Jedenie a pitie v laboratóriu je prísne zakázané. Ak sa potrebujete napiť alebo ísť na toaletu, požiadajte laboratórneho asistenta.

Všeobecné pokyny Počas celého pobytu v laboratóriu noste laboratórny plášť. Jedenie a pitie v laboratóriu je prísne zakázané. Ak sa potrebujete napiť alebo ísť na toaletu, požiadajte laboratórneho asistenta. Nepozerajte sa priamo do laserového lúča počas práce s laserom. Veľmi sa odporúča používať rukavice a ochranné okuliare (ktoré máte k dispozícii) počas manipulácie s chemikáliami. Chybné alebo poškodené zariadenia vám asistent vymení, ak o to požiadate. Očakáva sa však, že vyliate kvapaliny a pod. si upracete sami. Počas experimentu sa správajte environmentálne vľúdne! Pre odpady používajte príslušné nádobky papier, plasty, kovový odpad, sklo a kvapalné odpady. Všetky papiere, vrátane konceptov a poznámok, musíte nechať ležať na stole po skončení experimentu. Všetky výsledky musia byť na záver zaznamenané v žltom odpoveďovom hárku (Answer Sheet) alebo ako súbory v programe EXCEL. Uložte všetky súbory s experimentálnymi dátami na ploche vášho tímového laptopu. Hodnotiť sa bude iba žltý odpoveďový hárok a súbory EXCEL Experiment sa skladá z troch úloh a možno ho vykonať buď individuálne alebo tímovo. 1

TASK A.1 Tuk v mlieku Deň mlieka Mlieko možno opísať ako koloidný roztok obsahujúci proteíny, tuky a cukry (najmä laktózu). Dnešnou úlohou je skúmať tieto zložky mlieka v mliekarenskom laboratóriu fyzikálnymi, chemickými a biologickými metódami. Vaša práca je financovaná firmou cowboom. Firma má zámer vyrábať sériu mliečnych produktov. Vaša štúdia umožní zistiť rôzne vlastnosti vzoriek mlieka a ich obchodnú výhodnosť. Všeobecný materiál: laptop prepisovačky 2 vode odolné značkovače 2 ceruzky (plniaca ceruzka je pre úlohu Task A.1) pravítko s mierkou nožnice dlhá a krátka pinzeta nalepovacie papieriky (Post-it) elektronické hodiny kalkulačka destilovaná voda (fľaša 500 cm 3 ) ochranné okuliare papierové utierky nádoba na odpad papier (modré označenie) nádoba na odpad plasty (žlté označenie) nádoba na odpad sklo (zelené označenie) nádoba na odpad kvapaliny 2

Úloha A.1 Tuk v mlieku Mlieko je koloidná emulzia tukových guľôčok, ako aj hydrokoloídna suspenzia kazeínových micel, rozptýlených vo vodnom roztoku (Obrázok 1.1). Každá tuková guľôčka je obklopená membránou, ktorá bráni vzájomnému spájaniu guľôčok. Objem, obsah a rozmery týchto častíc významne ovplyvňujú vlastnosti mliečnych výrobkov.. Obrázok 1.1. Tukové guľôčky (a) a kazeínové micely (b) v mlieku. Rozmer mliečnych tukových guľôčok (drobučkých tukových kvapôčok) je 1 15 m a závisí od odrody kráv a ročného obdobia. Komerčné mlieko je zvyčajne homogenizované tukové guľôčky surového (čerstvo nadojeného) mlieka sa mechanicky rozbijú na drobnejšie čiastočky, ktoré už nie sú schopné stúpať v mlieku nahor a vytvárať vrstvu smotany. Keď svetelný lúč prechádza cez mlieko, je rozptyľovaný guľôčkami tuku a kazeínových micel formou odrazu a difrakcie. Rozptyl znižuje priehľadnosť mlieka a zoslabuje svetelný lúč prechádzajúci cez vrstvu mlieka. V tejto úlohe využijete rôzne rozptylové javy na určenie rozmerov a koncentrácie mikroskopických častíc. 3

Vzorky štandardné sklenené guľôčky v skúmavke, označenej GLASS vzorky mlieka v skúmavkách s označením K, L, M, N skúmavky obsahujúce mlieko s rôznymi vlastnosťami (v náhodnom poradí): surové (nehomogenizované) mlieko s obsahom 3,7 % tuku homogenizované mlieko s obsahom 3,7 % tuku surové (nehomogenizované) mlieko s obsahom 2,0 % tuku homogenizované mlieko s obsahom 2,0 % tuku Zoznam pomôcok: optická lavica so zeleným laserom (vlnová dĺžka = 532 nm), držiakom vzorky a tienidlom 14 mikroskopových sklíčok automatická pipeta a pipetové špičky 4 štipce papierové dištančné prúžky (hárok papiera na ich nastrihanie) testovací predmet (hárok papiera s napísaným textom) Úloha A.1.1 Určenie rozmeru častíc s použitím difrakcie svetla A.1.1.1 Určenie rozmeru mikroskopický sklenených guľôčok V tejto úlohe máte určiť rozmer štandardných sklenených guľôčok pomocou analýzy difrakčného obrazca na tienidle. Keď laserový lúč prechádza látkou, ktorá obsahuje drobné častice, a dopadá na tienidlo, okolo centrálnej stopy sa vytvárajú sústredné kružnice (Obrázok 1.2). Obrázok 1.2. Difrakcia svetla na guľôčkach s rovnakými. Vzdialenosti prvého a druhého minima intenzity od stredu sú označené x1 a x2. 4

Uhol rozptylu a tým obraz rozptýleného svetla na tienidle závisí od rozmeru častíc. Pre malé uhly rozptylu je priemer D rozptyľujúcich guľôčok daný vzťahom D = ki L / xi, (vzťah 1.1) kde je vlnová dĺžka svetla lasera, L vzdialenosť vzorky rozptyľujúcich častíc od obrazu na tienidle a xi vzdialenosť (na tienidle) difrakčného minima od stredu obrazca. Faktor ki je rôzny pre každé difrakčné minimum: k1 = 1,22 pre prvé difrakčné minimum (prvý tmavý krúžok od stredu) a k2 = 2,23 pre druhé difrakčné minimum. Postup merania: 1. Nastavte na optickej lavici do jednej priamky zelený laser, držiak vzorky a tienidlo. Podľa mierky na optickej lavici natavte apertúru lasera (otvor ktorým svetlo vychádza z lasera) približne na 40 cm, vzorku na 48 cm a tienidlo na 80 cm. 2. Pripravte vzorku tak, že do stredu mikroskopového sklíčka umiestnite prach sklenených guľôčok zo skúmavky s označením GLASS, priložte na ne druhé sklíčko, sklíčka k sebe pritlačte a na protiľahlých spojte štipcami. 3. Pripravenú vzorku vložte do držiaka vzorky. 4. Zapnite zelený laser. Skontrolujte, či lúč prechádza zostavou a dopadá na tienidlo. 5. Miernym vzájomným pohybom lasera a tienidla tak, aby sa dosiahol čo najčistejší difrakčný obraz maxím a miním na tienidle. Ak to treba pre lepšie pozorovanie, zatieňte si okolité svetlo hárkom papiera. 6. Ak je laserový lúč príliš slabý na pozorovanie difrakčného obrazca na tienidle, požiadajte laboratórneho asistenta o novú batériu do lasera alebo výmenu lasera (bez straty bodov) A.1.1.1.1 Pozorujte difrakčný obrazec na tienidle. Nakreslite približný graf závislosti intenzity I svetla od vzdialenosti x od stredu obrazca. Vyznačte v grafe polohy pozorovaných difrakčných miním x1 a x2 A.1.1.1.2 Zmerajte (3 krát) vzdialenosť prvého a druhého difrakčného minima od stredu. Pre presnejšie odčítanie zmerajte priemer kružnice zodpovedajúcej prvému alebo druhému minimu a výsledok deľte dvomi. Zmerajte tiež vzdialenosť L vzorky od tienidla. (Ak zmeníte polohu lasera treba vždy znova upraviť polohy tienidla a vzorky, aby sa dosiahol čo najkvalitnejší difrakčný obrazec. Môžete si vybrať na ktorej strane tienidla budete merať polohy maxím a miním). Výsledky zapíšte do tabuľky. LASER VYPNITE vždy keď ho nepoužívate! 5

A.1.1.1.3 Vypočítajte priemer sklenených guľôčok (s použitím vzťahu 1.1) pre každé z troch meraní prvého a druhého difrakčného minima. A.1.1.1.4 Vypočítajte strednú hodnotu priemeru guľôčok. A.1.1.2 Určenie približného rozmeru častíc v mlieku Na rozdiel od guľôčok, tenká vrstva mlieka nerozptyľuje svetlo tak,aby sa vytvoril jasný difrakčný obrazec, keďže častice v mlieku nemajú rovnaký rozmer. Intenzita rozptýleného svetla na tienidle len mierne klesá so zväčšovaním vzdialenosti od stredu obrazca. Rozmer osvetlenej plochy a uhlová závislosť intenzity svetla závisí od priemeru tukových častíc v mlieku (príklad na obrázku 1.3) Obrázok 1.3. Príklad závislosti intenzity rozptýleného svetla od uhlu rozptylu pre častice s rôznym priemerom D. Postup merania: 1. Ako bolo opísané v krokoch 2-5, pripravte vzorku mlieka zo skúmavky K, ktorá predstavuje surové nehomogenizované mlieko s obsahom 3,7 % tuku. 2. Použite automatickú pipetu na nakvapkanie 10 l mliek zo skúmavky K do stredu sklíčka s označeného K. Pred naberaním pipetou, skúmavku jemným prevracaním premiešajte. 3. Na nastavenie hrúbky vrstvy mlieka si nastrihajte prúžky papiera a vložte ich po obidvoch stranách kvapky. 4. Priložte druhé sklíčko označené K. 5. Sklíčka opatrne pritlačte z sebe s použitím štipcov. 6

6. Usporiadajte opäť optickú sústavu, pričom držiak vzorky a tienidlo teraz nastavte čo najbližšie k sebe. 7. Vložte do držiaka pripravenú vzorku mlieka. 8. Zapnite zelený laser. Skontrolujte, či lúč prechádza vzorkou a dopadá na tienidlo. Potom pohybujte laserom a držiakom vzorky tak, aby ste dostali na tienidle dobre pozorovateľnú plochu osvetlenú rozptýleným svetlom. (Môžete si vybrať, na ktorej strane tienidla budete pozorovať a merať osvetlenú plochu. Ak treba, použite hárok papiera na zatienenie okolitého rušivého svetla). A.1.1.2.1 Pozorujte osvetlenú plochu na tienidle. Zostrojte približný graf závislosti intenzity svetla I od vzdialenosti x od stredu stopy. V grafe vyznačte vzdialenosť xmilk, ktorú máte zmerať v nasledujúcej úlohe A.1.1.2.2. A.1.1.2.2 Určte približnú vzdialenosť xmilk od stredu stopy k okraju osvetlenej plochy. Zmerajte šírku osvetlenej oblasti a deľte dvomi. Zmerajte aj vzdialenosť Lmilk medzi vzorkou a tienidlom. VYPNITE LASER! A.1.1.2.3 Určte približný rozmer tukových častíc v mlieku. Použite hodnoty získané v úlohe 1.1.2.2 a vypočítajte priemer Dmilk tukovej guľôčky pomocou vzťahu 1.1. Použite faktor k2 = 2,23 a x2 = xmilk. A.1.2 Analýza mlieka za základe merania priehľadnosti V tejto úlohe porovnáte štyri vzorky mlieka (K, L, M, N opísané v úvode úlohy A.1). Ak sa pozeráte na nejaký objekt, napr. písaný text, cez tenkú vrstvu mlieka, objekt sa javí menej ostrý horšie viditeľný. Svetlo odrazené od objektu sa pri prechode cez mlieko rozptyľuje na tukových časticiach mlieka. Rozptýlené svetlo spôsobuje zahmlenie objektu a znižuje viditeľnosť. Priehľadnosť vrstvy mlieka tak klesá, ak rozptyl rastie. Miera rozptylu na tenkej vrstve mlieka s hrúbkou z závisí od objemového obsahu tuku v mlieku a od stredného priemeru D guľôčok. Ak na vrstvu mlieka dopadá svetlo s intenzitou I 0, potom intenzita I rozptýleného svetla je opísaná vzťahom I I 0 γ z / D. (vzťah 1.2) A.1.2.1 Určte teoreticky, ktorá zo vzoriek mlieka v tabuľke 1.1 bude vykazovať najsilnejší a ktorá najslabší rozptyl. Vzorky obsahujú homogenizované a surové - naturálne (nehomogenizované) mlieko (pričom Dhom < Dnat) s dvomi rôznymi obsahmi tuku (1 < 2). 7

Tabuľka 1.1. Parametre vzoriek mlieka 1 4. Vzorka Priemer častice Obsah tuku 1 D hom γ 1 2 D hom γ 2 3 D nat γ 1 4 D nat γ 2 Postup merania: 1. Zoberte 8 mikroskopových sklíčok a označte dvojice písmenami K, L, M, N. 2. Štyri sklíčka položte tesne vedľa seba na hárok papiera s vytlačeným textom (testovací objekt). 3. Pripravte vzorky mlieka K, L, M, N ako pri príprave vzorky v úlohe A.1.1.2. 4. Porovnajte viditeľnosť tlačeného textu cez vzorky K, L, M, N. A.1.2.2 Pozorujte text cez jednotlivé vrstvy mlieka a určte vzorky, ktoré vykazujú najsilnejší a najslabší rozptyl (najhoršiu a najlepšiu viditeľnosť). Uveďte vlastnosti týchto vybratých vzoriek na základe opisu vzoriek na začiatku úlohy A.1 a výsledku úlohy A.1.2.1. A.1.2.3 Zhrňte identifikáciu vzoriek mlieka v tabuľke. Rozhodnite, ako boli jednotlivé vzorky K, L, M, N spracované a aký je ich obsah tuku. Berte do úvahy vaše predchádzajúce odpovede a užitočné informácie uvedené v texte úlohy. Úloha A.1.3 Určenie rozmeru tukových častíc mlieka z merania útlmu svetla V úlohe A.1.2 ste skúmali rozptyl svetla na vzorkách mlieka. Teraz budete merať pomer svetla prechádzajúceho cez hrubú vrstvu vody, ktorá obsahuje malé množstvo mlieka. V čistej vode sa lúče svetla šíria voľne pozdĺž priamočiarej dráhy. Ak sa do vody pridá mlieko, častice tuku predstavujú prekážku šírenia svetla. Čím dlhšie svetlo v prostredí postupuje, tým väčšia je pravdepodobnosť, že lúč časticu zasiahne. Pomer voľne prechádzajúceho svetla cez vzorku je daný Lambertovým zákonom I = I 0 e NSz, (vzťah 1.3) 8

kde I je intenzita prechádzajúceho svetla, I 0 intenzita dopadajúceho svetla, N počet častíc v jednotke objemu, z hrúbka vrstvy, S účinný prierez jednej častice. Ak predpokladáme, že všetky tukové častice sú guľôčky s rovnakým priemerom D, platí S = πd 2 /4. (vzťah 1.4) V tomto experimente budete merať zmenu útlmu svetla pri pridávaní mlieka do nádoby pôvodne s čistou vodou a s konštantnou hrúbkou. Pridávaním mlieka sa zvyšuje počet tukových častíc, čo spôsobuje pokles intenzity prechádzajúceho svetla. Cieľom je meranie závislosti útlmu svetla od koncentrácie mlieka vo vode za účelom určenia parametrov potrebných na určenie priemeru tukových častíc. Na meranie intenzity svetla laserového lúča budete používať Luxmeter. Keďže svetlo z pozadia (slnečné svetlo z okna, osvetlenie miestnosti a pod.) ovplyvňuje meranie, treba vplyv pozadia z výsledku odčítať. Detailný opis postupu je uvedený ďalej. Zariadenie a pomôcky: červený laser v držiaku nádoba s vodou (50 cm 3 ciachovaná nádobka s modrým vrchnákom) luxmeter v držiaku automatická pipeta a pipetové špičky vzorka mlieka v skúmavke označenej K Súbor EXCEL: Milk A.1.3 Country Team A B.xslx na pracovnej ploche vášho laptopu Postup merania: 1. Na stole umiestnite červený laser, nádobku s vodou a luxmeter tak, aby lúč lasera prechádzal cez nádobu a dopadal na senzor luxmetra. Dôležité: Nádobku postavte tak, aby lúč dopadal kolmo na jej stenu. 2. Nádobku s vodou umiestnite 20 až 40 cm od senzora luxmetra. 3. Červený laser pripojte na USB port počítača. Zapnite počítač. Nastavte polohu lasera tak, aby bol lúč približne vodorovný. 4. Presvedčte sa, že je laser zaostrený na senzor lux-metra (stopa lasera je čo najmenšia) a lúč vstupuje do otvoru pred senzorom. Ak treba, nastavte šošovku na výstupe lasera jej otáčaním. 5. Zapnite lux-meter. Meranie urobte na vhodnom rozsahu lux-metra, t.j. od 2000 do 20 000. 6. Naplňte nádobku destilovanou vodou až po značku 50 ml. Overte, hrúbka vrstvy vody v nádobke je z = 25 mm. 7. Dôležité: Po nastavení zostavy senzora a lasera sa nesmie ich pozícia zmeniť počas celého merania. Ak sa náhodou s laserom alebo senzorom pohne, treba začať meranie od začiatku s nádobkou s čistou vodou. 9

A.1.3.1 Merajte a do tabuľky EXCEL zapisujte hodnoty intenzity svetla a celkového objemu mlieka pridaného do vody, ako je uvedené v bodoch 8 12. Taktiež zapíšte začiatočný objem vody V0. 8. Na lux-metri odčítajte intenzitu I 0 zodpovedajúcu intenzite svetla lasera prechádzajúceho cez čistú vodu. (Toto meranie zahŕňa aj svetlo z pozadia). Zapíšte hodnotu I 0 do EXCEL tabuľky. V prípade problému s počítačom (problem so softvérom, files not found, a pod.), požiadajte o pomoc asistenta (bez straty bodov). 9. Zmerajte údaj B 0, zodpovedajúci intenzite svetla prichádzajúceho z pozadia v miestnosti. Urobte to tak, že rukou zacloníte lúč lasera a odčítate hodnotu na luxmetri. Hodnotu B0 zapíšte do tabuľky EXCEL. 10. S použitím automatickej pipety so špičkou naberte mlieko s objemom V1 = 20 l zo skúmavky s označením K. Mlieko pridajte do nádobky s vodou a po uzatvorení nádobky roztok premiešajte niekoľkými prevráteniami. 11. Nádobku vráťte do pôvodnej polohy. Zmerajte a do tabuľky zapíšte novú hodnotu I1 z luxmetra. Opäť zacloňte laserový lúč a z luxmetra odčítajte hodnotu pozadia B1 a zapíšte ju do tabuľky. 12. Postup opakujte a vždy pridávajte 20 l mlieka do nádobky. Po pridaní každej dávky roztok premiešajte, zapíšte celkový objem pridaného mlieka Vi, údaj luxmetra I i a údaj merania pozadia B i do tabuľky EXCEL. Opakujte meranie až kým nepridáte 10 dávok mlieka alebo kým neklesne údaj I i na úroveň blízko B i. A.1.3.2 Pre každé meranie vypočítajte objemovú koncentráciu C i mlieka vo vode a relatívny koeficient prenosu α i = (I i B i )/(I 0 B 0 ). Výpočty urobte priamo v tabuľke EXCEL. A.1.3.3 Zostrojte graf závislosti prirodzeného logaritmu koeficientu prenosu ln α i od koncentrácie C i mlieka vo vode (graf zostrojte v programe EXCEL). A.1.3.4 V grafe v programe EXCEL vyneste trendovú priamku, ktorá zodpovedá lineárnej závislosti ln α = C. Zistite hodnotu parametra. Absolútnu hodnotu parametra zapíšte do odpoveďového hárku. A.1.3.5 Vzorka mlieka označená K obsahuje objemový podiel tuku (celkový objem tuku v jednotke objemu mlieka) = 0,037. Odvoďte vzťah pre koncentráciu N0 tukových častíc v mlieku (počet tukových častíc v jednotke objemu mlieka, v jednotkách SI 1/m 3 ) pomocou premenných D priemer, a. A.1.3.6 Odvoďte vzťah pre koncentráciu N tukových častíc v roztoku mlieka a vody pomocou objemovej koncentrácie (zlomku) C (koncentrácie mlieka vo vode), priemeru tukovej častice D a. 10

A.1.3.7 Odvoďte vzťah pre výpočet priemeru D tukovej častice vo vašej vzorke mlieka a vypočítajte číselnú hodnotu D. Pomôcka: Uvedomte si, že logaritmovaním BeerLambertovho zákona I = I 0 e NSz (diskutovaného v úvede úlohy A.1.3) dostávame lineárnu závislosť ln α = ln I I 0 = NSz medzi logartmom koeficientu prenosu a koncentráciou N. Použite vaše výsledky merania pre výpočet číselnej hodnoty priemeru tukovej častice. 11

Deň mlieka TASK A.2 Výroba syra a obsah proteínov Mlieko možno opísať ako koloidný roztok obsahujúci proteíny, tuky a cukry (najmä laktózu). Dnešnou úlohou je skúmať tieto zložky mlieka v mliekarenskom laboratóriu fyzikálnymi, chemickými a biologickými metódami. Vaša práca je financovaná firmou cowboom. Firma má zámer vyrábať sériu mliečnych produktov. Vaša štúdia umožní zistiť rôzne vlastnosti vzoriek mlieka a ich obchodnú výhodnosť. Všeobecný materiál: laptop prepisovačky 2 vode odolné značkovače 2 ceruzky (plniaca ceruzka je pre úlohu Task A.1) pravítko s mierkou nožnice dlhá a krátka pinzeta nalepovacie papieriky (Post-it) elektronické hodiny kalkulačka destilovaná voda (fľaša 500 cm 3 ) ochranné okuliare papierové utierky nádoba na odpad papier (modré označenie) nádoba na odpad plasty (žlté označenie) nádoba na odpad sklo (zelené označenie) nádoba na odpad kvapaliny 12

ÚLOHA A.2 Výroba tvarohu a obsah proteínov Tvaroh sa vyrába z mlieka pomocou špeciálnych baktérií a kvasných enzýmov v prítomnosti iónov Ca 2+. Počas výroby tvarohu sa mlieko spracúva v niekoľkých krokoch vrátane acidifikácie, koagulácie, dehydratácie a maturačných krokov. Dnes sa naučíte základné princípy výroby tvarohu a nahliadnete do jej biochemických a biofyzikálnych aspektov. V tejto úlohe vyrobíte tvaroh. Na výrobu tvarohu potrebujete okrem mlieka tri ďalšie prísady: CaCl2, zmes proteolytických enzýmov nazývanú syridlo a špecifickú bakteriálnu kultúru nazvanú štartovacie baktérie. Baktérie tvoria kyselinu mliečnu, ktorá znižuje ph na 5.0 6.0. Pri nižšom ph sa začínajú vyzrážavať (agregovať) niektoré mliečne proteíny nazývané kazeíny. Okrem toho je také ph optimálne pre počiatočné fázy reakcií uskutočňovaných syridlom, ktoré hydrolyzuje kazeín a spôsobuje ďalšie vyzrážanie a tvorbu tvarohu. Vápenaté ióny pridané do čerstvého (surového) mlieka ďalej uľahčujú koaguláciu tým, že neutralizujú elektrostatické odpudzovanie negatívne nabitých koagulujúcich micél a tak spôsobujú vznik hustejšieho tvarohu. Dostali ste všetky prísady/zložky potrebné na výrobu tvarohu. CaCl2, syridlo a baktérie sú označené ako substance A, B, a C (v náhodnom poradí) a vašou úlohou je určiť, ktorá prísada je ktorá. Úloha A.2.1 Výroba tvarohu Zoznam poskytnutého materiálu: mlieko v 300 ml plastovej fľaši (označenej nápisom MILK) prísada A (20 mg v mikrocentrifugačnej skúmavke; 3 kusy) prísada B (3 mg v mikrocentrifugačnej skúmavke; 3 kusy) prísada C (20 μl v mikrocentrifugačnej skúmavke; 3 kusy) 8 centrifugačných skúmaviek (50 ml) Stojan na skúmavky 12 Pasteurových pipiet 4 plastové Petriho misky 250 ml kadička Plastový lievik (biely) 4 nylonové filtre (v sáčku) Nádoba s teplou vodou (vodný kúpeľ), ktorú si vypýtate od asistenta v laboratóriu po skončení krokov 1 4 13

Postup: 1. Primerane premiešajte fľašu s mliekom, aby ste dobre premiešali všetky vrstvy. Pozor, miešajte tak, aby nevznikla pena! 2. Nalejte približne 50 ml mlieka do 4 centrifugačných skúmaviek (50 ml). Skúmavky označte I, II, III a IV. 3. Rozpustite predvážené množstvo prísady A (20 mg) v 1 ml destilovanej vody (merajte pomocou Pasteurovej pipety), takto rozpustenú prísadu pridajte do centrifugačnej skúmavky označenej I. a. Toto zopakujte aj pre skúmavky II a III (do každej pridajte rovnaké množstvo prísady A). Kadičku s objemom 250 ml môžete použiť ako nádobu na vodu. 4. Pomocou novej Pasteurovej pipety zoberte 1 ml zmesi zo skúmavky I a preneste ho do mikrocentrifugačnej skúmavky obsahujúcej prísadu B (3 mg). Prísadu v zmesi rozpustite a potom celý obsah skúmavky preneste späť do skúmavky označenej I. a. Toto zopakujte aj pre skúmavky II a IV (vždy zoberte novú prísadu B). 5. Zmiešajte obsahy skúmaviek tak, že zatvorené skúmavky prevrátite a zmesy nechajte inkubovať vo vodnom kúpeli 30 minút (teplý vodný kúpeľ si vypýtajte od asistenta v laboratóriu). Počas inkubácie odpovedzte na teoretické otázky. A.2.1.1 Ktorá frakcia mlieka má menšiu hustotu smotana alebo odtučnené mlieko? Prečo? 1. Smotana, pretože má vyšší obsah tukov 2. Odtučnené mlieko, pretože má nižší obsah tukov 3. Smotana, pretože má vyšší obsah proteínov 4. Odtučnené mlieko, pretože má nižší obsah proteínov 5. Smotana, pretože má vyššiu koncentráciu cukru 6. Odtučnené mlieko, pretože má nižšiu koncentráciu cukru A.2.1.2 Vo výrobni tvarohu sa pomocou centrifugácie čerstvé mlieko delí na frakcie s odlišnou hustotou (smotana a odtučnené mlieko). Obsah tukov týchto frakcií a štandardného mlieka sa môže merať pomocou infračervenej spektroskopie alebo inými metódami. Výrobňa cowboom dostala 200.0 L čerstvého mlieka so stanoveným obsahom tuku 4.1%. Na výrobu tvarohu je potrebné štandardizované mlieko s obsahom tuku 2.9%. Výrobňa má separátor, ktorý vie z čerstvého mlieka oddeliť (pripraviť) smotanu (s obsahom tuku 20%) a štandardizované mlieko. Koľko litrov smotany a štandardizovaného mlieka sa dá pripraviť z 200.0 L čerstvého mlieka? Vo výpočte zanedbajte malé rozdiely v hustote mlieka a jeho separačných produktov! Pokračujte vo výrobe tvarohu! 14

6. Rozpustite poskytnuté množstvo prísady C (20 μl) v 1 ml vody (merajte pomocou Pasteurovej pipety) a zložku C pridajte do skúmavky označenej I. Kadičku s objemom 250 ml môžete použiť ako nádobu na vodu. a. Toto zopakujte aj pre skúmavky III a IV (vždy zoberte novú prísadu C) 7. Prevrátením zatvorených skúmaviek premiešajte ich obsahy a všetky skúmavky inkubujte 30 minút vo vodnom kúpeli. 8. Filtráciou oddeľte tekutú a pevnú frakciu (srvátku a zrazené mlieko-tvaroh) v skúmavkách I IV. Nylonový filter vložte do plastového lievika, lievik vložte do čistej 50 ml skúmavky a vylejte obsah inkubovanej skúmavky na filter. Aby ste uľahčili filtráciu, môžete obsah skúmaviek I IV premiešať pomocou poskytnutej špachtle. Pre každú skúmavku použite nový filter a skúmavku, len lievik použite vždy rovnaký. Pred každou filtráciou lievik a špachtľu umyte. Skúmavky označte WHEY I, WHEY II, WHEY III a WHEY IV a odložte si ich pre úlohu A.2.2. Po každej filtrácii preneste zrazeninu (tvaroh) vo filtri do novej Petriho misky. Petriho misky označte CURD I, CURD II, CURD III a CURD IV a odložte si ich pre úlohu A.2.2. A.2.1.3.1 Vyplňte tabuľku týkajúcu sa tvorby tvarohu v rozdielnych vzorkách v Odpoveďovom hárku. A.2.1.3.2 Ktorá Petriho miska má najjemnejšiu zrazeninu? Neberte do úvahy misku/misky bez zrazeniny. Príslušnú rímsku číslicu napíšte do Odpoveďového hárku. A.2.1.4 Na základe vašich pozorovaní a výsledkov úlohy A.3 (urobenej vašim tímovým kolegom), určite funkciu každej prísady použitej na výrobu tvarohu a zapíšte to do Odpoveďového hárku. Vyberte si z nasledujúcich možností: 1. Spôsobuje tvorbu zrazeniny/tvarohu 2. Zosilňuje tvorbu zrazeniny/tvarohu 3. Spotrebúva laktózu A.2.1.5 Na základe úvodného textu a odpovedí 1 3 úlohy A.2.1.4 stanovte biologickú/chemickú podstatu prísad A, B a C. 1. CaCl2 2. syridlo 3. štartovacia kultúra baktérií Úloha A.2.2. Bradfordova metóda na stanovenie celkového obsahu proteínov Počas procesu výroby tvarohu z mlieka si všimnete objavenie sa dvoch fáz/zložiek: zrazeniny tvarohu a srvátky. K usadzovaniu tvarohu dochádza v dôsledku koagulácie mliečnych proteínov nazývaných kazeín, čo sa dosiahne pridaním proteolytických enzýmov (syridlo), ktoré katalyzujú špecifické biochemické modifikácie kazeínu (opísané nižšie). Alternatívne 15

možno spustiť koaguláciu pomocou silnej acidifikácie mlieka, ktorá vedie k vyzrážaniu kazeínu pri nízkom ph. Vyzrážanie mlieka pomocou acidifikácie Zoznam poskytnutého materiálu: mlieko, WHEY I a CURD I (použité alebo vytvorené v úlohe A.2.1) 1 M HCl (0.5 ml v mikrocentrifugačnej skúmavke) 2 Pasteurove pipety 3 centrifugačné skúmavky (15 ml) Papierové filtre (v sáčku) Plastové Petriho misky Excelovský súbor Milk A.2.2 country Team A/B.xlsx na pracovnej ploche počítača. Postup experimentu: 1. Uistite sa, že máte na sebe laboratórny plášť, rukavice a okuliare. 2. Pomocou Pasteurovej pipety preneste 10 ml mlieka do čistej 15 ml centrifugačnej skúmavky. Skúmavku označte Acid coagulation. 3. Pomocou čistej Pasteurovej pipety opatrne preneste 0.5 ml 1 M HCl z mikrocentrifugačnej skúmavky do skúmavky s mliekom. Skúmavku uzavrite a niekoľkokrát prevráťte. 4. Filtráciou do novej 15 ml centrifugačnej skúmavky oddeľte kvapalnú a pevnú frakciu (použite papierový filter!). Počas filtrácie môžete odpovedať na teoretické úlohy. Ak ste oddelili väčšiu časť kvapalnej frakcie (nemusíte čakať kým všetka kvapalina prejde cez filter), označte skúmavku LIQ. 5. Zrazeninu preneste do čistej Petriho misky a označte SOL. Bradfordova metóda je analytická spektroskopická metóda na stanovenie celkového obsahu proteínov vo vzorke. Metóda je založená na meraní absorbancie viditeľného svetla (VIS) vo vzorke zmiešanej s tzv. Bradfordovým činidlom (farbička Coomassie Brilliant Blue G-250). V závislosti od ph roztoku môže farbička existovať v troch formách: katiónovej (červenej), neutrálnej (zelenej a aniónovej (modrej). Pri fixnom nízkom ph je farbička najmä v protonizovanej červenej forme (λmax = 470 nm). Ak sa však farbička viaže s proteínmi (vďaka hydrofóbnym a iónovým interakciám), mení sa na stabilnú neprotonizovanú modrú formu (λmax = 595 nm). Tento modrý komplex proteínu s farbičkou je možné zaznamenať/detegovať pri vlnovej dĺžke 595 nm pomocou spektrofotometra alebo zariadenia, ktoré meria absorbanciu v mikroplatničkách. Na zvýšenie presnosti metódy sa zvyčajne robí kalibračná krivka s použitím známych množstiev relatívne lacného a čistého proteínu (akým je napríklad hovädzí sérový albumín, 16

BSA). Následne sa stanoví koncentrácia celkových proteínov v sledovanej vzorke tak, že sa porovnajú hodnoty absorbancie na kalibračnej krivke pre BSA s absorbanciou nameranou pre našu sledovanú vzorku. A.2.2.1 Na obrázku 2.1 dole sú znázornené absorbancie vzorky bez proteínu, menej koncentrovanej vzorky a viac koncentrovanej vzorky. Ku každej vzorke priraďte príslušnú krivku na obrázku 2.1. Obrázok 2.1. Absorbancia vzoriek pri rôznych UV-VIS vlnových dĺžkach (v nanometroch, nm). ( ) krivka 1, ( ) krivka 2, ( ) krivka3. Príprava riedení. Spektrofotometria. Zoznam poskytnutého materiálu: Mlieko (to isté z úlohy A.2.1) Bradfordovo činidlo (5 ml v centrifugačnej skúmavke) Hovädzí sérový albumín, BSA (1.5 mg v mikrocentrifugačnej skúmavke) Pufor (fosfátový tlmivý roztok, PBS; 20 ml v centrifugačnej skúmavke) 1% roztok Tritonu X (3 ml v centrifugačnej skúmavke) Pasteurove pipety 10 mikrocentrifugačných skúmaviek (s objemom 2 ml) Stojan na mikrocentrifugačné skúmavky mikrošpachtľa stolná centrifúga/vortex automatická pipeta a špičky mikrotitračná platnička (priehľadná 96-jamková s priehľadným plochým dnom) 17

Postup: 1. Pomocou Pasteurovej pipety alebo automatickej pipety pridajte čo možno najpresnejšie 1.5 ml fosfátového pufru (PBS) k 1.5 mg hovädzieho sérového albumínu (BSA) v mikrocentrifugačnej skúmavke. Skúmavku prevráťte a premiešajte na vortexe pokým sa všetok BSA nerozpustí (3 5 minút) (vortexujete tak, že skúmavku umiestnite do stredu na priloženom vortexe a zapnete ho) Poznámka! Na pridávanie PBS vo všetkých krokoch tohto experimentu môžete použiť rovnakú Pasteurovu pipetu v prípade, že ste si istí, že sa pipeta neznečistila. Ak tým nie ste si istí, použite zakaždým čistú Pasteurovu pipetu. 2. Do mikrocentrifugačnej skúmavky pripravte 1% roztok mlieka: pomocou Pasteurovej pipety preneste 1 ml PBS do skúmavky a potom do nej pomocou automatickej pipety pridajte 10 μl mlieka. Roztok poriadne premiešajte a označte MILK#1. Poznámka! Po každom použití zahoďte použitú špičku z automatickej pipety! 3. Do novej mikrocentrifugačnej skúmavky pripravte 0.02% roztok mlieka: pomocou Pasteurovej pipety preneste 1 ml PBS do novej skúmavky a potom do nej pomocou automatickej pipety pridajte 10 μl roztoku MILK#1. Roztok poriadne premiešajte a označte MILK#2. 4. Pripravte 1% roztok kvapalnej frakcie oddelenej z kyslého mlieka. Pomocou Pasteurovej pipety preneste 1 ml PBS do novej skúmavky a potom do tej istej skúmavky pomocou automatickej pipety pridajte 10 μl zmesi LIQ. Zmes poriadne premiešajte a skúmavku označte LIQ#1. 5. Pripravte 0.2% roztok kvapalnej frakcie oddelenej z kyslého mlieka. Pomocou automatickej pipety najskôr pridajte 160 μl PBS do čistej mikroskúmavky a potom do tej istej skúmavky pridajte 40 μl zmesi LIQ#1. Zmes poriadne premiešajte a skúmavku označte LIQ#2. 6. Preneste malé viditeľné množstvo pevnej frakcie izolovanej z kyslého mlieka (z Petriho misky SOL) do čistej mikroskúmavky pomocou špachtle, ktorú máte k dispozícii. Skúmavku označte SOL#1. Pomocou Pasteurovej pipety do tejto skúmavky preneste 1 ml 1% roztoku Tritonu X (Triton X je detergent, ktorý zabezpečí uvoľnenie proteínov obsiahnutých v zrazenine). Skúmavku poriadne premiešajte na vortexe 3 5 minút, kým sa zrazenina nerozpadne na menšie kúsky. V prípade, že nedostanete žiadnu pevnú frakciu, poproste asistenta v laboratóriu o pomoc (dostanete pripravenú vzorku, ale budú vám odrátané 2 body). 7. Pripravte 2% roztok kvapalnej frakcie z predchádzajúceho kroku. Pomocou Pasteurovej pipety najskôr pridajte 1 ml PBS do čistej mikroskúmavky a potom do tej istej skúmavky pomocou automatickej pipety pridajte 20 μl kvapalnej 18

frakcie SOL#1. Ubezpečte sa, že prenášate iba kvapalnú frakciu bez pevných častíc. Zmes poriadne premiešajte a skúmavku označte SOL#2. 8. Pripravte 1% roztok WHEY I. Pomocou Pasteurovej pipety preneste 1 ml PBS do čistej mikroskúmavky a potom do tej istej skúmavky pomocou automatickej pipety pridajte 10 μl srvátky. Zmes poriadne premiešajte a skúmavku označte WHEY#1. 9. Pripravte 0.2% roztok srvátky. Pomocou automatickej pipety najskôr pridajte 160 μl PBS do čistej mikroskúmavky a potom do tej istej skúmavky pridajte 40 μl zmesi WHEY#1. Zmes poriadne premiešajte a skúmavku označte WHEY#2. 10. Pomocou špachtle preneste do čistej mikroskúmavky malé viditeľné množstvo tvarohu/zrazeniny CURD I a označte ju CURD#1. Pomocou Pasteurovej pipety preneste do tejto mikroskúmavky 1 ml 1% roztoku Tritonu X; poriadne premiešajte 3 5 minút až kým sa zrazenina nerozpadne na menšie kúsky. V prípade, že nezískate žiadny tvaroh/zrazeninu, poproste asistenta v laboratóriu o pomoc (dostanete pripravenú vzorku, ale budú vám odrátané 2 body). 11. Pripravte 2% roztok kvapalnej frakcie obsahu skúmavky CURD#1. Pomocou automatickej pipety najskôr pridajte 1 ml PBS do čistej mikroskúmavky a potom do tej istej skúmavky pridajte 20 μl tekutej frakcie CURD#1. Uistite sa, že prenášate iba kvapalnú frakciu bez pevných častíc. Zmes poriadne premiešajte a skúmavku označte CURD#2. 12. Teraz by ste mali mať v mikroskúmavkách celkovo 10 vzoriek a štandard BSA a môžete začať s ich pipetovaním do mikrotitračnej platničky. Pri pipetovaní buďte opatrní, pretože roztoky obsahujúce proteíny majú sklon vytvárať bubliny, ktoré môžu pokaziť meranie! Ak vznikli bubliny, môžete sa ich pokúsiť rozbiť pomocou zašpicateného konca špičky. 13. Skontrolujte, či je na kryte platničky napísané meno vášho tímu (inak to konzultujte s asistentom v laboratóriu). Odstráňte kryt z platničky a dajte pozor, aby sa platničky náhodou medzi tímami nevymenili. 14. Najskôr na mikrotitračnej platničke pomocou automatickej pipety pripravte sériu riedení BSA nasledovne: a. Napipetujte 140 μl PBS do jamky H1. Potom napipetujte PBS (po 75 μl) do každej z jamiek A1 G1. b. Pridajte 10 μl BSA do jamky H1 a poriadne premiešajte s pipetou tak, že roztok opakovane naberiete a vypustite z pipety pričom dáte pozor, aby ste ho nespenili. c. Zoberte 75 μl roztoku z jamky H1 a preneste ho do jamky G1; poriadne premiešajte ako v kroku b) a preneste 75 μl výsledného roztoku do jamky F1. Tieto kroky opakujte kým neprídete k jamke B1. 19

d. Z jamky B1 neprenášajte 75 μl roztoku do jamky A1, ale odhoďte ho spolu so špičkou. Teraz by ste mali mať 75 μl kvapaliny vo všetkých jamkách stĺpca 1. e. Rovnaký postup zopakujte so stĺpcom 2. 15. Teraz napipetujte ostatné vzorky do jamiek na mikrotitračnej platničke (75 μl z každej) tak ako je to znázornené v Tabuľke 2.1. V prípade SOL#1 a CURD#1 sa uistite, že prenášate iba kvapalnú frakciu bez akýchkoľvek pevných častíc. Zakaždým poriadne premiešajte obsah s pipetou pipetovaním hore a dole. Table 2.1. Nákres mikrotitračnej platničky pre Bradfordovu metódu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A PBS PBS MILK #1 MILK #1 CURD #1 CURD #1 B B S B S MILK #2 MILK #2 CURD #2 CURD #2 C A A LIQ#1 LIQ#1 D LIQ#2 LIQ#2 E d i d i SOL#1 SOL# 1 F l u l u SOL#2 SOL# 2 G t i t i WHEY #1 WHE Y#1 H o o WHEY WHE n n #2 Y#2 16. Nakoniec pridajte 75 μl zriedeného Bradfordovho činidla do všetkých jamiek, ktoré obsahujú kvapalinu (keď pridávate Bradfordovo činidlo, premiešajte obsah jamky opakovaním pipetovaním hore dole). Jamky obsahujúce proteín by sa mali sfarbiť do modra. Na platničku priložte kryt, platničku inkubujte 5 minút pri izbovej teplote. Potom dajte platničku asistentovi v laboratóriu, ktorý zmeria absorbanciu. A.2.2.2 Vypočítajte výslednú koncentráciu (v mg/ml) BSA v jamkách A1 H1 mikrotitračnej platničky. S použitím hodnôt absorbancie nameraných asistentom vypočítajte priemerné hodnoty absorbancie pre každú koncentráciu BSA (t.j. pre jamky H1 a H2,...) a PBS kontrolu. Vyplňte tabuľku v Excelovskom súbore. A.2.2.3 Urobte graf z A.2.2.2 v Excelovskom súbore (koncentrácia BSA na osi x a priemerná hodnota absorbancie na osi y). A.2.2.4 S použitím hodnôt absorbancie nameraných asistentom vypočítajte priemerné hodnoty absorbancie pre každú zo vzoriek v mikrotitračnej platničke v stĺpcoch 4 7 (t.j. jamky A4 a A5...). Vyplňte tabuľku v Excelovskom súbore. 20

A.2.2.5 S pomocou kalibračnej krivky urobenej v úlohe A.2.2.3 a vypočítaných priemerných hodnôt absorbancie vzoriek určite celkovú koncentráciu proteínov (v mg/ml) pre všetky vzorky na mikrotitračnej platničke v stĺpcoch 4 7. Ak sa nameraná hodnota absorbancie vzoriek nachádza mimo rozsahu kalibračnej krivky, použite znamienko < ak je koncentrácia proteínov nižšia ako minimum alebo > ak je vyššia ako maximum. Ak s vašimi hodnotami nemôžete urobiť kalibračnú krivku, požiadajte asistenta v laboratóriu o pomoc (dostanete pripravené dáta, ale budú vám za to strhnuté 4 body). Vyplňte tabuľku v Excelovskom súbore. A.2.2.6 S použitím najpresnejších priemerných výsledkov vypočítajte celkovú koncentráciu proteínov (v mg/ml) vo vzorkách. Vyplňte tabuľku v Excelovskom súbore. Úloha A.2.3 SDS-PAGE na sledovanie zmien v zastúpení proteínov Približné zastúpenie/obsah proteínov čerstvého/surového mlieka sa nachádza v tabuľke 2.2. Tabuľka 2.2. Relatívny obsah proteínov čerstvého/surového mlieka a ich príslušná molekulová hmotnosť stanovená pomocou gélovej elektroforézy. Proteínová rodina Obsah v čerstvom mlieku, % Pozorovaná molekulová hmotnosť, g/mol (Da) α-kazeíny 45 55 32 000 β-kazeíny 25 35 29 000 κ-kazeíny 8 15 25 000 β-laktoglobulín 7 12 17 000 α-laktalbumín 2 4 12 000 Počas ovplyvnenia teplom môžu mliečne proteíny interagovať a vytvárať chemické komplexy s vyššou molekulovou hmotnosťou (nad 50 000 Da). V kravskom mlieku sa nachádza asi 90% kazeínu vo forme makromolekulárnych agregátov označovaných ako micely. V čerstvom mlieku je agregácii týchto micél zabránené tým, že vo vode rozpustné chvosty (glykomakropeptidy) sú pripojené ku kazeínu. Keď sa pridá syridlo, jeho enzýmy hydrolyzujú stabilizujúcu vonkajšiu vrstvu micél, čo vedie k tvorbe para-kazeínu s nižšou molekulovou hmotnosťou a zvyšuje hydrofobicitu (nemiešateľnosť s vodou). Týmto spôsobom začína agregácia hydrofóbnych častíc a pokračuje ďalším rozsiahlym rastom kazeínových zhlukov až kým nevznikne tvaroh. Tvaroh zachytáva vodu, tuk a baktérie. SDS polyakrylamidová gélová elektroforéza (SDS-PAGE) je metóda, ktorá sa používa na oddelenie proteínov na základe ich molekulovej hmotnosti. Proteíny sa vo vzorke denaturujú pomocou detergentu (SDS) a zahrejú, SDS sa viaže na aminokyselinové zvyšky proteínov a udeľuje im záporny náboj. Vzorka sa potom nanesie na gél, ktorým sa nechá prechádzať elektrický prúd. Elektrický prúd spôsobuje, že záporne nabité častice putujú ku 21

kladnej elektróde. Keďže polyakrylamidový gél neumožňuje väčším molekulám putovať rovnakou rýchlosťou ako malým (ktoré putujú rýchlejšie), dochádza k rozdeleniu proteínov na základe ich molekulovej hmotnosti. Zvyčajne sa do samostatnej dráhy na géli ako štandard nanesie aj zmes proteínov so známou molekulovou hmotnosťou jednotlivých zložiek zmesi, aby sa zjednodušila analýza výsledkov. Po elektroforéze môžu byť proteíny vizualizované pomocou farbičky viažúcej proteíny, akou je Coomassie Brilliant Blue. A.2.3.1 Obrázok 2.2 nižšie je príkladom SDS-PAGE gélu zafarbeného farbičkou Coomassie Brilliant Blue. Každá dráha na géli predstavuje jednu vzorku. Naznačte na obrázku v Odpoveďovom hárku, kde na géli môžete vidieť prúžok zodpovedajúci (*) α-kazeínu, (**) β-kazeínu, (***) κ-kazeínu, (#) β-laktoglobulínu, ( ) α-laktalbumínu. Obrázok 2.2. SDS-PAGE gél zafarbený farbičkou Coomassie Brilliant Blue. Dráha úplne vľavo (označená L) obsahuje zmes proteínov so známou molekulovou hmotnosťou (Mw) naznačenou vľavo v kilodaltonoch (kda). Dráhy 1 a 2 obsahujú mlieko; dráha 3 obsahuje tekutú frakciu získanú z kyslého mlieka; dráhy 4 a 5 obsahujú kvapalnú frakciu zo zrazeniny (nie srvátky) získanej z kyslého mlieka; dráha 6 obsahuje srvátku; dráhy 7 a 8 obsahujú tekutú frakciu tvarohu I. A.2.3.2 Pomocou softvéru na kvantifikáciu gélu boli vypočítané intenzity prúžkov pre jednotlivé dráhy v oblastiach 35 25 kda, 17 kda a 12 kda. Výsledky sú dané v percentách celkovej intenzity (relatívny obsah, %) príslušnej dráhy (viď Obrázok 2.3). Vysvetlite pozorované výsledky tak, že označíte príslušné tvrdenia buď ako pravda (napíšte +) alebo nepravda (napíšte 0) do Odpoveďového hárku. 22

Obrázok 2.3. Relatívny obsah (%) proteínov s rozličnými molekulovými hmotnosťami v označených dráhach na géli. Číslovanie dráh zodpovedá tomu, ktoré je na obrázku 2.2. číslo tvrdenie 1 Relatívny obsah proteínov s hodnotami molekulovej hmotnosti 32 25 kda, prezentovaný na grafe, neodráža fyzikálno-chemické procesy prebiehajúce počas kysnutia mlieka alebo výroby tvarohu. 2 Relatívny obsah kazeínov je znížený v tekutej frakcii izolovanej z kyslého mlieka a v srvátke, pretože kazeíny sa počas výroby tvarohu a kysnutia mlieka stávajú slabo rozpustné. 3 Relatívny obsah kazeínov je znížený v tekutej frakcii izolovanej z kyslého mlieka, pretože kazeíny sú počas kysnutia mlieka degradované, znehodnocované. 4 Relatívny obsah kazeínov je znížený v kvapalnej frakcii tvarohu, pretože sa počas výroby syra degradujú. 5 Relatívny obsah β-laktoglobulínu a α-laktalbumínu je zvýšený v srvátke, pretože tieto proteíny tvoria baktérie počas výroby tvarohu. 6 Relatívny obsah β-laktoglobulínu a α-laktalbumínu je zvýšený v kvapalnej frakcii získanej z kyslého mlieka a srvátky, pretože relatívny obsah kazeínov v kvapalných frakciách je znížený. 7 Relatívny obsah proteínov s molekulovou hmotnosťou 17 kda a 12 kda je zvýšený v kvapalnej frakcii tvarohu, pretože tieto reprezentujú produlty enzymatickej degradácie kazeínu. 8 Proteínové zloženie mlieka a kvapalnej frakcie zrazeniny kyslého mlieka je dramaticky odlišný, keďže kyselina degraduje proteíny. 23

Deň mlieka ÚLOHA A.3 Jodometrické stanovenie laktózy Mlieko možno opísať ako koloidný roztok obsahujúci proteíny, tuky a cukry (najmä laktózu). Dnešnou úlohou je skúmať tieto zložky mlieka v mliekarenskom laboratóriu fyzikálnymi, chemickými a biologickými metódami. Vaša práca je financovaná firmou cowboom. Firma má zámer vyrábať sériu mliečnych produktov. Vaša štúdia umožní zistiť rôzne vlastnosti vzoriek mlieka a ich obchodnú výhodnosť. Všeobecný materiál: laptop prepisovačky 2 vode odolné značkovače 2 ceruzky (plniaca ceruzka je pre úlohu Task A.1) pravítko s mierkou nožnice dlhá a krátka pinzeta nalepovacie papieriky (Post-it) elektronické hodiny kalkulačka destilovaná voda (fľaša 500 cm 3 ) ochranné okuliare papierové utierky nádoba na odpad papier (modré označenie) nádoba na odpad plasty (žlté označenie) nádoba na odpad sklo (zelené označenie) nádoba na odpad kvapaliny 24

ÚLOHA A.3 Jodometrické stanovenie laktózy Laktóza je disacharid zložený z galaktózy a glukózy. Obsah laktózy v roztoku možno stanoviť jodometrickou titráciou, pri ktorej je jód oxidovadlom a laktóza redukovadlom. V našom prípade budeme pridávať do vzorky mlieka s neznámym obsahom laktózy nadbytočné množstvo roztoku jódu so známou koncentráciou. Časť jódu zreaguje s laktózou vo vzorke a nezreagovaný jód stanovíme titráciou s roztokom tiosíranu sodného so známou koncentráciou Na2S2O3. Aby sa predišlo chybám spôsobenými stratami jódu pri titrácii, musíme urobiť aj slepý pokus. Postupujem pritom rovnako ako pri stanovení laktózy vo vzorke mlieka, ale pri titrácii namiesto vzorky mlieka použijeme rovnaký objem destilovanej vody. Od spotreby pri stanovení laktózy v mlieku odpočítame spotrebu pri slepom pokuse a takto korigovanú spotrebu použijeme potom na stanovenie obsahu laktózy vo vzorke mlieka. Navyše dostanete aj vzorku kyslého mlieka. Kyslé mlieko sa pripravilo z toho istého sladkého mlieka, ktoré ste titrovali, avšak látka B (tá istá ako v úlohe A.2.1) sa pridala do neho o deň skôr. Vašou úlohou je tiež určiť, ako sa s časom mení obsah laktózy (nemení sa, je väčší alebo je menší). A.3.1 V odpoveďovom hárku je uvedená molekulová štruktúra laktózy, ako aj možné štruktúry laktózy s otvorenými reťazcami tejto molekuly. Pre každú z uvedených možností rozhodnite, či je vzorec laktózy s otvoreným reťazcom správny. A.3.2 Napíšte vaše odpovede do odpoveďového hárku. Nižšie sú uvedené neúplné reakcie (bez koeficientov), ktoré prebiehajú pri opísanom stanovení. Doplňte do rovníc správne stechiometrické koeficienty (jednotku nevypisujte). C12H22O11(lactose) + I2 + NaOH C12H21O12Na + NaI + H2O Na2S2O3 + I2 NaI + Na2S4O6 Na základe vášho jodometrického stanovenia musíte určiť hmotnostný zlomok laktózy v mlieku a v kyslom mlieku. Zoznam chemikálií a pomôcok: mlieko v 300 ml plastovej fľaši označenej MILK kyslé mlieko (v 50 ml plastovej nádobe) roztok CuSO4 (v 50 ml plastovej nádobe) roztok NaOH (c = 0.5 mol dm -3 ) (v 50 ml plastovej nádobe) 25

roztok HCl c = 1 mol dm -3 (v 50 ml plastovej nádobe) 0.5 % škrobový roztok (v kvapačke) roztok jódu s koncentráciou 0.0500 mol dm -3 (v 100 ml Erlenmeyerovej banke chránenej hliníkovou fóliou) 2 odmerné banky s plastovými zátkami (250 ml) 4 Erlenmeyerove banky so sklenenými zátkami (200 ml) 2 kadičky (250 ml) 100 ml kadička (na destilovanú vodu) 10 ml pipeta 25 ml pipeta sklená tyčinka byreta a stojan (byreta je naplnená roztokom Na2S2O3 s konc. 0,100 mol dm -3 ) kadička pod byretou (100 ml) filtračný papier plastový lievik (modrý) 7 Pasteurových pipiet 3 plastové centrifugačné skúmavky (15 ml) váhy 3 hárky hliníkovej fólie 2 plniče pipiet Ak potrebujte viac chemikálií. prípadne filtračný papier alebo papierové utierky, požiadajte o ne laboratórneho asistenta. Nebudete mať za to stiahnuté body. (Pozor, roztok Na2S2O3 vám do byrety doplní lab. asistent). Postup stanovenia: Uvedomte si, že okrem slepého pokusu si musíte pripraviť dve vzorky mlieka (normálneho a kyslého) a stanoviť v nich obsah laktózy. Z časových dôvodov si organizujte čas tak, aby ste stihli aj bod 13 tohto postupu. 1. Zakaždým, keď chcete použiť vzorky mlieka, musíte nádoby s mliekom (s normálnym aj s kyslým) jemne pretrepať ale premiešať krúživým pohybom, aby ste ich dôkladne premiešali. Avšak miešanie nesmie byť príliš intenzívne, ale len také, aby sa pri ňom nezačala tvoriť na mlieku pena. Do 250 ml odmernej banky na váhach odvážte asi 10 g mlieka. Pri odbere mlieka použite Pasteurovu pipetu. Presnú hmotnosť odváženého 26

mlieka zapíšte do tab. 3.1 v odpoveďovom hárku. Potom pridajte do banky toľko destilovanej vody, aby bola banka naplnená do polovice. Obsah banky dôkladne premiešajte krúživým pohybom. 2. Na vyzrážanie mliečnych bielkovín pridajte do banky približne 5 ml roztoku CuSO4 Použite pritom Pasteurove pipety alebo 15 ml centrifúgové skúmavky. Nakoniec zmes premiešajte. Potom pridajte do zmesi približne 4 ml roztoku NaOH (0,5 mol dm -3 ). Na odmeranie objemu použite Pasteurove pipety alebo 15 ml centrifúgové skúmavky. Zmes znovu premiešajte. 3. Potom doplňte odmernú banku destilovanou vodou až po značku, zazátkujte ju plastovou zátkou, obsah starostlivo premiešajte a potom nechajte banku s obsahom stáť 20 minút, aby mohli prebehnúť vyžadované chemické reakcie. Počiatočný čas si poznačte na nálepku aby ste ho nezabudli. 4. Po uplynutí 20 minút, roztok prefiltrujte do 250 ml kadičky. Použite pritom lievik, suchý filtračný papier (kruhový) a ak treba aj sklenú tyčinku. 5. Z filtrátu odmerajte 25.00 ml do 200 ml Erlenmeyerovej banky. 6. Do zmesi pridajte 10.00 ml roztoku I2 (c = 0.0500 mol dm -3 ) a obsah banky jemne pomiešajte (krúživým pohybom). 7. Pridajte asi 7.5 ml roztoku NaOH (c = 0.5 mol dm -3 ) M NaOH. Na odmeranie objemu použite Pasteurove pipety alebo 15 ml centrifúgové skúmavky. Nakoniec zmes pomiešajte. 8. Erlenmeyerovu banku uzatvorte sklenou zátkou, banku s roztokom zabalte do hliníkovej fólie, aby ste ho chránili pred svetlom a nechajte stáť po dobu 20 minút. 9. Potom pridajte do roztoku asi 4 ml roztoku HCl (1 mol dm -3 ). Na odmeranie objemu použite Pasteurovu pipetu alebo 15 ml centrifúgovú skúmavku. Zapíšte si počiatočný objem roztoku Na2S2O3 v byrete. Potom titrujte nezreagovaný jód roztokom Na2S2O3 (c = 0,100 mol dm -3 ). Keď titrovaný roztok získa slabožlté sfarbenie, pridajte do neho niekoľko kvapiek škrobového roztoku. Sfarbenie roztoku sa zmení na tmavomodré. Potom titrujte opatrne ďalej až do odfarbenia titrovaného roztoku. Pri správnom dotitrovaní roztoku sa modré sfarbenie roztoku nesmie objaviť do dobu 30 sekúnd. Výsledky titrácie si poznačte do tabuľky 3.2 v odpoveďovom hárku. 27

10. Kroky 6 10 môžete opakovať viackrát, aby ste si boli istý, že môžete spoľahlivo určiť obsah laktózy vo vzorke. (Pozor na čas). 11. Experiment zopakujte s destilovanou vodou, čo poslúži ako slepý pokus. Pri slepom pokuse urobte len kroky 6 11 a namiesto filtrátu použite v kroku 6 destilovanú vodu. Výsledky zaznamenajte v tabuľke 3.2 v odpoveďovom hárku. Pipetu, kadičky (250 ml) a lievik opláchnite destilovanou vodou a lievik, ak treba, utrite papierovou utierkou. Môžete pritom použiť vodovodnú výlevku na konci laboratórneho stola. 12. Zopakujte kroky 1 11, avšak namiesto normálneho mlieka použite kyslé mlieko. Táto titrácia nemusí byť veľmi presná (dve paralelné titrácie postačujú). Dôležité je zistiť, či je obsah laktózy v kyslom mlieku väčší, rovnaký alebo menší ak v normálnom m lieku. Výsledky zapíšte do tab. 3.1 a 3.3 v odpoveďovom hárku. 25 ml pipetu treba vypláchnuť filtrátom z kyslého mlieka a 250 ml odmernú banku treba vypláchnuť destilovanou vodou, ak je to potrebné. A.3.3 Skontrolujte si, či ste tabuľky 3.1, 3.2 a 3.3 v odpoveďovom hárku vyplnili, ak sa vyžadovalo. A.3.4 Vypočítajte hmotnostný zlomok laktózy v mlieku a v kyslom mlieku. Z tab. 3.2 a 3.3 v odpoveďovom hárku použite len akceptovaný objem. Molová hmotnosť laktózy je 342 g /mol. TASK A.4 Produkcia mlieka súhrn výsledkov V tejto úlohe musíte rozhodnúť, či mlieko, ktoré ste podrobili analýze v úlohách A1 až A 3 je vhodné pre obchodné účely v istej firme, ktorá má meno cowboom. A.4.1 Firma cowboom by rada predávala mlieko s prídavkom vitamínu D. Na obrázku 4.1 je znázornená závislosť rozpustnosti vitamínu D v mlieku od obsahu tuku v mlieku. Vychádzajúc z výsledkov v úlohe A.1 určte, ktoré mlieko by ste vybrali pre tento účel (K, L, M, or N)? Z hľadiska štandardizácie a kvality je tiež dôležité, aby sa na povrchu mlieka nevytvárala smotana.. 28

Obrázok 4.1 Rozpustnosť (g/liter) vitamínu D v závislosti od obsahu tuku v mlieku (%). Šípka naznačuje nárast veličiny. A.4.2 Firma cowboom má zámer vyrábať mlieko, ktoré nevyvoláva alergické reakcie (alergy-free) u ľudí, ktorí sú alergickí na antibiotíkum gentamicín. Na obrázku 4.2 je znázornená závislosť obsahu laktózy v mlieku, do ktorého bola pridaná látka B (ako v úlohe A 2.1) v závislosti od inkubačného času v prítomnosti alebo v absencii antibiotík. Myslíte si, že mlieko, ktoré ste použili v úlohách A.2 a A.3 by bolo vhodné na tento účel a bolo by ho možné označiť ako mlieko, ktoré nevyvoláva alergiu na gentamicín? Obr. 4.2. Závislosť hmot. % laktózy od inkubačného času (h) mlieka látkou B neobsahujúceho gentamicin ( ), alebo obsahujúceho stopy gentamicin ( ). Šípky ukazujú smer vzrastu veličiny. A.4.3 Približne 65 % svetovej populácie má problémy s metabolizmom laktózy. Firma cowboom by to chcela využiť a predávať mlieko určené takýmto ľuďom. Takéto mlieko by malo obsahovať menej ako 0.01 hmotnostných % laktózy. Myslíte si, že mlieko, ktoré ste použili v úlohách A.2 a A.3 by bolo vhodné na tento účel? (Odpovedzte Yes alebo No). 29

A.4.4 Firma cowboom má zámer predávať mlieko, ktoré nevyvoláva alergické reakcie u ľudí, ktorí sú alergickí na kazeín, Takéto mlieko musí obsahovať menej ako 0.005 hmot. % kazeínu (spolu α, β a κ). Myslíte si, že mlieko, ktoré ste použili v úlohách A.2 a A.3 by bolo vhodné na tento obchodný účel? (Odpovedzte Yes alebo No). 30