DLHODOBÝ EFEKT PÔSOBENIA BAF NA ADHERENTNÉ BUNKOVÉ LÍNIE Jozef Hatok, Katarína Kliková, Tatiana Matáková a Dušan Dobrota Ústav lekárskej biochémie, Jesseniova lekárska fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave Malá Hora 4, 036 01 Martin, SLOVENSKO Abstrakt Už niekoľko desiatok rokov sú známe priaznivé účinky derivátov éter-fosfolipidov na prevenciu voči vzniku nádorových ochorení. Firma Areko, spol. s r.o. vyvinula zmes biologicky aktívnych fosfolipidov pod ochrannou známkou BAF. Práve túto zmes fosfolipidov, ako aj jej neaktívnu formu sme sa rozhodli testovať na nádorovej bunkovej línii DLD-1 (adenokarcinóm kolorekta) počas dlhodobej kultivácie. Po celkovej 18-dňovej kultivácii buniek s 0,05% obsahom BAF, ktorého prítomnosť v médiu nepôsobila na bunky letálne, sme následne pomocou histologického farbenia pozorovali zmeny v bunkovom raste pri ďalších hodinách kultivácie. V pokuse sme okrem kontroly (bez BAF ) použili aj zvyšujúce sa koncentrácie ako aktívnej zmesi BAF (A- BAF ), tak neaktívnej BAF (N-BAF ). Zistili sme, že už pri 24 hod pôsobil 0,1% obsah A-BAF na bunky cytolyticky. Pri 72 hod pôsobení tejto koncentrácie prežívalo iba niečo cez 10% nádorovej populácie buniek oproti kontrole, resp. neaktívnej zmesi BAF. Percentuálne vyššie koncentrácie A-BAF (0,2 a 0,3%) viedli k totálnemu usmrteniu nádorových buniek. Navyše sme po základnej dlhodobej kultivácii buniek s BAF testovali aj vplyv na citlivosť, resp. rezistenciu voči in vitro aplikovaným cytostatikám (n= 8) pomocou MTT testu. U väčšiny testovaných cytostatík sme nezistili výrazný vplyv A-BAF, výnimkou však boli mitomycín-c a paklitaxel, kde sme zistili signifikantné zmeny, avšak tieto cytostatiká sa pri liečbe kolorektálnych karcinómov nepoužívajú. Na pochopenie detailnejšieho mechanizmu pôsobenia aktívneho BAF sú však potrebné ďalšie experimenty na proteomickej, po prípade na molekulárnej úrovni. 1
Materiál a metodiky Zmes fosfolipidov Používali sme dve formy zmesi fosfolipidov: neaktívnu N-BAF a aktívnu A-BAF v obsahu 0,05% pri základnej kultivácii. Ďalej sme tiež testovali rôzne percentuálne obsahy BAF v rozpätí od 0,025 0,4%. Bunková línia V tomto experimente sme používali bunkovú líniu DLD-1, tzn. bunky kolorektálneho karcinómu, získané od medzinárodnej banky ATCC (Kat. č.: CCL-221 ). Samotná kultivácia buniek prebiehala v CO 2 inkubátore pri teplote 37 C. Bunky sme podľa potreby 1-3 x do týždňa pasážovali a kultivovali v médiu s takýmto zložením: základné médium Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), fetálne prasacie sérum (FBS, 10%) a penicilín/streptomycín (1%). Navyše sme použili tieto typy kultúr: C= kontrolnú (bez zmesi fosfolipidov), N-BAF = neaktívnu (zmes neaktívnych fosfolipidov; 0,05%) a A- BAF = aktívnu (zmes aktívnych fosfolipidov; 0,05%). Po základnej kultivácii (18 dní, dlhodobá) v 75 cm 2 fľašiach potom ešte nasledovala 2-dňová kultivácia v 12 resp. 96 jamkových platniach. Farbenie podľa May-Grünwalda a Giemsa Toto farbenie sme používali pri 12 jamkových platniach, kedy sme pomocou vákuovej pumpy odsali staré médium a následne bunky premyli roztokom PBS. Potom sme k bunkám pridali 200 µl May- Grünwaldovho roztoku a nechali pôsobiť 10 min. Po skončení 1. farbenia sme roztok odobrali a bunky opäť premyli pomocou PBS. Ako 2. farbičku sme použili roztok Giemsa-Romanowski (200 µl) a nechali pôsobiť 5 min. Nakoniec sme bunky premyli a nechali uschnúť. Metyl-tiazol tetrazoliový test Na in vitro testovanie chemorezistencie sme použili metyl-tiazol tetrazoliový (MTT) test. Princíp testu je založený na schopnosti živých buniek redukovať žltú rozpustnú tetrazoliovú soľ mitochondriálnym enzýmom sukcinátdehydrogenázou na nerozpustný modrý formazán. Suspenziu buniek (100 µl) o koncentrácii 15000/ ml sme nasadili v nultý deň na 96 jamkovú platničku. Potom sme ich nechali adherovať počas dvoch dní a následne sme pridali rôzne cytostatiká (okrem vnútornej kontroly) a po 72 hod sme stanovili rezistenciu, resp. citlivosť. Na základe nameraných absorbancií pri 540 nm sme určili koncentráciu LC 50 (letálna koncentrácia liečiva, ktorá usmrcuje 50% bunkovej populácie najúčinnejšia). Neskôr sme porovnávali získané údaje medzi kontrolnou kultúrou neaktívnou a aktívnou. 2
Výsledky Získané výsledky by sme podľa použitej metodiky rozdelili do dvoch oblastí. Na oblasť mikroskopickú (12-formátovú) a testovaciu (96-formátovú). V tej prvej sme sa hlavne zamerali na určenie vplyvu rôznych koncentrácií BAF, či už neaktívnej alebo aktívnej formy. Po 18-dňovej základnej kultivácii DLD-1 buniek s 0,05%-tnými roztokmi BAF v 75cm 2 fľašiach, sme následne bunky nasadili do 12-jamkovej platne o koncentrácii 50000 buniek/ ml v objeme 1 ml kultivačného média. Po ďalších dvoch dňoch kultivácie sme médium odstránili a doplnili nové s prídavkom rôznych koncentrácií BAF (okrem kontrolnej jamky), tak ako to uvádzame v tab. 1. Tabuľka 1: Rozdielne koncentrácie BAF v 12-jamkovej platni. N-BAF A-BAF A1= kontrola A2= 0,1% A3= kontrola A4= 0,1% B1= 0,05% B2= 0,2% B3= 0,05% B4= 0,2% C1= 0,075% C2= 0,3% C3= 0,075% C4= 0,3% Prichytené bunky o dno platne sme pozorovali pri rozličných časových intervaloch (12-24-48 a 72 hod) s narastajúcou koncentráciou obidvoch zmesí fosfolipidov BAF. Všetky platne v závislosti od počtu hodín kultivácie znázorňujeme na obr. 1. Obrázok 1: Časová kultivácia buniek DLD-1 s rôznym obsahom BAF. 3
V ľavom rohu obr. 1 znázorňujeme 12 hodinovú kultiváciu buniek s prídavkom BAF (1-2 stĺpec= N- BAF a 3-4 stĺpec= A- BAF ), kde oproti kontrolným jamkám (A1 a A3) sme nepozorovali žiaden úbytok počtu buniek. Pri 24 hod kultivácii (vľavo dole) sme zistili pokles počtu buniek v závislosti od narastajúcej koncentrácii A-BAF, ale až od C3= 0,075%. Výrazné odumieranie buniek sme pozorovali pri 48 a 72 hod kultiváciách, kedy sa najmä koncentrácie 0,2 a 0,3% A-BAF prejavovali letálne na nádorové bunky. V prvých dvoch stĺpcoch každej platničky sa nachádza, už spomínaná zmes neaktívnych BAF v narastajúcej koncentrácii, samozrejme okrem jamky A1, kde je iba samotné médium. Ako máme možnosť vidieť, práve oproti kontrole nepozorujeme žiadny rozdiel v obsahu buniek na dne platničky. Detailný pohľad na štrukturálne zmeny buniek uvádzame na obr. 2, kde sme použili zábery zo 48 hod kultivácie. Obrázok 2: Snímky DLD-1 buniek po 48 hod kultivácii. A kontrola; B 0,05% A-BAF ; C 0,1% A-BAF ; D 0,3% A-BAF V druhej časti výsledkov by sme sa chceli venovať vplyvu BAF na účinok testovaných cytostatík. Tento experiment sme realizovali na 96-jamkových platniach, kedy sme opäť po 18-dňovej základnej kultivácii DLD-1 buniek s 0,05%-tnými roztokmi BAF v 75cm 2 fľašiach nasadili do spomínanej platne bunky o koncentrácii 15000 buniek/ ml v objeme 100 μl. Po ďalších dvoch dňoch kultivácie sme k bunkám pridali rôzne cytostatiká (n= 8), kde sme navyše rozlišovali vplyv prítomnosti oboch foriem BAF. Preto sme mali 3 typy platní (C, N a A): C= kontrola (bez BAF ), N= neaktívny BAF a A= aktívny 4
BAF, pričom každá z platní obsahovala svoju vlastnú kontrolu (bez cytostatík) a blank (bez buniek, iba médium). Po následnej 72 hod kultivácii sme určili pre každé cytostatikum hodnotu LC 50 a vzájomne ich porovnávali (tab. 2). Tabuľka 2: Zoznam testovaných cytostatík a určenie vplyvu BAF podľa hodnoty LC 50. Testovaná koncentrácia Kontrola N-BAF A-BAF Cytostatikum [rozpätie: μg/ml] [LC 50 ] [LC 50 ] [LC 50 ] 5-Fluorouracil (0,25 250) 1,15 16,7 # 13,675 # Cis-Platina (0,1 100) 3,75 4,16 3,76 Etopozid (0,05 50) ns ns 31,66 Doxorubicín (0,008 8) 5,88 ns 6,8 Gemcitabín (0,3 300) 12,20 25,5 ns Mitomycín-C (0,01 10) 1,36 1,93 0,577 * Mitoxantrón (0,001 1) 0,55 ns 0,44 Paklitaxel (0,05 50) 4,92 5,72 1,95 * Legenda: LC 50 - letálna koncentrácia liečiva (μg/ml), ktorá usmrcuje 50% bunkovej populácie; * - P<0,05; # - P<0,01; ns- nebolo stanovené. Najlepší efekt pôsobenia A-BAF sme zistili pri kombináciách s mitomycínom-c a paclitaxelom, kde sme dokonca stanovili aj štatistickú významnosť (P<0,05). Naopak opačný vplyv A-BAF sme zistili pri cis-platine. U väčšiny testovaných liečiv sme nezistili výrazné zmeny hodnoty LC 50 medzi kontrolou a neaktívnym, resp. aktívnym BAF. Ako reprezentatívny obrázok MTT testu sme vybrali porovnanie nameraných kriviek pri mitomycíne-c (obr. 3). Na tomto obrázku môžme vidieť výrazný pokles krivky, teda hodnoty LC 50, pri A-BAF oproti kontrole. Navyše N-BAF má približné rovnakú hodnotu ako kontrola. Obdobne sme to zaznamenali aj pri paklitaxeli. Obrázok 3: Výsledné krivky stanovenia rezistencie DLD-1 buniek na mitomycín-c v závislosti od prítomného BAF a určenie hodnoty LC 50. Os y predstavuje percentuálne prežívanie buniek a os x stupeň nariedenia používaného cytostatika. Poďakovanie Táto práca bola realizovaná firmou Areko a taktiež podporená projektom "Centrum translačnej medicíny" spolufinancovaným zo zdrojov ES a Európskeho fondu regionálneho rozvoja. 5
Záver Na základe našej prvotnej štúdie, kedy sme sa rozhodli zistiť vplyv zmesi fosfolipidov BAF na bunky kolorektalného karcinómu v in vitro podmienkach môžeme zhodnotiť nasledovné závery: - pri dlhodobej kultivácii nemala nízka koncentrácia BAF vplyv na proliferáciu buniek; - následná aplikácia vyšších koncentrácií preukazovala cytolitický efekt aktívnej zmesi A-BAF na danú populáciu buniek v porovnaní s kontrolnou a taktiež aj neaktívnou formou BAF ; - výrazný vplyv A-BAF na zvýšenie citlivosti voči používaným cytostatikám sme nezaznamenali. Môžeme teda skonštatovať, že zmes aktívnych fosfolipidov pod známkou BAF má protinádorový účinok, avšak na určenie presného mechanizmu pôsobenia je potrebné uskutočniť ďalšie experimenty na proteomickej, po prípade molekulárnej úrovni. 6