunoelektroforezė mišraus tipo metodas, t. y. elektroforezės ir imunodifuzijos metodų kombinacija. Imunoblotingo atveju baltymų mišinys elektroforezės būdu išskirstomas į atskiras baltymo juosteles, kurios po to perkeliamos ant nitroceliuliozės membranos ir analizuojamos žymėtais antigenais ar antikūnais.

184 184 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI XVI skyrius 16. IMUNOLOGINIAI METODAI: IMUNOKOMPETENTINIŲ LĄSTELIŲ TYRIMAI Rozečių metodas Imunologinis metodas, skirtas imuninės sistemos ląstelių, turinčių skirtingos struktūros receptorius, tyrimams. Rozečių metodu galima nustatyti imunokompetentines ląsteles, turinčias šiuos receptorius: avino eritrocitams (T limfocitai), IgG ir IgM molekulių Fc daliai (Fc receptoriai) ir komplemento komponentams (C3 receptoriai) (B limfocitai). Ląstelės per minėtus receptorius sąveikauja su eritrocitais, juos prijungia savo paviršiuje, susiformuoja rozetes primenančios struktūros, kurių centre yra leukocitas, o aplink jį išsidėsto ne mažiau kaip 3 5 eritrocitai (61 pav.). Avino eritrocitai Žmogaus T limfocitas 61 pav. Žmogaus T limfocitai ir avino eritrocitai suformuoja E rozetes

185 II Dalis XVI skyrius 185 Egzistuoja įvairių šio metodo variantų: E rozetės, kurias sudaro žmogaus T limfocitai, inkubuojami in vitro sąlygomis su avino eritrocitais; T limfocitai spontaniškai suriša avino eritrocitus ir sudaro rozetes formuojančias ląsteles; šio komplekso susidarymą lemia T limfocitų CD2 molekulių, (avino eritrocito receptoriai ) ir avino eritrocitų (LFA-3 ligando) sąveika; EA rozetės, kurias sudaro limfocitai su jų paviršiuje esančiais avino eritrocitais. IgG Fc receptorius turinčios ląstelės, inkubuojant su padengtais IgG arba IgM avino eritrocitais, sudaro EA rozetes; tokiu būdu paruošti avino eritrocitai naudojami Fcγ ir Fcµ receptoriams nustatyti; EAC rozetės, kurias sudaro limfocitai su jų paviršiuje esančiais avino eritrocitais, dalyvaujant imunoglobulinams ir komplemento komponentams; EAC rozečių formavimusi pagrįstas metodas naudojamas komplemento C3b receptoriams nustatyti; anksčiau šis metodas buvo taikomas B limfocitams nustatyti; fagocituojančios ląstelės turi C3b receptorių ir gali formuoti EAC rozetes. Rozečių metodas buvo pirmasis metodas, taikomas periferinio kraujo T ir B limfocitams atskirti ir imuninei būklei įvertinti, kai dar nebuvo atrasti specifiniai, juos atpažįstantys antikūnai. Pastaraisiais dešimtmečiais klasikiniai šio metodo variantai naudojami retai, nes yra patikimesnių šiuolaikinių metodų, leidžiančių išvengti pagrindinių trūkumų: prasto rezultatų atkartojamumo, nepakankamo patikimumo ir mažo specifiškumo. Dabar T limfocitų ir jų subpopuliacijų tapatybė nustatoma tėkmės citometrijos metodu, naudojant monokloninius antikūnus. Kartais naudojamos įvairios metodo modifikacijos, kai vietoj eritrocitų naudojamos kitos ląstelės, dirbtinės dalelės ar labai didelės molekulinės masės junginiai, padedantys suformuoti rozetes Imunofluorescencijos metodas Jo esmė glūdi antigeno ir antikūno sąveikos vaizdinime, panaudojant fluorescencinius žymenis. Dėl tos priežasties, kad vaizdinimui naudojami įvairūs fluores cenciniai mikroskopai, vartojant imunofluorescencijos terminą kalbama apie imunofluorescencinę mikroskopiją. Imunofluorescencine mikroskopija galima tirti šiuos objektus: gyvas ląsteles (imunocitofluorescencija); audinius (imunohistofluorescencija); ir netgi atskirus mikroskopinio dydžio organizmus.

186 186 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Tokios rūšies tyrimai atliekami tiriant: objektų sandarą bei struktūrą; juose vykstančius dinaminius procesus; vystymosi procesus; transportą ir kt. Tyrimai atliekami nesuardant tiriamos sistemos, kaip tai dažniausiai atsitinka biocheminės analizės atveju, kai tyrimo objektai įvairiais metodais išskaidomi į jų sudedamąsias dalis. Būtent ši metodo ypatybė suteikia galimybę nustatyti tiriamo antigeno vietą konkrečiame mėginyje. Naudojant imunofluorescentinę mikroskopiją galima nustatyti baltyminės, angliavandenių ir kitos kilmės molekulių vietą ne tik konkrečiame audinyje, bet ir ląstelėje citoplazmoje, branduolyje ar atskirose organelėse. Siekiant šio tikslo ypač svarbu tinkamai paruošti tyrimo mėginį: ant dengiamųjų stiklelių uždedami audinių mikropjūviai, ląstelių suspensijos, kartais ląstelės tiesiog auginamos ant dengiamųjų stiklelių; audiniai ar ląstelės fiksuojami tam, kad būtų stabilizuotos ląstelinės bei baltyminės struktūros; fiksavimas turėtų kuo mažiau paveikti struktūras, tačiau turi sudaryti tinkamas sąlygas antikūnams pasiekti antigenų epitopus (yra du pagrindiniai fiksavimo būdai, besiremiantys baltymų nusodinimo organiniais tirpikliais, ypač žemoje temperatūroje, principu; cheminio sujungimo principu, panaudojant aldehido tipo junginius); daug papildomų kontrolių: teigiama (jei įmanoma), neigiama ir izotipinė (to paties izotipo nespecifiniai antikūnai monokloninių antikūnų atveju arba tos pačios rūšies neimunizuoto gyvūno serumas); kai tiriami ląstelių viduje esantys antigenai, būtina ląstelių membraną padaryti pralaidžią fluoroforais žymėtiems antikūnams (angl. permeabilization); jei tiriamas antigenas yra išoriniame plazminės membranos paviršiuje, plazminės membranos pralaidumas nekeičiamas; mėginio dažymas padedant antikūnams, žymėtiems fluoroforais; šiame etape panaudojama antigeno ir antikūno sąveika, kurios principas yra lygiai toks pats kaip imunofermentinėje analizėje: dažniausiai naudojami tiesioginės ir netiesioginės ELISA principai, kartais sudėtingesnės sistemos; skirtumas tik tas, kad vietoje plokštelių naudojami mikroskopiniai stikliukai, o antikūnai žymimi ne fermentu, o fluoroforu; rezultatų vaizdinimui būtinas epifluorescencinis arba konfokalinis fluorescencinis mikroskopas.

187 II Dalis XVI skyrius 187 Vaizdinimui naudojamas fluorescencijos reiškinys, kurio esmę sudaro: fluoroforas sužadinamas tam tikro, tik jam būdingo bangos ilgio šviesos energija; fluoroforo molekulės sudėtyje esantis elektronas yra pakeliamas į aukštesnį energijos lygį; iš aukštesnio lygio elektronas grįžta į savo stabilią padėtį išspinduliuodamas energijos perteklių kaip šviesos fotoną; išspinduliuotos energijos bangos ilgis visada bus didesnis negu sužadinimo energijos, nes dalis energijos prarandama išspinduliavimo metu. Filtrų sistema, esanti mikroskopuose, suteikia galimybę vaizdinti įvairiausiais fluoroforais žymėtus antikūnus; gali būti naudojami įvairiausio tipo fluoroforai su skirtingo ilgio sužadinimo ir išspinduliavimo bangomis. Panaudojant papildomas specifiškai dažančias įvairias ląstelės organeles (branduolį, aktiną, mitochondrijas, membraną ir t. t.) fluoroforus, galima tiksliai nustatyti dominančio baltymo vietą. Tinkamai parinkus fluoroforų derinį šiuolaikiniais mikroskopais galima tyrinėti ir kelis antigenus gaunamas įvairiaspalvis ląstelės vaizdas juodame fone. Kaip ir bet kuris metodas imunofluorescentinė mikroskopija turi ir trūkumų: fotoblukimas negrįžtamas dažo virsmas į nefluorescuojantį junginį; fluorescentinėje mikroskopijoje tai žalingas procesas, nes stebimas vaizdas pamažu blykšta; subjektyvumo faktorius; labai daug priklauso nuo paties tyrėjo ir vaizdų fiksavimo technikos; daug papildomų kontrolių: teigiama (jei įmanoma), neigiama ir izotipinė (to paties izotipo nespecifiniai antikūnai monokloninių antikūnų atveju arba tos pačios rūšies neimunizuoto gyvūno serumas) Tėkmės citometrijos metodas Tėkmės citometrijos metodas kartais vadinamas srautine citometrija (angl. flow citometry) vienas iš dažniausiai naudojamų metodų moksliniuose tyrimuose, analizuojant ląstelių išorės ir vidaus molekulių raišką, nagrinėjant įvairius ląstelių tipus heterogeninėse ląstelių populiacijose, įvertinant išskirtų populiacijų grynumą, nustatant ir apibūdinant ląstelių dydį ir kiekį. Šis metodas suteikia galimybę vienu metu įvertinti daugelį atskiros ląstelės

188 188 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI parametrų, nes matavimai atliekami su kiekviena pro lazerio šviesos pluoštą pratekančia ląstele. Tėkmės citometrijos matavimai gali būti atliekami tik specialiu prietaisu tėkmės citometru, kuriame yra sudėtingų, vieningai dirbančių sistemų: hidrodinaminė; optinė; elektroninė; lazerinė; kompiuterinių-programinių technologijų. Su tėkmės citometro lazeriu pagal fluorescencijos parametrus, naudojant fluorescuojančiais junginiais žymėtus antikūnus, atliekama kiekybinė ir kokybinė ląstelių analizė. Tėkmės citometrijoje naudojami fluorochromais žymėti antikūnai ar kitos makromolekulės, atpažįstančios dominančias ląstelių vidaus ar išorės struktūras ar tikslinius junginius. Šis metodas plačiai taikomas ląstelėms, turinčioms tam tikrų diferenciacijos antigenų, nustatyti. Tėkmės citometrija suteikia galimybę tirti ląstelių viduje, paviršiuje ir membranose esančius baltymus, fermentus, receptorius ir kitas makromolekules, įvertinti ląstelėje vykstančius procesus. Šiuolaikiniai prietaisai paprastai turi keletą lazerių ir didelį skaičių jutiklių skirtingų spalvų fluorescencijai fiksuoti. Padidėjęs lazerių ir jutiklių skaičius sudaro galimybes vienu metu panaudoti daugiau ir įvairesnių fluorescuojančių medžiagų ir atlikti daugelio parametrų lyginamąją analizę. Ši technologija skirta ne tik suspensijoje esančioms ląstelėms skaičiuoti ar individualioms savybėms įvertinti, bet ir rūšiavimui į atskiras frakcijas. Tėkmės citometrijos metodu galima tirti ne tik ląsteles, bet ir bakterijas, pirmuonis, mieles, mikrodaleles, kurių dydis nuo 0,5 iki 50 µm. Mėginių paruošimo metodikų gali būti labai įvairių, tačiau visais atvejais svarbu paruošti pavienių ląstelių pakankamos koncentracijos suspensiją be ląstelinių agregatų ir pašalinių priemaišų. Ląstelių analizei srautinės citometrijos metodu pakanka nedidelio mėginio tūrio (nuo 100 ml). Ląstelių koncentracija mėginyje nuo 10 5 iki 10 8 ląstelių/ml. Mėginių paruošimas tai ir fluorescencinių žymenų panaudojimas ląstelėms dažyti. Kaip ir imunofluorescencinės mikroskopijos atveju dažoma : tiesioginiu būdu, naudojant specifinius žymėtus antikūnus; netiesioginiu būdu, naudojant pirminius (tiriamajam baltymui specifinius) ir antrinius (pirminiams antikūnams specifiškus) antikūnus.

189 II Dalis XVI skyrius 189 Tiriant ląstelių viduje esančius antigenus, būtina ląstelių membraną padaryti pralaidžią fluoroforais žymėtiems antikūnams. Tėkmės citometras yra pakankamai sudėtingas prietaisas, dirbti su tokiu prietaisu reikia specialaus pasiruošimo ir gerų įgūdžių. Tam, kad duomenys nekeltų abejonių, prietaisą reikia kalibruoti naudojant kontrolinius mėginius, t. y. prietaisui turi būti pasakoma, koks mėginys yra neigiamas, o koks teigiamas. Bet kuriuo atveju citometras gali būti kalibruojamas, naudojant nedažytas ląsteles, ir ląsteles, dažytas tik vienos spalvos fluorochromu, o sertifikuotiems medicininiams tyrimams naudojami specialūs mikrorutuliukai. Šiame prietaise, apšvietus tiriamųjų ląstelių srautą lazerio šviesa, išmatuojamas jų dydis, granuliuotumas, išspinduliuojamos bangos ilgis bei fluorescencijos intensyvumas (62 pav.). Duomenys, gauti tėkmės citometru, atspindi kiekvienos ląstelės santykinį dydį, citoplazmos granuliuotumą ir fluorescenciją. Srautinės citometrijos metodu surinkti duomenys apie tiriamojo mėginio ląsteles analizuojami panaudojant kompiuterines programas, kuriose duomenys pateikiami grafinių vaizdų pavidalu. Priklausomai nuo tyrėjo pasirinkimo ir turimos programinės įrangos duomenys gali būti vaizdinami paprastomis vienmatėmis histogramomis, taškinėmis dvimatėmis ar trimatėmis diagramomis, tankio diagramomis. Dažniausia naudojamos paprastos histogramos ar taškinės dvimatės diagramos. Taškinėse diagramose kiekviena registruota ląstelė pateikiama kaip taškas, kurio koordinatės X ir Y ašių atžvilgiu rodo šios ląstelės atitinkamos fluorescencijos ar šviesos sklaidos (tyrėjas pasirenka, kuri ašis, kokį parametrą atspindi) intensyvumą. Tolimesnei analizei diagramos gali būti suskaidytos į sektorius, jose išskiriami atskiri regionai, atitinkantys tam tikras ląstelių populiacijas ir pan. Tiek taškinėje diagramoje, tiek ir histogramose galima pažymėti norimas ląstelių populiacijas ir rezultatus įvertinti statistiškai, pvz., skaičiuojant tam tikrų ląstelių nuošimtį nuo visų ląstelių ar nuo tam tikros pažymėtos populiacijos, visų registruotų ląstelių skaičių, fluorescencijos intensyvumo vidurkį ir pan. Sveikos ląstelės savo paviršiuje turi daugybę žymenų, kurie kinta jai vystantis, diferencijuojant; skirtingų tipų ląstelės turi tik tam tipui būdingus žymenis, leidžiančius atskirti jas nuo kitų. Ląstelės vystymosi sutrikimai gali įvairiais būdais pažeisti žymenų raišką: vienų žymenų raiška pasidaro pernelyg intensyvi, o kitų slopinama. Tėkmės citometrijos metodas suteikia galimybę fenotipuoti ląsteles (nustatyti ląstelės fenotipą), tokiu būdu atskiriant sveikas ląsteles nuo pažeistų. Būtent ląstelių fenotipavimas ir yra pagrindinė tėkmės citometrijos taikymo sritis medicininėje praktikoje. Šiuo metodu diagnozuojamos mielomos, limfomos ir leukemijos; be to jis naudojamas gydymo būdui, vaisto veiksmingumui ir paciento būklei vertinti. Tėkmės citometrijos metodu pagal tam tikrus paviršiaus žymenis ištirtas sveikų žmonių ir

190 190 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI Ląstelių suspensija Filtrai Jutikliai Lazeriai Lęšiai Filtrai Rezultatų vaizdinimas Jutiklis 62 pav. Tėkmės citometro veikimo schema onkologinių ligonių kraujas gali labai ryškiai skirtis, pvz., žmonėms, kurių B limfocitai turi diferenciacijos antigeną CD3, bet neturi CD20, diagnozuojama B ląstelių leukemija arba limfoma; diagnozė gali būti patikslinama arba patvirtinama naudojant kitus ląstelių žymenis (63 pav.). Tam tikro bangos ilgio šviesos spindulys (lazerio spindulys) nukreipiamas į hidrodinamiškai sufokusuotą (analizuojamos dalelės išrikiuojamos taip, kad po vieną kirstų lazerio spindulį) skysčio srautą: keletas jutiklių išdėstomi aplink tašką, kuriame lazerio spindulys kerta skysčio srautą; vienas jų lazerio spindulio kryptimi (FSC jutiklis), kitas statmenai lazerio spindulio krypčiai (SSC jutiklis) ir keletas jutiklių (FL-1 FL-4), skirtų skirtingų bangos ilgių fluorescencijai fiksuoti; kiekviena skysčio sraute esanti mikrodalelė, kertanti lazerio spindulio kelią, išsklaido lazerio spindulio šviesą, o dalelės paviršiuje ar pačioje dalelėje esančios fluorescuojančios medžiagos gali būti sužadinamos lazerio šviesos ir išspinduliuoti tam tikro ilgio šviesos bangas; šviesos signalai verčiami elektroniniais signalais, o šie pertvarkomi į skaitmeninę formą; panaudojant kompiuterines programas, duomenys apie kiekvienos analizuojamos dalelės savybes pateikiami grafiniu pavidalu.

191 II Dalis XVI skyrius 191 Sveiki žmonės CD3 CD20 Leukemija sergantys žmonės Ląstelių skaičius Ląstelių skaičius CD3 CD20 63 pav. Sveikų ir sergančių leukemija žmonių limfocitų paviršiaus žymenų CD3 ir CD20 histogramos (gautos tėkmės citometrijos tyrimo metu) Sveiko žmogaus kraujyje yra pakankamas kiekis limfocitų, turinčių diferenciacijos antigeną CD3 (viršuje kairėje), o sergančio žmogaus kraujyje šių limfocitų nėra (apačioje kairėje). Limfocitų su diferenciacijos antigenu CD20 sveiki žmonės beveik neturi (viršuje dešinėje), o sergantys gana didelį kiekį Elektroninės mikroskopijos metodas Imunoelektroninė mikroskopija naudojama tais pačiais tikslais kaip ir imunofluorescentinė mikroskopija, tik šiuo atveju, naudojamas daug galingesnis elektroninis mikroskopas, o vietoje fluoroforais žymėtų antikūnų naudojami antikūnai, žymėti aukso dalelėmis. Naudojant skirtingo skersmens aukso

192 192 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI daleles vienu metu galima tirti kelis antigenus. Didžiausias šio metodo privalumas labai didelis jautrumas, tačiau reikalingi ypatingai ploni pjūviai. Nors imunohistochemijos (audinių) mikroskopinis tyrimo metodas remiasi tais pačiais principais kaip ir imunofermentinė analizė, tai yra imunofluorescentinės mikroskopijos alternatyva, kai fermentais žymėti antikūnai dėl fermentinės reakcijos nudažo audinių pjūviuose esančius antigenus. Audinių pjūviai ruošiami kaip ir fluorescencinei mikroskopijai. Antigenų buvimo vietai nustatyti audinyje šiuo atveju fluorescencinio mikroskopo nereikia. Dažniausiai naudojami antikūnai, žymėti krienų peroksidaze arba šarmine fosfataze, kurių substratiniai mišiniai iškrenta netirpiomis rudomis (peroksidazė) ar tamsiai mėlynomis ir raudonomis (fosfatazė) nuosėdomis, gerai matomomis šviesiniu mikroskopu. SANTRAUKA Metodai, kuriais galima tirti ląstelių paviršiaus molekules (ląstelių žymenis), suteikia daugybę informacijos apie ląstelių linijas, jų aktyvumo būseną, sukibimą, judėjimą, gebėjimą reaguoti į įvairius stimulus ar sąveikauti su kitomis ląstelėmis. Rozečių metodas vienas pirmųjų imunokompetentinių ląstelių tyrimo metodų. Juo galima nustatyti atskiras ląstelių rūšis: T limfocitus, B limfocitus. Metodas nereikalauja sudėtingos aparatūros ar griežtai specifinių žymenų. Fluorescentinėje mikroskopijoje naudojami fluorescentine žyme pažymėti antikūnai ir galima nustatyti antigenus, esančius ant ląstelių ir ląstelių viduje, branduolyje ar atskirose organelėse. Vaizdinimui epifluorescenciniais arba konfokaliniais fluorescenciniais mikroskopais naudojami fluoroforais žymėti antikūnai, atpažįstantys tiriamąjį objektą ląstelėje. Imunoelektroninė mikroskopija turi daug bendro su imunofluorescentine mikroskopija, tačiau naudojamas daug galingesnis elektroninis mikroskopas, o vietoje fluoroforais žymėtų antikūnų naudojami antikūnai, žymėti aukso dalelėmis. Tėkmės citometrijos metodas įgalina kiekybiškai išanalizuoti ir išrūšiuoti ląstelių populiacijas, pažymėtas fluoroforais žymėtais antikūnais (vienu ar keliais). Šis metodas suteikia galimybę vienu metu įvertinti daugelį atskiros ląstelės parametrų: ląstelių išorės ir vidaus molekulių raišką, įvairius ląstelių tipus heterogeninėse ląstelių populiacijose, išskirtų populiacijų grynumą, ląstelių dydį ir kiekį. Tokie kompleksiniai tyrimai galimi naudojant sudėtingą prietaisą tėkmės citometrą.

193 II Dalis 193 XVII skyrius 17. TRANSPLANTACIJA Transplantacija (persodinimas), kitaip tariant, ląstelių, audinių ar organų, vadinamų transplantatais, perkėlimas iš vieno individo (donoro) kitam individui (recipientui, šeimininkui). Skiriamos šios transplantacijos formos: autologinė transplantacija (autotransplantacija) tai persodinimo rūšis, kai donoras ir recipientas yra tas pats individas (pvz., odos, kaulų čiulpų persodinimas); transplantatas vadinamas autotransplantatu, o jo antigenai autoantigenais; izogeninė (singeninė) transplantacija (izotransplantacija) tai persodinimo rūšis, kai donoras ir recipientas yra identiški homozigotiniai dvyniai; transplantatas vadinamas izotransplantatu, o jo antigenai izoantigenais; alogeninė transplantacija (alotransplantacija) tai ląstelių, organų arba audinių persodinimas, kai donoras ir recipientas yra iš tos pačios rūšies, bet genetiškai skirtingi individai; transplantatas vadinamas alotransplantatu, o jo antigenai aloantigenais; ksenogeninė transplantacija ląstelių, audinių ar organų persodinimas, kai donoras ir recipientas priklauso skirtingoms biologinėms rūšims (pvz., žmogus ir bezdžionė, žmogus ir kiaulė); transplantatas vadinamas ksenotransplantatu, o jo antigenai ksenoantigenais (64 pav.) Transplantato atmetimo reakcijos Autotransplantacija ir izotransplantacija yra sėkmingiausios persodinimo rūšys, nes jų atveju transplantatas praktiškai neatmetamas. Šeimininko (recipiento) specifinis imuninis atsakas į donoro aloantigenus ar ksenoantigenus vadinamas transplantato atmetimu. Transplantato didžiojo audinių dermės komplekso (MHC) molekulės pagrindiniai transplantato aloantigenai. Žmogaus organizme tai yra HLA molekulės.

194 194 IMUNOLOGIJOS IR IMUNOTECHNOLOGIJOS PAGRINDAI a Autogeninis b d Izogeninis (genetiškai identiškas dvynys) c Ksenogeninis (kita rūšis) Alogeninis a autologinė transplantacija; b izogeninė transplantacija; c alogeninė transplantacija; d ksenogeninė transplantacija. 64 pav. Transplantacijos variantai Transplantato atmetimo reakcijos gali būti 2 tipų: reakcija šeimininkas prieš transplantatą tai recipiento imuninės sistemos reakcija prieš transplantatą, apimanti antikūnų gamybą ir ląstelinius mechanizmus prieš svetimus audinius ar organus; ši reakcija gali būti labai ūmi, ūmi ar lėtinė; labai ūmi šeimininko prieš transplantatą reakcija pasireiškia po transplantacijos praėjus kelioms valandoms, pvz., perpylus nesuderinamos grupės kraują; ūmi atmetimo reakcija pasireiškia po transplantacijos praėjus kelioms dienoms ar savaitėms, pvz., recipiento citotoksiniams T limfocitams sąveikaujant su transplantato MHC antigenais; lėtinė reakcija pasireiškia po transplantacijos praėjus 60 ir daugiau dienų, pvz., prieš silpnus audinių dermės komplekso antigenus; reakcija transplantatas prieš šeimininką (dažniausiai kaulų čiulpų) tai transplantato subrendusių T limfocitų reakcija į šeimininko antigenus; ši atmetimo reakcija vyksta, kai šeimininko imuninė sistema nuslopinta ir negali atmesti alogeninių transplantato ląstelių; izogeninės transplantacijos atveju reakcija transplantatas prieš šeimininką vystosi dėl donoro T limfocitų reakcijos į audinių dermės komplekso antigenus; atmetimo reakcija gali būti ūminė ir lėtinė; ūminė atmetimo reakcija pasireiškia epitelio nekroze odoje, tulžies latakuose ir virškinimo sistemoje, gelta ir viduriavimu;