I.B. (2010) : 69 (11) ISSN

Transcript

1 Ferrell, W.R. and Kelso, E.B. and Lockhart, J.C. and Plevin, R.J. and McInnes, I.B. (2010) Protease-activated receptor-2 : a novel pathogenic pathway in a murine model of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases, 69 (11). pp ISSN , This version is available at Strathprints is designed to allow users to access the research output of the University of Strathclyde. Unless otherwise explicitly stated on the manuscript, Copyright and Moral Rights for the papers on this site are retained by the individual authors and/or other copyright owners. Please check the manuscript for details of any other licences that may have been applied. You may not engage in further distribution of the material for any profitmaking activities or any commercial gain. You may freely distribute both the url ( and the content of this paper for research or private study, educational, or not-for-profit purposes without prior permission or charge. Any correspondence concerning this service should be sent to the Strathprints administrator: strathprints@strath.ac.uk The Strathprints institutional repository ( is a digital archive of University of Strathclyde research outputs. It has been developed to disseminate open access research outputs, expose data about those outputs, and enable the management and persistent access to Strathclyde's intellectual output.

2 Protease-activated receptor-2: a novel pathogenic pathway in a murine model of osteoarthritis Wιλλιαm Ρ. Φερρελλ 1, Ελιζαβετη Β. Κελσο 1, ϑοην Χ. Λοχκηαρτ 2, Ροβιν Πλεϖιν 3, Ιαιν Β. ΜχΙννεσ Dιϖισιον οφ Ιντεγρατιϖε Βιολογψ, Υνιϖερσιτψ οφ Γλασγοω Γ11 6ΝΤ 2. Σχηοολ οφ Σχιενχε, Υνιϖερσιτψ οφ τηε Wεστ οφ Σχοτλανδ, Παισλεψ ΠΑ1 2ΒΕ 3. Στρατηχλψδε Ινστιτυτε οφ Πηαρmαχψ & Βιοmεδιχαλ Σχιενχε, Υνιϖερσιτψ οφ Στρατηχλψδε, Γλασγοω Γ1 1ΞΘ 4. Dιϖισιον οφ Ιmmυνολογψ Ινφεχτιον & Ινφλαmmατιον, Υνιϖερσιτψ οφ Γλασγοω Γ12 8ΘΘ Αδδρεσσ χορρεσπονδενχε το: Προφεσσορ Wιλλιαm Ρ. Φερρελλ, Ροοm 407, Λεϖελ 4, ΜχΓρεγορ Βυιλδινγ, Wεστερν Ινφιρmαρψ, Dυmβαρτον Ροαδ, Γλασγοω, Σχοτλανδ, Υνιτεδ Κινγδοm, Γ11 6ΝΤ Τελ: Φαξ: ε mαιλ: W.Φερρελλ βιο.γλα.αχ.υκ Τηε Χορρεσπονδινγ Αυτηορ ηασ τηε ριγητ το γραντ ον βεηαλφ οφ αλλ αυτηορσ ανδ δοεσ γραντ ον βεηαλφ οφ αλλ αυτηορσ, αν εξχλυσιϖε λιχενχε (ορ νον εξχλυσιϖε φορ γοϖερνmεντ εmπλοψεεσ) ον α ωορλδωιδε βασισ το τηε ΒΜϑ Πυβλισηινγ Γρουπ Λτδ το περmιτ τηισ αρτιχλε (ιφ αχχεπτεδ) το βε πυβλισηεδ ιν ΑΡD ανδ ανψ οτηερ ΒΜϑΠΓΛ προδυχτσ ανδ συβλιχενχεσ συχη υσε ανδ εξπλοιτ αλλ συβσιδιαρψ ριγητσ, ασ σετ ουτ ιν ουρ λιχενχε (ηττπ://αρd.βmϕϕουρναλσ.χοm/ιφορα/λιχενχε.πδφ)

3 Abstract Objective: Οστεοαρτηριτισ (ΟΑ) ισ α γλοβαλ χλινιχαλ χηαλλενγε φορ ωηιχη νο εφφεχτιϖε δισεασε mοδιφψινγ αγεντσ χυρρεντλψ εξιστ. Ηερειν ωε ιδεντιφψ προτεασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορ 2 (ΠΑΡ 2) ασ α νοϖελ πατηογενιχ mεχηανισm ανδ ποτεντιαλ τηεραπευτιχ ταργετ ιν ΟΑ. Methods: Εξπεριmενταλ ΟΑ ωασ ινδυχεδ ιν ωιλδ τψπε ανδ ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ mιχε βψ σεχτιονινγ τηε mεδιαλ mενισχο τιβιαλ λιγαmεντ (ΜΜΤΛ), λεαδινγ το δεϖελοπmεντ οφ α mιλδ αρτηροπατηψ. Χαρτιλαγε δεγραδατιον ανδ ινχρεασεδ συβχηονδραλ βονε φορmατιον ωερε ασσεσσεδ ασ ινδιχατορσ οφ ΟΑ πατηολογψ. Results: Φουρ ωεεκσ φολλοωινγ ΜΜΤΛ σεχτιον, χαρτιλαγε εροσιον ανδ ινχρεασεδ συβχηονδραλ βονε φορmατιον ωασ εϖιδεντ ιν ωιλδ τψπε mιχε βυτ συβσταντιαλλψ ρεδυχεδ ιν ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ mιχε. Χρυχιαλλψ, τηεραπευτιχ ινηιβιτιον οφ ΠΑΡ 2 ιν ωιλδ τψπε mιχε, υσινγ ειτηερ α ΠΑΡ 2 ανταγονιστ ορ α mονοχλοναλ αντιβοδψ ταργετινγ τηε προτεασε χλεαϖαγε σιτε οφ ΠΑΡ 2, ωασ αλσο εθυαλλψ εφφεχτιϖε ατ ρεδυχινγ ΟΑ προγρεσσιον in vivo. ΠΑΡ 2 ωασ υπρεγυλατεδ ιν χηονδροχψτεσ οφ ωιλδ τψπε βυτ νοτ σηαm οπερατεδ mιχε. Wιλδ τψπε mιχε σηοωεδ φυρτηερ ϕοιντ δεγραδατιον ειγητ ωεεκσ φολλοωινγ ινδυχτιον οφ ΟΑ, βυτ ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ mιχε ωερε στιλλ προτεχτεδ. Conclusions: Τηε συβσταντιαλ προτεχτιον φροm πατηολογψ αφφορδεδ βψ ΠΑΡ 2 δεφιχιενχψ φολλοωινγ ινδυχτιον οφ ΟΑ προϖιδεσ προοφ οφ χονχεπτ τηατ ΠΑΡ 2 ηασ α κεψ ρολε ιν ΟΑ ανδ συγγεστσ τηισ ρεχεπτορ ασ α ποτεντιαλ τηεραπευτιχ ταργετ.

4 Οστεοαρτηριτισ (ΟΑ) ισ α χηρονιχ δισαβλινγ χονδιτιον χυρρεντλψ αφφεχτινγ mιλλιονσ γλοβαλλψ 1 ωιτη ραδιολογιχαλ εϖιδενχε οφ ΟΑ ιν αππροξιmατελψ 80% οφ τηε ποπυλατιον αγεδ οϖερ ΟΑ ισ χηαραχτερισεδ βψ χαρτιλαγε δεγραδατιον ανδ ινχρεασεδ συβχηονδραλ βονε φορmατιον (οστεοσχλεροσισ). Dεσπιτε εξτενσιϖε πατηοπηψσιολογιχ ινϖεστιγατιονσ, χλινιχαλ mαναγεmεντ ηασ νοτ αλτερεδ σιγνιφιχαντλψ ανδ χοmπρισεσ αδmινιστρατιον οφ αναλγεσιχσ ανδ νον στεροιδαλ αντι ινφλαmmατορψ αγεντσ ανδ ρεχουρσε υπον ϕοιντ φαιλυρε το αρτηροπλαστψ. Νο υνιφψινγ πατηογενετιχ mοδελ εξιστσ συγγεστεδ ηψποτηεσεσ ενχοmπασσ πριmαρψ χαρτιλαγε mεταβολιχ δψσρεγυλατιον, εντηεσιαλ δισεασε τογετηερ ωιτη βιοmεχηανιχαλ δψσρεγυλατιον. Τηυσ φαρ, νο χριτιχαλ χηεχκποιντ πατηωαψ ηασ βεεν ιδεντιφιεδ τηατ ισ εσσεντιαλ φορ δισεασε προγρεσσιον ανδ ωηιχη mιγητ βψ χορολλαρψ ρεπρεσεντ α ϖαλιδ, δισεασε mοδιφψινγ ΟΑ τηεραπευτιχ ταργετ. Προτεασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορ 2 (ΠΑΡ 2) ισ α Γ προτειν χουπλεδ ρεχεπτορ ωηοσε τετηερεδ λιγανδ ισ αχτιϖατεδ βψ σερινε προτεασεσ. 3 ΠΑΡ 2 ισ πρεσεντ ιν χηονδροχψτεσ ιν χαρτιλαγε φροm ΟΑ πατιεντσ 4, ανδ φολλοωινγ ιτσ αχτιϖατιον, mατριξ mεταλλοπροτεασεσ (ΜΜΠσ) αρε γενερατεδ. 5 Ηοωεϖερ, τηεσε πρεϖιουσ οβσερϖατιονσ αρε ασσοχιατιϖε ανδ δο νοτ εσταβλιση τηε ρολε οφ ΠΑΡ 2 ιν τηε πατηογενεσισ οφ ΟΑ. Wε ηερε σουγητ διρεχτ εϖιδενχε οφ α χαυσαλ ρελατιονσηιπ βετωεεν ΠΑΡ 2 εξπρεσσιον ανδ χαρτιλαγε ανδ βονε πατηολογψ ιν α mυρινε mοδελ οφ ΟΑ. Methods Animals Εξπεριmεντσ ωερε περφορmεδ ον αδυλτ ωιλδ τψπε (ΠΑΡ 2 +/+ ) Χ57ΒΛ/6ϑ mιχε (βοδψ ωειγητ γ), ηουσεδ ιν στανδαρδ χαγεσ, ωιτη φοοδ ανδ ωατερ αϖαιλαβλε ad libitum, ανδ mαινταινεδ ιν α τηερmονευτραλ ενϖιρονmεντ. ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ (ΠΑΡ 2 / ) mιχε ωερε

5 γενετιχαλλψ mοδιφιεδ 6 ανδ mαινταινεδ υνδερ τηε σαmε χονδιτιονσ. Αλλ προχεδυρεσ ωερε περφορmεδ ιν αχχορδανχε Υνιτεδ Κινγδοm Ηοmε Οφφιχε ρεγυλατιονσ. Induction of experimental osteoarthritis Τωο πρεϖιουσλψ δεσχριβεδ mοδελσ οφ ϕοιντ ινσταβιλιτψ ωερε εmπλοψεδ. 7 Τηε πρινχιπαλ mοδελ υσεδ ινϖολϖεδ δεσταβιλισατιον οφ τηε mεδιαλ mενισχυσ βψ σεχτιον οφ τηε mεδιαλ mενισχο τιβιαλ λιγαmεντ (ΜΜΤΛ), ωηιχη ρεσυλτσ ιν δεϖελοπmεντ οφ α mιλδ αρτηροπατηψ ρεσεmβλινγ ηυmαν ΟΑ. 7 Α mορε σεϖερε mοδελ, ινϖολϖινγ αντεριορ χρυχιατε λιγαmεντ (ΑΧΛ) τρανσεχτιον, ωασ ινδυχεδ ιν α σmαλλερ γρουπ οφ mιχε. 7 Αλλ συργιχαλ προχεδυρεσ ωερε περφορmεδ βψ τηε σαmε ινϖεστιγατορ ωηο ωασ βλινδεδ το γενοτψπε ορ τρεατmεντ. Φολλοωινγ συργερψ, ανιmαλσ ωερε λεφτ φορ 4 ορ 8 ωεεκσ ανδ τηερεαφτερ, κνεε ϕοιντσ ωερε ηαρϖεστεδ φορ συβσεθυεντ ηιστολογιχαλ αναλψσισ. Κνεε ϕοιντ διαmετερ ωασ mεασυρεδ ωεεκλψ φορ α mοντη φολλοωινγ ΜΜΤΛ συργερψ ιν α σmαλλ χοηορτ οφ mιχε βυτ νο σιγνιφιχαντ διφφερενχε οχχυρρεδ οϖερ τιmε (Π=0.6, 1 ωαψ ΑΝΟςΑ, ν = 6). Ασ σιmιλαρ ρεσυλτσ ωερε οβταινεδ ωιτη τηε ΑΧΛ σεχτιον mοδελ, νο φυρτηερ συχη mεασυρεmεντσ ωερε περφορmεδ. Assessment of cartilage damage Ηιστολογιχαλ αναλψσισ οφ προγρεσσιον ανδ σεϖεριτψ οφ χαρτιλαγε δαmαγε ωασ υνδερτακεν ον ηαρϖεστεδ ϕοιντσ, ινϖολϖινγ δεχαλχιφιχατιον βψ ινχυβατινγ κνεε ϕοιντσ ιν 4% παραφορmαλδεηψδε σολυτιον φολλοωεδ βψ πηοσπηατε βυφφερ ανδ τηεν ιν 10% ΕDΤΑ σολυτιον ατ 4 ο Χ φορ 2 ωεεκσ. ϑοιντσ ωερε εmβεδδεδ ιν παραφφιν ωαξ ανδ φρονταλ σεχτιονσ (6 m) χυτ ατ 200 m ιντερϖαλσ, φολλοωεδ βψ σταινινγ ωιτη Ηαεmατοξψλιν, Σαφρανιν Ο/φαστ γρεεν. Τεν σεχτιονσ φροm εαχη mουσε ωερε γραδεδ υσινγ α ϖαλιδατεδ σχορινγ σψστεm, 7 φροm 0 (νορmαλ) το 6 (>80% λοσσ οφ χαρτιλαγε) βψ τωο σχορερσ βλινδεδ το τηε σπεχιmενσ, τακινγ εαχη θυαδραντ οφ τηε ϕοιντ σεπαρατελψ ανδ τηεν συmmινγ σχορεσ. Τηερε ωασ χλοσε

6 αγρεεmεντ βετωεεν σχορερσ (ιντραχλασσ χορρελατιον χοεφφιχιεντ 0.97; 95% ΧΙ 0.95 το 0.98) ωιτη τηε mεαν διφφερενχε ιν σχορε βεινγ 0.05 (95% ΧΙ 0.01 το 0.11). Assessment of osteosclerosis Φροm τηε σεχτιονσ οβταινεδ αβοϖε, τωο ωερε χηοσεν ατ ρανδοm, διγιταλλψ χαπτυρεδ (Ολψmπυσ ΒΞ51, DΠ70, ΑναλψΣΙΣ σοφτωαρε) ανδ στορεδ φορ χοmπυτερισεδ πλανιmετρψ αναλψσισ υσινγ ΘΣ Ονσχρεεν ϖ , (Ε θυαντιτιεσ Λτδ; ηττπ://ωωω.ε θυαντιτιεσ.χοm). Ονλψ τωο πηοτοmιχρογραπησ περ mουσε ωερε ρεθυιρεδ φορ πλανιmετριχ αναλψσισ ασ οστεοσχλεροσισ ωασ ρελατιϖελψ χονσιστεντ αχροσσ σεχτιονσ (χοεφφιχιεντ οφ ϖαριατιον 2.1%). Τηε αρεα οφ τηε mεδιαλ ανδ λατεραλ ασπεχτσ οφ τηε τιβιαλ πλατεαυ ωερε τραχεδ, φροm τηε επιπηψσεαλ πλατε το τηε λοωερ ζονε οφ χαρτιλαγε αδϕαχεντ το συβχηονδραλ βονε. Τηε τιβιαλ πλατεαυ ρεγιον ωασ σελεχτεδ ασ χαρτιλαγε δαmαγε ωασ mαξιmαλ ατ mεδιαλ ασπεχτ ωιτη τηε λατεραλ ρεγιον νεϖερ αππεαρινγ το βε αφφεχτεδ ιν ΜΜΤΛ σεχτιονεδ ωιλδ τψπε mιχε, ανδ σο χουλδ βε υσεδ ασ αν ιντερναλ ρεφερενχε. Χοντρολσ ωερε αλσο περφορmεδ ιν σηαm οπερατεδ ασ ωελλ ασ να ϖε mιχε. Ονχε τηε οϖεραλλ αρεα ον εαχη σιδε οφ τηε τιβιαλ πλατεαυ ωασ δετερmινεδ, αρεασ χονταινινγ mαρροω ωερε τραχεδ, συmmεδ ανδ συβτραχτεδ φροm τηε οϖεραλλ αρεα ον εαχη σιδε το ψιελδ τηε αρεα οχχυπιεδ βψ βονε. Χοmπαρισονσ ωερε mαδε βψ εξπρεσσινγ ασ τηε περχενταγε αρεα οχχυπιεδ βψ βονε ιν τηε mεδιαλ τιβιαλ χοmπαρεδ το τηε λατεραλ ρεγιον ιν ορδερ το νορmαλισε φορ ανιmαλ σιζε, σινχε αναλψσισ οφ να ϖε mιχε σηοωεδ τηε διφφερενχε βετωεεν τηεσε αρεασ το βε mινιmαλ (1.1 ± 3.4%, mεαν ± σεm, ν = 5). Σχορεσ ωερε ινδεπενδεντλψ ϖεριφιεδ βψ ανοτηερ βλινδεδ ασσεσσορ ανδ τηερε ωασ γοοδ αγρεεmεντ βετωεεν σχορερσ (ιντραχλασσ χορρελατιον χοεφφιχιεντ 0.91; 95% ΧΙ 0.77 το 0.97) ωιτη τηε mεαν διφφερενχε ιν σχορε βεινγ 2.7% (95% ΧΙ 5.45 το 0.06). Οστεοσχλεροσισ ωασ νοτ ασσεσσεδ ιν τηε ΑΧΛ mοδελ ασ ιτ ωασ πρεϖιουσλψ ρεπορτεδ τηατ βονε εροσιον χαν πενετρατε το τηε επιπηψσεαλ πλατε. 7

7 Immunohistochemistry Φολλοωινγ δεχαλχιφιχατιον, σεχτιονσ ωερε δεπαραφφινιζεδ, ρεηψδρατεδ ανδ σταινεδ ωιτη τηε mυρινε mονοχλοναλ αντιβοδψ (mαβ) ΣΑΜ 11 (Σαντα Χρυζ Βιοτεχηνολογψ, Σαντα Χρυζ, ΧΑ) ατ 1 γ/mλ υσινγ τηε Dακο (Ελψ, ΥΚ) ΑΡΚ (Ανιmαλ Ρεσεαρχη Κιτ) Περοξιδασε. ΣΑΜ 11 ισ α ηιγηλψ σπεχιφιχ mαβ το ηυmαν ΠΑΡ 2 τηατ βινδσ τηε mεmβρανε βουνδ παρτ οφ τηε ρεχεπτορ. Αντιγεν αντιβοδψ χοmπλεξ ωασ ϖισυαλιζεδ υτιλιζινγ διαmινοβενζιδινε (DΑΒ) ανδ χουντερσταινεδ ωιτη ηεmατοξψλιν. Τηε ΑΡΚ ωασ υτιλισεδ το mινιmισε ρεαχτιϖιτψ οφ σεχονδαρψ αντι mουσε αντιβοδψ ωιτη ενδογενουσ ιmmυνογλοβυλιν. Statistical analysis Dατα ωερε τεστεδ φορ νορmαλιτψ (Σιγmαστατ 2.03, ΣΠΣΣ Ινχ) ανδ εξπρεσσεδ ασ mεαν ± σεm ωιτη χοmπαρισονσ βψ ονε ορ τωο ωαψ ΑΝΟςΑ ανδ mυλτιπλε χοmπαρισονσ υσινγ Βονφερρονι χορρεχτιον. Νον νορmαλ δατα ωερε τρανσφορmεδ (σθυαρε ροοτ) πριορ το στατιστιχαλ αναλψσισ ανδ ιφ νορmαλιτψ ωασ στιλλ νοτ αχηιεϖεδ, νον παραmετριχ mετηοδσ ωερε υσεδ. Αγρεεmεντ βετωεεν σχορερσ ωασ ασσεσσεδ γραπηιχαλλψ υσινγ τηε Βλανδ Αλτmαν πλοτ 8 ανδ εξπρεσσεδ ασ τηε ιντραχλασσ χορρελατιον χοεφφιχιεντ. Results Φουρ ωεεκσ φολλοωινγ ΜΜΤΛ σεχτιον, ιmmυνοηιστοχηεmιχαλ αναλψσισ οφ χαρτιλαγε ρεϖεαλεδ ινχρεασεδ ΠΑΡ 2 εξπρεσσιον ιν συπερφιχιαλ λαψερ χηονδροχψτεσ (Φιγ 1α), χοmπαρεδ το σηαm οπερατεδ mιχε (Φιγ 1β). Ηαϖινγ εσταβλισηεδ ενηανχεδ εξπρεσσιον οφ

8 τηε ΠΑΡ 2 πατηωαψ ωιτη πλαυσιβλε τισσυε διστριβυτιον, πατηολογψ ωασ χοmπαρεδ ιν ωιλδ τψπε mιχε (ΠΑΡ 2 +/+ ; ν = 5) ανδ ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ λιττερmατεσ (ΠΑΡ 2 / ; ν = 5), ωιτη σηαm οπερατεδ ωιλδ τψπε mιχε (ν = 4) σερϖινγ ασ α νεγατιϖε χοντρολ. Χοmπαρεδ το σηαm οπερατεδ mιχε (Φιγ 1δ), ΠΑΡ 2 +/+ mιχε σηοωεδ χαρτιλαγε δαmαγε ανδ ινχρεασεδ συβχηονδραλ βονε φορmατιον (Φιγ 1ε) ωηερεασ συχη χηανγεσ ωερε mινιmαλ ιν ΠΑΡ 2 / mιχε (Φιγ 1φ). Συχη διφφερενχεσ χουλδ νοτ βε αττριβυτεδ το αν υνδερλψινγ διφφερενχε ιν βονε πηενοτψπε οφ ΠΑΡ 2 / mιχε ασ τηε αππεαρανχε οφ τηε υνοπερατεδ κνεε διδ νοτ διφφερ φροm ωιλδ τψπε λιττερmατεσ (Συππλεmενταρψ Φιγ 1). Το αδδρεσσ τηε τηεραπευτιχ υτιλιτψ οφ ΠΑΡ 2, οπερατεδ mιχε (ν = 6) ωερε τρεατεδ ωιτη ΣΑΜ 11 αντιβοδψ, ωηιχη ωε πρεϖιουσλψ δεmονστρατεδ ινηιβιτσ ΠΑΡ 2 αχτιϖατιον. 9 Ιν α φυρτηερ γρουπ (ν = 5), ωε υτιλισεδ π520, α σελεχτιϖε ΠΑΡ 2 ανταγονιστ. 10 Χονσιστεντ ωιτη δατα ιν τηε ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ ανιmαλσ, mιχε τρεατεδ ωιτη ΣΑΜ 11 (Φιγ 1γ) ορ π520 σηοωεδ σιγνιφιχαντλψ ρεδυχεδ ΟΑ πατηολογψ φουρ ωεεκσ ποστ οπερατιϖελψ (Φιγ 1 η, ι). Τωο ωαψ ΑΝΟςΑ ρεϖεαλεδ α σιγνιφιχαντ διφφερενχε ιν χαρτιλαγε δεγραδατιον βετωεεν γρουπσ (Π < ) ανδ βετωεεν ρεγιονσ (Π < ). ΠΑΡ 2 +/+ mιχε εξηιβιτεδ σιγνιφιχαντλψ γρεατερ χαρτιλαγε δεγραδατιον τηαν σηαm οπερατεδ, ΠΑΡ 2 / mιχε, ορ ωιλδ τψπε mιχε τρεατεδ ωιτη π520 (Φιγ 1η). Σιmιλαρλψ, οπερατεδ mιχε ρεχειϖινγ αν ισοτψπε αντιβοδψ δεϖελοπεδ συβσταντιαλλψ γρεατερ χαρτιλαγε δεγραδατιον τηαν ΣΑΜ 11 τρεατεδ mιχε. Χονσιστεντ ωιτη πρεϖιουσ ωορκ, 7 χαρτιλαγε δαmαγε ονλψ οχχυρρεδ ατ τηε mεδιαλ ασπεχτσ οφ τηε τιβια ανδ φεmυρ. Αναλψσισ οφ συβχηονδραλ βονε ρεϖεαλεδ διφφερενχεσ βετωεεν τρεατmεντ γρουπσ (Π = 0.006, 1 ωαψ ΑΝΟςΑ). ΠΑΡ 2 +/+ mιχε διφφερεντιατεδ φροm σηαm οπερατεδ, ΠΑΡ 2 / mιχε, ανδ ωιλδ τψπε ρεχιπιεντσ οφ π520 (Φιγ 1ι). Χονσιστεντ ωιτη τηισ, mιχε ρεχειϖινγ ισοτψπε χοντρολ σηοωεδ συβσταντιαλλψ γρεατερ οστεοσχλεροσισ τηαν ΣΑΜ 11 ρεχιπιεντσ. Χαρτιλαγε δαmαγε ανδ οστεοσχλεροσισ σχορεσ ωερε σιγνιφιχαντλψ χορρελατεδ (ρ =

9 0.7, Π < ). Σινχε γενετιχ δεφιχιενχψ οφ ΠΑΡ 2, ορ ινηιβιτιον βψ τωο διστινχτ ρουτεσ, ναmελψ ταργετινγ τηε προτεασε χλεαϖαγε σιτε ωιτη ΣΑΜ 11 ορ διρεχτλψ βψ ρεχεπτορ ανταγονισm, προϖεδ εφφεχτιϖε ιν πρεϖεντινγ τηε δεϖελοπmεντ οφ εξπεριmενταλ ΟΑ, ωε χονχλυδε τηατ ΠΑΡ 2 ασ α πιϖοταλ χηεχκποιντ ιν εαρλψ προγρεσσιον οφ ΟΑ πατηολογψ. Τηε λονγερ τερm εφφεχτσ οφ ΠΑΡ 2 βιολογψ ωερε εξαmινεδ υσινγ ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ mιχε βψ εξτενδινγ τηε ποστοπερατιϖε περιοδ το ειγητ ωεεκσ. Χοmπαρεδ το ωιλδ τψπε λιττερmατεσ (Φιγ 2α) χαρτιλαγε δαmαγε ωασ στιλλ σιγνιφιχαντλψ (Π <0.0001, 2 ωαψ ΑΝΟςΑ, ν = 7 8) λοωερ ιν ΠΑΡ 2 / mιχε (Φιγ 2β, χ) ανδ ονχε αγαιν τηε λαττερ σηοωεδ νο εϖιδενχε οφ ινχρεασεδ συβχηονδραλ βονε φορmατιον, ωηερεασ ΠΑΡ 2 +/+ mιχε σηοωεδ α σιγνιφιχαντ ινχρεασε χοmπαρεδ το τηε 4 ωεεκ mοδελ (Φιγ 2δ). Το φυρτηερ τεστ ουρ ηψποτηεσισ, τηε mορε αγγρεσσιϖε ΑΧΛ τρανσεχτιον mοδελ ωασ ινϖεστιγατεδ. ΠΑΡ 2 +/+ mιχε δεϖελοπεδ αλmοστ χοmπλετε χαρτιλαγε εροσιον, παρτιχυλαρλψ ατ τηε mεδιαλ φεmοραλ χονδψλε (Φιγ 3α, χ), ωηερεασ ΠΑΡ 2 / mιχε εξηιβιτεδ σιγνιφιχαντλψ (Π < , 2 ωαψ ΑΝΟςΑ, ν = 7 8) λοωερ λεϖελσ οφ δαmαγε (Φιγ 3β, χ). Discussion Ουρ οβσερϖατιονσ ιν ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ mιχε υσινγ βοτη ΜΜΤΛ ανδ ΑΧΛ τρανσεχτιον mοδελσ προϖιδε ποωερφυλ προοφ οφ χονχεπτ φορ α κεψ ρολε οφ ΠΑΡ 2 ιν ϕοιντ δεγραδατιον ασσοχιατεδ ωιτη ΟΑ, ανδ φυρτηερmορε δεmονστρατε τηε τηεραπευτιχ ποτεντιαλ οφ ΠΑΡ 2 ινηιβιτιον, ωηιχη χουλδ ηαϖε πρεϖεντατιϖε χλινιχαλ υτιλιτψ. Τηε mεχηανισm βψ ωηιχη ΠΑΡ 2 προmοτεσ ΟΑ ηασ ψετ το βε χλαριφιεδ. ΠΑΡ 2 προϖιδεσ φορ σενσινγ βψ χελλσ οφ τηε προτεασε ενϖιρονmεντ ανδ αλλοωσ τηεm το συβσεθυεντλψ ρεσπονδ. Φορ εξαmπλε, ΠΑΡ 2 ρεγυλατεσ σψνοϖιαλ ρελεασε οφ προ ινφλαmmατορψ χψτοκινεσ ινχλυδινγ ΙΛ 1, 11 ωηιχη ισ ιν τυρν α ποτεντ χηονδροχψτε χαταβολιν. 12 Αχτιϖατιον οφ ΠΑΡ 2 λεαδσ το ινηιβιτιον οφ οστεοχλαστ διφφερεντιατιον 13 ανδ χουλδ αλτερ τηε βαλανχε βετωεεν βονε φορmατιον ανδ

10 ρεσορπτιον ανδ τηερεβψ χοντριβυτε το οστεοσχλεροσισ οβσερϖεδ ιν ΠΑΡ 2 +/+ βυτ νοτ ΠΑΡ 2 / mιχε. Ηοωεϖερ, ωηετηερ ΠΑΡ 2 ηασ α διρεχτ ορ ινδιρεχτ εφφεχτ ον τηε βονε πηενοτψπε ανδ ιτσ ηιεραρχηιχαλ ρολε ιν ΟΑ αρε αρεασ φορ φυρτηερ ινϖεστιγατιον. Πριορ στυδιεσ ρεϖεαλεδ τηατ σελεχτιϖε ΠΑΡ 2 αχτιϖατιον οφ χηονδροχψτεσ δεριϖεδ φροm ηυmαν ΟΑ χαρτιλαγε λεαδσ το γενερατιον οφ ΜΜΠ 1 ανδ 13, 5 βοτη οφ ωηιχη αρε κνοων το πλαψ α κεψ ρολε ιν δεγραδατιον οφ αγγρεχαν ανδ χολλαγενσ. Αλτηουγη τηε ινιτιατινγ εϖεντ ιν τηε δεϖελοπmεντ οφ ΟΑ λεσιονσ ρεmαινσ υνκνοων, ουρ δατα συγγεστ τηατ ΠΑΡ 2 ισ α χρυχιαλ χηεχκποιντ τηατ mεδιατεσ τηε εφφεχτ οφ βιοmεχηανιχαλ ινσταβιλιτψ υπον χαρτιλαγε δεγραδατιον ανδ οστεοσχλεροσισ. ΠΑΡ 2 ινηιβιτορσ χουλδ τηερεφορε προϖιδε α νεω διρεχτιον ιν τηε δεϖελοπmεντ οφ δισεασε mοδιφψινγ οστεοαρτηριτισ δρυγσ (DΜΟΑDσ), ωηιχη φολλοωινγ δισαπποιντινγ ρεσυλτσ οφ τριαλσ ωιτη ΜΜΠ ινηιβιτορσ, βιπηοσπηονατεσ ανδ χψτοκινε ινηιβιτιον, 14 στιλλ ρεmαιν ελυσιϖε. ACKNOWLEDGMENTS Τηε αυτηορσ τηανκ Ελιζαβετη Βυρνσ ανδ Πετερ Κερρ φορ εξπερτ τεχηνιχαλ ασσιστανχε. Φινανχιαλ συππορτ βψ Αρτηριτισ Ρεσεαρχη ΥΚ (17728, 18901) ανδ τηε Χαρνεγιε Τρυστ ισ γρατεφυλλψ αχκνοωλεδγεδ. References 1. Βροοκσ ΠΜ. Τηε βυρδεν οφ mυσχυλοσκελεταλ δισεασε α γλοβαλ περσπεχτιϖε. Clin Rheumatol 2006;25(6): Λαωρενχε ΡΧ, ετ αλ. Εστιmατεσ οφ τηε πρεϖαλενχε οφ αρτηριτισ ανδ σελεχτεδ mυσχυλοσκελεταλ δισορδερσ ιν τηε Υνιτεδ Στατεσ. Arthritis Rheum1998;41(5):

11 3. Μαχφαρλανε ΣΡ, Σεαττερ Μϑ, Κανκε Τ, Ηυντερ ΓD, Πλεϖιν Ρ Προτεινασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορσ. Pharmacol. Rev. 2001;53(2): Ξιανγ Ψ, ετ αλ. Εξπρεσσιον οφ προτεινασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορσ (ΠΑΡ) 2 ιν αρτιχυλαρ χηονδροχψτεσ ισ mοδυλατεδ βψ ΙΛ 1βετα, ΤΝΦ αλπηα ανδ ΤΓΦ βετα Osteoarthritis Cartilage 2006;14(11): Βοιλεαυ Χ, ετ αλ. Αχτιϖατιον οφ προτεινασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορ 2 ιν ηυmαν οστεοαρτηριτιχ χαρτιλαγε υπρεγυλατεσ χαταβολιχ ανδ προινφλαmmατορψ πατηωαψσ χαπαβλε οφ ινδυχινγ χαρτιλαγε δεγραδατιον: α βασιχ σχιενχε στυδψ. Arth. Res. Ther. 2007;9(6):Ρ Φερρελλ WΡ, ετ αλ. Εσσεντιαλ ρολε φορ προτεινασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορ 2 ιν αρτηριτισ.j Clin Invest 2003;111(1): Γλασσον ΣΣ, Βλανχηετ Τϑ, Μορρισ ΕΑ. Τηε συργιχαλ δεσταβιλιζατιον οφ τηε mεδιαλ mενισχυσ (DΜΜ) mοδελ οφ οστεοαρτηριτισ ιν τηε 129/ΣϖΕϖ mουσε. Osteoarthritis Cartilage 2007;15(9): Βλανδ ϑμ, Αλτmαν DΓ. Στατιστιχαλ mετηοδσ φορ ασσεσσινγ αγρεεmεντ βετωεεν τωο mετηοδσ οφ χλινιχαλ mεασυρεmεντ. Lancet 1986;1(8476): Κελσο ΕΒ, ετ αλ. Τηεραπευτιχ προmισε οφ προτεινασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορ 2 ανταγονισm ιν ϕοιντ ινφλαmmατιον. J Pharmacol Expt Ther 2006;316(3): Ηεmβρουγη Τ, ετ αλ. Αντι ινφλαmmατορψ ανταγονιστσ οφ ΠΑΡ 2 αλσο ηαϖε αντιτυmορ ανδ αντιανγιογενιχ αχτιϖιτψ. Proc Amer Assoc Cancer Res 2005;46: Κελσο ΕΒ, ετ αλ. Εξπρεσσιον ανδ προινφλαmmατορψ ρολε οφ προτεινασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορ 2 ιν ρηευmατοιδ σψνοϖιυm: εξ ϖιϖο στυδιεσ υσινγ α νοϖελ προτεινασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορ 2 ανταγονιστ. Arthritis Rheum 2007;56(3):

12 12. Dαηεσηια Μ., Ψαο ϑθ. Τηε ιντερλευκιν 1 βετα πατηωαψ ιν τηε πατηογενεσισ οφ οστεοαρτηριτισ. J Rheumatol. 2008;35(12): Σmιτη Ρ, ετ αλ. Αχτιϖατιον οφ προτεασε αχτιϖατεδ ρεχεπτορ 2 λεαδσ το ινηιβιτιον οφ οστεοχλαστ διφφερεντιατιον. J Bone Miner Res 2004;19(3): Θϖιστ Π, ετ αλ. Τηε δισεασε mοδιφψινγ οστεοαρτηριτισ δρυγ (DΜΟΑD): Ισ ιτ ιν τηε ηοριζον? Pharmacol Res 2008;58(1):1 7.

13 Figure Legends Fig 1. ΠΑΡ 2 αβσενχε ορ ινηιβιτιον αmελιορατεσ ΟΑ πατηολογψ ιν τηε φουρ ωεεκ ΜΜΤΛ mοδελ. Ιmmυνοηιστοχηεmιστρψ οφ χαρτιλαγε ιν τηε mεδιαλ τιβιαλ ασπεχτ υσινγ ΣΑΜ 11 το δετεχτ ΠΑΡ 2 σηοωσ ινχρεασεδ συρφαχε εξπρεσσιον ιν χηονδροχψτεσ οφ τηε ωιλδ τψπε mουσε φολλοωινγ ΜΜΤΛ σεχτιον (α), χοmπαρεδ το α σηαm οπερατεδ ανιmαλ (β), ωιτη ισοτψπε χοντρολ (χ). Βαρ ινδιχατεσ 50 m. Ηιστολογιχαλ αππεαρανχεσ οφ τηε mεδιαλ ασπεχτ οφ τηε κνεε ϕοιντ φουρ ωεεκσ φολλοωινγ σηαm οπερατιον (δ), ορ φολλοωινγ ΜΜΤΛ σεχτιον ιν ειτηερ α ωιλδ τψπε (ε) ορ ΠΑΡ 2 δεφιχιεντ mουσε (φ), ορ ωιλδ τψπε mουσε τρεατεδ δαιλψ ωιτη ΣΑΜ 11 (1 γ ι.π.) ιmmεδιατελψ πριορ το ανδ αφτερ ινδυχτιον οφ ΟΑ (γ). Αρροωηεαδσ ιν (ε) δενοτε χαρτιλαγε δαmαγε ανδ * ινδιχατεσ οστεοσχλεροσισ. Σχαλε βαρ ιν πανελ φ ινδιχατεσ 500 m ανδ αππλιεσ το αλλ φουρ πηοτοmιχρογραπησ. Χαρτιλαγε δεγραδατιον σχορεσ (η) φορ τηε mεδιαλ τιβιαλ (ΜΤ), mεδιαλ φεmοραλ (ΜΦ), λατεραλ τιβιαλ (ΛΤ) ανδ λατεραλ φεmοραλ (ΛΦ) ρεγιονσ φολλοωινγ ΜΜΤΛ σεχτιον ιν ΠΑΡ 2 +/+ ανδ ΠΑΡ 2 / mιχε, ΠΑΡ 2 +/+ mιχε τρεατεδ ωιτη ΠΑΡ 2 ανταγονιστ π520 (5mγ ι.π. δαιλψ), ΣΑΜ 11 (1 γ ι.π. δαιλψ) ορ ισοτψπε (ΙγΓ2α) χοντρολ αντιβοδψ (ΙΣΟ; 1 γ ι.π. δαιλψ), αλονγ ωιτη σηαm οπερατεδ χοντρολσ. Dατα αρε εξπρεσσεδ ασ mεαν ± σεm, ν = 4 6. Αναλψσισ βψ ονε ωαψ ΑΝΟςΑ ωιτη mυλτιπλε χοmπαρισονσ υσινγ τηε Βονφερρονι χορρεχτιον, = Π < 0.05; = Π < 0.01; = Π < = Π< 0.005, Μανν Wηιτνεψ ρανκ συm τεστ. Περχενταγε διφφερενχε ιν βονε αρεα (ι) χοmπαρινγ τηε mεδιαλ ανδ λατεραλ τιβιαλ ρεγιονσ φολλοωινγ ΜΜΤΛ τρανσεχτιον ιν τηε αβοϖε γρουπσ οφ mιχε αλονγ ωιτη α να ϖε χοντρολ γρουπ. Αναλψσισ βψ ονε ωαψ ΑΝΟςΑ ωιτη mυλτιπλε χοmπαρισονσ υσινγ τηε Βονφερρονι χορρεχτιον, = Π < 0.05; = Π < 0.02; = Π < = Π < 0.001, τ τεστ. ΝΣ = νοτ σιγνιφιχαντ, τ τεστ. Fig 2. ΠΑΡ 2 δεφιχιενχψ στιλλ χονφερσ προτεχτιον ειγητ ωεεκσ φολλοωινγ ΜΜΤΛ σεχτιον. Εξαmινατιον οφ τηε mεδιαλ τιβιαλ ανδ φεmοραλ ρεγιονσ οφ τηε ΠΑΡ 2 +/+ mουσε (α) χοmπαρεδ το ιτσ ΠΑΡ 2 / λιττερmατε (β) ειγητ ωεεκσ φολλοωινγ ΜΜΤΛ σεχτιον σηοωσ χοντινυεδ προτεχτιον ιν τηε λαττερ. Σχαλε βαρσ ινδιχατε 500 m. Τηισ ωασ χονφιρmεδ φορ τηεσε τωο γρουπσ (ν = 7 ανδ 8 ρεσπεχτιϖελψ) ιν τερmσ οφ χαρτιλαγε δαmαγε σχορεσ (χ). = Π < 0.01, = Π < Οστεοσχλεροσισ, χοmπαρινγ % διφφερενχε ιν βονε αρεα βετωεεν τηε mεδιαλ ανδ λατεραλ τιβιαλ αρεασ, σηοωεδ α σιγνιφιχαντ ινχρεασε ιν τηε ειγητ ωεεκ mοδελ (ΜΜΤΛ8) χοmπαρεδ το 4 ωεεκσ (ΜΜΤΛ4) ιν ΠΑΡ 2 +/+ mιχε βυτ νο διφφερενχε βετωεεν τηε ΠΑΡ 2 / γρουπσ (δ). = Π < 0.02, = Π < Fig 3. Ειγητ ωεεκσ φολλοωινγ ΑΧΛ τρανσεχτιον, συβσταντιαλ δαmαγε ωασ εϖιδεντ ιν mυλτιπλε αρεασ οφ τηε κνεε ιν ΠΑΡ 2 +/+ (α), βυτ λεσσ σο ιν ΠΑΡ 2 / mιχε (β). Σχαλε βαρ ινδιχατεσ 1000 m. Χαρτιλαγε δαmαγε σχορεσ χονφιρm τηε mορε εξτενσιϖε νατυρε οφ δαmαγε ιν τηισ mοδελ οφ αρτηριτισ, βυτ τηερε ρεmαιν σιγνιφιχαντ διφφερενχεσ χοmπαρεδ το ΠΑΡ 2 / mιχε (χ). = Π < 0.001, = Π < 0.005, = Π < Supplementary Fig 1. Χοmπαρισον οφ τηε υνοπερατεδ κνεε ϕοιντ φροm τηε ωιλδ τψπε mουσε (α) ωιτη ιτσ ΠΑΡ 2 / λιττερmατε (β) σηοωσ νο αππαρεντ διφφερενχε ιν χαρτιλαγε ορ βονε πηενοτψπε. Σχαλε βαρσ ινδιχατε 500 m. Μεδιαλ τιβιαλ βονε αρεασ ιν (α) ανδ (β) ωερε 44.8% ανδ 43.2%, ρεσπεχτιϖελψ.

14 a d e b * f g c *** h 40 * ** 35 Cartilage score ** * ** p520 ISO SAM-11 MT LT MF LF i 30 Fig 1 % Difference bone area NS ** SHAM PAR-2+/+ PAR-2-/- PAR-2-/- PAR-2+/+ SHAM Naïve * *** ISO p520 SAM-11

15 a c 50 PAR-2+/+ PAR-2-/- Cartilage score b d % Difference bone area Fig MT LT MF LF ** MMTL8 * * MMTL4 PAR-2+/+ PAR-2-/-

16 a c 50 PAR2-+/+ PAR-2-/- 40 ** ** *** Cartilage score * 10 b 0 MT LT MF LF Fig 3

17 a b Supplemental Figure 1