Εισαγωγή 1. Λύματα κοπρανώδους προέλευσης και παράκτια ύδατα

Transcript

1

2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω ευχαριστίες πρωτίστως στην επιβλέπουσα καθηγήτρια Μ.Α. Ευστρατίου για την διεξαγωγή της παρούσας ερευνητικής προσπάθειας αλλά και στην εξεταστική επιτροπή Γ. Κόκορη και Μ. Καραντανέλλη για την κριτική ανάγνωση του κειμένου. Επίσης, πρέπει να ευχαριστήσω τους συνεργάτες στη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας Χριστίνα και Βαγγέλη για την πολύτιμη βοήθεια τους και την άψογη συνεργασίας μας. Ευχαριστώ και την κ. Ν. Αλεξίου για την σημαντική βοήθεια της στο εργαστηριακό κομμάτι της εργασίας αυτής. Τέλος, ευχαριστώ τους γονείς μου και τους φίλους για την αμέριστη βοήθεια και συμπαράσταση τους κατά την διάρκεια των φοιτητικών μου χρόνων.

3 Περιεχόμενα Περίληψη. 1 Εισαγωγή 1. Λύματα κοπρανώδους προέλευσης και παράκτια ύδατα Δείκτες μικροβιακής μόλυνσης Πηγή κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών Νομοθεσία Επιβίωση και επίδραση των περιβαλλοντικών παραμέτρων Σκοπός της ερευνάς 7 Υλικά και Μέθοδοι 1. Περιοχές μελέτης και δειγματοληψία Δημιουργία μικρόκοσμου Εργαστηριακοί χειρισμοί Ανάλυση δεδομένων 12 Μετασχηματισμός δεδομένων. 12 Δοκιμασία Kolmogorov Smirnov. 12 Μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης και συσχετίσεις. 12 Δοκιμασία Mann Whitney 13 Πολυδιάστατη Ανάλυση.. 13 Λογισμικά πακέτα εργασίας 15 Αποτελέσματα 1. Γενική περιγραφή Γραμμικό μοντέλο επιβίωσης των Κοπρανωδών Κολοβακτηριοειδών.. 23 Συσχέτιση των κολοβακτηριδίων και των ημερών επιβίωσης τους 3. Μοντέλο Γραμμικής Παλινδρόμησης της Επιβίωσης των Μικροοργανισμών Ρυθμός θνησιμότητας και παράγοντες που την καθορίζουν Πολυδιάστατη Ανάλυση των Κοπρανωδών Κολοβακτηριοειδών..30 Συζήτηση Βιβλιογραφία.. 33 Παράρτημα. 37

4 Περίληψη Η επίδραση των περιβαλλοντικών συνθηκών στην επιβίωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών (FC) στο θαλάσσιο περιβάλλον αποτέλεσε τον κύριο στόχο της παρούσας έρευνας. Μέσω εργαστηριακής προσομοίωσης εξομοιώθηκαν οι περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν στην Βόρεια Θάλασσα και στα νερά της Μεσογείου και μετρήθηκε η θνησιμότητα των FC. Πιο συγκεκριμένα ελέγχθηκε η θνησιμότητα φυσικού πληθυσμού κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών (FC): i. Σε συνάρτηση με θερμοκρασία, αλατότητα, έκθεση σε φωτεινή ακτινοβολία ii. Σε σχέση με την παρουσία φυσικού πληθυσμού μικροοργανισμών του θαλάσσιου περιβάλλοντος Τα αποτελέσματα που προέκυψαν φανέρωσαν ότι τα FC επέζησαν από επτά μέχρι και δέκα ημέρες ενώ η θνησιμότητα τους δεν φάνηκε να διαφοροποιείται σημαντικά μεταξύ των συνθηκών της Βόρειας Θάλασσας και της Μεσογείου. Ωστόσο, η θνησιμότητα των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών διαφοροποιήθηκε σημαντικά από την χρήση διηθημένου νερού κατά την πειραματική διαδικασία μεταξύ των δυο περιοχών. Η πολυμεταβλητή ανάλυση του αριθμού των αποικιών των FC έδειξε ότι η διήθηση του νερού είχε σημαντικότερη επίπτωση στην επιβίωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στις συνθήκες της Βόρειας Θάλασσας. Συμπέρασμα της εργασίας είναι ότι: i. Ο συνδυασμός των περιβαλλοντικών παραγόντων και συγκεκριμένα αυξημένη θερμοκρασία κατά C, αυξημένη αλατότητα κατά 7 ο / οο και μειωμένος χρόνος έκθεσης των δειγμάτων στην ηλιακή ακτινοβολία κατά 2 ώρες, δεν επηρέασε την θνησιμότητα των FC, των οποίων ο πληθυσμός μειώνεται σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα σε 7-9 ημέρες. ii. Η θνησιμότητα των FC επηρεάστηκε από την παρουσία φυσικού πληθυσμού μικροοργανισμών του θαλάσσιου περιβάλλοντος. Στις συνθήκες της Βόρειας Θάλασσας η απομάκρυνση του φυσικού πληθυσμού μικροοργανισμών του θαλάσσιου περιβάλλοντος παράτεινε την επιβίωση των FC στο θαλασσινό νερό κατά 2 ημέρες (από 6-7 σε 8-9 ημέρες). Στις συνθήκες της Μεσογείου η απομάκρυνση του φυσικού πληθυσμού μικροοργανισμών δεν επηρέασε την χρονική παραμονή των FC στο θαλασσινό νερό (8-9 ημέρες).

5 Εισαγωγή 1. Λύματα κοπρανώδους προέλευσης και παράκτια ύδατα Η εκροή λυμάτων αποτελεί ένα σημαντικό πρόβλημα που αντιμετωπίζει ο αστικός κόσμος εξαιτίας της διαρκούς αύξησης του πληθυσμού που κατοικεί στην παράκτια ζώνη, η οποία φιλοξενεί το 60% του συνολικού πληθυσμού του πλανήτη. Συνεπώς, τα αστικά υγρά λύματα θεωρούνται ως μια σημαντική απειλή που δέχεται το παράκτιο περιβάλλον σε παγκόσμια κλίμακα (GPA, 2001). Οι ποικίλες πιέσεις που δέχονται τα παράκτια ύδατα έχουν συνέπειες που σχετίζονται τόσο με την οικολογική κατάσταση των οικοσυστημάτων όσο και με την δημόσια υγεία καθώς η εκροή αστικών λυμάτων μπορεί να οδηγήσει στην εισαγωγή υψηλών φορτιών θρεπτικών, επικίνδυνων χημικών ουσιών και επιβλαβών παθογόνων μικροοργανισμών στο θαλάσσιο περιβάλλον (Owili, 2001). Η επίδραση των αστικών λυμάτων, και ιδιαίτερα αυτών που περιέχουν κοπρανώδεις ρύπους, στα επιφανειακά παράκτια ύδατα αποτελεί μια εκτενώς μελετημένη θεματική ενότητα (π.χ. Erin et al., 2001; GESAMP, 2001 και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Οι πιθανές ανεπιθύμητες επιπτώσεις της εκροής των υπονόμων και των υπόλοιπων αστικών ή και κτηνοτροφικών εκροών στην ποιότητα των υδάτων ποικίλουν και εξαρτώνται από τον όγκο της απορροής, την σύνθεση των λυμάτων (π.χ. περιεκτικότητα σε βαρέα μέταλλα, οργανοχλωριομένες ενώσεις) και την περιεκτικότητα τους σε λύματα. Ωστόσο, η έκταση και η ένταση των επιπτώσεων αυτών ρυθμίζεται και από τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των υδάτων που δέχονται τα λύματα και διαφέρει από περιοχή σε περιοχή (Nemerow & Dasgupta, 1991). Οι επιπτώσεις που προκύπτουν από την βακτηριακή ρύπανση αφορούν κατά κύριο λόγο την ανθρώπινη δημόσια υγεία ενώ δευτερογενώς μπορούν επίσης να λάβούν οικονομικές και κοινωνικές διαστάσεις. Για παράδειγμα, η ύπαρξη παθογόνων μικροοργανισμών στα παράκτια νερά καλλιέργειας εδώδιμων διηθηματοφάγων δίθυρων μπορεί να έχει επικίνδυνες συνέπειες καθώς τα δίθυρα αυτά (π.χ μύδια, στρείδια) βιοσυσσωρεύουν τα βακτήρια στην σάρκα τους και καταναλώνονται τελικά από τον άνθρωπο (Prieur et al., 1990). Σημαντική επίπτωση της παρουσίας παθογόνων μικροοργανισμών στην στήλη του νερού αποτελούν και οι ασθένειες που προκαλούνται από την επαφή των κολυμβητών με μολυσμένα ύδατα. Επιδημιολογικές έρευνες έδειξαν ότι υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ του μικροβιακού φορτίου και των γαστρεντερικών λοιμώξεων που καταγράφηκαν σε

6 κολυμβητές (Cabelli et al., 1982). Τα παράκτια ιζήματα μπορούν επίσης να περιέχουν σημαντικό αριθμό βακτηριακού φορτίου κοπρανώδους προέλευσης το οποίο συσσωρεύεται στην σάρκα των ιζηματοφάγων βενθικών οργανισμών και στην συνέχεια εισάγεται στην τροφική αλυσίδα και καταλήγει σε προϊόντα κατανάλωσης όπως τα ψάρια (Erin et al., 2001). 2. Δείκτες μικροβιακής μόλυνσης Στην Ευρωπαϊκή Ένωση οι χρησιμοποιούμενοι δείκτες της κοπρανώδους ρύπανσης στο υδάτινο περιβάλλον είναι τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή (faecal coliforms) και οι εντερόκοκκοι (enterococci) (EU, 2006). Η ιδέα της χρήσης των FC ως δείκτες της μικροβιακής ποιότητας των νερών βασίζεται στο ότι βρίσκονται σε υψηλές αφθονίες στα κόπρανα των ανθρώπων και των θερμόαιμων ζώων και όταν υφίσταται κοπρανώδης ρύπανση υπάρχει μεγάλη πιθανότητα τα βακτήρια αυτά να είναι παρόντα. Συνήθως τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή δεν θεωρούνται επικίνδυνα για την ανθρώπινη υγεία ωστόσο η παρουσία τους υποδηλώνει την πιθανή ύπαρξη παθογόνων μικροοργανισμών. Επίσης τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή δεν απαντώνται σε κανένα περιβάλλον ως γηγενής κάτοικοι εκτός από τον γαστρεντερικό σωλήνα των ανθρώπων και των ζώων και έτσι ενισχύεται ακόμα περισσότερο η αξία τους ως δείκτες κοπρανώδους ρύπανσης (Edberg et al., 2000). Οι εντερόκοκκοι αποτελούν ακόμα μία ομάδα βακτηρίων που συχνά χρησιμοποιούνται αντί των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών καθώς και αυτοί βρίσκονται στον γαστρεντερικό σωλήνα των ανθρώπων και των θερμόαιμων ζώων (Gleeson & Gray, 1997). Γενικά, οι εντερόκοκκοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες κοπρανώδους ρύπανσης παρόλο που ορισμένοι μπορούν περιστασιακά να υπάρξουν και ως κάτοικοι άλλων περιβαλλόντων. Υπάρχουν ενδείξεις ότι τα ολικά κολοβακτηριοειδή δεν αποτελούν ευαίσθητο δείκτη της ύπαρξης παθογόνων μικροοργανισμών. Αντίθετα οι εντερόκοκκοι έχουν αρκετά πλεονεκτήματα έναντι των ολικών κολοβακτηριοειδών καθώς δεν αναπτύσσονται στο θαλάσσιο περιβάλλον (WHO, 1993) και επιβιώνουν περισσότερο (McFeters et al., 1974). Επίσης, αν και βρίσκονται σε μικρότερες αφθονίες από τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή στα κόπρανα, μπορούν να εντοπισθούν και μετά από σημαντικές αραιώσεις. Ωστόσο, υπάρχει κάποιος προβληματισμός στην χρήση τους καθώς οι εντερόκοκκοι είναι μια

7 ομάδα με υψηλή ποικιλότητα ειδών και η παρουσία τους στο θαλάσσιο περιβάλλον δεν σχετίζεται απαραίτητα με την ύπαρξη κοπρανώδους ρύπανσης. Για παράδειγμα ο εντερόκοκκος Enterococcus faecalis var liquefaciens βρέθηκε σε νερά στα οποία δεν υπήρχαν παθογόνοι οργανισμοί (Geldreich, 1970) ενώ σε μία άλλη περίπτωση το 16% των εντερόκοκκων που συλήθηκαν από ρυπασμένα ύδατα δεν ήταν είδη που συνδέονται με κοπρανώδη ρύπανση (Pinto et al., 1999) 3. Πηγή κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών Η ύπαρξη των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στο θαλάσσιο περιβάλλον οφείλεται κατά κύριο λόγο στην απορροή λυμάτων χερσογενούς προέλευσης. Πιο συγκεκριμένα, τα αστικά και κτηνοτροφικά λύματα που προέρχονται από αστικές περιοχές και κτηνοτροφικές μονάδες συνήθως περιέχουν μεγάλο αριθμό βακτηριακών ειδών σε υψηλές αφθονίες (Vilanova et al., 2002). Επίσης, το γενικότερο υδρογραφικό δίκτυο απορροής της χέρσου (π.χ. ποτάμια, χείμαροι) μπορεί να μεταφέρει κοπρανώδης ρύπους (κτηνοτροφικές δραστηριότητες, χωριά και κωμοπόλεις) από τα ενδότερα χερσαία τμήματα στο θαλάσσιο περιβάλλον (GPA, 2001). 4. Νομοθεσία Η μικροβιολογική ποιότητα των παράκτιων υδάτων διαφυλάσσεται από κατάλληλο νομοθετικό πλαίσιο καθώς τα παράκτια νερά φιλοξενούν μια σειρά από ανθρώπινες δραστηριότητες που αφορούν την χρήση των υδάτων είτε για αναψυχή (π.χ. κολύμβηση) είτε για οικονομικές επενδύσεις (π.χ. υδατοκαλλιέργειες). Οι παραπάνω δραστηριότητες συνδέονται άμεσα ή έμμεσα με την δημόσια υγεία και οι περισσότερες διεθνείς οδηγίες για την ποιότητα των υδάτων χρησιμοποιούν τους βακτηριακούς δείκτες ως ένδειξη της μικροβιακής ποιότητας των νερών. Τόσο η διεύθυνση περιβαλλοντικής προστασίας των ΗΠΑ (USEPA) όσο και η Ευρωπαϊκή Ένωση χρησιμοποιούν τα κολοβακτηρίδια για την αποτύπωση της μικροβιακής ποιότητας των υδάτων. Πιο συγκεκριμένα η Ευρωπαϊκή Ένωση έχει θεσπίσει την Oδηγία για το νερό (Water Framework Directive 2000/60/EC) (EU, 2000) η οποία εγκαθιδρύει το πλαίσιο της προστασίας των εσωτερικών υδάτων, των μεταβατικών υδάτων, των παράκτιων υδάτων και των υπόγειων υδάτων με σκοπό την προώθηση της αειφόρου χρήσης του νερού κάτω από το πρίσμα της μακροχρόνιας προστασίας των διαθέσιμων υδάτινων πόρων (Glykogianni, 2002). Τα παράκτια νερά

8 κολύμβησης θεωρούνται ως προστατευμένες περιοχές από την Water Framework Directive. Η οδηγία για τα νερά κολύμβησης (EU Bathing Water Directive 2006/7/EC) προβλέπει ότι η συγκέντρωση των κολοβακτηριδίων και ιδιαίτερα της Escherischia coli δεν θα πρέπει να ξεπερνά τα 250 cfu/100ml ώστε τα νερά να χαρακτηρίζονται ως εξαιρετικής ποιότητας ή τα 500 cfu/100ml ώστε τα νερά να χαρακτηρίζονται ως ικανοποιητικής ποιότητας (EU, 2006). 5. Επιβίωση και επίδραση των περιβαλλοντικών παραμέτρων Η επιβίωση των εντεροβακτηρίων (enteric bacteria) έχει αποτελέσει θέμα σημαντικών μελετών και συζητήσεων τα τελευταία χρόνια με έμφαση στους πιθανούς κινδύνους στην δημόσια υγεία που προκύπτουν από την εκροή λυμάτων στα παράκτια ύδατα (Alkan et al., 1995). Σημαντική ερευνητική δραστηριότητα στην θεματολογία αυτή έχει σημειωθεί στο παρελθόν με επίκεντρο τους περιβαλλοντικούς παράγοντες που πιθανώς επηρεάζουν την επιβίωση των πληθυσμών των δεικτών κοπρανώδους ρύπανσης (π.χ. Escherichia coli και enterococci) με σκοπό την εκτίμηση της απόκρισης των βακτηριακών πληθυσμών στο υδάτινο περιβάλλον. Τα κολοβακτηρίδια φαίνεται να παρουσιάζουν υψηλή θνησιμότητα όταν εισέρχονται στο θαλάσσιο περιβάλλον ενώ η χρονική διάρκεια επιβίωσης τους ποικίλει από λίγες ώρες μέχρι και μερικές μέρες (Šolić & Krstulović, 1992). Η παρατηρούμενη ανομοιογένεια της διάρκειας επιβίωσης των μικροοργανισμών στο θαλάσσιο περιβάλλον αποδίδεται κυρίως στις διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν στα θαλάσσια οικοσυστήματα που βρίσκονται σε διαφορετικές γεωγραφικές τοποθεσίες. Μεταβολές των περιβαλλοντικών συνθηκών μπορεί επίσης να καταγράφονται και μέσα στο ίδιο θαλάσσιο οικοσύστημα και σχετίζονται με εποχιακές, μηνιαίες ή ακόμα και ημερήσιες διακυμάνσεις των συνθηκών που επικρατούν στην υδάτινη στήλη. Η επιβίωση των εντεροβακτηρίων έχει συσχετισθεί ικανοποιητικά στο παρελθόν με μια σειρά μεμονωμένων περιβαλλοντικών παραγόντων (π.χ. Mitchell & Chamberlin, 1978; McCambridge & McMeekin, 1981; Scheuerman et al., 1988; Tudor et al., 1990; Alkan et al., 1995). Ωστόσο, η διερεύνηση των επιπτώσεων της αλληλεπίδρασης των περιβαλλοντικών παραμέτρων στους βακτηριακούς πληθυσμούς αποτελεί μια λιγότερο μελετημένη θεματική ενότητα εξαιτίας της πολύπλοκης και δύσκολης εργαστηριακής μεθοδολογίας που απαιτείται ενώ η σχετική βιβλιογραφία είναι σχετικά περιορισμένη (Šolić & Krstulović, 1992). Η ηλιακή ακτινοβολία, η

9 θερμοκρασία, η αλατότητα, το ph, η θήρευση, ο ανταγωνισμός για τα θρεπτικά και οι τοξίνες που προέρχονται από τα θαλάσσια άλγη χαρακτηρίζονται ως οι σημαντικότεροι παράμετροι που καθορίζουν τη θνησιμότητα και γενικότερα το βαθμό επιβίωσης των κολοβακτηριδίων στο θαλάσσιο περιβάλλον (Šolić & Krstulović, 1992). Στην συνέχεια παραθέτονται οι κυριότεροι παράγοντες που παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην επιβίωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών. Θερμοκρασία Η θερμοκρασία του νερού και η επιβίωση των κολοβακτηριοειδών κοπρανώδους προέλευσης παρουσιάζουν μια αντίστροφη σχέση (Faust et al., 1975; Ayres, 1977). Σε ορισμένες περιπτώσεις μάλιστα η αύξηση της θερμοκρασίας προκάλεσε την εκθετική μείωση του βαθμού επιβίωσης τους καθώς με την αύξηση της θερμοκρασίας νερού κατά 10 o C προκλήθηκε μείωση του πληθυσμού κατά 55% (Šolić & Krstulović, 1992). Ωστόσο, γενικότερα η επίπτωση της θερμοκρασίας στους πληθυσμούς των FC, μεμονωμένα δεν επηρεάζει πολύ τον βαθμό θνησιμότητας τους (Alkan et al., 1995) αλλά γίνεται σημαντικότερη όταν συνδυάζεται με άλλους παράγοντες όπως η ηλιακή ακτινοβολία στα επιφανειακά νερά. Η θερμοκρασία μεμονωμένα αποκτά σημαντικό ρόλο σε βάθος μεγαλύτερο από 30 μέτρα και επηρεάζει σημαντικότερα την επιβίωση των βακτηρίων καθώς η ηλιακή ακτινοβολία είναι ιδιαίτερα εξασθενημένη στο βάθος αυτό. Ηλιακή Ακτινοβολία Η επιβίωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών και η μεταβολή της έντασης της ηλιακής ακτινοβολίας φαίνεται να παρουσιάζει μια αντιστρόφως ανάλογη σχέση (Faust et al., 1975; Fujioka et al., 1981). Ενδεικτικά αναφέρεται ότι η αύξηση της ακτινοβολίας κατά 100 Wm -2 μπορεί να επιφέρει μείωση 40% του πληθυσμού των κολοβακτηριοειδών (Šolić & Krstulović, 1992). Η ένταση της ηλιακής ακτινοβολίας γενικότερα συνδέεται με το βάθος και το ποσοστό της ακτινοβολίας που φθάνει σε συγκεκριμένα βάθη. Η επίδραση της ηλιακής ακτινοβολίας φαίνεται να διαδραματίζει τον σημαντικότερο ρόλο σε σύγκριση με άλλους περιβαλλοντικούς παράγοντες (π.χ. θερμοκρασία) στον βαθμό θνησιμότητας των FC (Fujioka et al., 1981; Pommepuy et al., 1992). Ωστόσο στο φυσικό περιβάλλον η θνησιμότητα καθορίζεται από ένα συνδυασμό παραγόντων που λειτουργούν συμπληρωματικά και καθορίζουν τον τελικό βαθμό θνησιμότητας των μικροοργανισμών.

10 Αλατότητα Η μεταβολή της αλατότητας ακολουθεί το πρότυπο μεταβολής της ηλιακής ακτινοβολίας καθώς παρουσιάζει αντιστρόφως ανάλογη σχέση με τα επίπεδα θνησιμότητας των κολοβακτηριοειδών κοπρανώδους προέλευσης (Faust et al., 1975). Πιο συγκεκριμένα μελέτες έχουν δείξει ότι η αύξηση των τιμών της αλατότητας προκαλεί την μείωση των πληθυσμών τους ενώ η μείωση της αλατότητας ευνοεί την επιβίωσή τους. Η επίδραση της αλατότητας δεν είναι γραμμική αφού η αύξηση της κατά 5 o / oo στο εύρος από 7 μέχρι 15 o / oo προκαλεί τη μεγαλύτερη μείωσης του πληθυσμού με ποσοστό της τάξης του 55%. Σε υψηλότερες τιμές αλατότητας και πιο συγκεκριμένα στο εύρος 15 έως 40 o / oo η μείωση των κολοβακτηριδίων φαίνεται να είναι ομαλότερη μιας και η άνοδος κατά 5 o / oo επιφέρει μείωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών της τάξης του 15%. (Faust et al., 1975; Fujioka et al., 1981). ph Η τιμή του ph του θαλασσινού νερού καθορίζει και αυτή τον βαθμό επιβίωσης των κολοβακτηριοειδών. Το ph του θαλασσινού νερού σε φυσιολογικές συνθήκες είναι περίπου ίσο με 8,2. Το όξινο ph είναι ευνοϊκό για την ανάπτυξη των κολοβακτηριοειδών (Rozen & Belkin, 2001). Οι ιδανικότερες τιμές για την επιτυχή επιβίωση τους κυμαίνονται μεταξύ 6 και 7, ενώ υψηλότερες ή χαμηλότερες τιμές από αυτές προκαλούν μεγάλη μείωση των κολοβακτηριοειδών. 6. Σκοπός της έρευνας Η παρούσα ερευνητική προσπάθεια αποτελεί μια συνεισφορά στη θεματική ενότητα που αναφέρεται στην επιβίωση των μικροοργανισμών στο θαλάσσιο περιβάλλον όταν αυτοί υπόκεινται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Πιο συγκεκριμένα, αποσκοπεί στην αποτύπωση της θνησιμότητας των πληθυσμών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών που αναπτύχθηκαν σε εργαστηριακό περιβάλλον προσομοιώνοντας τις περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν στην Μεσόγειο (Μυτιλήνη) και στην Βόρεια Θάλασσα (Blackpool). Επίσης, δευτερογενή ερευνητικό στόχο αποτέλεσε και η δημιουργία μοντέλου που περιγράφει αριθμητικά τον ρυθμό θνησιμότητας των FC όταν αυτά υπόκεινται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες ή εργαστηριακές μεθοδολογίες με σκοπό να εντοπισθούν οι πιθανές συνέπειες τους στους πληθυσμούς των βακτηρίων. Πιο συγκεκριμένα οι επιμέρους στόχοι της διπλωματικής εργασίας ήταν :

11 Κατασκευή μικρόκοσμου για τις ανάγκες τις προσομοίωσης των ιδιαίτερων περιβαλλοντικών συνθηκών που επικρατούν σε δύο διαφορετικά θαλάσσια οικοσυστήματα (Μυτιλήνη Blackpool) Καλλιέργεια των μικροοργανισμών και καταμέτρησή τους σε ημερήσια βάση, με σκοπό την καταγραφή της χρονικής διάρκειας επιβίωσής τους στο θαλάσσιο περιβάλλον Σύγκριση και μοντελοποίηση της θνησιμότητας των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες και εργαστηριακούς χειρισμούς

12 Υλικά και Μέθοδοι 1. Περιοχές μελέτης και δειγματοληψία Ως περιοχές μελέτης επιλέχθηκαν δύο θαλάσσιες παράκτιες περιοχές με διαφορετικές συντεταγμένες, που κατά τους θερινούς μήνες χρησιμοποιούνται για αναψυχή. Πιο συγκεκριμένα, μιας και παρούσα μελέτη ήταν κατά κύριο λόγο εργαστηριακή, με τον όρο περιοχή μελέτης εννοούνται οι περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν στην περιοχή μελέτης. Η πρώτη περιοχή μελέτης αφορά τις τυπικές συνθήκες που αναφέρονται στην θαλάσσια περιοχή της πόλης της Μυτιλήνης με γεωγραφικές συντεταγμένες 39,03Ν και 26,36E. Η δεύτερη περιοχή μελέτης αφορά τις συνθήκες που παρουσιάζονται στην θαλάσσια περιοχή της πόλης Blackpool της Αγγλίας με γεωγραφικές συντεταγμένες 53,50 N και 3,07 Ε. Οι περιοχές αυτές επιλέχθηκαν γιατί παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές όσον αφορά στις περιβαλλοντικές τους συνθήκες και ταυτόχρονα είναι χαρακτηριστικές περιοχές αναψυχής της Μεσογείου (Μυτιλήνη) και της Βόρειας Θάλασσας (Blackpool) οι οποίες έχουν κοινό Ευρωπαϊκό Δίκαιο. Το δειγματοληπτικό πλάνο της παρούσας εργασίας περιελάμβανε την λήψη δειγμάτων νερού από την μονάδα επεξεργασίας λυμάτων του βιολογικού καθαρισμού του δήμου Μυτιλήνης. Ποσότητα από λύματα προς επεξεργασία λήφθηκε, με την χρήση γυάλινου αποστειρωμένου δοχείου, τον Ιανουάριο του Το δείγμα νερού συλλέχθηκε τις πρώτες πρωινές ώρες και μεταφέρθηκε υπό ψύξη στο εργαστήριο. 2. Δημιουργία μικρόκοσμου Για την εκπόνηση του πειράματος κατασκευάσθηκε μικρόκοσμος σταθερών και ελεγχόμενων περιβαλλοντικών συνθηκών στο εργαστήριο. Η δημιουργία του μικρόκοσμου αποσκοπούσε στην προσομοίωση των περιβαλλοντικών συνθηκών που επικρατούν σε δυο διαφορετικές περιοχές. Συγκεκριμένα επιλέχθηκε η προσομοίωση των περιβαλλοντικών συνθηκών: A, της θαλάσσιας περιοχής του Blackpool της δυτικής ακτής της Αγγλίας, στην Βόρεια Θάλασσα, κατά τον μήνα Ιούλιο. B, των υδάτων της Μεσογείου και πιο συγκεκριμένα του βορειοανατολικού Αιγαίου στην περιοχή του στενού της Μυτιλήνης, για το ίδιο μήνα.

13 Η ανεύρεση των απαραίτητων χαρακτηριστικών της κάθε περιοχής για την πραγματοποίηση του πειράματος έγινε με τη βοήθεια του διαδικτύου [http//:aa.navy.mil (US National Observatory Astronomical Appl Dept), http//:sci.fi/~benefon/sol.html (Solar photoperiod calculator)]. Οι ελεγχόμενες συνθήκες περιελάμβαναν τις παραμέτρους της θερμοκρασίας, της αλατότητας και της φωτοπεριόδου που συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Ο πειραματικός σχεδιασμός της επιβίωσης των κολοβακτηριδίων στον μικρόκοσμο προέβλεπε την σταθερή θερμοκρασία των 16 o C για τα ψυχρά νερά της Βορείου Θαλάσσης και των 24,5 o C για τα νερά της Μεσογείου. Η σταθερή τιμή της αλατότητας που αναφέρεται στην Μεσόγειο ήταν 39 ο / οο ενώ για την προσομοίωση των συνθηκών της Βορείου Θαλάσσης η αλατότητα ρυθμίστηκε στο 32 ο / οο. Όσον αφορά την φωτοπερίοδο χρησιμοποιήθηκαν λάμπες Master Son-T Pia Agro 400W οι οποίες προσομοιώνουν την ηλιακή ακτινοβολία. Τα χαρακτηριστικά της λάμπας αυτής είναι: lumen output 55,000 lm και colour temp. 2050k. Η φωτοπερίοδος ρυθμίστηκε στις 16 ώρες (16 ώρες φως - 8 ώρες σκοτάδι) για τις συνθήκες της Βορείου Θαλάσσης και στις 14 ώρες (14 ώρες φως - 10 ώρες σκοτάδι) για τις συνθήκες της Μεσογείου. Τέλος, η τιμή του ph ελεγχόταν μεταξύ των τιμών 8,2 8,7 και για τα δύο περιβάλλοντα ώστε να αποφευχθεί η οξίνιση του υδάτινου περιβάλλοντος και η επίδρασή της στην επιβίωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών. Το πείραμα είχε δύο επιπλέον σκέλη: i. Χρήση διηθημένου νερού ώστε να κατακρατηθούν οι μικροοργανισμοί και τα σωματίδια του θαλασσινού νερού ii. Χρήση μη διηθημένου νερού για την παρουσία φυσικού πληθυσμού μικροοργανισμών του θαλάσσιου περιβάλλοντος 3. Εργαστηριακοί χειρισμοί Αρχικά πάρθηκαν 500ml λύματος από τη Μονάδα Επεξεργασίας Υγρών Αποβλήτων της πόλης της Μυτιλήνης στις στις 08:00 πμ λόγω του ότι προηγηθείσες μετρήσεις είχαν δείξει ότι τις πρωινές ώρες τα αστικά απόβλητα έχουν υψηλότερη περιεκτικότητα σε κοπρανώδεις μικροοργανισμούς. Από το δείγμα αυτό τοποθετήθηκαν 50ml λύματος σε 8 κωνικές φιάλες αντίστοιχα. Οι τέσσερις από αυτές περιείχαν 450ml φρέσκου θαλασσινού νερού και οι υπόλοιπες περιείχαν θαλασσινό νερό το οποίο είχε διηθηθεί από μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με διάμετρο πόρων 0,22 μm. Στις οκτώ κωνικές φιάλες εγκαταστάθηκε σταθερή παροχή αέρα για την ανάδευση και την οξυγόνωση των μικρόκοσμων (Eικ.1.1) Οι μικρόκοσμοι

14 παρέμειναν για 10 ημέρες στις σταθερές και ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Δείγματα των μικρόκοσμων λαμβάνονταν σε ημερήσια βάση τα οποία τοποθετούνταν, είτε με την μέθοδο τη σποράς σε τρυβλίο είτε με διήθηση μέσω μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με διάμετρο πόρων 0,45μm. Τα φίλτρα τοποθετούνταν σε τρυβλία με θρεπτικό υπόστρωμα Membrane Lauryl Sulphate Agar (MLSA), Oxoid MM0615, με σκοπό την απομόνωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών (FC). Τα τρυβλία επωάζονταν για 24 ώρες στους 44 0 C. Μετά την επώαση ακολουθούσε η καταμέτρηση του αριθμού των αποικιών. Η ονομασία, οι περιβαλλοντικές συνθήκες της εργαστηριακής προσομοίωσης και η μεταχείριση (treatment) του κάθε δείγματος παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Εικόνα 1. (α) σταθερή παροχή αέρα για την ανάδευση και την οξυγόνωση των μικρόκοσμων, (β) υδατόλουτρο που χρησιμοποιήθηκε στην πειραματική διαδικασία Πίνακας 1. Ονομασία, περιβαλλοντικές συνθήκες και μεταχείριση των δειγμάτων Ονομασία δειγμάτων L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 Περιοχή Blackpool Blackpool Blackpool Blackpool Μυτιλήνη Μυτιλήνη Μυτιλήνη Μυτιλήνη προσομοίωσης Θερμοκρασία ( ο C) ,5 24,5 24,5 24,5 Αλατότητα ( o / oo ) Διήθηση (0,22μm) Φωτοπερίοδος (ώρες) νερού ναι ναι όχι όχι ναι ναι όχι όχι

15 Εικόνα 2. Αντλία κενού (Millipore) για την διήθηση δειγμάτων νερού μέσω ηθμού 4. Ανάλυση δεδομένων Μετασχηματισμός δεδομένων Ο μετασχηματισμός των δεδομένων του αριθμού των αποικιών με την χρήση του δεκαδικού λογάριθμου επιλέχθηκε σύμφωνα με την διεθνή επιστημονική βιβλιογραφία (π.χ. Mezrioui et al., 1995; Cavallo et al., 1999; Cason & Hinton, 2006). Η λογαρίθμηση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε τόσο για την μετατροπή της πιθανής εκθετικής σχέσης ( y = e x ) μεταξύ του αριθμού των κολοβακτηριδίων και της διάρκειας παραμονής τους στο υδάτινο περιβάλλον σε γραμμική σχέση (y = b + ax) (Cavallo et al., 1999) όσο και για την προσαρμογή των πειραματικών αποτελεσμάτων στην κανονική κατανομή (Geissler et al., 2000). Δοκιμασία Kolmogorov Smirnov Η εφαρμογή της δοκιμασίας αυτής πραγματοποιήθηκε με σκοπό τον έλεγχο του αν οι πληθυσμοί των αποικιών των κολοβακτηριδίων ακολουθούν την κανονική κατανομή έτσι ώστε να είναι εφικτή η εφαρμογή παραμετρικών στατιστικών μεθόδων (Zar, 1984). Ο συγκεκριμένος έλεγχος εφαρμόσθηκε σε κάθε δείγμα ξεχωριστά. Μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης και συσχετίσεις Με την χρήση του μοντέλου της γραμμικής παλινδρόμησης (Linear Regression Model), όπως περιγράφεται στην διεθνή βιβλιογραφία (π.χ. Zar, 1984; Geissler et al., 2000; Norusis, 2005), υπολογίσθηκαν οι βέλτιστες ευθείες δηλαδή αυτές με το

16 μικρότερο άθροισμα τετραγώνων των αποστάσεων μεταξύ των πειραματικών τιμών και της θεωρητικής ευθείας. Ο αριθμός των αποικιών ήταν η εξαρτημένη και οι ημέρες παραμονής τους στις ελεγχόμενες συνθήκες η ανεξάρτητη μεταβλητή. Η βέλτιστη ευθεία για κάθε δείγμα εκφράζει την εξίσωση που περιγράφει τον ρυθμό με τον οποίο μεταβάλλεται ο αριθμός των αποικιών κατά την διάρκεια παραμονής τους στο υδάτινο περιβάλλον. Ο έλεγχος του πόσο καλά ταιριάζει η ευθεία του θεωρητικού μοντέλου στα πειραματικά δεδομένα (goodness of fit) πραγματοποιήθηκε με την χρήση του παραμετρικού συντελεστή συσχέτισης του Pearson (r).ο συντελεστής κυμαίνεται από -1 μέχρι +1 αν όλα τα σημεία βρίσκονται σε μια ευθεία με αρνητική κλίση ή σε μία ευθεία με θετική κλίση αντίστοιχα. Έτσι η απόλυτη τιμή του συντελεστή φανερώνει το πόσο κοντά συγκεντρώνονται τα δεδομένα γύρω από μια ευθεία. Μεγάλες θετικές τιμές (> 0,7) δηλώνουν μία ισχυρή γραμμική σχέση μεταξύ της ανεξάρτητης και της εξαρτημένης μεταβλητής ενώ αντίστοιχα μεγάλες κατά απόλυτη τιμή αρνητικές τιμές του συντελεστή υποδηλώνουν την ύπαρξη ισχυρής γραμμικής σχέσης με αρνητική κλίση μεταξύ της ανεξάρτητης και της εξαρτημένης μεταβλητής. Στη συνέχεια υπολογίσθηκαν οι εξισώσεις της μορφής y = αx +b που εκφράζουν καλύτερα την γραμμική σχέση των μεταβλητών. Στις εξισώσεις αυτές το b συμβολίζει τον σταθερό όρο ενώ το α εκφράζει την κλίση της ευθείας δηλαδή την μεταβολή της εξαρτημένης μεταβλητής (αριθμός αποικιών) όταν μεταβάλεται κατά μια μονάδα η ανεξάρτητη μεταβλητή (ημέρες). Ο υπολογισμός της κλίσης α χρησιμοποιήθηκε για την σύγκριση των δειγμάτων όσον αφορά τον ρυθμό επιβίωσης των αποικιών στις διάφορες περιβαλλοντικές συνθήκες. Δοκιμασία Mann Whitney Η δοκιμασία Mann-Whitney αποτελεί το μη παραμετρικό ανάλογο των παραμετρικών μεθόδων όπως η ανάλυση διασποράς (ΑNOVA) που ελέγχουν την ισότητα της μέσης τιμής μεταξύ δύο ή περισσότερων πληθυσμών (Zar, 1984). Πολυδιάστατη Ανάλυση Μεγάλο τμήμα των πολυδιάστατων στατιστικών μεθόδων βασίζονται στην αρχή της ομοιότητας (S) μεταξύ κάθε ζευγαριού δειγμάτων, όσον αφορά τις βιολογικές κοινότητες που περιλαμβάνουν. Αναπόφευκτα, επειδή η πληροφορία για κάθε δείγμα είναι πολύ-μεταβλητή (πολλές ανεξάρτητες μετρήσεις), υπάρχουν πολλοί τρόποι για

17 να καθοριστεί η εν λόγω ομοιότητα. Ο συντελεστής ομοιότητας S είναι τυπικά καθορισμένος να παίρνει τιμές σε κλίμακα (0,100%), ή λιγότερο συχνά (0,1), με τα άκρα της κλίμακας να αντιπροσωπεύουν ακραίες τιμές: S = 100% (ή 1) αν δυο δείγματα είναι εντελώς όμοια S = 0 αν δυο δείγματα είναι εντελώς ανόμοια. Από τους αριθμητικούς συντελεστές ομοιότητας οι οποίοι έχουν προταθεί στην διεθνή βιβλιογραφία, ιδιαίτερα γνωστός και ευρέως χρησιμοποιούμενος στην οικολογία είναι ο συντελεστής Bray- Curtis (S jk ) (Clarke & Warwick, 1994). S jk S i 1 S i 1 Y Y ij ij Y Y ik ik όπου S jk : η εκατοστιαία ομοιότητα μεταξύ των δειγμάτων j και k Y ij : η αφθονία του είδους i στο δείγμα j Y ik : η αφθονία του είδους i στο δείγμα κ S : ο συνολικός αριθμός των ειδών Μια από τις πλέον κοινές πολυδιάστατες αναλύσεις είναι αυτή της Ιεραρχικής Ομαδοποίησης (Cluster Analysis). Ως σημείο εκκίνησης της ανάλυσης ορίζεται ένα άνω τριγωνικός πίνακας ομοιότητας με βάση τον δείκτη Bray - Curtis. Η μέθοδος ομαδοποιεί τα διαφορετικά δείγματα σε ομάδες και έπειτα τις ομάδες μεταξύ τους. Η μέθοδος ομαδοποιεί πρώτα τις ομάδες με την μεγαλύτερη ομοιότητα και σταδιακά ομαδοποιεί δείγματα με όλο και μικρότερο ποσοστό ομοιότητας. Η μέθοδος σταματάει όταν φτάσει στο σημείο μία ομάδα να περιέχει ένα μόνο δείγμα. Το αποτέλεσμα της μεθόδου είναι η δημιουργία ενός διαγράμματος το οποίο λόγω της μορφής του ονομάζεται δενδρόγραμμα. Στον άξονα x παρουσιάζεται όλο το σετ των δειγμάτων ενώ στον άξονα y παρουσιάζεται το ποσοστό ομοιότητας στο οποίο ομαδοποιούνται οι διάφορες ομάδες (Clarke & Warwick, 1994).

18 Λογισμικά πακέτα εργασίας Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Microsoft Excel για τον μετασχηματισμό των δεδομένων, την κατασκευή γραφημάτων και την ηλεκτρονική διαχείριση των δεδομένων ενώ για τις υπόλοιπες στατιστικές δοκιμές (διαγράμματα διασποράς, δοκιμασία Kolmogorov Smirnov, γραμμική παλινδρόμηση και συσχετίσεις) χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 11.5 (SPSS Inc., 2002). Τέλος, η ιεραρχική ομαδοποίηση των πληθυσμών των κολοβακτηριδίων πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πακέτο Primer v5 (Clarke & Gorley, 2001)

19 Αποτελέσματα 1. Γενική περιγραφή Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την πειραματική διαδικασία παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Σε γενικές γραμμές, το κυριότερο πρότυπο που παρατηρήθηκε από τις επαναλαμβανόμενες μετρήσεις των αποικιών κατά την διάρκεια του πειράματος αφορά την μείωση του βαθμού της επιβίωσης των μικροοργανισμών. Την πρώτη ημέρα καταγράφηκαν υψηλές τιμές αποικιών σε όλα τα δείγματα οι οποίες ωστόσο φάνηκε να μειώνονται σημαντικά με την πάροδο των ημερών. Ωστόσο, διαφορές παρουσιάσθηκαν στην συνολική χρονική διάρκεια επιβίωσης των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στο σύνολο των δειγμάτων. Η μέγιστη διάρκεια επιβίωσης των μικροοργανισμών καταγράφηκε στα δείγματα L1, L6 και L8 η οποία ήταν εννέα ημέρες ενώ η ελάχιστη διάρκεια επιβίωσης παρατηρήθηκε στο δείγμα L3 και ήταν έξι ημέρες. Πιο συγκεκριμένα, για τις συνθήκες προσομοίωσης της Βόρειας Θάλασσας (Blackpool) και για το δείγμα L1 την πρώτη μέρα μετρήθηκαν αποικίες, την δεύτερη 24000, την τρίτη 2600 ενώ την δέκατη μέρα επιβίωσαν >10 αποικίες. Αντίστοιχα για το δείγμα L2 την πρώτη μέρα καταγράφηκαν αποικίες, την δεύτερη 28000, την τρίτη 2700 ενώ σε αντίθεση με τα δυο προηγούμενα δείγματα στο δείγμα L3 τα FC επιβίωσαν μέχρι και την έκτη ημέρα. Για το δείγμα L4 την πρώτη μέρα σημειώθηκαν αποικίες οι οποίες την δεύτερη ημέρα μειώθηκαν στις 28000, την τρίτη 1700 ενώ η επιβίωση τους σταματά την έβδομη ημέρα. Επιπλέον, αξίζει να σημειωθεί το γεγονός ότι, για τα δείγματα που αναφέρονται στις συνθήκες της Βόρειας Θάλασσας, καταγράφηκε μεγαλύτερη χρονική διάρκεια επιβίωσης των αποικιών (9 και 8 ημέρες) στα δείγματα L1-L2, στα οποία είχαμε χρησιμοποιήσει διηθημένο νερό, από αυτή (6 και 7 ημέρες) στα δείγματα (L3- L4), στα οποία δεν είχαμε διηθήσει το νερό. Όσον αφορά τα δείγματα που αναφέρονται στις περιβαλλοντικές συνθήκες της Μεσογείου (Μυτιλήνη) για το δείγμα L5 καταμετρήθηκαν αποικίες την πρώτη ημέρα ενώ την δεύτερη και την τρίτη βρέθηκαν και 2700 αποικίες αντίστοιχα. Η επιβίωση των αποικιών του δείγματος αυτού σταματά την όγδοη ημέρα. Για το δείγμα L6 η μέγιστη τιμή αφθονίας των αποικιών σημειώθηκε την πρώτη ημέρα (150000) ενώ την δεύτερη ημέρα ο αριθμός τους μειώθηκε στις Επιβίωση κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών για το δείγμα L6 καταγράφηκε μέχρι και την ένατη ημέρα. Στο δείγμα L7 την πρώτη ημέρα καταγράφηκαν αποικίες ενώ την

20 δεύτερη και την τρίτη ημέρα βρέθηκαν και 4000 αποικίες αντίστοιχα. Η επιβίωση των αποικιών για το δείγμα αυτό σταμάτησε την όγδοη ημέρα. Τέλος για το δείγμα L8 μετρήθηκαν αποικίες την πρώτη ημέρα, την δεύτερη και την τρίτη ημέρα. Η παρουσία των αποικιών αυτών ήταν ορατή μέχρι και την ένατη ημέρα. Αντίθετα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν για τις συνθήκες της Βόρειας Θάλασσας, η χρήση διηθημένου ή μη νερού στα δείγματα που αναφέρονται στις συνθήκες της Μεσογείου φάνηκε να μην καθορίζει τον συνολικό βαθμό επιβίωσης των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών. Πίνακας 2. Αριθμός αποικιών κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών/ml δείγματος που μετρήθηκαν κατά την διάρκεια του πειράματος L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 Blackpool Blackpool Blackpool Blackpool Μυτιλήνη Μυτιλήνη Μυτιλήνη Μυτιλήνη ΗΜΕΡΕΣ Φίλτρο Φίλτρο - - Φίλτρο Φίλτρο η 1.9x x x x x x x x η 2.4x x x x x x x x η 2.6x x x x x x x x η 7.0x x x x x x x x η 2.4x x x x x x x x η 1.0x x x x10 3.8x x x x η 8.4 x x10 < x x x x x10 8 η 3.7 x x10 <10 < x x x x10 9 η 1.1 x10 <10 <10 <10 < x10 < x10 10 η <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 Οι τάξεις μεγέθους που προέκυψαν για τον αριθμό των αποικιών στην κλίμακα χρόνου (ημέρες) παρουσίασαν μεγάλες διαφορές καθώς η σύγκριση της πρώτης ημέρας του πειράματος με την δέκατη ημέρα φανέρωσε την μείωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών κατά εκατοντάδες χιλιάδες. Επίσης, οι πειραματικές τιμές των αποικιών για το κάθε δείγμα παρέκκλιναν σημαντικά από την κανονική κατανομή που ως γνωστόν αποτελεί την κύρια προϋπόθεση για την εφαρμογή παραμετρικών στατιστικών μεθόδων. Έτσι, οι μετρήσεις των αποικιών μετασχηματίσθηκαν με την

21 χρήση του δεκαδικού λογάριθμου για το κάθε δείγμα με σκοπό τόσο την εξομάλυνση της τάξης μεγέθους των αποικιών μεταξύ των ημερησίων καταγραφών όσο και την προσαρμογή των πειραματικών τιμών στην κανονική κατανομή. Ο έλεγχος της κανονικότητας των μετασχηματισμένων δεδομένων πραγματοποιήθηκε με την δοκιμασία Kolmogorov-Smirnov και τα αποτελέσματα αυτής σημειώνονται στον Πίνακα 3. Το κυριότερο αποτέλεσμα της δοκιμασίας φανέρωσε ότι τα μετασχηματισμένα δεδομένα ακολουθούν την κανονική κατανομή για όλα τα δείγματα (p > 0.05). Έτσι, στη συνέχεια του κειμένου χρησιμοποιούνται μόνο τα μετασχηματισμένα δεδομένα των μετρήσεων των αποικιών. Πίνακας 3. Αποτελέσματα της δοκιμασίας Kolmogorov-Smirnov Test L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 Μετρήσεις Μέσος 2,567 2,360 2,127 2,106 2,483 2,968 2,595 2,840 Τυπ. απόκλιση 1,433 1,552 2,107 1,880 1,570 1,631 1,795 1,727 Kolmogorov- 0,487 0,593 0,771 0,533 0,475 0,610 0,676 0,559 Smirnov Z Σημαντικότητα 0,972 0,874 0,592 0,939 0,978 0,851 0,751 0,913 Η εφαρμογή του διαγράμματος διασποράς (Εικ.3) και των ραβδογραμμάτων (Εικ.4-7) του αριθμού των αποικιών και των ημερών έδειξε την μείωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών με το πέρας των ημερών. Ωστόσο, το σημαντικότερο ίσως αποτέλεσμα που πρόκυψε έγκειται στον τρόπο με τον οποίο παρουσιάζεται η εν λόγο μείωση. Πιο συγκεκριμένα, το σύνολο των δειγμάτων παρουσίασε γραμμική τάση μείωσης του αριθμού των FC στην κλίμακα του χρόνου (Εικ.3). 6 5 Log αποικιών FC Αποικίες 4 3 L8 L7 L6 L5 L4 2 L3 L L1 Χρόνος Mέρες (μέρες) Εικόνα 3. Διάγραμμα διασποράς του μετασχηματισμένου αριθμού των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών και ημερών όπου το κάθε δείγμα παρουσιάζεται με διαφορετικό χρωματισμό

22 (α) (β) Εικόνα 4. Ραβδογράμματα του λογαριθμημένου αριθμού των αποικιών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών για τα δείγματα (α) L1 και (β) L2

23 (α) (β) Εικόνα 5. Ραβδογράμματα του λογαριθμημένου αριθμού των αποικιών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών για τα δείγματα (α) L3 και (β) L4

24 (α) (β) Εικόνα 6. Ραβδογράμματα του λογαριθμημένου αριθμού των αποικιών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών για τα δείγματα (α) L5 και (β) L6

25 (α) (β) Εικόνα 7. Ραβδογράμματα του λογαριθμημένου αριθμού των αποικιών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών για τα δείγματα (α) L7 και (β) L8

26 2. Γραμμικό μοντέλο επιβίωσης των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών Συσχέτιση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών και των ημερών επιβίωσης τους Τα διαγράμματα που προηγήθηκαν έδειξαν ο αριθμός των αποικιών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών (εξαρτημένη μεταβλητή) και η διάρκεια παραμονής στο υδάτινο περιβάλλον (ανεξάρτητη μεταβλητή) παρουσίασαν λιγότερο ή περισσότερο μια γραμμική συσχέτιση. Η ένταση της συσχέτισης αυτής ελέγχθηκε με την χρήση του παραμετρικού συντελεστή συσχέτισης του Pearson. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Ιδιαίτερα υψηλός βαθμός γραμμικής συσχέτισης καταγράφηκε μεταξύ του αριθμού των αποικιών και των ημερών επιβίωσης τους καθώς τόσο στις συνθήκες προσομοίωσης των υδάτων της περιοχής της Μυτιλήνης όσο στις αντίστοιχες της περιοχής του Blackpool προέκυψαν τιμές μεγαλύτερες από 0,9 κατά απόλυτη τιμή (Πίνακας 4). Το αρνητικό πρόσημο του δείκτη συσχέτισης σε όλες τις περιπτώσεις φανέρωσε επιπλέον ότι η εξαρτημένη και η ανεξάρτητη μεταβλητή παρουσίασαν αντιστρόφως ανάλογη σχέση. Πιο συγκεκριμένα, όπως ήταν αναμενόμενο η διαδοχή των ημερών οδήγησε στην μείωση του αριθμού των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στο υδάτινο περιβάλλον. Πίνακας 4. Τιμές του συντελεστή Pearson μεταξύ του αριθμού των αποικιών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών και των ημερών επιβίωσης τους Δείγμα Συντελεστής συσχέτισης Pearson (Δείγμα Ημέρες) Σημαντικότητα L1-0,968 0,001 L2-0,981 0,001 L3-0,966 0,001 L4-0,975 0,001 L5-0,985 0,001 L6-0,959 0,001 L7-0,976 0,001 L8-0,966 0,001

27 3. Μοντέλο Γραμμικής Παλινδρόμησης της Επιβίωσης των Μικροοργανισμών Με δεδομένες τις υψηλές τιμές του δείκτη συσχέτισης, το επόμενο λογικό βήμα στην παρούσα μελέτη αποτέλεσε η κατασκευή των γραμμικών μοντέλων και των εξισώσεων που τα περιγράφουν για το κάθε δείγμα ξεχωριστά και για δυο περιοχές μελέτης που προσομοιώθηκαν. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την κατασκευή των γραμμικών μοντέλων παραθέτονται στη συνέχεια. Δείγματα L1 L2 Όσον αφορά τα δείγματα L1 L2 (Συνθήκες Blackpool, χρήση διηθημένου νερού στην πειραματική διαδικασία) η απόλυτη τιμή του δείκτη συσχέτισης (R) ήταν 0,971 ενώ η τιμή του δείκτη συσχέτισης υψωμένη στο τετράγωνο (R 2 ) βρέθηκε 0,944 (Πίνακας 5). Το μέγεθος R 2 δηλώνει το ποσοστό της μεταβλητότητας της εξαρτημένης μεταβλητής (αριθμός αποικιών FC) που ερμηνεύεται από το μοντέλο της παλινδρόμησης. Πιο συγκεκριμένα, περίπου το 94% της μεταβλητότητας που παρουσίασαν οι αποικίες των μικροοργανισμών ερμηνεύεται από την διαδοχή των ημερών παραμονής τους στο θαλασσινό νερό ενώ ένα πολύ μικρό ποσοστό (6%) δεν ερμηνεύεται από το μοντέλο σε συνολικό επίπεδο σημαντικότητας p < 0,001. Επίσης, το τυπικό σφάλμα της εκτίμησης βρέθηκε να είναι πολύ μικρό (0,356) και σε συνδυασμό με την ιδιαίτερα υψηλή τιμή του R 2 κρίθηκε σκόπιμο να μην εφαρμοσθεί ανάλυση υπολοίπων. Πίνακας 5. Στοιχεία του γραμμικού μοντέλου όπου R : ο συντελεστής συσχέτισης, R 2 : το ποσοστό της μεταβλητότητας της εξαρτημένης μεταβλητής που ερμηνεύεται από το μοντέλο R R 2 Τυπικό σφάλμα Σημαντικότητα εκτίμησης 0,971 0,944 0,356 0,001 Πίνακας 6. Αποτελέσματα της ανάλυσης διασποράς που χρησιμοποιείται από το γραμμικό μοντέλο Άθροισμα Βαθμοί Τετράγωνο μέσης F Σημαντικότητα τετραγώνων ελευθερίας εκτίμησης Παλινδρόμηση 38, , ,9 0,001 Υπόλοιπο 2, ,127 Σύνολο 40,415 19

28 Η ευθεία που περιγράφει την θνησιμότητα των αποικιών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών (Πίνακας 7) έχει ως σταθερό όρο την τιμή 5,108 ενώ η κλίση της υπολογίσθηκε ίση με - 0,481, έτσι η εξίσωση έχει την μορφή: επιβίωση των FC = 5,108 (0,481 x ημέρες παραμονής) Πίνακας 7. Συντελεστές της εξίσωσης που περιγράφουν τα δείγματα L1 - L2 Μη τυποποιημένοι συντελεστές Μοντέλο B Τυπικό Σφάλμα t Σημαντικότητα (Σταθερά) 5,108 0,172 29,707 0,001 Μέρες -0,481 0,028-17,347 0,001 Δείγματα L3 L4 Για τα δείγματα L3 L4 που αναφέρονται στις συνθήκες του Blackpool (χρήση μη διηθημένου νερού στην πειραματική διαδικασία) ο συντελεστής συσχέτισης μεταξύ του αριθμού των αποικιών που καταμετρήθηκαν και της διάρκειας παραμονής των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στο θαλασσινό νερό βρέθηκε ίσος με 0,968. Στην περίπτωση των δειγμάτων αυτών το ποσοστό της μεταβλητότητας της εξαρτημένης μεταβλητής που ερμηνεύεται από το γραμμικό μοντέλο ήταν της τάξης του 94% ενώ το υπόλοιπο 6% δεν ερμηνεύεται από το μοντέλο (Πίνακας 8). Το συνολικό επίπεδο σημαντικότητας των υπολογισμών ήταν p<0,001 ενώ το τυπικό σφάλμα κυμάνθηκε σε χαμηλά επίπεδα (0,497). Πίνακας 8. Στοιχεία του γραμμικού μοντέλου όπου R : ο συντελεστής συσχέτισης, R 2 : το ποσοστό της μεταβλητότητας της εξαρτημένης μεταβλητής που ερμηνεύεται από το μοντέλο R R 2 Τυπικό σφάλμα εκτίμησης Σημαντικότητα 0,968 0,938 0, ,001 Πίνακας 9. Αποτελέσματα της ανάλυσης διασποράς που χρησιμοποιείται από το γραμμικό μοντέλο Άθροισμα Βαθμοί Τετράγωνο μέσης F Σημαντικότητα τετραγώνων ελευθερίας εκτίμησης Παλινδρόμηση 67, , ,026 0,001 Υπόλοιπο 4, ,248 Σύνολο 71,797 19

29 Πίνακας 10. Συντελεστές της εξίσωσης που περιγράφουν τα δείγματα L3 L4 Μη τυποποιημένοι συντελεστές Μοντέλο B Τυπικό Σφάλμα t Σημαντικότητα (Σταθερά) 5,631 0,240 23,429 0,001 Μέρες -0,639 0,039-16,493 0,001 Η ευθεία που προέκυψε για τα δείγματα L3 L4 έχει ως σταθερό όρο την τιμή 5,631 και ως κλίση την τιμή -0,639. Έτσι, η εξίσωση που περιγράφει την θνησιμότητα των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών είναι η εξής: επιβίωση των FC = 5,631 (0,639 x ημέρες παραμονής) Δείγματα L5 L6 Όσον αφορά τα δείγματα L5 L6 που αναφέρονται στις περιβαλλοντικές συνθήκες των παράκτιων υδάτων της Μυτιλήνης (χρήση διηθημένου νερού στην πειραματική διαδικασία), ο υπολογισμός του δείκτη συσχέτισης μεταξύ του αριθμού των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών και των ημερών παραμονής τους στο θαλασσινό νερό φανέρωσε μια ιδιαίτερα υψηλή μεταξύ τους συσχέτιση (0,959). Μεγάλο ήταν και το ποσοστό της μεταβλητότητας του αριθμού των αποικιών FC που ερμηνεύεται από το γραμμικό μοντέλο (92%) ενώ το ποσοστό της μεταβλητότητας που δεν αποδίδεται στην διάρκεια παραμονής των FC θαλασσινό νερό ήταν 8%. Χαμηλό μπορεί να θεωρηθεί και το τυπικό σφάλμα των μετρήσεων (0,457) ενώ το επίπεδο της στατιστικής σημαντικότητας των υπολογισμών χαρακτηρίζεται ως ιδιαίτερα υψηλό (p<0,001) Πίνακας 11. Στοιχεία του γραμμικού μοντέλου όπου R : ο συντελεστής συσχέτισης, R 2 : το ποσοστό της μεταβλητότητας της εξαρτημένης μεταβλητής που ερμηνεύεται από το μοντέλο R R 2 Τυπικό σφάλμα εκτίμησης Σημαντικότητα 0,959 0,921 0, ,001 Πίνακας 12. Αποτελέσματα της ανάλυσης διασποράς που χρησιμοποιείται από το γραμμικό μοντέλο Άθροισμα τετραγώνων Βαθμοί ελευθερίας Τετράγωνο μέσης εκτίμησης F Σημαντικότητα Παλινδρόμηση 43, , ,792 0,001 Υπόλοιπο 3, ,209 Σύνολο 47,332 19

30 Πίνακας 13. Συντελεστές της εξίσωσης που περιγράφουν τα δείγματα L5 L6 Μη τυποποιημένοι συντελεστές Μοντέλο B Τυπικό Σφάλμα t Σημαντικότητα (Σταθερά) 5,552 0,221 25,161 0,001 Μέρες -0,514 0,036-14,450 0,001 Η εξίσωση που περιγράφει την θνησιμότητα των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών για τα δείγματα L5 L6 είναι η εξής: επιβίωση των FC = 5, 552 (0, 514 x ημέρες παραμονής) Δείγματα L7 L8 Όσον αφορά τα δείγματα L7 L8 που στις περιβαλλοντικές συνθήκες των παράκτιων υδάτων της Μυτιλήνης (χρήση μη διηθημένου νερού στην πειραματική διαδικασία) ο συντελεστής γραμμικής συσχέτισης μεταξύ της εξαρτημένης (πληθυσμός FC) και της ανεξάρτητης μεταβλητής (διάρκεια παραμονής των FC στο θαλασσινό νερό) υπολογίσθηκε στην τιμή 0,968. Το γραμμικό μοντέλο, όπως και στα προηγούμενα δείγματα, φάνηκε να ερμηνεύει ιδιαίτερα υψηλό ποσοστό (94%) της μεταβλητότητας που παρουσίασε η ανεξάρτητη μεταβλητή ενώ το ποσοστό που δεν ερμηνεύεται (6%) πιθανώς καθορίζεται από παράγοντες που δεν μπορούν να προβλεφθούν από το μοντέλο. Το τυπικό σφάλμα των εκτιμήσεων ήταν 0,442 ενώ το επίπεδο σημαντικότητας σε όλα τα βήματα του γραμμικού μοντέλου υπολογίσθηκε p<0,001. Πίνακας 14. Στοιχεία του γραμμικού μοντέλου όπου R : ο συντελεστής συσχέτισης, R 2 : το ποσοστό της μεταβλητότητας της εξαρτημένης μεταβλητής που ερμηνεύεται από το μοντέλο R R 2 Τυπικό σφάλμα εκτίμησης Σημαντικότητα 0,968 0,937 0, ,001 Πίνακας 15. Αποτελέσματα της ανάλυσης διασποράς που χρησιμοποιείται από το γραμμικό μοντέλο Άθροισμα τετραγώνων Βαθμοί ελευθερίας Τετράγωνο μέσης εκτίμησης F Σημαντικότητα Παλινδρόμηση 52, , ,910 0,001 Υπόλοιπο 3, ,195 Σύνολο 56,171 19

31 Πίνακας 16: Συντελεστές της εξίσωσης που περιγράφουν τα δείγματα L7 L8 Μη τυποποιημένοι συντελεστές Μοντέλο B Τυπικό Σφάλμα t Σημαντικότητα (Σταθερά) 5,825 0,213 27,300 0,001 Μέρες - 0,565 0,034-16,429 0,001 Η εξίσωση που περιγράφει την θνησιμότητα των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών για το δείγμα L7 L8 είναι: επιβίωση των FC = 5, 825 (0, 565 x ημέρες παραμονής) 4. Ρυθμός θνησιμότητας και παράγοντες που την καθορίζουν Από την παραγώγιση της εξίσωσης y = b + ax ως προς την μονάδα του χρόνου που χρησιμοποιήθηκε (ημέρες) προκύπτει ότι : y = b + ax y (x) = a. Έτσι ο ρυθμός επιβίωσης των FC εκφράζεται από το μέγεθος a. Ωστόσο η κλίση των ευθειών που υπολογίσθηκαν ήταν αρνητική οπότε το μέγεθος a εκφράζει τον ρυθμό θνησιμότητας των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών. Στον συγκεντρωτικό Πίνακα 17 παρουσιάζονται οι ρυθμοί θνησιμότητας των FC τόσο στην εργαστηριακή προσομοίωση των περιβαλλοντικών συνθηκών της θαλάσσιας περιοχής του Blackpool όσο και στην αντίστοιχη προσομοίωσης των νερών της Μυτιλήνης. Πίνακας 17. Ρυθμός θνησιμότητας των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στις περιβαλλοντικές συνθήκες της θαλάσσιας περιοχής του Blackpool και της Μυτιλήνης Δείγματα Περιοχή Ρυθμός Θνησιμότητας L1 L2 Blackpool 0, 481 L3 L4 Blackpool 0,639 L5 L6 Μυτιλήνη 0,514 L7 L8 Μυτιλήνη 0,565 Ο ρυθμός θνησιμότητας στις συνθήκες της περιοχής του Blackpool κυμάνθηκε από 0,481 έως 6,639 ενώ ο μέσος ρυθμός θνησιμότητας υπολογίσθηκε ίσος με 0,560. Όσον αφορά την θνησιμότητα των FC στην εξομοίωση των συνθηκών της Μυτιλήνης η τιμή της κυμάνθηκε από 0,514 έως 0,565 ενώ η μέση τιμή ήταν 0,540. Ωστόσο, η εφαρμογή της μη παραμετρικής δοκιμασίας Mann-Whitney για τον έλεγχο της ισότητας της μέσης τιμής δύο πληθυσμών έδειξε ότι ο ρυθμός θνησιμότητας των FC

32 δεν διαφέρει στατιστικώς σημαντικά μεταξύ των περιβαλλοντικών συνθηκών της Μυτιλήνης και του Blackpool (Πίνακας 18). H χρήση διηθημένου νερού στην πειραματική διαδικασία φάνηκε να επηρεάζει σημαντικά την επιβίωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών. Πιο συγκεκριμένα, η εφαρμογή της δοκιμασίας Mann-Whitney στα ενωμένα δεδομένα από τις δυο περιοχές κατέδειξε ότι η χρήση διηθημένου νερού μειώνει την μέση θνησιμότητα των FC ενώ η χρήση μη διηθημένου νερού συνηγορεί στην αύξηση της θνησιμότητας τους (Πίνακας 18 και Εικόνα 8). Πίνακας 18. Έλεγχος Mann- Whitney για την μέση θνησιμότητα μεταξύ των διαφορετικών περιοχών και της χρήσης διηθημένου ή μη νερού στην πειραματική διαδικασία Μεταξύ Περιοχών Διηθημένο ή μη νερό Mann-Whitney U 8,000 0,000 Wilcoxon W 18,000 10,000 Z 0,000-2,309 Σημαντικότητα 1,000 0,021* * = στατιστικώς σημαντικές διαφορές σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95% Εικόνα 8. Ρυθμός θνησιμότητας των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στις διαφορετικές περιοχές και με χρήση διηθημένου ή μη νερού

33 5. Πολυδιάστατη Ανάλυση των Κοπρανωδών Κολοβακτηριοειδών Η πολυδιάστατη ανάλυση των πληθυσμών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών βασίσθηκε στην μέθοδο της ιεραρχικής ομαδοποίησης ή ανάλυση κατά συστάδες (Cluster Analysis). Η εφαρμογή της δοκιμασίας αυτής είχε ως αποτέλεσμα το δενδρόγραμμα που παρουσιάζεται στην Εικόνα 9. Τα κυριότερα αποτελέσματα που προέκυψαν αφορούν την υψηλή τιμή του δείκτη ομοιότητας Bray-Curtis μεταξύ των δύο περιοχών (Blackpool Μυτιλήνη) που ξεπερνά το 80% και δεν τις διαχωρίζει μεταξύ τους. Ωστόσο, όσον αφορά την περιοχή του Blackpool η χρήση διηθημένου νερού στην πειραματική διαδικασία φάνηκε να ομαδοποιεί τα δείγματα L1 και L2 σε ένα γκρουπ, ενώ τα δείγματα L3 και L4 όπου χρησιμοποιήθηκε μη διηθημένο νερό σχημάτισαν ένα δεύτερο γκρουπ. Η τιμή του δείκτη ομοιότητας μεταξύ των προαναφερθέντων ομάδων ήταν η μικρότερη (80%) που καταγράφηκε και φανέρωσε ότι για την περιοχή του Blackpool η χρήση διηθημένου νερού παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στο θαλάσσιο περιβάλλον. Εικόνα 9. Ιεραρχική ομαδοποίηση των αποικιών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών Αντίθετα, όσον αφορά στην προσομοίωση της θαλάσσιας περιοχής της Μυτιλήνης προέκυψαν δυο ευδιάκριτες ομάδες που απαρτίζονταν από τα δείγματα L5-L7 και L6-L8 αντίστοιχα. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι το διηθημένο νερό στις περιβαλλοντικές συνθήκες των Μεσογειακών υδάτων δεν επηρεάζει σημαντικά την θνησιμότητα των πληθυσμών των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών.

34 Συζήτηση Η διάρκεια της επιβίωσης των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών στο θαλάσσιο περιβάλλον σύμφωνα με την σχετική βιβλιογραφία ποικίλει από λίγες ώρες μέχρι και μερικές μέρες (Šolić & Krstulović, 1992). Στην μελέτη αυτή τα FC φάνηκε να επιβιώνουν από έξι έως και εννιά μέρες. Πιο συγκεκριμένα, ο πληθυσμός των FC που αναπτύχθηκε σε θαλασσινό νερό επέζησε από 8 έως 9 μέρες σε συνθήκες Μυτιλήνης και 6 έως 9 σε συνθήκες Ατλαντικού Ωκεανού. Παρατηρήθηκε εκθετική μείωση των αποικιών στις ελεγχόμενες συνθήκες με την πάροδο των ημερών, γεγονός που έχει καταγραφεί και σε παρόμοιες μελέτες με διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (Mitchell & Chamberlin, 1978; McCambridge & McMeekin, 1981; Alkan et al., 1995). Οι προαναφερθείσες μελέτες ωστόσο στο σύνολο τους εστιάζουν στην επίδραση μεμονωμένων περιβαλλοντικών παραμέτρων και όπως υποστηρίζουν αρκετοί συγγραφείς η επιβίωση των μικροοργανισμών καθορίζεται ισχυρότερα από την ηλιακή ακτινοβολία (Fujioka et al., 1981). Τα ευρήματα της μελέτης αυτής όμως έδειξαν ότι ο συνδυασμός των ποικίλων παραγόντων (π.χ ηλιακή ακτινοβολία, θερμοκρασία, αλατότητα) δεν διαφοροποίησε σημαντικά την βακτηριακή θνησιμότητα καθώς αν και μεμονωμένα οι περιβαλλοντικές συνθήκες ήταν διαφορετικές σε συνθήκες Βόρειας Θάλασσας και σε συνθήκες Μεσογείου, ωστόσο ο συνδυασμός τους είχε παρόμοια επίπτωση στην επιβίωση των μικροοργανισμών. Εξάλλου, η σημαντικότητα του συνδυασμού των περιβαλλοντικών παραμέτρων στην θνησιμότητα των μικροοργανισμών έχει τονισθεί και σε άλλες αντίστοιχες έρευνες (π.χ. Alkan et al., 1995 και αναφορές που παραθέτονται εκεί). Οι διαφορετικοί χειρισμοί στην πειραματική διαδικασία όπως η χρήση διηθημένου ή μη νερού αποτελεί θεματολογία σχετικά περιορισμένης έρευνας καθώς η πλειοψηφία των μελετών αφορά την επίδραση των περιβαλλοντικών παραμέτρων στους βακτηριδιακούς πληθυσμούς κάτω από μια τυποποιημένη πειραματική διαδικασία (π.χ. Mezrioui et al., 1995; Cavallo et al., 1999; Cason & Hinton, 2006). Στην εργασία αυτή υπογραμμίζεται η σημαντικότητα των εργαστηριακών χειρισμών κατά την πειραματική διαδικασία (treatment) μίας και η θνησιμότητα των FC φάνηκε να επηρεάζεται περισσότερο από την χρήση διηθημένου ή μη νερού παρά από τις διαφορετικές τιμές των περιβαλλοντικών παραμέτρων μεταξύ των δύο περιοχών. Η χρήση διηθημένου νερού περιόρισε την θνησιμότητα των FC και η επίδραση του ήταν εμφανέστερη στις συνθήκες προσομοίωσης των υδάτων της Βόρειας Θάλασσας