vaja Kvan*ta*vno določanje proteinov. 6. vaja Kvan*ta*vno določanje proteinov. 6. vaja Kvan*ta*vno določanje proteinov

Σχετικά έγγραφα
Diferencialna enačba, v kateri nastopata neznana funkcija in njen odvod v prvi potenci

2.1. MOLEKULARNA ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA

Funkcije. Matematika 1. Gregor Dolinar. Fakulteta za elektrotehniko Univerza v Ljubljani. 14. november Gregor Dolinar Matematika 1

Zaporedja. Matematika 1. Gregor Dolinar. Fakulteta za elektrotehniko Univerza v Ljubljani. 22. oktober Gregor Dolinar Matematika 1

Odvod. Matematika 1. Gregor Dolinar. Fakulteta za elektrotehniko Univerza v Ljubljani. 5. december Gregor Dolinar Matematika 1

13. Jacobijeva metoda za računanje singularnega razcepa

Funkcijske vrste. Matematika 2. Gregor Dolinar. Fakulteta za elektrotehniko Univerza v Ljubljani. 2. april Gregor Dolinar Matematika 2

vaja Izolacija kromosomske DNA iz vranice in hiperkromni efekt. DNA RNA Protein. ime deoksirbonukleinska kislina ribonukleinska kislina

Funkcije. Matematika 1. Gregor Dolinar. Fakulteta za elektrotehniko Univerza v Ljubljani. 21. november Gregor Dolinar Matematika 1

1. Trikotniki hitrosti

p 1 ENTROPIJSKI ZAKON

Spektroskopija. S spektroskopijo preučujemo lastnosti snovi preko njihove interakcije z različnimi področji elektromagnetnega valovanja.

Numerično reševanje. diferencialnih enačb II

Integralni račun. Nedoločeni integral in integracijske metrode. 1. Izračunaj naslednje nedoločene integrale: (a) dx. (b) x 3 +3+x 2 dx, (c) (d)

3. vaja Razsoljevanje proteinov z gelsko izključitveno kromatografijo

IZPIT IZ ANALIZE II Maribor,

Delovna točka in napajalna vezja bipolarnih tranzistorjev

Molekularna spektrometrija

Tekočinska kromatografija

8. Diskretni LTI sistemi

IZVODI ZADACI ( IV deo) Rešenje: Najpre ćemo logaritmovati ovu jednakost sa ln ( to beše prirodni logaritam za osnovu e) a zatim ćemo

+105 C (plošče in trakovi +85 C) -50 C ( C)* * Za temperature pod C se posvetujte z našo tehnično službo. ϑ m *20 *40 +70

Odvod. Matematika 1. Gregor Dolinar. Fakulteta za elektrotehniko Univerza v Ljubljani. 10. december Gregor Dolinar Matematika 1

SKUPNE PORAZDELITVE VEČ SLUČAJNIH SPREMENLJIVK

Booleova algebra. Izjave in Booleove spremenljivke

Kotne in krožne funkcije

NEPARAMETRIČNI TESTI. pregledovanje tabel hi-kvadrat test. as. dr. Nino RODE

1. Έντυπα αιτήσεων αποζημίωσης Αξίωση αποζημίωσης Έντυπο Πίνακας μεταφράσεων των όρων του εντύπου...

Tretja vaja iz matematike 1

KOLOKVIJI IZ ANALIZNE KEMIJE

KODE ZA ODKRIVANJE IN ODPRAVLJANJE NAPAK

Analizna kemija II vaje

Osnove elektrotehnike uvod

S t r a n a 1. 1.Povezati jonsku jačinu rastvora: a) MgCl 2 b) Al 2 (SO 4 ) 3 sa njihovim molalitetima, m. za so tipa: M p X q. pa je jonska jačina:

Državni izpitni center SPOMLADANSKI IZPITNI ROK *M * NAVODILA ZA OCENJEVANJE. Sreda, 3. junij 2015 SPLOŠNA MATURA

Kontrolne karte uporabljamo za sprotno spremljanje kakovosti izdelka, ki ga izdelujemo v proizvodnem procesu.

PONOVITEV SNOVI ZA 4. TEST

Tabele termodinamskih lastnosti vode in vodne pare

Vaje: Električni tokovi

DISKRETNA FOURIERJEVA TRANSFORMACIJA

DULCOTEST DT1 Fotometer

NAVODILA ZA PRAKTIČNO DELO PRI VAJAH PREDMETA MERITVE V DELOVNEM OKOLJU. (Interno)

Laboratorijske vaje pri predmetu kemija

1. Definicijsko območje, zaloga vrednosti. 2. Naraščanje in padanje, ekstremi. 3. Ukrivljenost. 4. Trend na robu definicijskega območja

Vaja 5: Spektrofotometrično določanje Cr (VI)

Fazni diagram binarne tekočine

SEMINAR IZ KOLEGIJA ANALITIČKA KEMIJA I. Studij Primijenjena kemija

Jure Stojan 2. predavanje termodinamične osnove, encimske katalize encimska kataliza časovni potek encimske reakcije začetna hitrost

CM707. GR Οδηγός χρήσης SLO Uporabniški priročnik CR Korisnički priručnik TR Kullanım Kılavuzu

PROCESIRANJE SIGNALOV

Funkcije. Matematika 1. Gregor Dolinar. Fakulteta za elektrotehniko Univerza v Ljubljani. 12. november Gregor Dolinar Matematika 1

LABORATORIJSKE VAJE IZ KEMIJE

POROČILO 3.VAJA DOLOČANJE REZULTANTE SIL

Varjenje polimerov s polprevodniškim laserjem

Transformator. Delovanje transformatorja I. Delovanje transformatorja II

RAZVOJ IN UPORABA KVALITATIVNIH IN KVANTITATIVNIH METOD ZA DOLOČITEV KOMPONENT URINA

CO2 + H2O sladkor + O2

Problem lastnih vrednosti

Avtomatizirana analiza

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO. Darinka Brodnjak Vončina ANALIZNA KEMIJA II. Zbrano gradivo

Posnemanje fotorazgradnje sertralina v okolju. Tjaša Gornik, Mentor: doc. dr. Tina Kosjek Somentor: prof. dr.

Aleš Mrhar. kinetični ni vidiki. Izraženo s hitrostjo in maso, dx/dt očistkom

Άσκηση 7η Ιστοκαλλιέργεια Παρασκευή και αποστείρωση υποστρώµατος

Iterativno reševanje sistemov linearnih enačb. Numerične metode, sistemi linearnih enačb. Numerične metode FE, 2. december 2013

5. PARCIJALNE DERIVACIJE

BIOKEMIJA IN MOLEKULARNA BIOLOGIJA

Αθήνα, 15 Οκτωβρίου 2014 Αρ. Πρωτ.: 2988

Matematika 1. Gregor Dolinar. 2. januar Fakulteta za elektrotehniko Univerza v Ljubljani. Gregor Dolinar Matematika 1

Analizna kemija. Odgovori na izpitna vprašanja 2. del. Laboratorijska biomedicina šolsko leto 2008/2009

Bojan Božič, Jure Derganc, Gregor Gomišček, Vera Kralj-Iglič, Janja Majhenc, Mojca Mally, Praktikum iz biofizike Študijsko leto 2017/2018

Eliminacijski zadatak iz Matematike 1 za kemičare

Vaja: Odbojnostni senzor z optičnimi vlakni. Namen vaje

Nova področja v analizni kemiji

MATEMATIČNI IZRAZI V MAFIRA WIKIJU

Ovrednotenje vzorca naravne vode

ΠΡΙΤΣΙΝΑΔΟΡΟΣ ΛΑΔΙΟΥ ΑΕΡΟΣ ΓΙΑ ΠΡΙΤΣΙΝΙΑ M4/M12 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - ΑΝΤΑΛΛΑΚΤΙΚΑ

POROČILO. št.: P 1100/ Preskus jeklenih profilov za spuščen strop po točki 5.2 standarda SIST EN 13964:2004

Matematika vaja. Matematika FE, Ljubljana, Slovenija Fakulteta za Elektrotehniko 1000 Ljubljana, Tržaška 25, Slovenija

ΚΕΦ. 8 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ UV-Vis Μ. ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ ΠΑΡΑΔΟΣΕΙΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΙ

Podobnost matrik. Matematika II (FKKT Kemijsko inženirstvo) Diagonalizacija matrik

Ovo nam govori da funkcija nije ni parna ni neparna, odnosno da nije simetrična ni u odnosu na y osu ni u odnosu na

*M * Osnovna in višja raven MATEMATIKA NAVODILA ZA OCENJEVANJE. Sobota, 4. junij 2011 SPOMLADANSKI IZPITNI ROK. Državni izpitni center

3.1 Reševanje nelinearnih sistemov

Poglavje 7. Poglavje 7. Poglavje 7. Regulacijski sistemi. Regulacijski sistemi. Slika 7. 1: Normirana blokovna shema regulacije EM

Effect of Fibre Fineness on Colour and Reflectance Value of Dyed Filament Polyester Fabrics after Abrasion Process Izvirni znanstveni članek

STANDARD1 EN EN EN

FTN Novi Sad Katedra za motore i vozila. Teorija kretanja drumskih vozila Vučno-dinamičke performanse vozila: MAKSIMALNA BRZINA

VPLIV RAZLIČNIH PARAMETROV PRANJA NA ODSTRANJEVANJE STANDARDNE UMAZANIJE Z BOMBAŽNE TKANINE

Pošto pretvaramo iz veće u manju mjernu jedinicu broj 2.5 množimo s 1000,

2 tg x ctg x 1 = =, cos 2x Zbog četvrtog kvadranta rješenje je: 2 ctg x

Gimnazija Krˇsko. vektorji - naloge

IZVODI ZADACI (I deo)

VPLIV REAKCIJSKIH SPREMENLJIVK NA POTEK IN HITROST MODELNE REAKCIJE NATRIJEVEGA TIOSULFATA S KLOROVODIKOVO KISLINO

Funkcije več spremenljivk

SEKUNDARNE VEZE međumolekulske veze

Metoda končnih elementov III

Avtomatizirana analiza

PROUČEVANJE OSMOZE PRI DVEH RAZLIČNIH RASTLINSKIH TKIVIH

Linearna algebra 2 prvi kolokvij,

ARHITEKTURA DETAJL 1, 1:10

Transcript:

28. 3. 11 UV- spektrofotometrija Biuretska metoda Absorbanca pri λ=28 nm (A28) UV- spektrofotometrija Biuretska metoda vstopni žarek intenziteta I Lowrijeva metoda Bradfordova metoda Bradfordova metoda Lowrijeva metoda lučka izstopni žarek intenziteta I monokromator λ=28 nm absorbanca kiveta z vzorcem (debelina l) 1

Absorbanca pri λ=28 nm (A 28 ) T = I I transmitanca A = - log T absorbanca molarni ekslnkcijski koeficient [M - 1 cm - 1 ] A 28 = ε 28 c l množinska koncentracija [M] dolžina opične pol (debelina kivete) [cm] Velja približek: če je absorbanca = 1 je koncentracija enaka 1 mg/ml Metoda temelji na spremljanju absorbance pri λ=28 nm, kjer absorbirata predvsem aminokislini triptofan in Lrozin. 2 3 µg/ml hitra nedestruklvna poceni močno odvisna od aminokislinske sestave sestava pufra vpliva na absorbanco SICER HITRA IN POCENI METODA, A NENATANČNA TER ODVISNA OD SESTAVE PROTEINA 2

y 28. 3. 11 Kolorimetrične metode Kolorimetrične metode niso absolutne, kar pomeni, da za določevanje koncentracije proteinov potrebujemo UMERITVENO KRIVULJO. x y 35 Za določevanje koncentracije proteinov v neznanem vzocu moramo pripravil umeritveno krivuljo, kar pomeni, da za znane koncentracije znanega proteina izmerimo absorbance pri želeni λ. - umeritvena krivulja ni linearna v celotnem območju 1 5 2 8 3 11 4 14 5 17 3 25 2 15 umeritvena krivulja - pozorni moramo bil na izbiro znanega proteina za izdelavo umeritvene krivulje - umeritvena krivulja mora bil narejena v ustreznem območju 6 2 7 23 8 26 9 29 1 32 1 5 2 4 6 8 1 12 x y = 3x + 2 - za izdelavo umeritvene krivulje uporabimo protein v enakem pufru, kot se nahaja naš vzorec, da pri meritvi upoštevamo prispevek raztopine Za določevanje koncentracije proteinov v neznanem vzocu moramo pripravil umeritveno krivuljo, kar pomeni, da za znane koncentracije znanega proteina izmerimo absorbance pri želeni λ. C (BSA) [µg/ml] A 28 5,25 1,2 1 - najpogosteje kot znan protein uporabimo BSA (angl. Bovine serum albumin). - sicer bi bilo najbolje dobil protein, ki je čimbolj podoben našem (npr. če želimo v vzorcu določal koncentracijo prolteles IgG kot standard uporabimo znane koncentracije čistega IgG). - pazimo na ustrezno koncentracijsko območje! 1,5 2,1 3,15 5,25 1,5 2 1 c(prot.) [µg/ml]? A 28,35 A (28 nm),8,6,4,2 5 1 15 2 25 c(bsa) [mikrog/l] c(prot.) = 7 µg/ml Series1 y =,5x (, ), ker če ni proteina, ni absorbance!!! 3

Biuretska metoda 1,2 1 Protein + CuSO 4 vijolično obarvana snov 2 µl vzorca 8 µl dh 2 O A (28 nm),8,6,4,2 5 1 15 2 25 c(bsa) [mikrog/l] Series1 y =,5x c(prot.) = 7 µg/ml Če, da smo vzorec v kivel redčili (5x redčenje), moramo to upošteval pri podaji končnega rezultata! V tem primeru je končna koncentracija proteinov v našem vzorcu 35 µg/ml. hpp://en.wikipedia.org/wiki/biuret_test; 27.3.211 Biuretska metoda Metoda temelji na reakciji pepldne vezi z bakrom v bazičnem in v prisotnosl kalij- natrijevega tartrata, kar povzroči formacijo violičnega kompleksa. 5 16 mg/ml primerna metoda za vse proteine dobro ponovljiva METODA PRIMERNA ZA VSE PROTEINE, A PREVEČ SLABO OBČUTLJIVA ZA RUTINSKO UPORABO obupno slabo občutljiva metoda dolgotrajna priprava reagentov, slaba obstojnost (sveža priprava) vpliv drugih snovi v raztopini (urea...) deluje samo za večje od tripepldov Lowrijeva metoda Protein + CuSO 4 + Folin- Ciocalteu r. 3H2O x P2O5 x 13WO3 x 5MoO3 x 1H2O" 3H2O x P2O5 x 14WO3 x 4MoO3 x 1H2O modro obarvana snov hpp://www.gbiosciences.com/; 27.3.211 4

Lowrijeva metoda Podobno kot biuretska metoda temelji na reakciji med pepldno vezjo in bakrom, vendar redukcija Folin- Ciocalteujevega reagenta povzroči nastanek violočno obarvanega kompleksa. 2 1 µg/ml primerna metoda za vse proteine občutljiva na širokem področju zelo občutljiva v primerjavi tudi z UV METODA JE ZELO OBČUTLJIVA, A JO MOTI VELIKO SNOVI, KI SE JIH UPORABLJA PRI IZOLACIJAH PROTEINOV metodo mol veliko snovi (citrate, cistein, DTT, EDTA, HEPES, merkaptoetanol, Nonidet P- 4, fenol, Tricin, TRIS in Triton X- 1). razkrajanje molibdenskega barvila nujna prisotnost Lrozina Bradfordova metoda Bradford ina! 47 nm 595 nm Bradfordova metoda Metoda temelji na vezavi Coomassie Brilliant Blue (CBB) na proteine v kislem, saj se veže na pozilvno nabite (arginin, hisldin, lizin) in aromatske aminokisline. Vezava povzroči spremembo absorbcijskega vrha CBB s 47 na 595 nm. 1 2 µg/ml hitra in poceni visoko specifična za proteine zelo občutljiva kompalbilna z mnogimi snovmi nelinearnost, prekrivanje obeh spektrov NAJPRIMERNEJŠA METODA ZA OBČUTLJIVO DOLOČEVANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV Potek vaje - priprava umeritvene krivulje z znanimi koncentracijami BSA - priprava vzorcev za meritve z Bradfordovo metodo - določanje absorbance (28 nm) in določitev koncentracije proteinov v vzorcih 5