Avtomatizirana analiza

Transcript

1 Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2011 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza ( ). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.

2 PRENOSNI MICROCOIL NMR SISTEM SKLOPJEN Z KAPILARNO ELEKTROFOREZO (Portable microcoil NMR detection coupled to capillary electrophoresis) SEMINARSKA NALOGA PRI PREDMETU AVTOMATIZIRANA ANALIZA Študentka: Eva Aljančič Mentor: prof. dr. Boris Pihlar Študijsko leto: 2010/2011

3 UVOD Kapilarna elektroforeza (CE) priklopljena na jedrski magnetno resonančni spektrometer (NMR) ponuja možnost ločiti, kemijsko opredeliti in zagotoviti strukturne informacije o analitih v majhnem volumnu vzorca. Prejšnji združeni CE-NMR sistemi uporabljajo laboratorijske magnete in spektrometre, ki zahtevajo zelo dolge ločitvene kapilare. Nov tehnološki razvoj v elektroniki je zmanjšal velikost NMR sistema in majhni trajni magneti zagotavljajo možnosti za resnično prenosno NMR. V tem delu je CE skupaj z NMR, ki vključuje microcoil sondo in 1.8 T trajni magnet za merjenje 19 F NMR spektrov. Ločitve fluoriranih molekul, so dokazali z neprekinjenim in prekinjenim tokom, raziskali so vplive difuzije, uporabnost majhnih vzorcev, vpliv koncentracije vzorca, injiciranja, Rezultati so pokazali, da je spenjanje CE z NMR izvedljiv v obliki prenosnega instrumenta s katerim lahko zagotovitovimo poceni dobljene strukturne informacije o mikrolitrih vzorca. OSNOVE KAPILARNA ELEKTROFOREZA Kapilarna elektroforeza je separacijska analizna metoda, pri kateri se komponente vzorca ločijo zaradi različne hitrosti potovanja v električnem polju v kapilari. Uveljavlja se kot dobra alternativa tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti in daje primerljive rezultate, hkrati pa za analizo porabi veliko manj vzorcev in topil. 1

4 Osnove elektroforezne ločitve Ločitev molekul pri kapilarni elektroforezi temelji na osnovah klasične elektroforeze. Nabite molekule, ki jih izpostavimo električnemu polju, potujejo k elektrodi z nasprotnim nabojem. Hitrost njihovega potovanja je odvisna od moči električnega polja, celokupnega naboja proteina ter zavornega koeficienta. Z elektroforezo ločimo delce z različnimi naboji, ker se razlikujejo njihove elektroforezne mobilnosti, kot tudi delce z enakimi naboji, če so različne velikosti ali oblike, ker nanje delujejo različne zavorne sile. Princip ločitve Ločitev analitov poteka v stekleni kapilari, napolnjeni z elektroforeznim pufrom, ob priključitvi visoke napetosti. Zaradi razlike v napetosti med anodo in katodo začnejo delci z nabojem potovati. Na njihovo potovanje pa vpliva še dodatni tekočinski tok, ki ga imenujemo elektroosmozni tok. Elektroosmozni tok nastane zaradi negativnega naboja silanolnih skupin ob steni kapilare, ki privlači katione, predvsem oksonijeve ione H30+. Ko priključimo napetost, začnejo hidratirani oziroma solvatirani kationi potovati proti katodi in s seboj potegnejo celotno raztopino. Elektroosmozni tok je pomemben pri vrednostih ph nad 3. Zaradi elektroosmoznega toka se molekule gibljejo neodvisno od naboja, v isto smer (običajno proti katodi), saj je elektroossmozni tok močnejši od elektroforezne mobilnosti molekul. Najhitreje se zato gibljejo majhni delci s pozitivnim nabijem, sledijo jim veliki delci s pozitivnim nabijem, nato nevtralni delci ti potujejo s hitrostjo elektroosmoznega toka in nazadnje še delci z negativnim nabojem. Elektroosmozni tok zmanjšamo s povečanjem ionske moči 2

5 ali viskoznosti pufra, z zmanjšanjem ph pufra, z dodatkom organskih topil (etanola, metanola, acetonitrila) ali zmanjšanjem napetosti. Kapilare Kapilare so osrednji element celotnega sistema, saj v njih poteka ločitev molekul. Najpogosteje so izdelane iz kremenčevega stekla, ki prepušča UVsvetlobo, je obstojno v širokem območju ph in nereaktivno. Zunanja stran je prevlečena s plastjo poliimida, ki zagotovi mehansko odpornost. Na končnem delu kapilare, kjer je t. i. detekcijski mehurček, je poliimidna zaščita odstranjena. Pufer Vrsta in koncentracija delovnega pufra sta velikega pomena za uspešno ločitev molekul. Najpogosteje gre za raztopine anorganskih soli v vodi, to sta na primer fosfatni in boratni pufer, ki jim lahko dodamo površinsko aktivne snovi, organske modifikatorje ali kiralne spojine. Pri izbiri pufra moramo upoštevati topnost in stabilnost molekul iz vzorca v pufru. NMR Jêdrska magnétna resonánca je fizikalni pojav, ki opisuje interakcijo magnetnih momentov atomskih jeder z elektromagnetnim poljem s frekvenco enako lastni frekvenci jeder. Pri tem merimo magnetne lastnosti snovi posredno, prek absorbiranega in izsevanega elektromagnetnega sevanja. Delovanje jedrske magnetne resonance Vzorec vstavimo v statično magnetno polje. Tuljava obseva vzorec z radijskimi valovi. Pri določeni frekvenci atomska jedra v vzorcu absorbirajo valovanje in 3

6 ob tem preidejo iz osnovnega v vzbujeno stanje. Po določenem času se jedra vrnejo v osnovno stanje in ob tem izsevajo elektromagnetno valovanje, kar zaznamo s tuljavo. Merimo lahko, kolikšen del prejete energije so jedra izsevala nazaj, ter po kolikšnem času. Za poskus z jedrsko magnetno resonanco potrebujemo jedra, ki imajo od nič različen magnetni moment. Takšna jedra morajo imeti liho število protonov ali nevtronov, npr. 1 H, 2 H, 13 C, 15 N, 31 P, 19 F. EKSPERIMENTALNI DEL Slika 1: a) Shema CE-NMR sistema (b) CE (1) in ločevalna kapilara (2) priklopljena na prenosni microcoil NMR sistem z magnetom 1,8 T (3), doma narejeno sondo za določanje položaja (4), in spektrometerom (5). 4

7 Za ločitev treh fluoriranih snovi DFA,TFA,PFPAso za matriko uporabili 5mM o- ftalne kisline in 0,27mM HTAB. UGOTOVITVE Vpliv napetosti Napetost med ločevanjem na CE slabo vpliva na NMR signal. Sweedler je pokazal kako drugo magnetno polje, ki ga povzroča elektroforezni tok v CE kapilarah izkrivlja homogenost magnetnega polja pri RF tuljavah. Ta efekt povzroča črtno razširitev in slab SNR in NMR signal. Za odpravo tega efekta so med pridobivanjem NMR podatkov izklopili napetost in poskusi so bili izvedeni v načini prekinjenega toka z mobilizacijo prek tlaka ali napetosti. Pri poskusih prekinjenega toka je napetost izklopljena za določeno časovno obdobje.to je do tedaj ko analit doseže NMR mikro tuljavo in je omogčeno ponovljivo NMR skeniranje. Difuzija in premik vzorca Med ustavitvijo napetosti so povzročali skrb difuzijski učinki predvsem zaradi uporabe večje kapilare. Te učinke difuzije so raziskovali z hidrodinamičnim injiciranjem vzorca TFA in z omogočenjem da se vzorec nekaj časa zadrži v kapilari pred UV/VIS analizo. Po injiciranju vzorca so napetost izkloplili tik preden bi vzorec dosegel UV/VIS detektor in sicer za 2minuti. Postopek so nato ponovili v različnih periodah (0,1 in 5min). Opazili so dve stvari, ki sta predstavljeni na sliki 2a. Ti rezultati kažejo da je uporabljen pritisk koristen zaradi počasnejšega pretoka vzorca skozi kapilaro, kar bi lahko omogočilo več NMR skenov pridobljenih z neprekinjeno-tlak-pretok metodo. Poleg tega ni opaziti večjih difuzijskih 5

8 razširitev pri različnih ustavljanjih na podlagi širine vrhov.višina vrha je dokaz o difuziji, saj je povezana s koncentracijo, zato so jih primerjali med seboj. Višine pri 0,1,5 min poteka se spremenijo za 3%,kar pomeni da so učinki difuzije pri prekinjenem toku minimalni in nebi smeli biti problem. Zato ker difuzijski učinki niso problem ni bojazni za daljše analize NMR. Kot alternativa je za premik vzorca v NMR tuljavo uporabljen pritisk, napetost pa se lahko uporablja za natančno določitev pozicije vzorca z izmeničnim preklapljanjem pozitivne in negativne polarnosti. Slika 2 a) Elektropherogram za 2,85 mm vzorec TFAz uporabljeno napetostjo skozi celoten postopek (modra), uporabljena napetost za 2min nato pa sledi prekinitev v različnih časovnih intervalih še preden vzorec zapusti kapilaro z pomočjo 50 mbarskega pritiska ( prekinitev za 0min rdeča, 1minzelena,5min-vijolična) b) Vzorec TFA je bil dopiran z 0.5mM DFA (* vrhov); izmenično preklapljanje polarnosti (20 kv, 4 s injiciranje s 40 mbar), je označeno z rdečo barvo 6

9 Na sliki 2b je prikazan elektroferogram ločitve vzorca TFA(2,85mM) dopiranega z DFA z preklapljanjem polaritete glede na pozicijo vzorca v kapilari.dfa je bil uporabljenv majhni koncentraciji (0,3mM) za vizulizacijo spreminjanja smeri pretoka vzorca.(najprej z negativno napetostjo dobimo velik vrh za TFA, sledi mu majhen vrh DFA) Po 3,2min napetosti smo polariteto reklopili na pozitivno, tako da analiti migrirajo v obratni smeri (majhnemu vrhu DFA sledi velik vrh TFA).TFA vzorec prvi pade na detektor pri 2,9min in pri 3,5min. Ko smo napetostno polariteto zamenjali pri 5min je detektor zaznal analit tretjič, vidimo velik vrh ki mu pri 6,5 sledi manjši vrh DFA. Zaznavni časi nam pokažejo da je spreminjanje točke polarnosti vedno zrcalno vrhu vzorca, kot je za pričakovati. S tem lahko manipuliramo s položajem. Poleg tega ni difuzijskega razširjenega vrha in višina in širina se razlikujeta za manj kot 2% oz. 5%.Ti rezultati kažejo da je uporaba napetosti za pozicijo vzorca bolj obvladjiva in natančnejša od tlaka, saj izmenična napetost ne povzroča sprememb v hitrosti kot se to zgodi pri tlaku. Tako UV/VIS absorpcijski podatki kažejo da uporaba pritiska ali sprostitev elektroforeznega položaja ne bi smele škodljivo vplivati na širino vrha vzorca. Volumen vzorca Drugi vidik pri obravnavi ravnotežja med CE in NMR zagotavlja dovolj vzorca za NMR detekcijo, medtem ko je možno doseči popolno kemično ločevanje prek CE. Pomebna potreba po visoki občutljivosti NMR je čim večji faktor polnjenja ali povečanje volumna vzorca znotraj NMR opazovanega volumna tuljave do maksimalnega zaznavnega jedrskega spina. Za normalno CE ločevanje so ponavadi uporabljene µm kapilare. Pri tem delu pa so bile uporabljene 200µm kapilare, ki zagotavljajo večji polnilni faktor tuljave in povečajo NMR občutljivost na račun izgube pri CE ločitiveni resoluciji zaradi Joulovega učinka 7

10 segrevanja. Ta sistem ima zmanjšan tuljavski faktor polnjenja, prednost tega modela pa je preprosta zamenjava CE ločitvene kapilare. Koncentracija vzorca Poleg povečanja kapilare je potrebno pri NMR zagotoviti čim večjo koncentracijo vzorca ki se lahko zazna s prenosnim NMR v kratkem času pridobitve. Mikro tuljave z zmanjšanim premerom in manjšo težo imajo večjo masno občutljivost kot RF tuljave ki so uporabljene pri konvencionalni analizi pri NMR-ju. Če želimo izkoristit manjše SNR, ki jih ponujajo manjše RF tuljave, pa mora biti sredstvo, s katerim se lahko vnese maso vzorca, manjše prostornine kot mikro tuljava in pri tem mora biti št.resonančnih jeder konstatno. Za vzdrževanje občutljivosti mase se mora koncetracija vzorca povečati,volumen tuljave pa zmanjšati. CE-NMR analiza nam ponuja številne prednosti kot so kemijsko ločevanje, koncetracija in speciacija kakor tudi dodatne analize vzorcev. Obstaja precejšnje neskladje med koncentracijami potrebnih za pridobitev zadostne SNR v prenosnem NMR z uporabo mikro tuljavskih detektorjev v nižjem področju, magnetov nižje resolucije kot so opisani in uporabljene pri tem eksperimentu. Eden od izzivov pri delu z visokimi koncentracijami je interpretacija UV/VIS podatkov. To je posebno izrazito kadar ima vzorec majhno absorptivnost pri majhnih valovnih dolžinah. 8

11 Slika 3 3,56 M TFA vzorca z 5 mm pufrom ftalne kisline, kot BGE, pri 30 mbar pritisku in 4 s injiciranje s 40 mbar: (a) electropherograms vrha TFA pri različnih valovnih dolžinah (zelena-214 nm, rdeča-254 nm, modra- 280 nm), (b) rekonstrukcija istega dvojnega vrha zastopanega v (a) z uporabo različnih eksperimentov, 0,65 M TFA raztopljen v vodi (modra), 0,66 M TFA raztopimo v BGE (rdeča), in 3,56 M TFA raztopljen v BGE (zelena). Kot je npr.videti na sliki 3a kjer 3,56 M vzorec potisnemo skozi kapilaro z 30mbar tlakom in dobimo nepričakovane oblike vrhov pridobljenih pri različnih UV/VIS valovnih dolžinah. Pri daljših valovnih dolžinah (254 in 280nm)dobimo signal TFA pričakovane oblike. Pri 214nm pa so dobili dvojni vrh. Absorpcijski spekter čistega TFA izmerjen v kapilari je dosegel najvišjo molarno absorptivnost 420 dm 2 mol -1 pri nizki valovni dolžini ( nm) in se nato postopoma zmanjšal na 0,01 dm 2 mol -1 pri 220nm. Elektroferogrami na sliki 3a so pokazali kako ima lahko absorpcija TFA pri krajših valovnih dolžinah za 9

12 posledico dvojni vrh, ki se zdi kot prekrivanje dveh Gaussovih krivulj, eden ima negativno absorpcijo drugi pa pozitivno v primerjavi z ozadjem elektrolita. Slika 3b nam prikazuje razlike v absorbanci mešanice TFA-voda kjer dobimo pozitiven vrh za TFA medtem ko za TFA-ozadje dobimo negativen vrh TFA. Dvojni vrh je bil vsota teh različnih absorpcijskih koeficientov kot je razvidno iz zelene sledi na sliki. Čeprav je UV/VIS direktna detekcija najbolj občutljiva pri 214 nm z pufrskim sistemom bi to lahko pri višjih koncentracijah povzročilo zmedo kar pa ne bi bilo opazno pri NMR detekciji. Prekinjen in neprekinjen pretok Za pridobitev NMR spektrov je potrebno po ločitvi CE izklopiti napetost, medtem ko se prenašajo podatki, saj s tem preprečimo široko linijo. Če želimo prikazati metodo prekinjenega toka uporabimo 1,8M TFA in 0,6M PFPA in ju elektrokinetično vbrizgamo na 150cm dolgo ločitveno kapilaro (30kV za 30s). Slika 4 (a) Elektroferogram za 1,8 M TFA in 0,6 M PFPA z negativnim elektrokinetičnim injiciranjanjem (30 kv in 30 s) z uporabo 5 mm ftalne kisline, ph 5,3 in pri tlaku 30 mbar (modra) in kombinirani napetostno-tlačni postopek (rdeča) v 200-id μm kapilari, dolžine 150 cm. (b) SNR od 19 F NMR spektrov (32 skenov, 8,2 mikrosekund širino impulza) v TFA (zeleni kvadrat), PFPA (rdeč krogec), in TFA-PFPA mešanica (modra) 10

13 Na slik 4a nam modra sled UV/VIS predstavlja posledico stalnega pritiska 30 mbarov in s tem mobilizacijo analita, ki so bili delno ločeni pri elektrokinetičnem injiciranju skozi preostanek kapilare. Uporaba tlaka na daljši čas poskusa je priporočljiva pri večjih kapilarah in višjih koncentracijah analita, zaradi Joluovega segrevanja. Boljša ločitev vzorca je bila dosežena z 15kV napetostjo za 1,5 min takoj po injiciranju in hkrati z stalnim pritiskom 30 mbar dokler vzorec ne zapusti kapilare. Napetost je bila uporabljena v nasprotni smeri kapilarnega toka tako da so bili vrhovi skupaj in ločeni (rdeča). Tlačnonapetostna kombinacija pri eksperimentu je pokazala izbolljšanje glede tlaka in koncentracije vzorca. Zgoraj tlačno napetostno metodo so uporabili pri naslednjem poskusu z TFA in PFPA vzorci. Metodo CE so občasno prekinili da so lahko skenirali podatke za NMR. SNR signali in oblike vrhov so bili uporabljeni pri določitvi dveh ločenih snovi v spektru. Na sliki 4b vidimo SNRs za NMR vrhove v odvisnosti migracijskega časa. Barve v spektru predstavljajo dve različni substanci, TFA je zelen, PFPA pa rdeč, modra barva pa predstavlja mešanico TFA in PFPA, kar pa kaže na to da analita še nista popolnoma ločena. Ta nepopolna ločitev vzorca se preverja z UV/VIS CE elektroferogramom na sliki 4a. Prekrivanje vrhov je lahko posledica difuzije pri ponavljajočem prekinjanju pretoka in tlačno mobilizacijo. Referenčni spektri posameznih spojin, TFA in PFPA so bili pridobljeni za primerjavo s spektri z tlačno napetostno metodo neprekinjenega toka separacije vzorčne mešanice. Ob koncu poskusa je bila zaznana čista snov PFPA, kar predvidevamo zaradi dveh NMR vrhov z razmerjem višin 3:6 kar ustreza referenčni strukturi PFPA. Ti predhodni rezultati kažejo da so podatki pridobljeni z NMR skladni z podatki pridobljeni z UV/VIS metodo. Separacije so bile dosežene z napetostjo uporabljeno na 11

14 začetku za 1,5 min, nato pa je bil vzorec mobiliziran na detektor NMR z uporabo konstantnega tlaka (50 mbar). Ker je pritisk povzročil da je tok bistveno počasnejši od elektrokinetičnega pretoka, to pomeni da je čas primeren za analizo NMR. Injiciranje Slika 5 Kaže rezultate dveh različnih načinov injiciranja, elektrokinetičnega in hidrodinamičnega. Elektrokinetska metoda kaže on-column CE predkoncentracijski efekt in pristransko injiciranje vzorca kar je razvidno iz slike 5 na levi strani, kjer se vidi pomembno razliko v obliki vrhov in njihovi višini. UV/VIS vrh od TFA ki se je prvi izločil ima 2,3x večjo ploščino ko uporabimo elektrokinetično injiciranje. V primerjavi z vrhom TFA pa se je v primeru PFPA vrha plošična povečala za 1,5x, kar kaže da pri elektrokinetičnem injiciranju prednostno predkoncentriranje zelo bremeni majhne in bolj mobilne molekule TFA v primerjavi z večjimi manj mobilnimi PFPA, kar pa je v skladu s teoretičnimi predpostavkami. Online NMR spektre smo pridobili z neprekinjenim pretokom CE, kar je tudi prikazano. 19 F spektri NMR nam pokažejo da se lahko s to metodo pridobi čiste TFA in PFPA signale(slika 5 desno). Različne barve TFA in PFPA predstavljano NMR skane v času gibanja skozi tuljavo. Elektrokinetična predkoncentracija je vidna v UV/VIS 12

15 elektroferogramu, kjer se odraža v NMR SNR vrednostih, kjer tlačno injiciranje kaže nižje vrednosti SNR od elektrokinetičnega injiciranja (vidno na sliki 5). SNR vrednosti za TFA so približno 2x večje za elektrokinetično injiciranje od tistih z tlačnim injiciranjem. Za PFPA je ta razlika 1,3-kratna. Ti rezultati kažejo da tako NMR kot CE dajeta enako kakovostne rezultate z neprekinjenim tokom ali prekinjenim tokom. ZAKLJUČEK To je prvi dokaz združene CE in NMR ki ponuja stroškovno učinkovit sistem za pridobitev strukturne informacije o vzorcih in ki je koristen za farmacevtsko in okoljsko področje. Vse to je izvedljivo pri zelo strogih ločitvenih pogojih pri CE. V teh poskusih dokazovanja koncepta jim je uspelo izločiti strukturne informacije iz NMR spektrov v primerjavi z UV/VIS elektroferogramov ter 19 F spektrov. Nadalen razvoj v visoki magnetni ločljivosti in višji jakosti magnetnega polja bo izboljšal RF občutljivost kar bo v korist CE separaciji in NMR strukturnim pojasnevanjem z znižanjem zahtevanih koncentracij vzorcev. Da bi izboljšali sistem CE-NMR bi bilo potrebno da bi imeli stalno napetost pri ločitvi medtem ko se podatki prenašajo do NMR-ja. Hergenr je pokazal spenjanje CE z NMR z uporabo NMR tuljave, ki omogoča stalno napetost med pridobivanjem NMR podatkov, saj le ta ustvarja magnetno polje pravokotno na B0 področje. Tako ne povzroči nehomogenosti prostora kjer je vzorec, za razliko od sedanje magnetne tuljave. 13

16 VIRI Anal. Chem. 2011,83, : Portable Microcoil NMR Detection Coupled to Capillary Electrophoresis JOANA DIEKMANN, KRISTL L. ADAMS, GREGORY L. KLUNDER, LEE EVANS, PAUL STEELE, CARLA VOGT, AND JULIE L. HERBERG. 14