UDŽBENK H O R M O N Prof. Marina Stojanov 1 2 OSTALA LTERATURA 1. ialal, Winter WE, Chan DW. Diagnostic Endocrinology, AACC, Washington DC, 1999. 2. Greespan FS, Gardner DG. Basic & Clinical Endocrinology, Lange, McGraw-Hill, 2004. 3. Burtis CA, Ashwood MD, Bruns DE. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 5ed., Elsevier Health Sci., 2012. 3 4
Podela : Razlika u strukturi, načinu transporta, metabolizmu i mehanizmu dejstva. 1. Steroidi (kortizol, vit.d). Hidrofobni, cirkulišu reverzibilno vezani na proteinske nosače (CBG, SHBG). Mali % slobodnih. 2. Polipeptidi ili proteini (ACTH, gonadotropini). Hidrosolubilni, cirkulišu u nevezanom obliku koncentracija fluktuira. 3. Supstance nastale iz aminokiselina (tiroksin cirkuliše vezan za tri proteina); (kateholamini nisu vezani za proteine). 5 6 Regulatorno: Dejstvo hormona a. Održavanje homeostaze ekstra- i intracelularne tečnosti normalan rad i funkcionisanje organizma. Metabolizam soli, vode, UH, lipida, proteina. b. Odgovor na urgentna stanja (gladovanje, infekcije, trauma, psihički stres). c. Reproduktivna funkcija (gametogeneza, seksualno ponašanje, fertilizacija, ishrana fetusa, porođaj). 7 Morfogeneza : Uloga u nastanku muških i ženskih polnih karakteristika (polni hormoni). ntegrativno : -Određen hormon deluje na određen biohemijski proces i metaboličku aktivnost jednog organa; mogu da deluju i hormoni sintetisani u različitim endokrinim žlezdama. nsulin (+ glukagon, hormon rasta, hormoni adrenalnih žlezda, tireoidne žlezde). -Povezanost endokrinog i nervnog sistema (mineralokortikoidi). 8
Regulacija hormonskog izlučivanja Regulacija hormonskog izlučivanja Sinteza hormona dinamički proces; nivo cirkulišućeg hormona u fiziološkim granicama. Balans hormona: stvaranje hormona potrebe organizma. Centralno mesto: predni režanja hipofize luči tropne hormone regulacija ciljnih endokrinih žlezda. Glavni ciljni organi tropnih hormona: tireoidna žlezda, adrenalni korteks i gonade. 9 Regulacija sistemima povratne sprege : pozitivna i negativna (direktna i indirektna) Direktna negativna povratna sprega: supresivni efekat visokog nivoa Ca na izlučivanje PTH. ndirektna negativna povratna sprega- tropni hormon kontrola izlučivanja adrenokortikalnog, gonadalnog i tireoidalnog hormona. Pozitivna povratna sprega ne deluje izolovano deo kontrolnog sistema (stimulacija oslobađanja LH - povećanjem estradiola pre ovulacije). 10 Kontrola centralnim nervnim sistemom Hormoni neurohipofize (oksitocin, vazopresin) i adrenalne medule (epinefrin) primarno kontrolisani nervnim sistemom. Odnos nervnog i endokrinog sistema - različiti kontrolni mehanizmi povratne sprege (uključen i hipotalamus). Tip kontrole višim centrima u mozgu: kontrolni sistem otvorene petlje (open-loop control system) opisuje (pr. hormonski odgovor na stres). 11 Hormonski receptori Biološki odgovor ciljnećelije na određen hormon iniciran vezivanjem za receptor na ili u ciljnojćeliji. H + R HR *Kompleks HR aktivira ciljnućeliju za biohemijske procese; manifestuju se kao hormonski efekti. 12
Karakteristike kompleksa hormonreceptor: Specifičnost Fiziološka koncentracija cirkulišućih hormona: 10-9 10-12 mol/l; ostalih proteina 10-3 mol/l jedna hormonska molekula se može prepoznati među milion i milijardu molekula drugih supstanci. Osobina zasićenja ćelije imaju ograničen broj recetora i max. kapacitet za vezivanje hormona. Stepen odgovora ciljnog tkiva proporcionalan br. HR. Max. sva mesta na receptoru popunjena. Visok afinitet: formiranje HR pri niskoj konc. hormona visoka konst. afiniteta (K). 13 Ka - konstanta asocijacije [HR] - konc. hormona vezanog za receptor [H] - konc. slobodnog hormona [R] - konc. slobodnog receptora 1 Ka = Kd Ka = [HR] [H] [R] 1 Kd = Ka disociona konst. ravnoteže (10 9 10-12 ) 14 Regulacija receptora Vezivanje hormona za receptor utiče na afinitet okolnih mesta vezivanja. Povećana okupiranost jednog receptora smanjen afinitet preostalih (negativna kooperativnost). Modulacija hormonskog dejstva visok receptorski afinitet pri niskim konc. hormona; nizak pri visokoj. Hormoni kontrolišu aktivnost svojih recetora (homologni efekat); receptori mogu biti modulirani i drugim hormonima (heterogeni efekat). 15 Regulacija receptora Jedan hormon može da ima jak afinitet prema svom receptoru i izvestan prema receptoru drugog hormona rasipanje specifičnosti (specificity spillover). Najčešće kod hormona slične strukture. Disfunkcija receptora uzrok kongenitalnih ili stečenih endokrinih oboljenja. Uzroci: nedovoljna sinteza receptora, interferencija sa vezivanjem za receptor (prisustvo antireceptorskih antitela), strukturna promenljivost receptora, poremećaji na molekularnom nivou (posle vezivanja za receptor). 16
MEHANZAM HORMONSKOG DEJSTVA Dva tipa: a) za peptidne hormone i kateholamine (membranski receptori); b) za steroide i jodotironine (intracelularni). Peptidni hormoni i kateholamini Vezivanjem za receptore na ćelijskoj membrani stvara se»sekundarni glasnik«prenos hormonskih efekata na intracelularne enzime genska ekspresija membranski transport. Prvi glasnik: hormon; drugi: mala organska molekula (camp, inozitol fosfat, jon). Dve osnovne klase membranskih receptora za peptidne hormone i neurotransmitere: G proteini i sa aktivnošću tirozin kinaze. 17 18 Receptori povezani sa G proteinima G proteini (guanozin nukleotid-vezujući protein) vezivanje sa ciljnim proteinima (adenilat ciklaza i fosfolipaza C). Kombinacija hormona sa receptorima aktivacija adenilat ciklaze stvaranje camp na unutrašnjoj površini membrane. Aktivacija zavisi od: specifičnog receptora, vezujućeg G proteina i adenilat ciklaze. Hormonsko-receptorska aktivacija fosfolipaze C analogna sistemu adenilat ciklaze (deluje preko regulatornog G proteina). 19 20
RECEPTOR SA AKTVNOŠĆU TROZN KNAZE Sadrže intracelularni domen sa aktivnošću tirozin kinaze. Sastoje se iz dveα- i dveβ-subjedinice povezane disulfidnim mostovima. α-subjedinice su ekstracelularne i sadrže vezivno mesto za hormone; β- subjedinice imaju intracelularni deo koji sadrži ATP-vezivno mesto i deo katalitičke kinaze. 21 22 STERODN TREODN HORMON Liposilubilni ulaze u ćeliju i vezuju se za intracelularne receptore. U dinamičkoj su ravnoteži sa slobodnim hormonom (u ćeliju ulaze pasivnom difuzijom). Receptori sadrže deo koji vezuje hormone, DNK-vezujući deo i N-terminalni vezujući deo. Vezivanje hormona za specifični receptor konformacione promene u receptoru mogućnost vezivanja specifične regulatorne DNK sekvence na 5' kraju ciljnog gena. Ova nuklearna mesta vezivanja hormonsko regulatorni / elementi odgovora postavljeni ushodno od genačiju transkripciju kontrolišu. 23 24
STERODN TREODN HORMON Vezivanje HR za DNK regulatorne elemente: > ili < gensku transkripciju, stvara se sekvenca DNK na koju deluje RNK polimeraza. Stvorena mrnk određuje sintezu specifičnih proteina/enzima - menjaju hormonske efekte. Tireoidni hormoni dejstvo slično steroidnim. T 3 vezuje se za hormonski receptor 10 x jače od T 4 dobro korelira sa njihovim biološkim potencijalom. 25 ENDOKRN POREMEĆAJ Posledica viška ili nedostatka određenog hormona. Stvaranjem patoloških hormona, rezistencijom na hormonsko dejstvo, poremećajem hormonskog dejstva, poremećajem u transportu, metabolizmu i višestruki endokrinološki poremećaji. 26 PROTENSK HORMON Metode određivanja: Hipofiza, štitna žlezda, pankreas, paratireoidne žlezde. Razlike: struktura; fiziološko dejstvo : jednostavni nonapeptidi (oksitocin), kompleksni glikoproteini (FSH, LH, TSH). Nemaju određene hemijske grupe potrebne za reakcije pri određivanju nije moguće direktno određivanje. 27 Bioesej: praćenje fiziološkog odgovora specifičnog za hormon koji se meri. n vivo: životinji se injicira određeni hormon prati se odgovor ciljne žlezde. Neosetljivi, nedovoljno specifični, skupi, teški za izvođenje. n vitro: inkubacija tkiva, membrana, ćelijskih linija sa hormonom merenje odgovora na hormon. Bioesej se ne koristi za rutinska određivanja hormona. 28
. RECEPTORSKA ODREĐVANJA Mogućnost sinteze antitela sposobnih da vežu sve proteinske hormone. Merenje veoma niskih koncentracija visok afinitet vezivanja antitela za hormonski antigen. Sposobnost antitela da razlikuje određeni hormon od strukturno sličnih supstanci. ** munometrijske metode najznačajnija sendvič metoda. Zahteva dva ili više antitela protiv epitopa - proteinske molekule: hormon je u sendviču između antitela. Jedno antitelo - vezano začvrstu fazu (ekstrahuje molekule iz biološkog uzorka); drugo za signalnu molekulu (radioizotop, RA) zmereni signal direktno proporcionalan koncentraciji hormona. Neizotopski obeleživači kod imunometrijskih metoda: enzimi, fluorofore, hemiluminescentne molekule. 29 30!! Prednosti: bolja preciznost, brže reakciono vreme, povećana osetljivost i specifičnost. Mogućnost aplikacije na automatske analizatore. mmunoassay animation zbor metode određivanja u biološkom materijalu (krv, plazma, serum, urin) zavisi od osetljivosti metode, lakoće sakupljanja uzoraka, fiziološke aktivnosti hormona. Promena nivoa nekih hormona - brza (gonadotropini) uzimanje više uzoraka u određenom vremenskom intervalu. 31 32
ADENOHPOFZN HORMON 1. Hormon rasta (GH) 2.Prolaktin (PRL) 3.Tireo-stimulirajući hormon (TSH) 4. Gonadotropini 5. ACTH Hormon rasta Kontrola izlučivanja GHRH, GHH (somatostatin). Lučenje pulsatilno -dijagnoza : GF-1 Pojačano lučenje : gigantizam (deca) akromegalija (odrasli) Poremećaj GH: OGTT- zdravi :glukoza inhibira lučenje GH 33 34 Metabolička dejstva hormona rasta pojačana lipoliza (ketogeni efekat) povećana produkcija glukoze i smanjeno preuzimanje glukoze od tkiva (dijabetogeni efekat) * povećana sinteza proteina (anabolički efekat) 35 36
Procena statusa hormona rasta 1. Arginin infuzioni test : (0,5 g arginina/kg) i.v., 30 min ; uzorci krvi na 30 min., tokom 2h. Norm. odg. > 15 mj/l. 2. Bovril test : 20 vodenog rastvora bovrila/1,5m 2 telesne površine; uzorci krvi na 30 min., tokom 2h. Norm. odg. > 20 mj/l. 3. Test vežbanja : pacijent trči uz stepenice 10 min. Norm. odg. > 20 mj/l. 37 PROLAKTN Polipeptidni hormon stimulacija razvoja mlečne žlezde, održavanje laktacije. Sekrecija pulsirajuća; povećana u snu i pri stresu (način uzimanja uzoraka!) Kod žena zavisi od estrogena. zlučivanje povećano tokom trudnoće, opada 3 nedelje nakon porođaja. Nedostatak kod infarkta hipofize nemogućnost dojenja. * Povećane konc.:prolaktin-sekretujući tumori hipofize! 38 TSH Glikoprotein (α i β-subjedinica) stimuliše sintezu i izlučivanje tireoidnih hormona. Sekreciju TSH stimuliše hipotalamusni TRH inhibicija visokim koncentracijama tireoidnih hormona. Primarni hipotireoidizam povećana sekrecija Hipertireoidizam - snižena 39 40
GONADOTROPN 41 ADRENOKORTKOTROPN HORMON (ACTH) *Polipeptidni hormon : stimuliše sekreciju adrenalnih glukokortikoida, ne i mineralo kortikoida. Cirkadijani ritam: najviši u 8h, najniži u ponoć. *Povećana sekrecija : pituitarni tumori (ACTHzavisni Cushing), primarna adrenalna hipofunkcija (Addison). 42 SPTVANJE FUNKCJE HPOFZE VAZOPRESN (ADH) TESTOV STMULACJE (STMULATORN TESTOV) SUSPEKTNA HPOFUNKCJA TESTOV SUPRESJE (SUPRESON TESTOV) SUSPEKTNA HPERFUNKCJA SUSPEKTNA DSFUNKCJA PREDNJEG REŽNJA HPOFZE TEST 3 DOZE!!! 43 44
Slučaj 1. Laboratorijski nalazi: Serum: kortizol (09,00 h) 300 nmol/l (288 635 nmol/l) Pedesetogodišnji muškarac je pao i udario glavom o ivičnjak. Bio je u nesvesti nekoliko sekundi. Na pregledu nisu utvrđene fizičke povrede glave, ali je radiografija lobanje pokazala uvećanje pituitarnog udubljenja. Pacijent je rekao da je predhodnih GH < 2 µg/l ( < 2 µg/l) slobodan tiroksin 12 pmol/l (10 35 pmol/l) TSH 2 mj/l (0,4 4,2 mj/l) testosteron 4 nmol/l (0,52 38,17 nmol/l) LH < 1,5 J/L ( 2 12 J/L) FSH < 1,0 J/L ( 1,24 15,4 J/L) prolaktin < 50 mj/l ( < 20 mj/l) 12 meseci izgubio libido, da nije imao potrebe da se često brije i da je primetio gubitak potpazušnih i pubičnih malja. Često je osećao nesvesticu pri jutarnjem ustajanju, a bez obzira na vreme koje bi provodio na suncu nije dobijao uobičajenu boju. 45 Kombinovani glukagon, TRH i GnRH stimulacioni test : Serum : kortizol (maksimum) 350 nmol/l u 180 min LH, FSH nema povećanja u odnosu na bazni nivo GH nema povećanja u odnosu na bazni nivo TSH 5 mj/l u 20 min. 3 mj/l u 60 min. 46 Slučaj 2. Slučaj 3. Desetogodišnji dečak je hospitalizovan radi ispitivanja uzroka niskog rasta. Oduvek je bio nizak, ali su se roditelji zabrinuli kada ga je nadrastao njegov sedmogodišnji brat. Od kada mu je visina izmerena, dve godine ranije, porastao je samo za 3 cm. Na rutinsku kontrolu je primljena sredovečna žena kojoj je urađena mastektomija a zatim i radioterapija zbog karcinoma dojke. Nije bilo znakova recidiva, ali se ona žalila na pojačanu žeđ i izlučivanje velikih količina urina. Nije bilo znakova glukozurije i ona je podvrgnuta daljim ispitivanjima. Laboratorijski nalazi: Slučajni uzorak : Osmolalnost plazme Na Osmolalnost urina 295 mosm/kg 114 mmol/l 90 mosm/kg Laboratorijski nalazi: Serumski GH : 4 µg/l (posle snažnog vežbanja) 4 µg/l (tokom hipoglikemije izazvane insulinom) 47 Test lišavanja tečnosti: Posle 6h testa lišavanja tečnosti, telesna masa joj je opala sa 60 kg na 57,6 kg i test je prekinut. Na kraju testa : Osmolalnost plazme 307 mosm/kg Osmolalnost urina 220 mosm/kg Zatim je pacijentkinji data tečnost i dobila je dozu dezmopresina. Nakon toga osmolalnost se povećala na 610 mosm/kg. 48
FUNKCJA TREODEJE Sekretorne jedinice tireoidne žlezde (folikuli) sadrže koloid: tireoglobulin (jodirani glikoprotein); male količine jodiranog tireoalbumina. Aktivnost žlezde povećana < količina koloida i volumen folikula; kada je smanjena akumulacija koloida, povećanje volumena folikula. Drugi tip ćelija parafolikularnećelije (C ćelije) stvaraju polipeptidni hormon kalcitonin. 49 50 TREODN HORMON Tireoidna žlezda luči: 1. tiroksin (3,5,3',5'-L-tetrajodtironin, T 4 ); 2. trijodtironin (3,5,3'-L-trijodtironin, T 3 ) 3. male količine 3,3',5'-L-trijodtironina (reverzni T 3, rt 3 ) 4. minimalne količine monojodtirozina (MT) i dijodtirozina (DT): prekurzori T 3 i T 4. Jedinjenja/elementi neophodni za sintezu tireoidnih hormona TREOGLOBULN (Tg) TREOSTMULRAJUĆ HORMON (TSH) TREODNA PEROKSDAZA (TPO) JOD 51 52
TREOGLOBULN (Tg) Glikoprotein (5496 AK), Mm ~ 660000 140 tirozinskih ostataka, 10% UH (manoza, N-acetilglukozamin, galaktoza, fukoza, sijalinska kiselina, hondroitin sulfat). 4 tirozinska mesta vezivanja: 1 na amino-terminalnom kraju; 3 na karboksi-terminalnom kraju. Gen za Tg na dugačkoj ruci hromozoma 8; sadrži 8500 nukleotida; kodira monomer pre-tireoglobulina (pre-tg). Transkripciju Tg gena stimuliše TSH. Translacija mrnk u grubom ER; Tg lanci se glikoziliraju tokom transporta do Goldži aparata. U Goldži aparatu, Tg dimeri se inkorporiraju u egzocitne vezikule fuzija sa apikalnom membranom oslobađanje Tg u lumen folikula. 53 Tireostimulirajući hormon (TSH); tireotropin Sintetiše se u adenohipofizi pod dejstvom TRH hipotalamusa. Glikoprotein, Mm ~ 28000, (15% ugljenih hidrata) Sastoji se od 2 nekovalentno vezane α i ß subjedinice ß-subjedinica odgovorna za biološku i imunološku specifičnost Peptidi se sintetišu odvojeno spajaju pre vezivanja UH grupe. Glavni eksterni regulator tireoidne žlezde. Vezuje se za TSH receptore locirane na bazalnoj membrani folikularnih ćelija. 54 Tireoidna peroksidaza (TPO) Glikoprotein vezan za membranu, Mm ~ 120000; prostetična grupa hem. Sintetiše se na grubom ER. Preko Goldžijevog kompleksa i egzocitnih vezikula prenosi do apikalnećelijske membrane. nhibiraju - antitireoidni lekovi grupe tioureje (metimazol, karbimazol, propiltiouracil). 55 J O D Hrana osnovni izvor joda (jaja, plodovi mora, hleb, dijetarni proizvodi), jodinovana so, dijetarni suplementi. Preporučene dnevne potrebe : 150 µg/dan. Tireoidna žlezda koncentriše jod sadži ~ 90% telesnog pool -a. U cirkulaciji u obliku -. Brzo se resorbuje iz GT-a. 56
SNTEZA TREODNH HORMONA 1. Hvatanje - u tireoidnu folikularnućeliju. 2. Difuzija jodida do apikalne membrane. 3. Transport - do koloida. 4. Oksidacija neorganskog - do jodina ( + ) 5. Kuplovanje dva dijodotirozina (DT) tetrajodtironin (tiroksin, T4); monojodtirozina (MT) i DT trijodotironin (T3) 6. Endocitoza Tg iz koloida u folikularnućeliju; fuzija Tg sa lizozomom, proteoliza oslobađanje T4, T3, DT i MT 7. Oslobađanje T4 i T3 u cirkulaciju 8. Dejodinacija DT i MT tirozin 57 KOLOD MTMT DT DT MT Tgb + Tgb DT Oksidacija/H 2 O 2 DT Jodinacija DT MT - Kuplov. Peroksidaza Peroksidaza Peroksidaza * * * Sekretovanje u koloid TRODNA FOLKULARNA ĆEL. H 2 O 2 Tgb Peroksidaza Peroxidase Tgb u Golgi ap. mrna Sinteza proteina Tirozin + druge amino kiseline O 2 + H + NADPH NADP+ Mitohondrija Tiroid-specifična dejodinaza Lizozomi Sekundarni lizozomi Proteazehidroliza MT Na + - Dejodinacija K + DT T 4,T 3 Simport Koncentracija Difuzija * Na + - Na + /K + - Na + ATPaza T 4,T Ekstracelularni prostor (krvotok) 3 Oslobađanje u cirkulaciju * T 3 MT DT DT MT Tgb T DT 4 T DT 4 Tgb Tgb Tgb PK camp Povećan ćelijski rast Adenil ciklaza TSH Receptor TSH LATS/TS TSH TRH 58 Sekrecija TROZN JODNACJA TROZNA STUPANJ 4 - JODNACJA HO CH2CHCOOH- NH2 TREOGLOBULN HO CH2CHCOOH NH2 STUPANJ 5 - KUPLOVANJE JODOTROZNA HO + 5 HO CH2CHCOOH HO NH2 3 Tireoglobulin Tireoglobulin O T 4 5 3 MONOJODTROZN (MT) HO CH2CHCOOH- NH2 TREOGLOBULN 3,5,3 5 -tetrajodtironin JODNACJA TROZNA DJODTROZN (DT) HO CH2CHCOOH NH2 - TREOGLOBULN 59 HO CH2CHCOOH NH2 Tireoglobulin + CH2CHCOOH NH2 Tireoglobulin HO 3,3,5 -Trijodotironin T 3 O 60
DEJODNACJA PUT DEAKTVACJE 5-dejodinacija rt3 O 3,5,3 5 -tetrajodotironin T4 O CH2CHCOOH NH2 dejodinaze CH2CHCOOH PUT AKTVACJE 5 - dejodinacija CH2CHCOOH NH2 NH2 3,3,5 -Trijodotironin (reverzi T3) 3,5,3 -Trijodotironin (T3) 61 T3 O Dejodinaze (selenodejodinaze selenodejodinaze) * Dejodinaza (jetra, bubreg, tireoideja, hipofiza). Dvojna aktivnost: 5 i 5 dejodinaza. Afinitet za supstrate rt3>t4>t3. (nhibira je propiltiouracil). * Dejodinaza 5 dejodinaza (mozak, hipofiza, srce, placenta). Katalizuje konverziju T4 u T3 u ekstartireoidnim tkivima. Dejodinaza 5 dejodinaza (placenta, mozak, koža). Glavni put inaktivacije tireoidnih hormona: T4 rt3 (neaktivan) T3 3,3 T2 (neaktivan) 62 Produkcija T4 i T3 T4 je primarni sekretorni proizvod tireoidne žlezde. Tireoidna žlezda sekretuje oko 70-90 µg T4 dnevno. Ukupna dnevna produkcija T3 je ~ 15-30 µg. T3 nastaje na 2 načina: Oko 80% cirkulišućeg T3 nastaje dejodinacijom u perifernim tkivima. * Samo oko 20% nastaje direktnom sekrecijom iz tireoidne žlezde. 63 Vezujući proteini za tireoidne hormone Više od 99% cirkulišućeg T4 i T3 vezano za proteine plazme: - tiroksin-vezujući globulin (TBG) : 75% - transtiretin (TTR), tiroksin-vezujući prealbumin (TBPA): 10-15%. - albumin: 7%. 64
Mehanizam dejstva tireoidnih hormona Receptori za tireoidni hormone na jedru; afinitet za T3 je 10x veći nego za T4. Broj nuklearnih receptora - mali. 4 varijante nuklearnih receptora (opisani i mitohondrijalni za T3). Slobodni receptori (TR) se vezuju za element hormonskog odgovora DNK (HRE) i korepresor (CoR). Nakon vezivanja T3 za receptor CoR se oslobađa, vezuju se koaktivatori (CoA) i počinje transkripcija mrnk. 65 66 Kontrola tireoidne funkcije 1) klasična hipotalamusno-hipofizno-tireoidna osa. 2) hipofizna i periferne dejodinaze modifikacija efekata T4 i T3. 3) autoregulacija hormonske sinteze u tireoideji, zavisno od raspoloživosti joda. 4) stimulacija ili inhibicija tireoidne funkcije TSH receptorskim autoantitelima. 67 68
Feedback Feedback regulacija Efekti na fetalni razvoj Hipotalamus Somatostatin Dopamin TRH TRH T3 T4 Tireoideja i adenohipofiza fetusa počinju da funkcionišu oko 11 nedelje života. Tkivo T3 T4 TSH T3 TSH Tireoideja T4,T3 T4 T4 Visok nivo tipa dejodinaze u placenti T3 i T4 (majke) inaktivirani u placenti mala količina dostupna fetusu neophodna za normalan razvoj mozga fetusa. 69 70 Potrošnja kiseonika i produkcija toplote T3 stimulacijom Na +,K + - ATP-aze u skoro svim tkivima osim mozga, slezine i testisa. Doprinosi povećanju brzine bazalnog metabolizma. TH snižavaju nivo SOD; povećano stvaranje slobodnih radikala. Kardiovaskularni efekti T3 stimuliše transkripciju α-teških lanaca, a inhibira ß-teških lanaca miozina poboljšava kontraktilnost kardijačnog mišića. Povećava transkripciju Ca 2+ -ATP-aznog gena; broj ß-adrenergičnih receptora i koncentraciju G proteina. TH imaju značajne pozitivne inotropne i hronotropne efekte na srce. 71 72
TH: normalan rast i razvoj kostiju T3 : značajan regulator sazrevanja kostiju - T3 reguliše ekspresiju faktora koji direktno utiču na linearan rast kostiju. - T3 može da učestvije u diferencijaciji i proliferaciji osteoblasta; sazrevanju hondrocita osifikacija kostiju. Hematopoezni efekti Povećana potreba za O 2 (hipertireoidizam) povećana produkcija eritropoetina povećana eritropoeza. Tireoidni hormoni povećavaju sadržaj 2,3 DPG u eritrocitima, omogućavaju povećanu disocijaciju HbO 2 povećana dostupnost O 2 tkivima. 73 74 Metabolizam UH i lipida Povišene koncentracije tireoidnih hormona povećavaju hepatičnu glukoneogenezu i gligogenolizu; intestinalnu apsorpciju glukoze pogoršati diabetes mellitus. TH deluju na povećanje hepatičnih LDL receptora kod povećanog lučenja TH sniženje nivoa holesterola. POREMEĆAJ TREODNE FUNKCJE HPOTREODZAM Primarni hipotireoidizam (subklinički i manifestni) Kongenitalni hipotireoidizam Sekundarni hipotireoidizam HPERTREODZAM 75 76
Hipotireoidizam Primarni tireoidna žlezda ne prozvodi dovoljne količine T4 i T3 (hronični limfocitni tiroditis). Snižene vrednosti T4 (FT4), povišene TSH. Subklinički povišen TSH, T4 (FT4) u referentnim granicama. Autoimuni tiroditis (Hashimoto) prisustvo autoantitela. Kongenitalni atireoza; sekundarno poremećaj sinteze TH. Mentalna retardacija neophodna rana dijagnostika! Sekundarni (centralni) hipotireoidizam Hipofizna ili hipotalamusna oboljenja deficit TSH (često i ostalih hipofiznih hormona). Kod oštećenja hipotalamusa nema povećanja TSH kao odgovor na stimulaciju TRH. 77 78 Hipertireoidizam Povišen FT4, snižen TSH Subklinički: snižen TSH, FT4 u granicama referentnih vrednosti. Treba uraditi FT3 - pre se povećava u cirkulaciji od FT4. 79 80
Određivanje TSH RA niska osetljivost (detekcioni limit 1 mj/l) nemogućnost razlikovanja normalnih od subnormalnih vrednosti (hipertireoidizam). munometrijska ("sendvič") metoda molekule TSH most između 2 ili > anti-tsh antitela. Prvo (monoklonsko) upravljeno prema specifičnojβ-subjedinici i vezano začvstu fazu sistema za separaciju; prisutno u višku, selektivno imunoekstrahuje većinu TSH molekula iz seruma. Kvantifikacija vezanog hormona- drugim antitelom (monoklonsko, poliklonsko) upravljenim prema različitim antigenskim mestima na TSH (pr. α-subjedinice). 81 Određivanje TSH Detekciono antitelo obeleženo: radioizotopom, enzimom, fluoroforom, hemiluminescentnom molekulom. Kod imunometrijskih metoda direktna proporcionalnost sa koncentracijom analita viši signal odgovara većoj koncentraciji. Novije imunometrijske metode za TSH hemiluminescentna tehnologija detekcioni limit: 0,01-0,02 mj/l. 82 Sakupljanje i čuvanje uzoraka. Cirkadijani ritam. Najviši: 02-04 h ; najniži: 17 18 h. Očekivane vrednosti: Nehemolizovani i nelipemični uzorci seruma/plazme. Stabilni 5 dana na 2-8 C; zamrznuti mesec dana. Referentni intervali: Svaki proizvođač testa daje preporučene referentne vrednosti. 83 84
ODREĐVANJE TROKSNA PB test određivanje joda vezanog za proteine. Mogućnost određivanja jodoproteina, jodotirozina, neorganskog J i Tg. Korisni: selektivno odvajanje jodotironina od ostalih jedinjenja joda. Nespecifični retko se koriste. Osetljivija metoda za ukupni T 4 metoda kompetitivnog vezivanja za proteine kompeticija obeleženog i neobeleženog T 4 za ograničen broj vezivnih mesta proteina. Specifični vezujući protein TBG. Referentna metoda za T 4 izotopsko razblaživanje - masena spektrometrija: serumu se dodaje T 4 obeležen tricijumom. T 4 se ekstrahuje iz seruma, derivatizuje i analizira tehnikom GC/MS. Koriste se i GC/EC kao i HPLC. 85 munoodređivanje Koriste visoko specifična antitela protiv albumin-t 4 konjugata. Neophodno blokirati vezivanje T 4 za TBG - blokirajući agensi. Reagens izbora: 8-anilino-1-naftalen-sulfonska kiselina (ANS). Efikasno istiskuju T 4 iz TBG ne utiču na vezivne karakteristike antitela. 86 Za merenje distribucije T 4 između vezane i nevezane frakcije koristi se 125. Metode razdvajanja slobodne od obeležene frakcije T 4 : a) precipitacija proteina amonijum sulfatom, PEG b) tehnikačvrste faze: T 4 -specifična antitela vezana za kuglice, namagnetisane partikule, zidove epruveta. Postupak je: brz, inkubacioni period 1 h (sobna temperatura ili 37 C) 20 uzoraka, 2 ili 3 kontrole i 6 kalibratora (2x) za < od 3 h. Detekcioni limit: 5 nmol/l. zotopske metode 87 Neizotopske metode Obeleživači: enzimi (peroksidaza iz rena, AP, β-dgalaktozidaza); fluorescentne i hemiluminescentne molekule. Kod heterogenih EA T 4 antitelo se mobiliše na plastičnim površinama slobodan analit se odvaja dekantovanjem ili ispiranjem. Posle ispiranja katalitička aktivnost vezanog enzima se određuje korišćenjem hemiluminescentnog supstrata. Homogena imunoodređivanja tehnika multiplikovanog imunoodređivanja (enzyme-multiplied immunoassay technique, EMT), koristi G-6-PDH kao enzimski obeleživač - kovalentno vezan za T 4. Vezivanje T 4 - specifičnog antitela za obeleživač < enzimsku aktivnost. 88
T 4 + T 4 -E +Ab Ab:T 4 + Ab:T 4 -E (aktivan) (neaktivan) 89 Neizotopske metode Nepotrebno odvajanje slobodnog od enzimski vezanog hormona (neaktivan). Klonirani enzimski donorski imunoesej (cloned enzyme donor immunoassay, CEDA) primena inaktivnih fragmenataβ-galaktozidaze: enzimski akceptori (EA) i enzimski donori (ED). T 4 u uzorku kompetira sa ED-obeleženim T4 za limitiran broj vezivnih mesta na anti-t 4. Katalitička aktivnost holoenzima povećava se proporcionalno količini T 4 u serumu. 90 Homogeno fluorescentno imunoodređivanje Fluorescentno obeleženi T 4 i T 4 iz seruma kompetiraju za vezivna mesta na T 4 antitelu. Ekscitacija (485 nm), emisija (525 550 nm) registrovana polarizacija obrnuto proporcionalna koncentraciji T 4 u uzorku. Heterogeno fluorescentno imunoodređivanje Zasnovano na primeni elemenata iz grupe lantanida (pr. europijum). Fluorescentni signal obrnuto proporcionalan T 4 u uzorku. Vreme očitavanja za svaki uzorak, kratko mogućnost brzog određivanja većeg broja uzoraka. 91 Turbidimetrijska metoda Homogeno određivanje kompeticija T 4 iz seruma i T 4 fikol konjugata za mesta vezivanja na specifičnom antitelu. Stepen aglutinacije promena A na 600 nm. Hemiluminescentno imunoodređivanje Za inicijaciju hemiluminescencije H 2 O 2. 92
Sakupljanje i čuvanje uzoraka T 4 prilično stabilan na sobnoj temperaturi; > 24 h na 2 8 C; zamrznut- stabilan 30 dana. Hemoliza i lipemija ne utiču na određivanje (jaka hemoliza razblažuje uzorak niže vrednosti); zamućene centrifugirati. 131 interferira (uzorak uzet 2 3 dana posle davanja); terapiju prekinuti mesec dana. Kod dece uzorci iz pete (kapilare, filter papir * ) skrining novorođenčadi na hipotireoidizam. 93 Referentni intervali : daje ih svaki proizvođač, kao preporučene vrednosti. 94 Određivanje trijodtironina u serumu Kompetitivno vezivanje za proteine (CPB) TBG, prirodni vezujući protein. Direktno određivanje sa antitelima protiv T 3. Antiserum se dobija korišćenjem T 3 - obogaćenog Tg, T 3 -HSA ili T 3 - BSA konjugatima. 95 96
zotopske metode Obeleživač: 125 -T 3 i T 3 - specifično antitelo. ANS za oslobađanje T 3 od serumskih proteina. Kalibraciona kriva: 0,385 12,32 nmol/l. Neizotopske metode Peroksidaza/AP obeleživači T 3 ili T 3 antitela Enzimska aktivnost fotometrijski, fluorescentni, hemiluminescentni supstrati. Heterogene i homogene. Različite metode za T 3 pojava odstupanja za isti serumski uzorak. Uzrok: razlike u unakrsnoj reaktivnosti antiseruma, interferenciji sa proteinima i različitim osetljivostima metode. 97 Referentni intervali Starost nmol/l > 37 nedelja 0,08 2,17 1 3 dana 1,54 11,40 1 11 meseci 1,62 3,77 1 5 godina 1,62 4,14 6 10 godina 1,45 3,17 11 15 godina 1,26 3,28 16 20 godina 1,23 3,23 20 50 godina 1,23 3,14 50 90 godina 0,62 2,79 Trudnoća poslednjih 5 meseci 1,79 3,80 98 Određivanje slobodnih tireoidnih hormona nterakcija slobodnih tireoidnih hormona i vezujućih proteina reverzibilna ravnoteža vezivanja: [FT 4 ] x [TBP] = K x [T4: TBP] [FT 4 ] = koncentracija slobodnog T 4 u serumu [TBP] = koncentracija slobodnih vezivnih mesta na TBP K = konstanta asocijacije [T 4 : TBP] = konc. T 4 - vezivnih mesta na TBP 99 Hipertireoidizam primarno > FT 4 ; estrogeni, idiopatska ili genetska stanja > TBP. U oba slučaja [T 4 : TBP] >. Nizak nivo [T 4 : TBP] posledica: primarno < [FT 4 ] ili primarno < [TBP]. Klinički značaj: razlikovanje promena [T 4 :TBP] posledica primarnih promena [FT 4 ] (hiper-; hipotireoidizam) od posledica primarnih promena [TBP]. Metode za određivanje koncentracija FT 4 i FT 3 u serumu: direktne (referentne); indirektne (rasprostranjenije u rutini). 100
Direktne referentne metode Najpouzdanije metode: ravnotežna dijaliza i ultrafiltracija; razdvajanje slobodnih hormona od proteinski vezanih direktno određivanje slobodne frakcije. Sakupljanje i čuvanje uzoraka isto kao i za ukupni T 4 Referentne vrednosti Starost FT 4 (pmol/l) FT 3 (pmol/l) Novor. (1-5 dana) 29,6 72,1 Deca (2 m. 14 g.) 10,3 28,3 Odrasli (21 87 g.) 10,3 34,7 4,0 7,4 Trudnoća trimestar 9,0 25,7 3,2 5,9 i trimestar 6,4 20,6 3,0 5,2 101 102 ndirektne metode za određivanje slobodnih tireoidnih hormona Uključuju dva odvojena testa za određivanje konc. slobodnog hormona: merenje ukupnog T 4 (ili T 3 ) i nivoa TBG ili slobodne hormonske frakcije. Rezultati se matematički kombinuju dobija se konc. slobodnog hormona. Dve vrste: izračunavanje indeksa i "direktni" imunoesej. 103 ndirektna indeks metoda Princip: serum se obogati malim količinama radioobeleženog T 4, brzo se distribuira između slobodnog i vezanog T 4. Frakcija obeleženog hormona dijalizira kroz semipermeabilnu membranu, zatim meri radioaktivnost. Metoda ngbar-a (tehnika dvostruke dijalize ) i metoda Sterling-a i Brenner-a (magnezijum precipitirajuća metoda). zračunavanje: % FT4 = (C o /C i ) x 100 C 0 količina izmerene radioaktivnosti/min. Mg precipitiranog dijalizata. C i količina izmerene radioaktivnosti /min./ml dijalizata. Sakupljanje i čuvanje uzoraka isto kao za ukupni T 4. Referentne vrednosti: za FT 4 : 0,02 0,04% konc. ukupnog hormona. Dijazibilna frakcija T 3 10x > od T 4 (slabije vezan 104 za TBG); referentni interval: 0,2 0,4 %.
zračunavanje vrednosti slobodnih hormona: Ukupan T 4 x %FT 4 = FT 4 zbor i primena testova za merenje slobodnih tireoidnih hormona Ukupan T 3 x % FT 3 = FT 3 Referentni intervali Starost FT 4 (pmol/l) FT 3 (pmol/l) Pupčana vrpca 21,9 51,6 0,2 6,0 Novorođenčad 33,5 81,3 Deca i odrasli 10,3 29,7 4,0 7,4 105 Određivanje T 4 i T 3 rezultati dobri kod zdravih osoba, hiper- i hipotireoidnih pacijenata i onih sa blagim poremećajem vezujućih proteina. Nepouzdani kod familijarnog disalbuminemijskog hipertireoidizma (serumski albumin >). Pacijenti klinički eutireoidni - vrednosti za T 4 visoke. Slično i kod pacijenata sa cirkulišućim T 4 autoantitelima ili kod > vezivanja T 4 prealbuminom. 106 Određivanje slobodnog tiroksina u stanjima koja utiču na tiroid-vezujuće proteine Kliničko stanje Direktna Druge Dvostepene Analogne ravnotežna indeks metode metode metode Normalan SBP Hipotireoidizam L L L L Hipertireoidizam H H H H Hiperestrogenizam N N N N Patološki SBP Višak TBG N H N L, N ili H Nedostatak TBG N L N L, N ili H Disalbuminemija N N H* N H T 4 autoantitela N H N H Nizak T 4 NTB N H L N L L Visok T 4 NTB N H N H N H H L Nizak, N normalan; H visok *normalan kada se određuje sa obeleženim T 4 ; visok pri određivanju sa obeleženim T 3 107 Rezultati za FT4 i FT3 nepouzdani kod kongenitalnog viška ili nedostatka TBG. 108
109 110 111 112
Princip TROKSN VEZUJUĆ GLOBULN TBG indirektno preko kapaciteta vezivanja T 4 ; direktno-određivanjem koncentracije proteina TBG. Kod zdravih odraslih osoba kapacitet vezivanja za TBG: 16 24 mg/l. Metoda relativno specifična za TBG; neki lekovi ili abnormalno vezivanje TH interferiraju inhibiraju vezivanje T 4 lažno niske vrednosti za TBG. U praksi direktno merenje TBG imunoesejom veća preciznost i imunospecifičnost. Kompetitivno hemiluminescentno enzimsko određivanje TBG (TBG obeležen peroksidazom i TBG antitelom). Kod zdravih osoba referentni interval: 12 28 mg/l. 113 TROKSN VEZUJUĆ GLOBULN DRUG PROTEN KOJ VEZUJU TREODNE HORMONE RMA (two-site immunoradiometric assay): serumu se u višku dodaje TBG vezan za antitelo (vezuje sav endogeni TBG); 125 obeležen T 4, vezuje se za TBG anti-tbg-tbg- 125 -T 4 sendvič. Za razliku od RA kod RMA, radioaktivnost direktno proporcionalna količini TBG u uzorku. ndividualni TBP metodom elektroforeze razdvajanje proteinskih frakcija. Meri se radioaktivnost vezana za pojedinačne proteinske trake (albumin, prealbumin, TBG) i množi koncentracijom ukupnog T 4. Kapacitet vezivanja T 4 u normalnom serumu za TBG : 10 25 mg/l, prealbumin: 49 70 mg/l, albumin : 12-34 mg/l. 114 TROKSN VEZUJUĆ GLOBULN DRUG PROTEN KOJ VEZUJU TREODNE HORMONE Osnovna primena: identifikacija pacijenata sa eutireoidnim hipertiroksinemijama i eutireoidnim hipotiroksinemijama. Omogućava razlikovanje poremećaja u koncentraciji normalnih T 4 -vezujućih proteina od patoloških sa promenjenim afinitetom za T 4. Sakupljanje i čuvanje uzoraka isto kao i za ukupni T 4. 115 ODREĐVANJE TREOGLOBULNA Određuje se metodom imunoeseja sa dva i više antitela. Problem svih imunoeseja Tg interferencija sa endogenim anti-tg antitelima (kod pacijenata sa kancerom prisutna 35%). Pre Tg odrediti prisustvo anti-tg. RA nema interferencije sa antitelima. Sakupljanje i čuvanje uzoraka. Pacijenti moraju da prestanu sa uzimanjem supstitucione terapije da bi imali > nivo TSH pre sakupljanja uzoraka. Referentni interval. Eutireoidni: 3 42 µg/l ; 87% zdravih odraslih< 10 µg/l. Visok nivo kod neonatusa, značajno opada u prve 2 god. 116
ODREĐVANJE ANTTREODNH ANTTELA Nekoliko tehnika za detektovanje i kvatifikaciju Tg autoantitela: agar gel precipitaciona tehnika, imunofluorescencija tkivnog preseka, pasivna hemaglutinacija, ELSA, RA. Taninska metoda hemaglutinacije eritrocita uzorak pacijenta se pomeša sa taninskom kiselinom, zatim obloži prečišćenim humanim Tg. Kombinacijom antitela sa antigenom na eritrocitima aglutinacija eritrocita. Test nije visoko specifičan; 5-10% zdrave populacije nizak titar Tg antitela bez simptoma bolesti; > vrednosti: kod žena i sa starošću. Reaktivnostčešća kod: Hashimoto tiroditisa (> 85%) i Graves-ove bolesti (> 30%; titar > 1: 1600). 117 118 ODREĐVANJE ANTTREODNH ANTTELA ELSA, RMA, RA dobro koreliraju sa testovima aglutinacije, mnogo osetljiviji i specifičniji za tireoidna autoimuna oboljenja. RMA i ELSA detekcioni limit: 3 mj/l. Osetljivija: RA razblaženi serum se inkubira sa 125 obeleženim Tg antigen-antitelo kompleksi precipitiraju dodatkom proteina A. Detekcioni limit: 0,2 mj/l. Sakupljanje i čuvanje uzoraka: *** serum se mora zamrznuti ako određivanje nije istog dana. 119 120