ANTIGÉNY Epitopes (antigenic determinants). epitopes lymphocytes antibodies

Transcript

1 ANTIGÉNY Epitopes (antigenic determinants). Small, specific regions on antigens, called epitopes, are bound by the antigen receptors on lymphocytes and by secreted antibodies.

2 bielkovinový nosič rôzne povrchové determinanty = organické molekuly s nízkou Mr bielkovinový nosič

3

4 ANTIGÉNY Po vniknutí cudzorodej látky imunogénu do organizmu vzniká imunitná odpoveď (IO) ako reakcia IS. Podstatou tejto reakcie je rozpoznanie vlastného a nevlastného. Imunogény sú makromolekulové látky (proteíny, polysacharidy) schopné navodiť imunitnú odpoveď voči štruktúram na svojom povrchu. Antigénový determinant (epitop) je konkrétna sekvencia aminokyselín (6-9), monosacharidov, alebo z 5-6 nukleotidov, alebo haptén. Svojou veľkosťou zodpovedá približne väzbovému miestu na protilátke. Antigény sú látky zahŕňajúce imunogény, ale aj také látky, ktoré samy o sebe nie sú schopné imunitnú odpoveď vyvolať. Tieto látky s nízkou molekulovou hmotnosťou haptény sa stávajú imunogénnymi až po spojení s makromolekulou (proteínom, polysacharidom). Všetky imunogény sú Ag, ale nie všetky Ag sú imunogénne. Odpoveď IS nevzniká na celú makromolekulu, ale iba na určitý jej úsek epitop. Na jednej imunogénnej molekule môže byť rôzny počet epitopov, pričom ich schopnosť navodiť odpoveď IS býva rôzna. Nie všetky epitopy sú rozpoznávané B- aj T-lymfocytmi, preto sa rozlišujú B-epitopy a T- epitopy.

5 ANTIGÉNY Interakciu Ag determinantu a Ab zabezpečujú hlavne nekovalentné, reverzibilné väzby (elektrostatické, vodíkové, hydrofóbne a Van der Walsove), teda sú relatívne slabé a všetky si vyžadujú tesnú blízkosť interagujúcich miest a spojenia sa prirovnávajú ku kľúču azámke. Pri reakcii Ag s Ab v živom organizme (in vivo) dochádza ku inhibícii biologickej účinnosti patogénov. Antigény sa rozdeľujú aj podľa aktivity T a B buniek v organizme a to na Ag nezávislé od týmusu (týmus independentné, Ag TI) a na antigény závislé of týmusu (týmus dependentné, Ag TD). Ag TI stimulujú B lymfocyty k tvorbe protilátok bez účasti T lymfocytov. Jedná sa väčšinou o polyméry s opakujúcimi sa antigénnymi determinantami, ktoré sú ťažko degradovateľné (LPS). Väčšina Ag patrí medzi Ag TD, kde dôležitú úlohu zohrávajú aj T lymfocyty.

6 ROZDELENIE ANTIGÉNOV Podľa funkcie: Kompletný funkčný = imunogén Nekompletný = haptén (haptein pripevniť) Podľa pôvodu: - prirodzené - syntetické - arteficiálne fyzikálnym alebo chemickým spôsobom pozmenené prirodzené Ag Podľa vzťahu k určitému organizmu: - exogénne (cudzie bb., bb. štruktúry a molekuly; mikroorganizmy, vírusy, peľ, liečivá, Ag transplantovaných tkanív) - endogénne - sú súčasťou vlastných bb. a tkanív = autoantigény autológne Ag

7 ROZDELENIE ANTIGÉNOV Vzhľadom na vzájomný vzťah 2 organizmov, medzi ktorými sa uskutočňuje prenos Ag (transplantácie tkanív): Xenogénne heterológne pochádzajú z jedinca iného druhu (prasa človek) Alogénne homológne (allos = iný) - pochádzajú z geneticky iného jedinca toho istého druhu (človek človek) Izogénne (isos = rovnaký) - pochádzajú z geneticky identického jedinca toho istého druhu (jednovajcové dvojča) Syngénne (syn = spolu) - pochádzajú z geneticky identického jedinca v rámci inbredného kmeňa (inbredný kmeň vzniká opakovaným krížením súrodencov po mnoho generácií) Autoantigénne autológne Ag vlastného organizmu organizmus ich toleruje, iba za určitých podmienok sa stávajú imnogénnymi autoimunitné ochorenia)

8 HETEROFILNÉ ANTIGÉNY - Zistené vo fylogeneticky nepríbuzných druhoch, napr. v bb. živočíchov a mikroorganizmov: Heterofilná príbuznosť medzi Ag A beta hemolytických streptokokov a Ag ľudského myokardu. Po streptokokovej infekcii sa v organizme nachádzajú anti streptokokové Ab, ktoré in vivo môžu reagovať krížovou reakciou s Ag svalových vlákien myokardu poškodenie tkaniva srdca beta hemolytické streptokoky - mikróby lyzujúce erytrocyty Krížová reakcia: Protilátka, ktorej tvorbu indukoval určitý Ag, reaguje s iným Ag, ktorý má rovnaké alebo podobné Ag determinanty.

9 Imunogén 2 základné vlastnosti: 1. Imunogénnosť schopnosť navodiť imunitnú odpoveď (vznik protilátok a senzibilizovaných Ly) 2. Špecifickosť schopnosť reagovať len s tými Ab, ktorých tvorbu daný Ag vyvolal. S ostatnými Ly a Ab zvyčajne nereaguje. Haptén ak je injektovaný sám o sebe nie je schopný vyvolať imunitnú odpoveď nie je imunogénny, môže len špecificky reagovať s už vytvorenými Ab, ale nedokáže vyvolať ich novú tvorbu. = organické molekuly s nízkou Mr Haptény a determinanty zodpovedajú za špecifickosť Ag - Ab reakcie bielkovinový nosič Imunitnú odpoveď môže vyvolať len celý komplex = imunogén

10 VLASTNOSTI IMUNOGÉNOV Fyzikálne - molekulová hmotnosť: Mr > 10 kd 10 kd slabo imunogénne, > 100 kd najsilnejšie - rozpustnosť: korpuskulárne Ag, nerozpustné koloidné Ag, rozpustné čím < rozpustnosť koloidných Ag, tým > imunogénnosť Chemické (štruktúra a degradovateľnosť) Biopolyméry bielkoviny, polysacharidy, nukleoproteíny (NK sú imunogénne len vo forme nukleoproteínov) Čisté lipidy sú len hapténmi, imunogénne sú len v komplexoch s proteínmi alebo polysacharidmi. Biologické (druhová vzdialenosť)

11 Chemické zloženie imunogénov Typ Ag polypeptidy proteíny polysacharidy glykoproteíny nukleoproteíny Príklad proteohormóny plazmatické, mikrobiálne, enzýmy kapsuly baktérií Ig, Ag krvných skupín, MHC antigény chromatín, ribozómy lipoproteíny plazmatické, bb. membrány lipopolysacharidy bb. steny G- baktérií = endotoxíny

12 VLASTNOSTI IMUNOGÉNOV Schopnosť navodiť IO nie je pri všetkých Ag rovnako silná. Sila Ag závisí najmäodmr,aleajodpočtu povrchových determinantov. Najsilnejšie Ag proteíny a polysacharidy Výnimka: želatína má napriek svojej Mr veľmi malý počet epitopov, preto je slabým imunogénom. Keď sa na želatínu naviažu haptény s nízkou Mr, preberú funkciu determinantov. Takto modifikovaná želatína môže byť imunogénna. Stupeň imunogénnosti ovplyvňuje aj degradovateľnosť molekuly imunogénu. Pri jej rozklade môže dôjsť k deštrukcii epitopov a tým k znižovaniu imunogénnosti ako aj k zmene špecifickosti. Čiastočná degradácia Ag v makrofágoch však môže mať za následok objavenie sa nových epitopov. Ak tieto nové epitopy sú v natívnej molekule skryté a teda pre receptory imunokompetentnej bunky neprístupné, môže sa po opracovaní Ag zvýšiť jeho imunogénnosť.

13 VLASTNOSTI IMUNOGÉNOV Biologické - cudzorodosť - druhová vzdialenosť - čím > fylogenetický rozdiel medzi organizmom, z ktorého Ag pochádza, a organizmom, do ktorého Ag vniká, tým > je jeho imunogénnosť (vírus človek) Aby cudzorodá látka mohla byť Ag, nestačí jej len jedna z vlastností, nato je potrebná vhodná kombinácia uvedených vlastností. Imunogény sa v prírode vyskytujú zvyčajne vo veľmi komplexnej forme, sú to najmä vírusy, mikróby, živočíšne bb. a ich súčasti) Schopnosť reagovať IO na určitý Ag sa dedí ako autozomálny dominantný znak. Kvalitu a smer IO určujú popri genóme imunizovaného jedinca a vlastnostiach Ag aj iné faktory, a to najmä miesto, kde vzniká kontakt Ag s organizmom (spôsob imunizácie) a množstvo Ag.

14 BAKTERIÁLNE Ag - sú endotoxíny G- baktérií - endotoxín = lipopolysacharidový komplex z b. steny G- baktérií (nejde o toxín pochádzajúci z vnútra baktérie, ale o látku, ktorá sa nachádza v ich povrchovej vrstve) - endotoxíny najrozšírenejšie bakteriálne Ag, s ktorými sa organizmus teplokrvných živočíchov dostáva do styku už ihneď po narodení (kolonizácia črevného traktu baktériami). Podmienkou prežitia je vytvorenie účinných Ab. - endotoxínový komplex sa uvoľňuje do okolitého prostredia vtedy, keď sa baktérie rozrušia. Endotoxín spúšťa veľké množstvo biologických reakcií: - menšie dávky spôsobujú zvýšenie telesnej T, zmeny v množstve cirkulujúcich Leu, zvýšenie glukózy v krvi a iné - ovplyvňuje cievny systém, uvoľnenie katecholamínov a glukokortikoidov, metabolizmus bb. a tkanív - menia FA a znižujú prirodzenú rezistenciu proti infekcii - väčšia dávka endotoxínov smrteľný šok

15 BAKTERIÁLNE Ag - Streptokoky A vylučujú exotoxín streptolyzín O. Protilátky proti streptolyzínu O sa volajú antistreptolyzín O (ASLO). Vysoký titer týchto protilátok (vysoké ASLO) svedčí o čerstvej streptokokovej infekcii. Najimunogénnejšia časť streptokokov A je ich povrchová zložka M- proteín. Táto bielkovina brzdí fagocytózu. Ak sa utvoria protilátky proti M- proteínu, fagocytóza sa zvýši.

16

17

18 SUPERANTIGÉNY Nie všetky antigény, ktoré sa viažu na molekuly MHC II.tr., sú viazané v peptidovom žliabku. Tým sa odlišujú od iných antigénov a patria do skupiny známej pod názvom superantigény (SAgs). SAgs sa odlišujú spôsobom väzby, čo im umožňuje stimulovať veľmi veľké množstvo T buniek, často s katastrofálnymi následkami. SAgs sú produkované mnohými odlišnými patogénmi, včítane baktérií, mykoplaziem a vírusov. SAgs sú prezentované antigén prezentujúcimi bunkami za pomoci molekúl MHC II.tr., ale nie sú viazané v peptidovom žliabku (kde sa nachádza väzbové miesto pre antigén), teda neboli spracované antigén prezentujúcimi bunkami. Sú to proteínové molekuly (hlavne bakteriálneho pôvodu, ale aj vírusov napr. besnoty), ktoré stimulujú určitý subtyp T buniek a to priamym a tesným naviazaním sa na MHC molekuly II.tr. na antigén prezentujúcich bunkách a zároveň na V β domény T-bunkových receptorov, čím sa stimuluje aktivácia T buniek. Stafylokokové enterotoxíny po požití infikovanej potravy (sú zodpovedné za otravy jedlom), s následným vznikom toxického šoku, tiež stimulujú mnoho T buniek práve týmto spôsobom.

19 Cα Cβ Vα Vβ α1 β1 normal Ag Superantigen α2 β2

20 SUPERANTIGÉNY Bakteriálne toxíny, napr. Staphylococcus aureus pôsobia ako SAgs, aktivujú súčasne veľké percento T buniek s následnou sekréciou veľkého množstva cytokínov, ktoré môžu spôsobiť šokové stavy u hostiteľa. SAgs sú takým typom antigénu, ktorý aktivuje tie T bunky, ktoré vykazujú špecifický V β segment (V β 3 alebo V β 11) ako súčasť ich TCR. V β segmenty sa nachádzajú na bunkovom povrchu takmer 20% z celkovej populácie T lymfocytov, teda veľké % T buniek s rôznou antigénnou špecificitou môže byť naraz aktivovaná superantigénom. SAgs sa viažu takmer výlučne na V β oblasť TCR a nie na Vα.

21 Tumoršpecifické antigény (neoantigény, onkofetálne antigény) ich štúdium je súčasťou imunológie nádorov. Sú spravidla bežne prítomné v určitých tkanivách a telových tekutinách ľudského embrya, ale po narodení obyčajne v krátkom čase buď z organizmu úplne vymiznú, alebo sa tvoria len v extrémne nízkych koncentráciách. Pri rakovinovej premene tkaniva sa však začínajú tieto antigény vo zvýšenej miere syntetizovať. Pre túto vlastnosť sa tumoršpecifické antigény nazývajú aj onkofetálnymi. Ich biologický význam je nejasný. Predpokladá sa, že nejakým spôsobom súvisia s rýchlym rastom buniek a tkanív. V pokusoch in vitro môžu byť bunky malígnych nádorov usmrtené cytotoxickými protilátkami, alebo senzibilizovanými lymfocytmi, ktorých tvorba je indukovaná neoantigénmi, prípadne môžu byť likvidované aktivovanými makrofágmi. Predpokladá sa, že in vivo sú nádory deštruované najmä mechanizmami celulárnej imunity, protilátky majú len malú úlohu. Je otázne, prečo nádory rastú, keď máme protinádorové imunitné mechanizmy? Odpoveď nie je jednoduchá, lebo doteraz nie je presne známy mechanizmus protinádorovej imunity.

22 Tumoršpecifické antigény (neoantigény, onkofetálne antigény) Predpokladá sa, že rast nádorov in vivo umožňuje okrem špecifických vlastností nádorovej bunky aj špecifická imunologická tolerancia (lymfatický systém nerozpoznáva neoantigény ako cudzie) ako aj imunologická blokáda protilátkami. Doposiaľ je charakterizovaných niekoľko antigénov asociovaných s nádormi. Z nich sú najlepšie preskúmané karcinoembryonálny antigén a α 1 fetoproteín.

23 Karcinoembryonálny antigén Karcinoembryonálny antigén (CEA carcinoembryonic antigen) tento špecifický antigén bol objavený v r (Gold a Freedman). Výskyt: - adenokarcinóm (zhubná rakovina žliaz) v ľudskom tráviacom systéme - v orgánoch tráviaceho traktu ľudských 2 až 6 mesačných fétov. CEA molekuly sa nachádzajú na povrchu nádorových buniek, odkiaľ sa dostávajú do krvného obehu. CEA sa nachádza vo zvýšených koncentráciách v sére pacientov s karcinómom hrubého čreva a pankreasu. CEA je glykoproteín, Mr 200 kd, obsah sacharidov je viac než 50%, jeho hlavnou zložkou je N-acetylglukozamín. Stanovenie hladiny CEA v sére má účel diagnostický, ale aj prognostický a to pred chirurgickým zákrokom a po ňom. Ak zmizne CEA z cirkulácie, to znamená, že nádor bol z tela odstránený. Pretrvávanie zvýšenej hladiny CEA poukazuje na prítomnosť metastáz v organizme.

24 α 1 fetoproteín (AFP) α 1 fetoproteín (AFP) je hlavný plazmatický proteín počas vývoja ľudského fétu. Bol však dokázaný aj v sére pacientov s primárnou rakovinou pečene a aj u pacientov s teratokarcinómami (teratóm je nádor obsahujúci vlasy, zuby, kosti a iné materiály, ktoré v danej časti organizmu normálne nerastú). AFP sa syntetizuje v pečeni. Počas embryonálneho vývoja dosahuje najvyššiu koncentráciu (550 ng/ml) vo fetálnom sére v týždni gestácie. Jeho hodnota sa potom znižuje viac než stonásobne na hodnotu 2-10 ng/ml, čo je normálna hodnota u ľudí. AFP je glykoproteín s Mr 70 kd, obsahuje asi 4% sacharidov. Neboli zistené rozdiely medzi AFP z izolovaných fétov a z ľudských hepatálnych nádorov.

25 Transplantácia Už v r.1932 E.Padgett použil kožné transplantáty medzi členmi rodiny u popálených jedincov. Hoci tieto transplantáty neprežívaly dlho, dočasným prežitím umožnili reepitelizáciu, chránili pred infekciou a pred stratou telových tekutín. Už vtedy sa ukázalo, že kožné štepy blízkych členov rodiny prežívajú dlhšie než štepy náhodných darcov. V r.1937 J.B.Brown dosiahol permanentné prežívanie kože po transplantácii medzi monozygotnými dvojčatmi. Podstatu tejto transplantácie objasnil už v r Lillie, ktorý zistil, že u monozygotných dvojčiat dochádza k miešaniu krvi v placentárnej cirkulácii, čo neskôr bolo dokázané, a je to podstatou vzniku tolerancie Základným pravidlom v biológii je, že organizmus v záujme zachovania svojej jedinečnosti sa bráni pred cudzorodými bunkami a tkanivami a preto ich odvrhuje. Transplantácia je prenos živých buniek, tkanív a orgánov z jedného miesta na iné u toho istého jedinca (autotransplantácia), alebo medzi dvoma rôznymi jedincami, ktorí môžu byť geneticky totožní (jednovaječné dvojčatá), alebo medzi príslušníkmi inbredného kmeňa, resp. medzi jedincami, ktorí sa od seba antigénne líšia.

26

27

28 Transplantácia Aj napriek obrovskému technickému pokroku v medicíne a snahe lekárov pomôcť ťažko chorým ľuďom, úspešnosť transplantácií orgánov je nízka. Príčinou nie je nešikovnosť chirurgov, ale práve imunita, pretože hlavným mechanizmom neznášanlivosti tkanív darcu a príjemcu s následným odvrhnutím tkaniva je imunitná reakcia príjemcu. Naše vedomosti z oblasti regulácie imunity sú ešte nedostatočné a preto sa zatiaľ ani nedarí prekonať biologickú nezlúčivosť tkanív. Ak patria antigénne odlišní donor a recipient k rovnakému biologickému druhu, vtedy hovoríme o alogénnej transplantácii. Ak patria k inému druhu, jedná sa o xenogénnu transplantáciu. O osude transplantátu, štepu (angl. graft) rozhoduje genetický vzťah medzi darcom (donor) a príjemcom (recipient). Transplantáty prenesené medzi geneticky identickými jedincami sa prihoja, pretože je medzi nimi antigénna identita. Štepy prenesené medzi geneticky odlišnými jedincami (pri alogénnom prenose) sa neprihoja, sú odvrhnuté, vypudené. Rejekcia vypudenie je dôsledkom špecifickej imunitnej odpovede príjemcu na histokompatibilné antigény darcu. Za určitých podmienok môže byť u príjemcu navodená neschopnosť reagovať na transplantát, vzniká tzv. imunologická tolerancia.

29 Transplantácia Ak je reakcie schopný iba príjemca, dochádza k reakcii hostiteľa proti štepu, ktorá sa v angl. terminológii označuje ako host versus graft reaction (HvGR). Ak je však štep tvorený imunokompetentnými bunkami (alebo ak obsahuje určitý počet týchto buniek), reaguje štep proti hostiteľovi, reakcia sa nazýva graft versus host reaction (GvHR). Štruktúry zodpovedné za transplantačnú reakciu sú regulované histokompatibilnými génmi (gény H). Sem patria gény, ktoré určujú: 1. antigény erytrocytov 2. antigény lymfocytov 3. transplantačné antigény Uvedené delenie H génov sa opiera o metódu ich identifikácie. Antigény erytrocytov sa dokazujú predovšetkým aglutinačným testom, lymfocytové antigény hlavne lymfocytotoxickým testom a transplantačné antigény metódou tkanivových štepov (najčastejšie kožných alebo nádorových).

30 Transplantácia Podľa toho, akú intenzívnu imunitnú odpoveď vyvolávajú, rozdeľujú sa H gény na dve skupiny: 1. tie, ktoré in vivo a in vitro vyvolávajú akútnu reakciu (to sú gény hlavného histokompatibilného komplexu, MHC = major histocompatibility complex) 2. tie, ktoré spôsobujú protrahovanú chronickú reakciu (to sú gény vedľajšieho histokompatibilného komplexu, non MHC). MHC je extrémne polymorfný systém. U myší, ale aj u človeka obsahuje viac ako 50 alel, avšak pre jednotlivé non-mhc sú známe najviac 3 alely. Gény MHC sú tesne viazané s génmi, ktoré regulujú intenzitu imunitnej odpovede (Ir gény). Všeobecne platí, ža antigény MHC spôsobujú akútne vypudenie transplantovaných orgánov alebo tkanív, napr. kože.

31 Transplantačné reakcie Reakcia hostiteľa proti štepu (HvGR): Pr.: transplantovaná koža je v prvých dňoch po prenose bledá. Za 2-4 dni sa štep vaskularizuje a farba sa mení na ružovú. Rozdiel medzi aloštepom a autoštepom sa zreteľne objaví po 4-7 dňoch. Ak bol prenesený autogénny štep a ružové sfarbenie pretrváva, svedčí to o krvnom zásobení s pokračovaním epitelizácie transplantovaného miesta. Štep postupne splynie s kožou príjemcu. Iný je sled reakcií, ak sa jedná o aloštep. Ten sa stáva cyanotickým, postupne nekrotizuje a po dňoch je vypudený, odpadne. Doba, za ktorú dôjde k vypudeniu štepu je určená štyrmi základnými faktormi: 1. množstvom transplantovaného tkaniva 2. imunogénnosťou darcovho transplantačného antigénu 3. stupňom genetickej rozdielnosti medzi darcom a príjemcom 4. imunitným stavom hostiteľa U príjemcu, ktorý dostane druhý štep od toho istého darcu, doba za ktorú je štep vypudený sa skracuje na 5-7 dní. U hyperimúnnych zvierat, ktoré majú v krvi protilátky proti transplantačným antigénom darcu, prebieha odvrhnutie štepu ešte skôr, než dôjde k vaskularizácii.

32 Transplantačné reakcie Reakcia štepu proti hostiteľovi (GvHR): Táto reakcia je vyvolaná imunokompetentnými bunkami, ktoré sú implantované príjemcovi, ktorý sám imunologicky nereaguje. Areaktivita môže vzniknúť: 1. ak je príjemcom novorodený organizmus 2. ak sa dospelý príjemca stane neschopným imunologicky reagovať v dôsledku imunosupresie, alebo v dôsledku jeho patologickej imunitnej nedostatočnosti. Mechanizmus vypudenia štepu je proces, ktorý sa dá rozdeliť do troch fáz: 1. rozpoznanie 2. proliferácia spojená s diferenciáciou 3. deštrukcia Fáza rozpoznania a deštrukcie prebiehajú priamo v štepe. Proliferačná a diferenciačná fáza sa rozvíjajú v lymfatických uzlinách, ktoré drenujú lôžko štepu.

33 Transplantačné reakcie Rozpoznávacia fáza Bezprostredne po transplantácii sa začínajú antigény z darcovho tkaniva vyplavovať do krvného obehu príjemcu, alebo sa prichytia na bunkách cievneho endotelu štepu. Antigén sa tak dostáva do priameho kontaktu s bunkami imunitného systému v krvnom obehu hostiteľa. Efektorová zložka imunitnej odpovede sa skladá z lymfocytov, makrofágov a polymorfonukleárov. Každý jednotlivý typ buniek zohráva špecifickú úlohu v rozvoji imunitnej odpovede. Rozpoznanie aloantigénov je funkciou Th lymfocytov. Antigény sú rozpoznávané Th bunkami buď pri prietoku krvi štepom, alebo s prispením makrofágov, ktoré vychytávajú antigény zo štepu alebo z tkanivovej tekutiny (lymfy) a potom ich prezentujú T bunkám v lymfatickej uzline (kooperácia makrofágov s T bunkami).

34 Proliferácia a diferenciácia Ak sa lymfocyty stretli s antigénmi pri prechode štepom a rozpoznali ich ako cudzie, vracajú sa do príslušných lymfatických uzlín, tam proliferujú a stimulujú ďalšie efektorové prekurzorové bunky (T a B lymfocyty). Väčšina novo senzibilizovaných buniek potom opúšťa uzlinu a krvným obehom sa dostáva do štepu, kde buď priamo alebo s pomocou ďalších systémov (PMN, špecifické protilátky, komplement) štep zničí. Určité množstvo lymfocytov pretrváva v obehu ako tzv. pamäťové bunky. Deštrukčná fáza Existuje niekoľko možných ciest, včítane ich rôznych kombinácií: 1. aktivované zabíjačské T bunky sa viažu prostredníctvom špecifických bunkových receptorov na bunky štepu a rozrušia ich. T bunky tiež uvoľňujú faktory, napr. faktor aktivujúci migráciu makrofágov (MAF), ktoré urýchľujú infiltráciu štepu mononukleárnymi bunkami 2. aktivované B lymfocyty sa diferencujú na plazmatické bunky a produkujú špecifické protilátky proti antigénom štepu. Protilátky sa môžu priamo viazať s komplementom a aktivovať ho. Mediátory zápalu potom vo zvýšenej miere lákajú PMN na miesto štepu. Rozpadom PMN sa uvoľňujú lyzozómy a proteolytické enzýmy, ktoré spôsobia deštrukciu tkaniva štepu.

35 Spôsoby imunosupresie ožarovaním X-lúčmi injektovaním kortikosteroidov podávaním protilátok proti leukocytom recipienta

36 Nádorové bunky sa líšia od normálnych buniek z ktorých vznikli a preto by mali byť rozpoznané imunitnými mechanizmami a eliminované. Odlišnosti od normálnych buniek sú však buď príliš malé, takže sú imunitným systémom ignorované, alebo nádorové bunky majú mechanizmy, ktorými paralyzujú niektoré zbrane IS. PROTINÁDOROVÁ IMUNITA Malígna transformácia buniek dôsledok zlyhania rôznych mechanizmov regulácie delenia buniek (mutáciami v tzv. onkogénoch alebo antionkogénoch). Tieto gény v svojej nemutovanej podobe kódujú rôzne normálne signalizačné molekuly (napr. proteín-kinázy), transkripčné faktory, proteíny regulujúce adhezivitu buniek, alebo apoptózu. Mutantné formy génov môžu mať konštitutívne abnormálne zvýšenú aktivitu (produkty onkogénov), alebo zníženú (produkty anti-onkogénov). To môže mať za následok: - nekontrolovatelné delenie buniek - ich únik z normálnej lokalizácie v tkanive - disemináciu do iných tkanív a - agresívny rast v nich.

37 The presentation of the peptide fragments of the tumor cell antigens in complex with HLA class I molecules

38 Nádorové antigény Prítomnosť špecifických povrchových antigénov na nádorových bunkách je nevyhnutným predpokladom pre rozpoznanie nádorových buniek imunitným systémom. Doposiaľ identifikované dve kategórie nádorových Ag: - TSA (tumor specific antigens antigény špecifické pre nádory) -TAA (tumor associated antigens antigény asociované s nádormi) TSA sem patria proteíny, ktoré sa na normálnych bunkách nevyskytujú, napr. - komplexy MHC I.tr. s naviazanými abnormálnymi fragmentami bunkových proteínov (produkty mutovaných génov). TSA sú typické pre chemicky indukované nádory a pre niektoré leukémie. - komplexy MHC I.tr. s fragmentami proteínov onkogénnych vírusov (EBV) - abnormálne formy glykoproteínov: glykozylácia, sialylácia povrchových molekúl nádorových buniek TAA sem patria už spomínané AFP a CEA

39 Membrána normálnej bunky Membrána nádorovej bunky

40 Protinádorové mechanizmy imunity Vrodené - NK, PMN, aktivované makrofágy, komplement Adaptívne - CTL, ADCC reakcie Príčiny odolnosti nádorov voči IS - variabilita nádorových buniek (vznik mutantných foriem) - malá hustota expresie nádorových Ags ( IS ich potom ignoruje) - sialylácia povrchu nádorových buniek vedie k zamaskovaniu niektorých epitopov nádorových Ags - niektoré nádory produkujú faktory inaktivujúce T bunky - niektoré nádory exprimujú na svojom povrchu FasL - indukcia apoptózy T bb. - faktory produkované niektorými nádormi inhibujú funkcie alebo životnosť DC (napr. oxid dusnatý indukuje apoptózu DC) Terapia nádorov chirurgické odstránenie, chemoterapia, rádioterapia, imunoterapia (MoAbs, a/alebo bunkami sprostredkovanými mechanizmami).

41 Nádorové bunky sa líšia od normálnych buniek z ktorých vznikli a preto by mali byť rozpoznané imunitnými mechanizmami a eliminované. Odlišnosti od normálnych buniek sú však buď príliš malé, takže sú imunitným systémom ignorované, alebo nádorové bunky majú mechanizmy, ktorými paralyzujú niektoré zbrane IS. PROTINÁDOROVÁ IMUNITA Malígna transformácia buniek dôsledok zlyhania rôznych mechanizmov regulácie delenia buniek (mutáciami v tzv. onkogénoch alebo antionkogénoch). Tieto gény v svojej nemutovanej podobe kódujú rôzne normálne signalizačné molekuly (napr. proteín-kinázy), transkripčné faktory, proteíny regulujúce adhezivitu buniek, alebo apoptózu. Mutantné formy génov môžu mať konštitutívne abnormálne zvýšenú aktivitu (produkty onkogénov), alebo zníženú (produkty anti-onkogénov). To môže mať za následok: - nekontrolovatelné delenie buniek - ich únik z normálnej lokalizácie v tkanive - disemináciu do iných tkanív a - agresívny rast v nich.

42 Význam sacharidov pre vznik nádorov V štruktúre sacharidov rovnako ako v nukleových kyselinách a proteínoch sú uložené dôležité biologické informácie. V skutočnosti sacharidy ako nositelia informácií majú najväčšiu kapacitu, pretože majú najväčší potenciál vytvárať variabilné štruktúry. Napr. z dvoch rovnakých monosacharidov môže vzniknúť 11 rôznych disacharidov, kým dve aminokyseliny môžu vytvoriť len 1 dipeptid. Nomenklatúra rôznych sacharidov je založená na variácii cukrových podjednotiek, rozdielov väzieb medzi nimi a na prítomnosti alebo absencii rozvetvených reťazcov. Sada sacharidov nádorových buniek sa výrazne odlišuje od normálnych buniek a preto môžu byť použité ako marker. Sacharidy na povrchu nádorových buniek pomáhajú vytvárať metastázy. Nádorová bunka po penetrácii do krvného obehu cirkuluje v krvi a môže opustiť krvné cievy len cez stenu žilových kapilár.

43 V kapilárach krvných ciev nádorové bunky prichádzajú do kontaktu s E - selektínmi endotelových buniek a opúšťajú krvný obeh cez priestory medzi endotelovými bunkami. (Pozn.: E-selektíny sú špeciálne povrchové adhezívne molekuly, ktoré interagujú so sacharidmi na povrchu iných buniek.) Týmto spôsobom sa nádorová bunka dostáva do iných tkanív a orgánov, kde vytvára metastázy. Nádorová bunka potrebuje na opustenie krvného obehu 8-24 h. Len jedna z buniek, ktoré sa uvoľnili z primárneho nádoru prežije a vytvorí novú kolóniu. Nádorové bunky majú na svojom povrchu tzv. adhezívne molekuly CAM (cell adhesion molecules). Tieto molekuly sa počas tvorby metastáz viažu s CAM na bunkách orgánov a tkanív, ktoré sú im najviac podobné.

44 Čím bohatšia je sieť kapilár v orgáne, tým častejšie sa v ňom vytvárajú metastázy. To je aj vysvetlením, prečo sú najčastejšie metastázy určitých nádorov v konrétnych orgánoch a tkanivách. CAM a imunoglubulíny (Igs) sú štrukturálne homológne. Lektíny (typ proteínov schopný vytvárať rýchlo, selektívne a reverzibilne väzby so sacharidmi) zohrávajú dôležitú úlohu v raste nádoru. Sú fixované povrchovými sacharidmi na nádorových bunkách, čím ochraňujú (maskujú) nádor pred imunitným systémom. Napr. ak sú bunky melanómu opracované chemickými látkami, ktoré obsahujú laktózu, ich schopnosť vytvárať metastázy je o polovicu nižšia. Nádory sú schopné indukovať tvorbu krvných ciev (angiogenéza). Krvné cievy v sekundárnych nádoroch sú viac permeabilné, preto sekundárne nádory ľahšie metastázujú.

45 The presentation of the peptide fragments of the tumor cell antigens in complex with HLA class I molecules

46 Nádorové antigény Prítomnosť špecifických povrchových antigénov na nádorových bunkách je nevyhnutným predpokladom pre rozpoznanie nádorových buniek imunitným systémom. Doposiaľ identifikované dve kategórie nádorových Ag: - TSA (tumor specific antigens antigény špecifické pre nádory) -TAA (tumor associated antigens antigény asociované s nádormi) TSA sem patria proteíny, ktoré sa na normálnych bunkách nevyskytujú, napr. - komplexy MHC I.tr. s naviazanými abnormálnymi fragmentami bunkových proteínov (produkty mutovaných génov). TSA sú typické pre chemicky indukované nádory a pre niektoré leukémie. - komplexy MHC I.tr. s fragmentami proteínov onkogénnych vírusov (EBV) - abnormálne formy glykoproteínov: glykozylácia, sialylácia povrchových molekúl nádorových buniek TAA sem patria už spomínané AFP a CEA

47 Membrána normálnej bunky Membrána nádorovej bunky

48 Protinádorové mechanizmy imunity Vrodené - NK, PMN, aktivované makrofágy, komplement Adaptívne - CTL, ADCC reakcie Príčiny odolnosti nádorov voči IS - variabilita nádorových buniek (vznik mutantných foriem) - malá hustota expresie nádorových Ags ( IS ich potom ignoruje) - sialylácia povrchu nádorových buniek vedie k zamaskovaniu niektorých epitopov nádorových Ags - niektoré nádory produkujú faktory inaktivujúce T bunky - niektoré nádory exprimujú na svojom povrchu FasL - indukcia apoptózy T bb. - faktory produkované niektorými nádormi inhibujú funkcie alebo životnosť DC (napr. oxid dusnatý indukuje apoptózu DC) Terapia nádorov chirurgické odstránenie, chemoterapia, rádioterapia, imunoterapia (MoAbs, a/alebo bunkami sprostredkovanými mechanizmami).

49

50 Biológia rakoviny, Vanda Repiská BIOLÓGIA RAKOVINY Doc. RNDr. Vanda Repiská, PhD. Ústav lekárskej biológie a genetiky, Lekárska fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Sasinkova ulica 4, I. poschodie, Bratislava, vanda.repiska@fmed.uniba.sk Rakovina vzniká nekontrolovaným množením nádorových buniek. Nádory prsníka tvarom pripomínajú kraba (nie raka = cancer), tak nepresným pomenovaním vznikol pojem rakovina. Je príčinou smrti každého piateho človeka na Zemi, pričom v tzv. rozvinutých krajinách sa, najmä u starších ľudí, postupne stáva hlavnou príčinou úmrtia. Najčastejším typom rakoviny u žien je rakovina prsníka, u mužov rakovina pľúc a hrubého čreva u oboch pohlaví. Nádorové bujnenie sa vyskytuje u všetkých mnohobunkových organizmov, zvierat aj u ľudí. Delenie buniek, rast a obnova tkanív sú veľmi presne regulovanými procesmi. Ak sa bunka, v dôsledku poruchy riadenia (deregulácie) bunkového cyklu, vymkne spod tejto prísnej kontroly môže vzniknúť nezávislá bunka, z ktorej vznikne nádor. Nádory delíme na benígne (nezhubné) a malígne (zhubné). Vznik nádoru je zvyčajne viac stupňový proces, spôsobený postupným zlyhávaním genetickej kontroly delenia buniek a nárastom ich malignity. Niektoré malígne bunky sa dokážu odpojiť a preniknúť do krvného alebo lymfatického riečiška, dostať sa do vzdialenejšieho orgánu, kde môžu vytvoriť metastázu. Tvorba metastáz je aktívny viacstupňový proces. Existujú experimentálne dôkazy, že primárny nádor už od začiatku obsahuje bunky, ktoré majú schopnosť metastázovať. Telové bunky majú svoje vlastné vnútorné biologické hodiny. Normálna bunka má určenú životnosť a stanovený počet delení. Potom zanikne prirodzenou (programovanou) smrťou (apoptóza). Pri každej replikácii DNA sa stratí krátky úsek DNA z koncov chromozómov (teloméra). Ide o sekvencie šiestich báz TTAGGG, ktoré sa v telomére opakujú priemerne asi 20 krát a pri každej replikácii sa jedno z nich nereplikuje, čím sa teloméra skracuje. Ak sa stratí aj posledné opakovanie už sa nemôže začať replikácia, bunka sa nadokáže deliť a zaniká. Zmyslom tohto mechanizmu je likvidácia starých buniek, u ktorých je zvýšená pravdepodobnosť hromadenia mutácií a môžu sa premeniť na malígne. V embryonálnych a v niektorých nádorových bunkách je aktívny enzým telomeráza, ktorý dokáže obnovovať telomerické sekvencie a tým robí bunku prakticky nesmrteľnou. Medzi najdôležitejšie faktory podporujúce vznik rakoviny patria dedičná predipozícia, vek, fajčenie, výživa, účinok onkogénnych vírusov a tzv. karcinogénne látky. Samostatné postavenie má imunitný systém, ktorý v organizme likviduje vznikajúce nádorové bunky. Zlyhanie špecifickej imunity, zvyšuje riziko vzniku nádorov, najmä zhubných, tak ako je to známe napr. o Kaposiho sarkóme u pacientov s chorobou AIDS. 1

51 Biológia rakoviny, Vanda Repiská Regulácia delenia eukaryotických buniek Delenie buniek prebieha pod dôkladnou genetickou kontrolou, je presne načasované a má definované kontrolné uzly. Ak nepokračuje správne, cyklus sa zastaví, aby sa mohli uskutočniť opravy alebo sa navodí apoptóza (programovaná smrť bunky). Význam celého procesu je v tom, aby vznikali dcérske bunky bez mutácií a aby boli likvidované rizikové bunky, ktoré by mohli zahubiť organizmus. Pre riadenie bunkového cyklu platia tri základné pravidlá: 1) normálna telová bunka sa bude deliť len po tom, ako dostane príslušný podnet z okolia, a to buď cestou endokrinnou (napr. rastovým hormónom) alebo parakrinnou (rastovými faktormi, produkovanými bunkami v okolí). Nezávisle sa delia len nádorové bunky. 2) Príkaz pre pokračovanie bunkového cyklu sa realizuje cestou tzv. signálnych dráh v bunke. Výsledkom je zvyčajne cielená expresia (transkripcia a translácia) niektorého z génov. 3) Na riadení priebehu bunkového cyklu sa podieľajú dva typy génov, tumorsupresorové gény (TSG) a protoonkogény, ktoré navzájom pôsobia. Ich vzťah sa zdá byť antagonistický, ale v skutočnosti pri každom z krokov bunkového cyklu sa nimi kódované bielkoviny (produkty) navzájom ovplyvňujú (obr. 1). Okrem týchto dvoch typov génov sa na vzniku rakoviny podieľajú aj gény opravy DNA (mutátory). bielkovina kódovaná TSG Protoonkogén proliferácia (delenie a diferenciácia buniek) Obr. 1 Interakcia tumorsupresorového génu a protoonkogénu Tumorsupresorové gény - ich normálnou funkciou je brzdiť alebo úplne zastaviť delenie buniek. Kódujú bielkoviny, ktoré buď kontrolujú niektorú etapu bunkového cyklu (napr. proteín p53), alebo riadia časovo správnu expresiu niektorých génov (napr. proteín rb1). Ich produkty teda predstavujú prirodzenú prevenciu vzniku nádorových buniek. Pri ich poruche sa zvyšuje pravdepodobnosť premeny normálnej bunky na zhubnú, pretože dôjde k vyradeniu jedného alebo viacerých kontrolných bodov v bunkovom cykle. Mutácia jednej alely zvyčajne nestačí na vznik nádorovej bunky. V ľudských nádoroch sa často vyskytuje mutovaná forma génu TP53. Tento gén kóduje bielkovinu p53. Jeho úlohou je pozastaviť začiatok replikácie DNA, čím opravné enzýmy získajú čas na opravu poškodenia DNA. Ak je poškodení príliš veľa, práve p53, navodí procesy vedúce k apoptóze. Preto sa p53 nazýva aj strážca genómu. Proteíny niektorých regulačných génov sú potrebné na replikáciu DNA. Na tieto regulačné gény sa napojí proteín rb1 (kódovaný génom RB1) a blokuje začatie replikácie. Po kontrole a oprave mutácií v DNA je rb1 uvoľnený a môže začať replikácia DNA. Ak v bunke dôjde k strate účinnosti bielkoviny, kódovanej TSG (mutáciou TSG alebo jej zablokovaním), proteíny kódované protoonkogénmi pôsobia bez kontroly a výsledkom je nebezpečenstvo deregulácie bunkového cyklu (obr. 2 ) 2

52 Biológia rakoviny, Vanda Repiská bielkovina kódovaná TSG Protoonkogén deregulácia bunkového cyklu (malignita) Obr. 2 Schéma straty účinnosti TSG a následnej deregulácie bunkového cyklu Príkladom zlyhania tumorsupresorového génu môže byť mutácia jednej alely génu TP53 (za vzniku tzv. syndrómu Li-Fraumeni), alebo mutovanie oboch alel génu RB1, ktorý vyvolá vznik retinoblastómu (nádor sietnice oka). Pri syndróme Li-Fraumeni vznikol jedinec, ktorý má v každej telovej bunke mutovanú jednu alelu TP53. Dôsledkom je, že proteín p53, ktorý produkujú jeho bunky, nie je schopný navodiť apoptózu. Následne sa v bunkách hromadia mutácie a je len otázkou času, kedy sa niektorá z nich stane malígnou. U pacientov sa vyskytujú najprv benígne a potom malígne nádory. Pri nádore sietnice v oku (retinoblastóm) je situácia trochu odlišná. Mutácia jednej alely RB1 v bunke totiž neovplyvní funkčnosť bielkoviny rb1. Sietnica je však v našom tele jednou zo štruktúr, ktoré sú najviac vystavené ultrafialovému svetlu a teda aj pravdepodobnosti, že bude gén RB1 celkom zmutovaný. Existuje dedičná a nededičná forma retinoblastómu. Nededičná forma: u zdravého človeka sa táto malignita vyskytne len ak sú v jednej bunke, postupne mutované obidve alely génu RB1. Ide zriedkavú nededičnú formu, ktorá sa prejaví zvyčajne jedným nádorom v jednom oku. Dedičná forma: naopak pri dedičnej forme, má jedinec v každej telovej bunke gén RB1 v heterozygotnom stave (dôsledok gametickej mutácie), je teda relatívne vysoká pravdepodobnosť, že v niektorej z buniek sietnice dôjde k mutácii aj druhej alely a k vzniku nádoru. Preto sa tento dedičný retinoblastóm objavuje nezriedka u detí a na oboch očiach. Príkladom straty pôsobenia TSG je zabránenie účinku bielkovín kódovaných tumorsupresorovými génmi, ako dôsledok pôsobenia onkoproteínov, po infekcii bunky niektorým DNA vírusom, napr. ľudských bradavíc (human papilloma virus - HPV). Niektoré z nich (najmä HPV 16 a 18) majú onkogénny potenciál a dávajú sa do priameho súvisu so vznikom nádorových ochorení, napr. karcinómu krčka maternice(obr. 3). Kódujú proteíny E6 a E7. Onkoproteín E6 sa viaže na p53 a E7 na Rb1 a znemožňuje ich funkciu. Obr. 3 Zhubný nádor krčka maternice (žlté šípky). Prerastanie nádorových hmôt do kanála krčku maternice (modrá šípka). Nezmenený vaječník (čierna šípka). (foto : MUDr. Michal Palkovič, PhD. Ústav patologickej anatómie LF UK v Bratislave) Protoonkogény (proliferačné gény) kódujú bielkoviny, ktoré riadia pokračovanie v bunkovom cykle. Nazývame ich onkogény, ak spôsobia dereguláciu bunkového cyklu. 3

53 Biológia rakoviny, Vanda Repiská Bielkoviny kódované protoonkogénmi sú zodpovedné za prenos signálov aktivujúcich pokračovanie v bunkovom cykle (mitogénne aktivátory) medzi bunkami, do bunky až po riadenú transkripciu určených génov. Vyskytujú sa na všetkých úrovniach riadenia bunkového cyklu (obr. 4) a tvoria signálové cesty (dráhy, kaskády) Obr. 4 Lokalizácia bielkovín kódovaných protoonkogénmi. 1. mitogénne aktivátory (endokrinná a parakrinná regulácia), 2. membránové proteíny (receptory a G proteíny), 3. plazmatické transmitery (prenášajú signál do jadra), 4. jadrové protoonkogény (transkripčné faktory, cyklíny a pod.). Pri regulácii jednotlivých procesov prebiehajúcich počas každej z etáp bunkového cyklu majú zásadný význam cyklíny. Sú to regulačné molekuly, ktoré po väzbe na príslušný enzým nazývaný cyklín-dependentná kináza (cdk) túto aktivujú. Cyklínov je 8 rodín (A až H), cyklín-dependentných kináz je tiež viacero druhov. V každej etape bunkového cyklu je prítomný iný cyklín a použije sa k nemu príslušná kináza. V adekvátnom čase je cyklín rozložený. Naopak, kinázy majú dlhšiu životnosť, ale použitý je vždy len ten typ, pre ktorý sú v jadre prítomné príslušné cyklíny. Prehľad o najdôležitejších cyklínoch a cdk pri riadení bunkového cyklu uvádza tab. 1. Tab. 1 Najdôležitejšie komplexy cyklíny, cdk a ich funkcia Cyklín cdk D 1-3 riadia 4,6 pokračovanie G 1 fázy E 2 prechod z G 1 do S fázy A 2 pokračovanie S fázy A 1 prechod z S fázy do G2 B 1 M-fáza Cyklín dependentné kinázy, po vytvorení komplexu s príslušným cyklínom, fosforylujú určitú regulačnú bielkovinu (obr. 5), čím táto sa buď aktivuje alebo inaktivuje. Preto sa tieto enzýmy nazývajú aj proteínkinázy. aktivácia cdk cyklín 4

54 Biológia rakoviny, Vanda Repiská Obr. 5 Aktívny komplex cyklín/cdk. Okrem toho existujú aj inhibítory všetkých uvedených molekúl. Súhrou všetkých zúčastnených molekúl sa zabezpečuje správne načasovanie a špecifickosť riadenia bunkového cyklu. K deregulácii bunkového cyklu a následnej malígnej transformácii bunky môže viesť aj premena protoonkogénu na onkogén (obr. 6). Stane sa to vtedy, keď ním kódovaná bielkovina zmení svoje vlastnosti (dôsledok mutácie) alebo sa jej vytvára príliš veľa (overexpresia). Obr. 6 mutácia Schéma protoonkogén onkogén deregulácia bunkového cyklu overexpresia premeny (malignita) protoonkog énu na onkogén Zmena vlastností bielkoviny kódovanej protoonkogénom je zvyčajne dôsledkom jeho mutácie. Tento proteín je potom stále aktívny a vysiela falošné podnety na pokračovanie v cykle, bez toho, aby sa uskutočnili predchádzajúce kroky v signálovej dráhe. Príkladmi sú K-ras a bcr-abl. Mutácia K-ras protoonkogénu sa vyskytuje pomerne často, napríklad u 90 % malígnych nádorov podžalúdkovej žľazy (pankreasu). V prípade bcr-abl ide o dôsledok chromozómovej prestavby (vznikne tzv. fúzny gén), ale výsledok je rovnaký proteín abl je stále aktívny a do jadra prináša príkaz na delenie (u chronickej myeloidnej leukémie). Nadmerná syntéza bielkoviny kódovanej protoonkogénom (overexpresia) vedie k deregulácii bunkového cyklu. Rýchlosť malígnej transformácie bunky je priamo úmerná nadbytku produkovaných bielkovín. Overexpresia môže byť vyvolaná dvomi spôsobmi: 1.) nadpočetnosťou (amplifikáciou) počtu alel protoonkogénu v bunke alebo 2.) poruchou riadenia transkripcie (regulačná overexpresia). 1.) Amplifikácia počtu alel môže v bunke nastať dvomi spôsobmi. a) Prvým je nerovnomerný crossing-over v profáze prvého meiotického delenia, kedy jeden z nesesterských chromatídov získa obidve alely. Ide o zriedkavý jav, ale s výnimkou protoonkogénov, sa považuje za veľmi významný pre vývoj genómu. b) Druhý spôsob amplifikácie protoonkogénov súvisí s retrovírusmi. Ide o zvláštnu skupinu RNA vírusov, ktoré sú v bunke enzýmom reverzná transkriptáza prepísané do formy 5

55 Biológia rakoviny, Vanda Repiská dvojvláknovej DNA a táto sa, ako tzv. provírus vloží (inzertuje) náhodne do niektorého z chromozómov. Prvý problém je v tom, že sa genóm retrovírusu podobá na molekulu mrna a že si môže s bunkovou mrna vymeniť časť svojej genetickej informácie (tzv. rekombinácia). Ak táto mrna vznikla transkripciou bunkového protoonkogénu (c-onc), retrovírus potom získa vírusovú kópiu tohto génu (tzv. v-onc). Druhý problém spočíva v tom, že začiatočné a koncové úseky provírusu (tzv. LTR sekvencie) veľmi silne podporujú transkripciu. Ak je v bunke potrebné transkribovať príslušný protoonkogén, sú použité všetky v jadre prítomné alely. Kým z pôvodných alel (c-onc) sa vytvorí normálny počet bielkovín, z v-onc sa (vzhľadom na účinok LTR sekvencií) vytvorí veľké množstvo danej bielkoviny. Výsledkom je náhle zlyhanie regulácie bunkového cyklu a rýchla premena normálnej bunky na malígnu, ako je to už dlhšie známe u tzv. Rousovho sarkómu alebo u niektorých akútnych leukémií. Preto označujeme retrovírusy obsahujúce v-onc ako akútne transformujúce. 2.) Regulačná overexpresia môže mať tiež dva druhy príčin. a) Prvý je dôsledkom chromozómovej mutácie, kedy došlo ku premiestneniu (translokácii) protoonkogénu na iný chromozóm, do oblasti, kde sa nachádza permanentne používaný gén. Silná transkripcia tohto génu sa potom prenesie aj na vložený protoonkogén a výsledkom je, ako napr. u Burkittovho lymfómu. b) Druhou príčinou je to, že sa pred protoonkogén inzertuje provírus z retrovírusu. Jeho LTR sekvencie zvyšujú transkripciu génu nasledujúceho za ním. Situácia síce nie je taká dramatická, ako v už uvedenom prípade, keď provírus obsahuje v-onc, ale zvýšená tvorba protoonkogénu môže spôsobiť dereguláciu bunkového cyklu. Gény opravy DNA Mutácie v DNA nastávajú pod vplyvom chemických, biologických a fyzikálnych faktorov, ale napr. aj poruchami pri jej replikácii. Aby sa tieto chyby v genetickej informácii neodovzdávali do dcérskych buniek, vyvinuli sa u všetkých organizmov, vrátane človeka, komplexné systémy zisťujúce a opravujúce mutácie v DNA. Hromadenie mutácií je vysoko rizikové, pretože môže viesť k malígnej transformácii bunky. Gény, ktoré kódujú bielkovinové systémy na zisťovanie mutácií a opravu DNA sa nazývajú mutátory. Existuje niekoľko systémov opravy DNA. Účasť génov opravy DNA na vzniku nádorov je dokázaná existenciou niektorých dedičných nádorových syndrómov. Títo pacienti majú mutované gény opravy DNA, tým nedochádza k oprave poškodenia a môže vzniknúť rakovina. Napríklad u pacientov so syndrómom Xeroderma pigmentosum je porucha génov zodpovedných za vyštiepenie poškodeného úseku tzv. excíznu reparáciu DNA, čo sa prejavuje až násobným zvýšením výskytu nádorov kože. Mutácie v génoch zodpovedajúcich za opravu chybne spárovaných báz (tzv. mismatch opravu DNA) sú príčinou dedičnej predispozície na vznik ľudského nepolypózneho kolorektálneho karcinómu (nádor hrubého čreva a konečníka, HNPCC). Spôsobuje ho mutácia v ktoromkoľvek zo šiestich známych génov. Najčastejšie sa mutácie vyskytujú v génoch MSH2 a MLH1. Ataxia teleangiektázia Typickými príznakmi sú poruchy chôdze, poruchy tvorby protilátok a s tým súvisiace respiračné infekcie a predispozícia na vznik nádorov (kože, žalúdka, maternice, prsníka...). Toto recesívne dedičné ochorenie je vyvolané mutáciami v géne ATM. Gén ATM je tumorsupresorový gén a nachádza sa na chromozóme 11. Doposiaľ sa v ňom našlo 130 rôznych mutácií. Mutácia tohto génu vedie k zvýšenej citlivosti na ionizujúce žiarenie. Nedochádza k tvorbe proteínu p53, oprava DNA je nedostatočná, čo prispieva 6

56 Biológia rakoviny, Vanda Repiská k nahromadeniu chýb v genetickom materiáli. Mutácia v géne ATM prispieva aj k urýchleniu rakoviny prsníka. Rakovina prsníka a vaječníkov Karcinómy prsnej žľazy a vaječníkov (obr. 7 a 8) sa radia k najčastejším nádorovým ochoreniam u žien v Slovenskej republike. Výskyt oboch týchto foriem rakoviny je často geneticky podmienený, asi 5 až 10 % týchto nádorov vzniká v dôsledku dedičnej predispozície. Ochorenie je indukované predovšetkým mutáciami v dvoch génoch BRCA1 a BRCA2. Teda u nositeľa mutácie v jednom či druhom géne je zvýšené riziko vzniku rakoviny prsníka a vaječníkov. Gén BRCA2 je zodpovedný aj za vznik rakoviny prsníka u mužov. Celoživotné riziko vzniku rakoviny prsníka pre ženy v bežnej populácii je 10%, kým u žien s mutáciou v týchto génoch až 85% a rakovina sa prejaví o 10 rokov skôr. Gén BRCA1 sa nachádza na chromozóme 17 a gén BRCA2 na chromozóme 13. Gény BRCA zaraďujeme k TSG sú veľké a ich produkty sa zúčastňujú na oprave zlomov v oboch reťazcoch DNA, ktoré vznikli žiarením. Mutácia v génoch BRCA1 a BRCA2 spôsobuje stratu ich funkcie, čo vedie k zvýšenému počtu chýb pri replikácii DNA a v konečnom dôsledku k nádorovému rastu. Novo objaveným génom, ktorý súvisí s rakovinou prsníka, ako aj hrubého čreva a konečníka je CHEK2. Nachádza sa na chromozóme 22. Jeho produkt je potrebný v G2 fáze bunkového cyklu. Pri poškodení nepovoľuje vstup bunky do mitózy. Obr. 7 Karcinóm prsníka (žltá šípka) obraz získaný pri vyšetrení magnetickou rezonanciou (foto: MUDr. Katarína Rauová, Onkologický ústav Svätej Alžbety Bratislava) 7

57 Biológia rakoviny, Vanda Repiská Obr. 8 Zhubný nádor vaječníka (žlté šípky) pozostávajúci z viacerých dutín vyplnených čírou tekutinou.. Zvyšky vaječníka (čierna šípka). (foto : MUDr. Michal Palkovič, PhD. Ústav patologickej anatómie LF UK v Bratislave) Rakovina prostaty Rakovina prostaty (obr. 9 a 10) je najčastejšie diagnostikovaná malignita u mužov po päťdesiatom roku života a druhá najčastejšia príčina smrti u mužov západnej populácie. Ročne je celosvetovo diagnostikovaných nových prípadov rakoviny prostaty. Napriek tomu sa vie len málo o genetickej predispozícii. Pozornosť sa zameriava najmä na prostatický špecifický antigén (PSA) a prostatický špecifický membránový antigén (PSM), ktoré sú potenciálnymi markermi pre odhalenie progresie a tvorby metastáz. Gén zodpovedný produkciu PSA sa nachádza na chromozóme 19, PSM na chromozóme 11. Nedávno boli objavené ďalšie dva lokusy HPC1 na chromozóme 1 a HPCX na chromozóme X ( muži ho dedia od matky) Obr. 9 Zhubný nádor prostaty (žlté šípky). Rozšírený močový mechúr (čierna šípka). (foto : MUDr. Michal Palkovič, PhD. Ústav patologickej anatómie LF UK) 8

58 Biológia rakoviny, Vanda Repiská Obr. 10 Rez zhubným nádorom prostaty (žlté šípky). Močové kamene (čierna šípka). vznikajúce zabránením odtoku moču z močového mechúra. (foto : MUDr. Michal Palkovič, PhD. Ústav patologickej anatómie LF UK v Bratislave) Apoptóza Zánik buniek je udalosť, ktorá sa v makroorganizme uskutočňuje priebežne. Súvisí s neustálou prestavbou a regeneráciou tkanív, orgánov a organizmu. Má aj základný význam pri remodelačných procesoch počas embryogenézy (napr. pri oddelení sa prstov alebo spriechodnení čreva). Zároveň je spôsobom, ako sa telo chráni pred rizikom pochádzajúcim z buniek, ktoré už prekročili svoju životnosť alebo z tých, ktoré sú potenciálne nebezpečné, napríklad pre riziko ich malígnej transformácie. Najstaršie známym mechanizmom zániku buniek je patologický proces - nekróza, pri ktorej je rozpad bunky (buniek) sprevádzaný zápalovou reakciou okolia. Jedným z hlavných procesov, ktoré nekrózu vyvolávajú, je praskanie lyzozómov, uvoľnenie ich enzýmov a natrávenie bunky (tzv. autolýza)a jej okolia. Apoptóza je naopak tzv. tichá bunková smrť, ktorá nevyvoláva reakciu v okolí. Aj to je dôvod, prečo bola jej existencia zistená až pred dvomi desaťročiami. Je vyvolaná sériou procesov riadených bunkou, ktoré vedú k jej zániku (obr. 11). Preto sa nazýva aj programovaná alebo fyziologická smrť bunky. Pri apoptóze sa v bunke zastaví syntéza bielkovín, netvoria sa lyzozómy. Následne dochádza k štiepeniu jadrovej DNA na krátke úseky. Rozložený chromatín sa pripája na vnútornú stranu jadrovej membrány. Súčasne sú rozložené aj bielkoviny v cytoplazme a v organelách. Bunka sa začína scvrkávať. Apoptotický proces pokračuje vytváraním mechúrikov z jadrového obalu, ktoré obsahujú zvyšky chromatínu. Zároveň sa cytoplazmatická membrána vydúva a postupne sa odškrcujú mechúriky, ktoré obsahujú zvyšky cytoplazmy, jej obsahu a jadra. Takto vznikajú tzv. apoptotické telieska, ktoré sú v tkanive pohlcované bunkami schopnými fagocytózy, napr. makrofágmi. Materiál uložený v mechúrikoch je v tkanive recyklovaný. 9

59 Biológia rakoviny, Vanda Repiská Apoptózové telieska sú pohlcované fagocytmi a rýchlo degradované. Chromatín sa oddeľuje a tvoria sa výbežky na povrchu bunky. Vznikajú apoptózové telieska. Agregácia chromatínu na jadrovú membánu a zahustenie cytoplazmy. Bunka sa scvrkáva. V bunke sa zastavujú syntetické procesy Obr. 11 Schéma priebehu apoptózy Aktivácia (vyvolanie) apoptózy je proces, ktorým sa v bunke spúšťa séria mechanizmov a reakcií vedúcich k apoptóze. Delíme ju na dva hlavné typy, exogénnu a endogénnu. Pri exogénnej aktivácii dochádza k naviazaniu signálnej molekuly z mimobunkového priestoru na špecifický receptor na povrchu bunky. Tento spôsob je bežný napríklad pri vývoji a reakcii buniek špecifickej imunity (napr. T lymfocytov). Pri endogénnej aktivácii apoptózy vzniká podnet v bunke samotnej. Najdôležitejšia časť endogénnej aktivácie apoptózy súvisí s replikáciou DNA, teda hlavne s nahromadením neopraviteľného množstva mutácií v nej a s telomérami. Súvisia s proteínom p53 a boli opísané v časti o biológii rakoviny. Proteín p53, cez sústavu (kaskádu) pomocných proteínov, uvoľní proteín bcl2 z väzby na bielkovinový kanál bax vo vonkajšej membráne mitochondrií. Tým sa umožní, aby z priestoru medzi ich vonkajšou a vnútornou membránou mitochondrie unikol enzým cytochróm c. Tento sa viaže na bielkovinový komplex Apaf1 (apoptózu aktivujúci faktor). Spolu vytvoria apoptozóm, ktorý aktivuje proteolytický enzým kaspáza 9. Tento enzým aktivuje podriadené kaspázy (3, 6, 7), ktoré rozštiepia bunkové bielkoviny. Kaspáza 9 aktivuje aj enzýmy štiepiace DNA. tzv. DNázy, Mechanizmov spustenia a priebehu apoptózy je viac, ale ich opis je nad rámec tohto textu. 10