GLYKOKONJUGOVANÉ VAKCÍNY. ANNA FLEISCHHACKEROVÁ, PAVOL FARKAŠ a SLAVOMÍR BYSTRICKÝ. 2. Vakcíny na báze sacharidov glykokonjugáty. Obsah. 1.

Σχετικά έγγραφα
Obvod a obsah štvoruholníka

Prechod z 2D do 3D. Martin Florek 3. marca 2009

Ekvačná a kvantifikačná logika

Matematika Funkcia viac premenných, Parciálne derivácie

M6: Model Hydraulický systém dvoch zásobníkov kvapaliny s interakciou

(MHC = major histocompatibility complex)

Start. Vstup r. O = 2*π*r S = π*r*r. Vystup O, S. Stop. Start. Vstup P, C V = P*C*1,19. Vystup V. Stop

Goniometrické rovnice a nerovnice. Základné goniometrické rovnice

Kontrolné otázky na kvíz z jednotiek fyzikálnych veličín. Upozornenie: Umiestnenie správnej a nesprávnych odpovedí sa môže v teste meniť.

Podnikateľ 90 Mobilný telefón Cena 95 % 50 % 25 %

Cvičenie č. 4,5 Limita funkcie

Matematika 2. časť: Analytická geometria

Základné poznatky molekulovej fyziky a termodynamiky

The Bioactivity of Glycocluster and Glycodendrimer

Gramatická indukcia a jej využitie

PRIEMER DROTU d = 0,4-6,3 mm

Ινσουλίνη και καρδιά. Ηλιάδης Φώτης Λέκτορας Α.Π.Θ.

7. FUNKCIE POJEM FUNKCIE

1. Limita, spojitost a diferenciálny počet funkcie jednej premennej

HASLIM112V, HASLIM123V, HASLIM136V HASLIM112Z, HASLIM123Z, HASLIM136Z HASLIM112S, HASLIM123S, HASLIM136S

Motivácia Denícia determinantu Výpo et determinantov Determinant sú inu matíc Vyuºitie determinantov. Determinanty. 14. decembra 2010.

,Zohrievanie vody indukčným varičom bez pokrievky,

Moderné vzdelávanie pre vedomostnú spoločnosť Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ M A T E M A T I K A

Pevné ložiská. Voľné ložiská

KATEDRA DOPRAVNEJ A MANIPULAČNEJ TECHNIKY Strojnícka fakulta, Žilinská Univerzita

C. Kontaktný fasádny zatepľovací systém

Odporníky. 1. Príklad1. TESLA TR

Modelovanie dynamickej podmienenej korelácie kurzov V4

1. písomná práca z matematiky Skupina A

SLOVENSKO maloobchodný cenník (bez DPH)

Návrh vzduchotesnosti pre detaily napojení

Priamkové plochy. Ak každým bodom plochy Φ prechádza aspoň jedna priamka, ktorá (celá) na nej leží potom plocha Φ je priamková. Santiago Calatrava

Tomáš Madaras Prvočísla

AerobTec Altis Micro

Vyhlásenie o parametroch stavebného výrobku StoPox GH 205 S

Matematika prednáška 4 Postupnosti a rady 4.5 Funkcionálne rady - mocninové rady - Taylorov rad, MacLaurinov rad

Οξεία βρογχίτιδα. Ιωάννης Γαροφαλάκης Παθολόγος

ARMA modely čast 2: moving average modely (MA)

Biogénne pozitrónové PET rádionuklidy

Deti školského veku roky. Deti - vek batolivý/ predškol. roky chlapci dievčatá študujúci zvýš.fyz. aktivita 1,6 1,7 1,5 1,3 1,0

Υδατάνθρακες. Χρήστος Κρούπης, MSc, PhD. Επίκουρος Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Αττικόν Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο

Harmonizované technické špecifikácie Trieda GP - CS lv EN Pevnosť v tlaku 6 N/mm² EN Prídržnosť

KATABOLIZMUS LIPIDOV BIOCHÉMIA II TÉMA 05 DOC. RNDR. MAREK SKORŠEPA, PHD.

IMUNITNÝ SYSTÉM výber z prednášky

Rozsah hodnotenia a spôsob výpočtu energetickej účinnosti rozvodu tepla

3. Striedavé prúdy. Sínusoida

Gymnázium Jána Adama Raymana. Penicilín. Ročníková práca z chémie. 2005/2006 Jozef Komár 3.C

KATALÓG KRUHOVÉ POTRUBIE

Modul pružnosti betónu

ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΑΝΟΣΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑΣ ΣΤΗ ΣΗΨΗ

Život vedca krajší od vysnívaného... s prírodou na hladine α R-P-R

CHÉMIA Ing. Iveta Bruončová

Zateplite fasádu! Zabezpečte, aby Vám neuniklo teplo cez fasádu

13. ZÁKLADNÉ VZŤAHY MEDZI IMUNITNÝM, NERVOVÝM A ENDOKRINNÝM SYSTÉMOM

D-Glucosamine-derived copper catalyst for Ullmann-type C- N coupling reaction: theoretical and experimental study

Biologická olympiáda Ročník : 47 Školský rok : 2012/2013 Kolo : Celoštátne Kategória : A Teoreticko-praktická časť.

Supplementary material

Mandelamide-Zinc Catalyzed Alkyne Addition to Heteroaromatic Aldehydes

ANTIGÉNY Epitopes (antigenic determinants). epitopes lymphocytes antibodies

ZADANIE 1_ ÚLOHA 3_Všeobecná rovinná silová sústava ZADANIE 1 _ ÚLOHA 3

Sacharidy karbohydráty - hydráty uhlíka, uhľohydráty, glycidy

Kompilátory. Cvičenie 6: LLVM. Peter Kostolányi. 21. novembra 2017

Kontrolné otázky z jednotiek fyzikálnych veličín

Analýza údajov. W bozóny.

24. Základné spôsoby zobrazovania priestoru do roviny

Deliteľnosť a znaky deliteľnosti

CHEST COPD. George Dimopoulos, MD, FCCP; Ilias I. Siempos, MD; Ioanna P. Korbila, MD; Katerina G. Manta, MD; and Matthew E. Falagas, MD, MSc, DSc

Presence of an Infection Control Committee Presence of an Infection Control Team Round the facility for infection control. no 61.

6 APLIKÁCIE FUNKCIE DVOCH PREMENNÝCH

ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΕΦΗΒΕΙΑ. Ευφηµία Παπαδοπούλου-Αλατάκη Επίκουρη καθηγήτρια παιδιατρικής-παιδιατρικής ανοσολογίας Δ Παιδιατρική Κλινική ΑΠΘ

Free Radical Initiated Coupling Reaction of Alcohols and. Alkynes: not C-O but C-C Bond Formation. Context. General information 2. Typical procedure 2

Klinický obraz a diagnostika vlasatobunkovej leukémie

172,,,,. P,. Box (1980)P, Guttman (1967)Rubin (1984)P, Meng (1994), Gelman(1996)De la HorraRodriguez-Bernal (2003). BayarriBerger (2000)P P.. : Casell

Jednotkový koreň (unit root), diferencovanie časového radu, unit root testy

Klasifikácia látok LÁTKY. Zmesi. Chemické látky. rovnorodé (homogénne) rôznorodé (heterogénne)

a autoimunitné choroby

Nukleové kyseliny a proteosyntéza

Termodynamika. Doplnkové materiály k prednáškam z Fyziky I pre SjF Dušan PUDIŠ (2008)

alu OKNÁ, ZA KTORÝMI BÝVA POHODA DREVENÉ OKNÁ A DVERE Profil Mirador Alu 783 Drevohliníkové okno s priznaným okenným krídlom.

Forever IMMUBLEND TM

Výpočet. grafický návrh

Preparation of Hydroxyapatite Coatings on Enamel by Electrochemical Technique

Τα περιοδικά Science και Nature από το 2009 είναι πλέον διαθέσιμα και ηλεκτρονικά μέσω της ιστοσελίδας της βιβλιοθήκης.

Synthesis of α-deoxymono and -Difluorohexopyranosyl. 1-Phosphates and Kinetic Evaluation with Thymidylyl- and. Guanidylyltransferases

Τμήμα Επιδημιολογικής Επιτήρησης και Παρέμβασης

Electronic Supplementary Information

Πανδηµική γρίπη A(H1N1) 2009 και η σηµασία του εµβολιασµού στη συλλογική ανοσία. Συλλογική ανοσία. (herd immunity) ιασπορά της µόλυνσης: όλοι επίνοσοι

Procedure 2(b) (obvious errors in a number of language versions)

Staromlynská 29, Bratislava tel: , fax: http: // SLUŽBY s. r. o.

Komplexné čísla, Diskrétna Fourierova transformácia 1

Prevencia recidivujúcich infekcií dýchacích ciest z pohľadu klinického imunológa a alergológa

Τμήμα Επιδημιολογικής Επιτήρησης και Παρέμβασης

Spojité rozdelenia pravdepodobnosti. Pomôcka k predmetu PaŠ. RNDr. Aleš Kozubík, PhD. 26. marca Domovská stránka. Titulná strana.

Prínos prietokovej cytometrie v diagnostike vybraných indolentných lymfómov

Lewis Acid Catalyzed Propargylation of Arenes with O-Propargyl Trichloroacetimidate: Synthesis of 1,3-Diarylpropynes

SUPPORTING INFORMATION

met la disposition du public, via de la documentation technique dont les rιfιrences, marques et logos, sont

Monitoring mikrobiálnych pomerov pôdy na kalamitných plochách Tatier

SUPPORTING INFORMATION. Polystyrene-immobilized DABCO as a highly efficient and recyclable organocatalyst for Knoevenagel condensation

ΑΛΚΑΛΟΕΙΔΩΝ ΘΡΥΠΤΟΦΑΝΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Λ. ΖΩΓΡΑΦΟΣ

Transcript:

GLYKOKONJUGOVANÉ VAKCÍNY ANNA FLEISCHHACKEROVÁ, PAVOL FARKAŠ a SLAVOMÍR BYSTRICKÝ Oddelenie imunochémie glykokonjugátov, Chemický ústav, Slovenská akadémia vied, Dúbravská cesta 9, 845 38 Bratislava chemflei@savba.sk Došlo 16.9.13, prijaté 25.9.13. Kľúčové slová: glykokonjugát, konjugácia, polysacharid, antigén, vakcína, lymfocyty, imunologická pamäť Obsah 1. Úvod 2. Vakcíny na báze sacharidov glykokonjugáty 3. Chémia glykokonjugátov 3.1. Polysacharidy a oligosacharidy, viacbodové a jednobodové viazanie 3.2. Syntetické sacharidy 3.3. Využitie ramienok 4. Spracovanie glykokonjugátu bunkami imunitného systému 5. Záver 1. Úvod V posledných rokoch bol pozorovaný enormný výskyt infekčných mikroorganizmov rezistentných voči väčšine používaných antibiotík, čím sa významne sťažuje úspešné liečenie týchto infekcií. Ak je liečba neúčinná voči antibiotikám prvej voľby, nastupujú antibiotiká druhej, prípadne tretej voľby, ktoré sú však nákladnejšie a častokrát aj toxické. V súčasnosti sa pozornosť sústreďuje najmä do oblastí profylaxie. Trendom sa stali moderné konjugované vakcíny, ktoré zabezpečujú rýchlu a účinnú ochranu hostiteľa voči útoku mikrobiálnych patogénov. Príprava konjugovaných vakcín spočíva v použití dominantného antigénu. Najčastejšie sa jedná o sacharidové štruktúry nachádzajúce sa na povrchu mikroorganizmov, ktoré sú považované za akési štruktúry prvého kontaktu medzi patogénom a hostiteľskou bunkou. Výhodou konjugovaných vakcín, oproti oslabeným živým alebo inaktivovaným celobunkovým vakcínam, je práve vznik úzko antigén-špecifickej imunitnej odpovede spojenej s tvorbou ochranných protilátok v dostatočnom množstve. Článok prináša prehľad chemických štruktúr vybraných polysacharidových antigénov a glykokonjugátových vakcín zavádzaných do praxe. Príspevok ďalej poukazuje na význam chemickej konjugácie polysacharidov na proteínové nosiče, zaoberá sa možnosťami chemickej prípravy glykokonjugátov a ponúka základné informácie o prezentácii a spracovaní glykokonjugátu bunkami imunitného systému. 2. Vakcíny na báze sacharidov glykokonjugáty Sacharidy ukrývajú vo svojej štruktúre obrovský informačný potenciál. Ich variabilita je výsledkom cyklických foriem (furanóza, pyranóza), rozsiahlej chirality a typu väzby (1-2, 1-3, 1-4, 1-6), i a vzrastá počtom sacharidových jednotiek. Sacharidy hrajú dôležitú úlohu v množstve biologických procesov, uplatňujú sa hlavne v medzibunkovej komunikácii a v rozpoznávaní buniek a patogénov. Množstvo sacharidov v eukaryotických bunkách je konjugovaných s proteínmi (glykoproteíny) alebo lipidmi (glykolipidy, lipopolysacharidy). U prokaryotov sa na povrchu bunky nachádzajú rôzne sacharidové štruktúry, napr. lipopolysacharid (LPS) a polysacharidová kapsula (CPS), ktorá je zložená z množstva opakujúcich sa oligosacharidových jednotiek. Polysacharidový vonkajší obal pridáva povrchu bakteriálnych buniek vysoký stupeň hydrofilnosti, čo zvyšuje ich odolnosť voči fagocytóze bunkami imunitného systému, podporuje bakteriálnu adhéziu, stimuluje mikrokolonizáciu. Nesporne sa tak považuje za významný virulentný faktor 1. Dôležitú úlohu v patogenéze a manifestácií infekcie teda zohrávajú povrchové polysacharidy mikroorganizmov, ktoré sa stali základom pre konštrukciu subcelulárnych vakcín. Bakteriálne polysacharidy sú však veľmi slabé imunogény a patria do T-nezávislej skupiny antigénov (TI-antigény) 2. Na rozdiel od T-závislých antigénov (TD), ktorými sú hlavne proteíny, T-antigény (sacharidy) nevyvolávajú tvorbu dlhotrvajúcej imunologickej pamäte, pretože k indukcii imunitnej odpovede nevyžadujú kooperáciu s T H -lymfocytmi. T-nezávislé antigény môžeme rozdeliť do dvoch podskupín podľa toho, akým spôsobom aktivujú B-lymfocyty. Do prvej skupiny (TI-1) patrí hlavne bakteriálny lipopolysacharid (LPS). TI-1 sú definované ako antigény so schopnosťou indukovať proliferáciu a diferenciáciu zrelých aj nezrelých B-lymfocytov. Pri tomto druhu protilátkovej reakcie dochádza hlavne k tvorbe nízkoafinitných protilátok triedy IgM. Druhý typ T-nezávislých antigénov (TI-2) má charakteristickú štruktúru sú to polyméry zložené z opakujúcich sa základných jednotiek, ako sú napr. mikrobiálne povrchové polysacharidy (kapsulárny polysacharid). TI-2 aktivujú len zrelé 120

B-lymfocyty, ktoré tvoria špecifické imunoglobulíny, nedochádza však k tvorbe pamäťových buniek 3,4. Vo všeobecnosti stále platí, že pre indukovanie účinnej a dlhodobej imunitnej ochrany je nevyhnutná účasť T-lymfocytov. V roku 1931 Avery a Goebel ako prví pripravili konjugovanú vakcínu pozostávajúcu z povrchového polysacharidu S. pneumoniae typu 3 a konského sérového albumínu. Zistili, že práve konjugáciou sacharidu k proteínu je možné vytvoriť z pôvodne T-lymfocyt nezávislého antigénu T-závislý antigén 5. Imunizácia takto pripravenými glykokonjugátmi vedie teda k spolupráci T- a B- lymfocytov, čoho výsledkom je tvorba vysokoafinitných sacharid-špecifických IgG protilátok, dochádza k prepnutiu protilátkovej triedy IgM na IgG a v neposlednom rade k tvorbe pamäťových B-buniek a dlho žijúcich pamäťových T-buniek, čím sa zabezpečí dlhotrvajúca ochrana. Glykokonjugátová vakcína proti patogénnym mikroorganizmom bola na imunizáciu ľudí prvýkrát použitá na konci 80. rokov. Prvým veľkým cieľom bolo skonštruovanie účinnej vakcíny, ktorá by dokázala ochrániť deti ako aj dospelých pred infekciou spôsobenou baktériou Haemophilus influenzae typu b (Hib). Hib bol dovtedy hlavnou príčinou bakteriálnej meningitídy v USA, avšak po uvedení glykokonjugátovej vakcíny na trh došlo až k 95% zníženiu výskytu meningitídy spôsobenej práve týmto patogénom. Tento obrovský úspech otvoril dvere pre výskum ďalších definovaných glykokonjugátov z prírodných (natívnych), depolymerizovaných alebo synteticky pripravených sacharidov 6,7. Dnes už existuje niekoľko, do praxe zavádzaných glykokonjugátových vakcín, ktoré úspešne eliminujú výskyt infekčných chorôb, spôsobených patogénmi Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi Vi, ako aj spomínaným Haemophilus influenzae (tab. I). Imunogenicita glykokonjugátov je rôzna a táto variabilita závisí najmä od štruktúry použitého sacharidu (tab. II). 3. Chémia glykokonjugátov 3.1. Polysacharidy a oligosacharidy, viacbodové a jednobodové viazanie Príprava konjugátov z vysokomolekulových prírodných polysacharidov sa obvykle vykonáva viacbodovým, neselektívnym viazaním na proteín (obr. 1). Ďalšou možnosťou je selektívna degradácia polysacharidu a využitie takto získaných produktov. Menšie polysacharidy a oligosacharidy sa môžu viazať selektívne využitím určitej funkčnej skupiny, napr. redukujúceho konca, karboxylovej skupiny (KDO, 3-deoxy-D-mano-2-oktulozónová kyselina, štrukturálna súčasť LPS) alebo využitím aminoskupiny (GlcN) na štruktúrnej časti zvanej core (jadro) v prípade lipopolysacharidov a lipooligosacharidov. Kapsulárny polysacharid Haemophilus influenzae typ b ( 3)-β-D-Ribf-(1 1)-ribitol-5-(PO 4 ) bol využitý na prípravu rôznych typov glykokonjugátov, ktoré sú súčasťou komerčných vakcín 34. Selektívnou hydrolýzou polysacharidu sa získala frakcia oligosacharidu ribozylribitolfosfátu (n = 3 10), ktorý sa redukčnou amináciou viazal na proteín (obr. 1b) 35. Natívny CPS sa po reakcii s brómkyánom (CNBr) a dihydrazidom kyseliny adipovej konjugoval k proteínu (obr. 1a) 36,37. Kovalentným viazaním polysacharidov na imunogénne proteíny sa ukázal potenciál konjugovaných vakcín v prevencii bakteriálnych ochorení. Pre Haemophilus influenzae typu b sa uvádza veľmi vysoká úspešnosť imunizácie (> 95 %), čo napovedá o možnosti globálnej kontroly ochorenia vyvolaného týmto patogénom 38. Výsledky imunizácie podobnými konjugovanými vakcínami na základe kapsulárnych polysacharidov proti Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a Salmonella typhi sú tiež sľubné. Jodistanová oxidácia vicinálneho diolu na terminálnom neredukujúcom konci polysacharidu meningokoku séroskupiny B (NeuNAc ) dáva aldehyd, ktorý sa využil na konjugáciu reduktívnou amináciou 7. Konjugácia meningokokového lipooligosacharidu (LOS) cez redukujúci koniec na štruktúrnej časti lipid A zachováva epitopy (O-špecifický reťazec LOS) a konjugovaná vakcína má vďaka lipidovej časti zlepšené imunologické vlastnosti 39. Viazanie sacharidu kovalentnou väzbou na proteín, úplné odstránenie nezreagovaných molekúl a presná charakterizácia konjugátu sú kľúčové. Voľný sacharid, resp. Sacharid O O C H N Proteín OH NH a b HO HN Obr. 1. Schématické znázornenie prípravy glykokonjugátu z polysacharidu: viacbodovým neselektívnym viazaním na proteín s využitím BrCN (a); selektívnym jednobodovým viazaním oligosacharidov pripravených degradáciou PS, využitím redukčnej aminácie (b) 121

Tabuľka I Prehľad glykokonjugátových vakcín na báze povrchových polysacharidov pochádzajúcich z patogénnych mikroorganizmov Organizmus Sacharidová časť a Proteínový nosič b Stav Referencie Haemophilus influenzae typ b (Hib) Neisseria meningitidis skupina C CPS CRM197 licencované HibTiter, VaxemHib CPS (oligosacharid) TT licencované QuimiHib (Kuba) CPS (vysoká Mw) TT licencované ActHib CPS (redukovaná veľkosť) OMPs licencované PedvaxHIB derivát De-O-Ac CPS TT licencované NeisVac C (oligosacharid) CPS (oligosacharid) CRM197 licencované Meningitec, Menjugate Salmonella typhi Vi O-acetyl pektín repa Fáza III cit. 30 Shigella flexneri LPS (O-reťazec) repa Fáza III cit. 31 Shigella sonnei LPS (O-reťazec) repa Fáza III cit. 31 Streptococcus pneumoniae CPS (sk. 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, CRM197 licencovaná Prevenar 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F a 23F) S. pneumoniae CPS (sk. 4, 6B, 9V, 14, 19F, CRM197 licencované Prevenar 23F, 18C ) S. pneumoniae CPS (sk. 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, PHiD licencovaná Synflorix 14, 18C, 19F, 23F) S. pneumoniae skupina 9V CPS (sk. 9V) OMPs licencované cit. 32 S. pneumoniae skupina 7F CPS (sk. 7F) DT, TT Fáza III cit. 33 a CPS kapsulárny polysacharid, LPS lipopolysacharid, b CRM197 rekombinantný difterický toxín, TT tetanový toxoid, OMPs proteíny vonkajšej membrány (N. meningitidis typ b), repa rekombinantný exotoxín A (P. aeruginosa), PHiD rekombinantný proteín D (netypizovaný H. influenzae), DT difterický toxoid proteín by mohol významne skresľovať imunologickú charakterizáciu produktu. Na prečistenie konjugátu od nezreagovaného proteínu resp. sacharidu sa najviac využíva separácia na základe molekulovej hmotnosti. Problém však nastáva, ak sa na konjugáciu použije polysacharid, ktorého molekulová hmotnosť je rádovo vyššia ako molekulová hmotnosť proteínu. Produkt konjugácie má potom zvyčajne podobnú molekulovú hmotnosť ako pôvodný polysacharid, a preto môže byť zložité, alebo aj nemožné, tieto časti separovať. V tomto prípade je výhodnejšie využiť iné metódy, napríklad separáciu bielkoviny od polysacharidu a konjugátu na základe ich rôznych hydrofóbnych interakcií 40. 3.2. Syntetické sacharidy Napriek nesporným úspechom konjugovaných vakcín vyrobených z prírodných polysacharidov alebo ich derivátov, požiadavka presnej charakterizácie konjugátov zvyšuje tlak na prípravu vytipovaných a presne definovaných sacharidových epitopov. Tieto oligosacharidy (tri- až hexasacharidy) sa potom pomocou vhodne zvoleného ramienka viažu na proteín. Zavedením vhodných funkčných skupín na ramienko (aj na proteín) sa môže efektivita konjugácie významne zvýšiť, a navyše nezreagovaný sacharid sa môže recyklovať. Synteticky pripravený terminálny hexasacharid LPS Vibrio cholerae sérotyp O1 Ogawa sa porovnal s mono- až pentasacharidom s cieľom zistiť minimálnu potrebnú dĺžku reťazca pre adekvátnu imunitnú odpoveď po naviazaní na proteín (BSA, bovínny sérový albumín). Zistilo sa, že kým aj konjugáty menších sacharidov sú dobré imunogény, nenavodzujú tvorbu vibriocídnych protilátok na takej úrovni ako hexasacharid alebo prírodný LPS. Uvažuje sa, že menšie sacharidy nemajú celý potrebný epitop na navodenie požadovanej imunitnej odpovede 41. Konjugácia predmetných sacharidov sa uskutočnila naviazaním 3,4-dietoxycyklobut-3-én-1,2-diónu na aminoskupinu ramienka aglykónu pri ph 7. Konjugácia s proteínom prebieha pri ph 9, nezreagovaný sacharid sa môže ľahko izolovať 42. Podobný postup sa použil aj na prírodný LPS Vibrio cholerae sérotyp O1 Inaba a Ogawa 43. 122

Tabuľka II Prehľad štruktúr povrchových polysacharidov z patogénnych baktérií použitých pri konštrukcii konjugovaných vakcín Mikroorganizmus Haemophilus influenzae typ b 8,9 Neisseria meningitidis skupina A 10,11 Neisseria meningitidis skupina B 12 Neisseria meningitidis skupina C 11,12 Neisseria meningitidis skupina W135 13,11 Polysacharid 3)- -D-Ribf-(1 1)-D-Ribitol-(5 OPO3 6)- -D-ManpNAc(3/4OAc)-(1 OPO3 8)- -D-Neup5Ac-(2 9)- -D-Neup5Ac(7/8OAc)-(2 6)- -D-Glcp-(1 4)- -D-Neup5Ac(9OAc)-(2 Neisseria meningitidis skupina Y 11,13 6)- -D-Galp-(1 4)- -D-Neup5Ac(9OAc)-(2 Salmonella typhi Vi 14 4)- -D-GalpNAcA(3OAc)-(1 Streptococcus pneumoniae Typ 1 15 3)-D-AAT- -Galp-(1 4)- -D-GalpA(2/3OAc)-(1 3)- -D-GalpA-(1 S. pneumoniae Typ 3 16 3)- -D-GlcA-(1 4)- -D-Glcp-(1 S. pneumoniae Typ 4 17 3)- -D-ManpNAc-(1 3)- -L-FucpNAc-(1 3)- -D-GalpNAc-(1 4)- -D- Galp2,3(S)Py-(1 S. pneumoniae Typ 5 18 4)- -D-Glcp-(1 4)-[ -L-PnepNAc-(1 2)- -D-GlcpA-(1 3)] - -L- FucpNAc-(1 3)- -D-Sugp-(1 S. pneumoniae Typ 6A 19 2)- -D-Galp-(1 3)- -D-Glcp-(1 3)- -L-Rhap-(1 3)-D-Rib-ol-(5 P S. pneumoniae Typ 6B 20 2)- -D-Galp-(1 3)- -D-Glcp-(1 3)- -L-Rhap-(1 4)-D-Rib-ol-(5 P S. pneumoniae typ 7F 21 6)-[ -D-Galp]- -D-Galp-(1 3)-(2-OAc)- -L-Rhap-(1 4)- -D-Glcp-(1 3)- [ -D-GlcpNAc-(1 2)- -L-Rhap-(1 4)]- -D-GalpNAc-(1 S. pneumoniae Typ 9V 22 4)- -D-GlcpA(2/3OAc)-(1 3)- -D-Galp-(1 3)- -D-ManpNAc(4/6OAc)- (1 4) - -D-Glcp-(1 4)- -D-Glcp-(1 S. pneumoniae Typ 14 23 4)- -D-Glcp-(1 6)-[ -D-Galp-(1 4)]- -D-GlcpNAc-(1 3)- -D-Galp-(1 S. pneumoniae Typ 18C 24 4)- -D-Glcp-(1 4)-[ -D-Glcp(6OAc) (1 2)][Gro-(1 P 3)]- -D-Galp- (1 4) S. pneumoniae typ 19A 25 4)- -D-ManpNAc-(1 4)- -D-Glcp-(1 3)- -L-Rhap-(1 P S. pneumoniae Typ 19F 26 4)- -D-ManpNAc-(1 4)- -D-Glcp-(1 2)- -L-Rhap-(1 P S. pneumoniae Typ 23F 27 4)- -D-Glcp-(1 4)-[ -L-Rhap-(1 2)]-[Gro-(2 P 3)] - -D-Galp-(1 4)- - L-Rhap-(1 Shigella flexneri 28 2)- -L-Rhap-(1 2)- -L-Rhap-(1 3)- -L-Rhap-(1 3)- -D-GlcpNAc-(1 Shigella sonnei 29 4)-L-AltpNacA-(1 3)- -2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-D-Gal-(1 3.3. Využitie ramienok Ramienka pre spájanie molekúl sacharidov a bielkovín sa využívajú z dvoch hlavných dôvodov: i) umožňujú funkčnú skupinu posunúť ďalej a urobiť ju tak prístupnejšou a ii) umožňujú zabudovať novú, reaktívnejšiu funkčnú skupinu. Väzby tvorené v kľúčovom kroku sú najčastejšie nasledovné: amidová väzba (tvorba amidovej väzby je v skutočnosti najbežnejšia, napr. heterobifunkčné ramienko s neprírodnou skupinou na jednom konci a aminoskupinou na druhom sa použitím vhodného činidla (napr. karbodiimidu) viaže na molekulu proteínu: Staudingerova ligácia použitá na viazanie čiastočne degradovaného lipopolysacharidu Vibrio cholerae sérotyp O1 Inaba) Obr. 2. Schématické znázornenie prípravy glykokonjugátu Staudingerovou ligáciou 123

(obr. 2) 44. tioéterová väzba (derivát tiolu a maleimidu sa použil na prípravu konjugátu z čiastočne degradovaného LPS Vibrio cholerae sérotyp O1 Inaba) 45,46. cykloadície (alkín-azid 1,3-dipolárne reakcie, prehľad využitia 47, Dielsova-Alderova cylkoadícia 48 ). Popisovaná chémia je uplatniteľná všeobecne v oblastiach, kde je potrebné spájať rôzne molekuly, makromolekuly či už prírodného, syntetického alebo semisyntetického pôvodu 49 52. 4. Spracovanie glykokonjugátu bunkami imunitného systému Po vniknutí antigénu (glykokonjugátu) do organizmu dochádza k jeho naviazaniu na B-bunkový receptor (BCR), čo predstavuje pre bunku prvý kompetečný signál, ktorý zabezpečí zvýšenú expresiu MHC II molekúl a kostimulačných molekúl. Glykokonjugát (antigén) sa v ďalšom kroku dostáva dovnútra B-bunky pomocou endocytózy (exogénna cesta prezentácie antigénu), kde sa štiepi na menšie fragmenty. Polysacharidová časť glykokonjugátu je spracovaná v endolyzozóme za pomoci ROS (reaktívne formy kyslíka) na menšie oligosacharidy, proteínová časť je pomocou kyslých proteáz štiepená na peptidy. Výsledným produktom sú menšie fragmenty (komplexy) označené ako sacharid-peptid. Vzniknutý komplex sa pomocou svojej peptidovej časti viaže na MHC II molekuly a celý komplex sa následne presúva do bunkovej membrány. Naviazanie proteínovej časti komplexu sacharid-peptid na MHC II následne umožní naviazaniu viac hydrofilnej sacharidovej časti k receptoru CD4 + T H -buniek ( TCR). Proces od väzby antigénu na BCR až po jeho prezentáciu trvá približne 30 až 60 minút. Prezentovaný glykopeptid je rozpoznávaný antigénovým receptorom T H -lymfocytov (TCR). Dochádza tak k aktivácii T-lymfocytov a k interakcii medzi oboma lymfocytmi. Spojením B- a T-lymfocytov dochádza tiež k interakcii medzi kostimulačnými molekulami. B-lymfocyty vo svojej membráne konštitutívne exprimujú antigén CD40, pre ktorý je partnerskou interakčnou molekulou v membráne T-lymfocytov CD40L. Tento antigén sa objavuje v membráne len aktivovaného T-lymfocytu, na pokojných T-lymfocytoch prítomný nie je. Hoci B-lymfocyt po interakcii s T H -lymfocytom je schopný proliferácie, na svoju diferenciáciu na plazmatické a pamäťové bunky potrebuje ešte postupový signál. Tento signál vzniká po interakcii diferenciačného antigénu Obr. 3. Jednotlivé kroky spracovania a prezentácie glykokonjugátu vedúce k aktivácii CD4 + T H -buniek a následnej indukcii B- buniek produkovať sacharid špecifické protilátky triedy IgG 54 124

CD27 s jeho ligandom CD70 a cytokínmi sekretovanými aktivovanou T-bunkou (napr. IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 a i.) (obr. 3). Výsledkom úplnej aktivácie B-lymfocytov je teda ich diferenciácia na plazmatické bunky a dlhožijúce pamäťové bunky, ktoré produkujú sacharid-špecifické protilátky triedy IgG 4,53,54. 5. Záver Očkovanie, ako účinná ochrana hostiteľa voči útoku mikrobiálnych patogénov, je jedným z najúspešnejších profylaktických metód. Ako perspektívne sa javia hlavne glykokonjugované vakcíny. Príprava týchto vakcín spočíva v naviazaní dominantného povrchového oligo- alebo polysacharidového epitopu, pochádzajúceho z pôvodného patogénu, na proteínový nosič. Pokrok v chemickej konštrukcii glykokonjugovaných vakcín súvisí najmä s najnovšími trendmi v oblasti makromolekulovej chémie, ako aj s detailnými poznatkami o povrchových štruktúrach daného patogénu. Konjugované vakcíny, na rozdiel od čistých polysacharidov alebo oligosacharidov, sú schopné stimulovať T-bunkovo závislú imunitnú odpoveď. Imunizácia glykokonjugátmi tak vedie k diferenciácii B-buniek na plazmatické a dlhožijúce pamäťové bunky, ktoré produkujú vysoko afinitné neutralizujúce protilátky namierené práve voči imunodominantnej sacharidovej časti, pričom celkovo dochádza k tvorbe imunologickej pamäte. Glykokonjugované vakcíny, ako výsledok úspešného spojenia chémie a medicíny, patria nesporne k najväčším úspechom a pokrokom v oblasti boja proti infekčným chorobám. LITERATÚRA 1. Kuberan B., Linhardt R. J.: Curr.Org. Chem. 4, 653 (2000). 2. Stein K. E.: Infect. Dis. 165, 49 (1992). 3. Kontseková E., Kontsek P.: Základy imunológie. Polygrafické stredisko UK, Bratislava, 2004. 4. Buc M.: Základná a klinická imunológia. VEDA, Bratislava, 2012. 5. Avery O. T., Goebel W. F.: J. Exp. Med. 54, 437 (1931). 6. Jennings H. J., Lugowski C.: J. Immunol. 127, 1011 (1981). 7. Robbins J. B., Schneerson D.: J. Infect. Dis. 161, 821 (1990). 8. Branefors-Helander P., Erbing C., Kenne L., Lindberg B.: Acta. Chem. Scand. B. 30, 276 (1976). 9. Crisel R. M., Baker R. S., Dorman D. E.: J. Biol. Chem. 250, 4926 (1975). 10. Bundle D. R., Smith I. C. P., Jenning H. J.: J. Biol. Chem. 249, 2275 (1974). 11. Lemercinier X., Jones C.: Carbohydr. Res. 296, 83 (1996). 12. Bhattacharjee A. K., Jenning H. J., Kenny C. P., Martin A., Bundle D. R.: J. Biol. Chem. 250, 1926 (1975). 13. Bhattacharjee A. K., Jenning H. J., Kenny C. P., Martin A., Bundle D. R.: Can. J. Biochem. 54, 1 (1976). 14. Heyns K., Kiessling G.: Carbohydr. Res. 3, 340 (1967). 15. Lindberg B., Lindqvist B., Lönngren J., Powell D. A.: Carbohydr. Res. 78, 111 (1980). 16. Reeves R. E., Goebel W. F.: J. Biol. Chem. 139, 511 (1941). 17. Jones C., Currie F., Forster M. J.: Carbohydr. Res. 221, 95 (1991). 18. Jansson P. E., Lindberg B., Lindquist U.: Carbohydr. Res. 140, 101 (1985). 19. Rebers P. A., Heidelberger M.: J. Am. Chem. Soc. 83, 3056 (1961). 20. Kenne L., Lindberg B., Madden J. K.: Carbohydr. Res. 73, 175 (1979). 21. Moreau M., Richards J. C., Perry M. B., Kniskern P. J.: Carbohydr. Res. 15, 79 (1988). 22. Rutherford T. J., Jones C., Davies D. B., Elliott A. C.: Carbohydr. Res. 218, 175 (1991). 23. Lindberg B., Lonngren J., Powell D. A.: Carbohydr. Res. 58, 177 (1977). 24. Lugowski C., Jennings H. J.: Carbohydr. Res. 131, 119 (1984). 25. Katzenellenborgen E., Jennings H. J.: Carbohydr. Res. 124, 235 (1983). 26. Jennings H. J., Rosell K. G, Carlo D. J.: Can. J. Chem. 58, 1069 (1980). 27. Richards J. C., Perry M. B.: Biochem. Cell. Biol. 66, 758 (1988). 28. Kenne L., Lindberg B., Petersson K., Romanowska E.: Carbohydr. Res. 56, 363(1977). 29. Kenne L., Lindberg B., Petersson K., Katzenellenbogen E., Romanowska E.: Carbohydr. Res. 78, 119 (1980). 30. Kossaczka Z., Bystrický S., Bryla D. A., Shiloach J., Robbins J. B., Szu S. C.: Infect. Immun. 65, 2088 (1997). 31. Cohen D., Ashkenazi S., Green M., Lerman Y., Slepon R., Robin G., Orr N., Taylor D. N., Sadoff J. C., Chu C., Shiloach J., Schneerson R., Robbins J. B.: Infect. Immun. 64, 4074 (1996). 32. Blum M. D., Dagan R., Mendelman P. M., Pinsk V., Giordani M., Li S., Bohidar N., McNeely T. B.: Vaccine. 18, 2359 (2000). 33. Puumalainen T., Zeta-Capeding M. R., Kayhty H., Lucero M. G., Auramen K., Leroy O., Nohynek H.: Pediatr. Inf. Dis. J. 21, 309 (2002). 34. Lindberg A. A.: Vaccine. 17, 28 (1999). 35. Anderson P., Pichichero M. E., Insel R. A.: J. Clin. Invest. 76, 52 (1985). 36. Schneerson J., Barrera O., Sutton A., Robbins J. B.: J. Exp. Med., 152, 361 (1980). 37. Schneerson R., Robbins J. B., Parke Jr J. C., Bell C., Schlesselman J. J., Sutton A., Wang Z., Schiffman G., Karpas A., Shiloach J.: Infect. Immun. 52, 519 (1986). 38. Ada G., Isaacs D.: Clin. Microbiol. Infect. 9, 79 (2003). 39. Mieszala M., Kogan G., Jennings H. J.: Carbohydr. 125

Res. 338, 167 (2003). 40. Suárez N., Massaldi H., Fraguas L. F., Ferreira F.: J. Chromatogr. A. 1213, 169 (2008). 41. Saksena R., Ma X., Wade T. K., Kováč P., Wade W. F.: Carbohydr. Res. 340, 2256 (2005). 42. Hou S., Saksena R., Kováč P.: Carbohydr. Res. 343, 196 (2008). 43. Xu P., Alam M. M., Kalsy A., Charles R. C., Calderwood S. B., Qadri F., Ryan E. T., Kováč P.: Bioconjugate Chem. 22, 2179 (2011). 44. Grandjean C., Boutonnier A., Guerreiro C., Fournier J. M., Mulard L. A.: J. Org. Chem. 70, 7123 (2005). 45. Grandjean C., Boutonnier A., Dassy B., Fournier J. M., Mulard L. A.: Glycoconjugate J. 26, 41 (2005). 46. Grandjean C., Wade T. K., Ropartz D., Ernst L., Wade W. F.: Pathog. Dis. 67, 136 (2013). 47. Tripathi, R. P., Dwivedi, P., Sharma, A., Kushwaha, D. and Tiwari, V. K.: Click Chemistry in Glycoscience: New Developments and Strategies (Witczak Z. J., Bielski R., eds.), kap. 12. Wiley, Weinheim 2013. 48. Pozsgay V., Vieira N. E., Yergey A.: Org. Lett. 4, 3191 (2002). 49. Farkaš P., Bystrický S.: Chem. Pap. 64, 683 (2010). 50. Pozsgay V., Kubler-Kielb J.: Carbohydrate-Based Vaccines (Roy R., ed.), kap. 3. American Chemical Society, Oxford 2008. 51. Sletten E. M., Bertozzi C. R.: Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974 (2009). 52. Canalle L. A., Löwik D. W. P. M., van Hest J. C. M.: Chem. Soc. Rev. 39, 329 (2010). 53. Avci F., Kasper D.: Annu. Rev. Immunol. 28, 29 (2010). 54. Avci F. Y., Li X., Tsuji M., Kasper D. L.: Nat. Med. 17, 1602 (2011). A. Fleischhackerová, P. Farkaš, and S. Bystrický (Institute of Chemistry, Slovak Academy of Sciences, Bratislava): Glycoconjugate Vaccines This paper provides an overview of carbohydratebased glycoconjugate vaccines used in clinical practice. The structures of capsular polysaccharides mostly used in vaccine design and preparation of glycoconjugates are highlighted. Molecular mechanisms by which glycoconjugates are able to elicit T-cell-dependent immune response are mentioned. 126