QUANTA Plex TM Celiac IgA Profile Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Plex TM Celiac IgA Profile Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Plex Celiac IgA Profile είναι μια ανοσολογική ανάλυση φθορισμού για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των αντισώματα IgA αντι-ανθρώπινης τρανσγλουταμινάσης ιστού (h-ttg) και αντι-απαμιδιωμένου πεπτιδίου γλιαδίνης (DGP) και ανίχνευση επαρκούς ποσότητας IgA σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα αποτελεί βοήθημα στη διάγνωση της κοιλιακής νόσου εντεροπάθειας με ευαισθησία στη γλουτένη. Ανεπαρκής IgA υποδηλώνει ότι δεν υπάρχει επαρκής IgA που να επιτρέπει την ανίχνευση των IgA αντι-h-ttg ή αντι-dgp. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η κοιλιακή νόσος είναι μια χρόνια πάθηση, της οποίας τα κύρια χαρακτηριστικά περιλαμβάνουν φλεγμονή και χαρακτηριστική ισοπέδωση του εντερικού βλεννογόνου, με αποτέλεσμα ένα σύνδρομο δυσαπορρόφησης γνωστό ως εντεροπάθεια με ευαισθησία στη γλουτένη. Η ακριβής αιτιολογία της νόσου παραμένει άγνωστη αλλά η γλιαδίνη, το διαλυτό στην αλκοόλη κλάσμα της γλουτένης σίτου, αποτελεί σαφώς τον τοξικό παράγοντα. 1,2 Αρχικά, η διάγνωση της κοιλιακής νόσου γινόταν μέσω μιας σειράς εντερικών βιοψιών. Πιο πρόσφατα, προτάθηκαν οι οροδιαγνωστικές δοκιμασίες για αντισώματα αντι-γλιαδίνης, αντι-ενδομυΐου και αντι-ttg, με σκοπό τη διαλογή των ασθενών με υποψία εντεροπάθειας με ευαισθησία στη γλουτένη, καθώς και την παρακολούθηση της διατροφικής συμμόρφωσης. 3-5 Η Ευρωπαϊκή Εταιρία Παιδιατρικής Γαστρεντερολογίας και Διατροφής (European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition) πρότεινε τη χρήση δεικτών αντισωμάτων, όπως τα αντισώματα αντι-γλιαδίνης και αντι-ενδομυΐου, για τη μείωση του αριθμού των εντερικών βιοψιών που απαιτούνται για τη διεξαγωγή μιας διάγνωσης. 5 Το αντιγόνο ανδομυΐου έχει αναγνωριστεί ως το ένζυμο διασταυρούμενης σύνδεσης πρωτεΐνης ttg. 6 Οι ειδικές διαδικασίες ELISA οι οποίες περιλαμβάνουν το ttg ως αντιγόνο προσφέρουν μια αξιόπιστη, αντικειμενική εναλλακτική λύση ως προς τις παραδοσιακές αναλύσεις με βάση τον ανοσοφθορισμό, χρησιμοποιώντας λεπτά τμήματα οισοφάγου πρωτευόντων θηλαστικών ως υπόστρωμα. 6-8 Το αντιγόνο h- ttg έχει παραχθεί μέσω ανασυνδυασμένης τεχνολογίας, και μπορεί να παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα σε σύγκριση με το αντιγόνο από ήπαρ ινδικού χοιριδίου. 7,8 Πρόσφατες έρευνες αποκάλυψαν ότι αντισώματα αντιδραστικά για γλιαδίνη από ασθενείς με κοιλιακή νόσο δεσμεύουν έναν πολύ περιορισμένο αριθμό ειδικών επιτόπων στο μόριο γλιαδίνης Αυτές οι μελέτες περαιτέρω αποκαλύπτουν ότι η επιλεκτική απαμιδίωση της γλιαδίνης από το σχετιζόμενο με κοιλιακή νόσο ένζυμο ttg προκαλεί ενισχυμένη δέσμευση από τα αντισώματα αντιγλιαδίνης. Οι αναλύσεις που χρησιμοποιούν απαμιδιωμένα πεπτίδια γλιαδίνης παρέχουν υψηλότερη διαγνωστική ακρίβεια για κοιλιακή νόσο σε σύγκριση με τις τυπικές αναλύσεις αντι-γλιαδίνης και ακόμα και τις αναλύσεις αντι-ttg. 12,13 Επιπλέον, τα συγκεκριμένα αντισώματα παρουσιάζουν ενδιαφέρον ως προς την παρακολούθηση της δραστηριότητας της νόσου στο χρόνο, καθώς και για τον έλεγχο της τήρησης μιας διατροφής ελεύθερης γλουτένης. 13 Ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών με κοιλιακή νόσο έχουν ανεπάρκεια IgA Συνεπώς, μια στρατηγική ευαίσθητων δοκιμασιών διαλογής για τους επηρεαζόμενους πληθυσμούς συμπεριλαμβάνει δοκιμασίες για IgA αντι-dgp και αντι-h-ttg αντισώματα, καθώς και δοκιμασίες για επιλεκτική ανεπάρκεια IgA. Η ερπητοειδής δερματίτιδα (DH) είναι μια δερματική νόσος η οποία, όπως συμβαίνει και με την κοιλιακή νόσο, προκαλείται από την πέψη πρωτεϊνών σίτου. Η πλειοψηφία των ασθενών με DH παρουσιάζουν νηστιδική ατροφία των λαχνών όμοια με εκείνη που απαντάται στην κοιλιακή νόσο και η αυστηρή διατροφή ελεύθερη γλουτένης βελτιώνει τόσο τις εντερικές όσο και τις δερματικές βλάβες. 1,2,18 Οι τρέχουσες οροδιαγνωστικές μέθοδοι, όπως οι δοκιμασίες ενδομυΐου, αμιγούς γλιαδίνης και ttg παρουσιάζουν χαμηλότερη απόδοση στην περίπτωση της δοκιμασίας DH, με ποσοστά ευαισθησίας που κυμαίνονται μόλις μεταξύ 60-75% 18, σε σύγκριση με τα ποσοστά ευαισθησίας που υπερβαίνουν το 95% για κοιλιακή νόσο. 3-8 Το QUANTA Plex TM Celiac IgA Profile είναι μια δοκιμασία διαλογής για αντισώματα που απαντώνται σε άτομα με κοιλιακή νόσο και τη σχετιζόμενη διαταραχή ευαισθησίας στη γλουτένη ερπητοειδή δερματίτιδα. Επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση των IgA αντισωμάτων τόσο σε ένα συνθετικό απαμιδιωμένο πεπτίδιο γλιαδίνης όσο και σε ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ttg, ενώ ταυτόχρονα ανιχνεύει πιθανή ανεπάρκεια IgA. Αρχη Μεθοδου Η ανασυνδυασμένη h-ttg και το συνθετικό DGP δεσμεύονται το καθένα σε διαφορετικούς, χρωματισμένους με φθορισμό κόμβους. Οι δύο διαφορετικοί επικαλυμμένοι με αντιγόνο κόμβοι, καθώς και ένας επικαλυμμένος με αντι-iga κόμβος ελέγχου και ένας επικαλυμμένος με IgA κόμβος ελέγχου, αναμιγνύονται μεταξύ τους και τοποθετούνται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν τα αντιγόνα στην αντιδραστική τους κατάσταση. Τα προαραιωμένοι διαλύματα ελέγχου, ένα διάλυμα ελέγχου ελεύθερο ορού το οποίο αποτελείται από αραιωτικό δείγματος χωρίς προσθήκη ορού και οι αραιωμένοι οροί ασθενούς προστίθενται σε ξεχωριστά μικροπηγαδάκια, επιτρέποντας στα τυχόν αντισώματα DGP και h-ttg να δεσμευθούν στα ακινητοποιημένα αντιγόνα στους κόμβους, και στην ελεύθερη IgA να δεσμευθεί στον κόμβο αντι-iga. Στη συνέχεια, μια αντι-ανθρώπινη IgA συζευγμένη σε ένα φθορίζοντα ανιχνευτή προστίθεται σε κάθε μικροπηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο φθορίζον σύζευγμα αντι-ανθρώπινης IgA να δεσμευθεί σε οποιαδήποτε αντισώματα του ασθενούς τα οποία έχουν συνδεθεί στα αντιγόνα επάνω στους κόμβους ή συλληφθεί από τον κόμβο αντι-iga, και στην IgA στον κόμβο IgA. Τα δείγματα στη συνέχεια μετρώνται στον αναλυτή ροής Luminex 100 ή 200. Αυτός ο αναλυτής ροής μπορεί να διακρίνει το χρώμα κάθε κόμβου από τους άλλους, καθώς και να μετρήσει την ένταση φθορισμού του συζεύγματος σε κάθε κόμβο. 19 Η ένταση φθορισμού στον κόμβο είναι ανάλογη προς την ποσότητα του δεσμευμένου συζεύγματος, η οποία με τη σειρά της είναι ανάλογη προς την ποσότητα των αντισωμάτων του ασθενούς που έχουν 1

2 δεσμευθεί στους επικαλυμμένους με αντιγόνο κόμβους ή στον κόμβο αντι-iga. Κάθε αντίσωμα μπορεί να προσδιοριστεί ημι-ποσοτικά, συγκρίνοντας την ένταση φθορισμού του δείγματος του ασθενούς με εκείνη του αντίστοιχου σχεδιάγραμμα διαλύματος βαθμονόμησης. Συγκρίνοντας τις υπολογισμένες Μονάδες Luminex του κόμβου αντι-iga και του κόμβου IgA είναι δυνατόν να αναγνωριστεί ένας ορός με επιλεκτική ανεπάρκεια IgA, όπως περιγράφεται παρακάτω στην Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων. Αυτοί οι δύο κόμβοι ελέγχου μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για να διασφαλιστεί η ανίχνευση ψευδών αρνητικών αποτελεσμάτων λόγω λειτουργικού σφάλματος, όπως περιγράφεται στον Έλεγχο Ποιότητας. Προσέξτε ότι αυτοί οι κόμβοι δίνουν τα ίδια αποτελέσματα όταν ένα άτομο έχει ανεπάρκεια IgA και όταν δεν προστεθεί ορός στο πηγαδάκι. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου, 12 ταινίες (1 x 8) μικροκοιλοτήτων (ασημένια σφραγίδα στο χρώμα) με θήκη, που περιέχουν κόμβους 4 διαφορετικών "χρωμάτων". Καθένας από τους χρωματισμένους κόμβους είναι επικαλυμμένος με ένα διαφορετικό καθαρό αντιγόνο (h-ttg, DGP, anti-iga ή IgA), σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά μέσα 2. QUANTA Plex Negative Control, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό με μη ανθρώπινα αντισώματα h-ttg και DGP αντιγόνα, προαραιωμένος, (έτοιμος προς χρήση), 1.2mL 3. Celiac IgA Calibrator, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού στα αντιγόνα h-ttg και DGP, προαραιωμένο, (έτοιμος προς χρήση),1.2ml 4. Celiac IgA Positive Control, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού στα αντιγόνα h-ttg και DGP, προαραιωμένο, (έτοιμος προς χρήση), 1.2mL 5. HRP αραιωτικό δείγματος, 1 φιαλίδιο - χρώματος ροζ, που περιέχει αλατούχο διάλυμα με ρυθμιστικό Tris, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικά, 50mL (χρησιμοποιείται επίσης στο Διάλυμα Ελέγχου Ελεύθερο Ορού) 6. Σύζευγμα IgA σεσημασμένο με φθορισμό (κατσίκας), αντιανθρώπινη IgA (ειδικό για άλφα αλυσίδα), 1 φιαλίδιο χρώματος κεχριμπαρί - λυοφιλοποιημένη σκόνη, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικά. Ανατρέξτε στο τμήμα Μεθόδων για οδηγίες ανασύστασης 7. QUANTA Plex Conjugate Diluent, 1 φιαλίδιο - χρώματος ροζ, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, στεθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικά, 7mL Προσοχή 1. Το προϊόν αυτό περιέχει μια χημική ουσία (0.02% chloramphenicol) που θεωρείται καρκινογενή. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Όταν απορρίπτονται τα αντιδραστήρια να ρίχνεται μεγάλη ποσότητα νερού έτσι ώστε να αποφεύγεται η συσσώρευση κατάλοιπων στις υδραυλικές εγκαταστάσεις. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. 4. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 5. Να ακολουθούνται όλοι οι κανονισμοί και νόμιμες διαδικασίες για την απόρριψη των αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η προσθήκη αζιδίου ή άλλων συντηρητικών στα δείγματα ορού μπορεί να επηρεάσουν τα αποτελέσματα. 3. Η προσαρμογή αυτής της ανάλυσης για χρήση με ορισμένους αυτόματους επεξεργαστές υγρού δείγματος κατέδειξε ότι δίνει ισοδύναμα αποτελέσματα με εκείνα που λαμβάνονται με χρήση της χειροκίνητης διαδικασίας. Αποτελεί ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να αξιολογεί ότι η αυτόματη διαδικασία δίνει αποτελέσματα δοκιμασίας εντός των αποδεκτών ορίων. 4. Η απόδοση της ανάλυσης επηρεάζεται από μια ποικιλία παραγόντων. Αυτοί συμπεριλαμβάνουν τη θερμοκρασία εκκίνησης των αντιδραστηρίων, τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος, την ακρίβεια και επαναληψιμότητα της τεχνικής χορήγησης με πιπέττα, την επαναληψιμότητα της τεχνικής ανάμιξης, το κυτταρόμετρο ροής Luminex 100 ή 200 συσκευή ανάλυσης που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση των αποτελεσμάτων και τη διάρκεια των χρόνων επώασης κατά την ανάλυση. Η προσοχή στη συνάφεια είναι σημαντική για την ακρίβεια και επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. 5. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 6. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας(κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 7. Είναι δυνατό να παρατηρηθεί μη αποδεκτά χαμηλός φθορισμός μετά από πολλαπλές χρήσεις από ένα μεμονωμένο φιαλίδιο φθορίζοντος συζεύγματος κατά τη διάρκεια ενός χρονικού διαστήματος. Για να αποφευχθεί αυτό, είναι σημαντικό να τηρούνται όλες οι συνιστώμενες διαδικασίες χειρισμού φθορίζοντος συζεύγματος. 8. Η χημική μόλυνση του φθορίζοντος συζεύγματος μπορεί να προέρχεται από τον ακατάλληλο καθαρισμό ή ξέπλυμα του εξοπλισμού ή των οργάνων. Κατάλοιπα από συνήθη εργαστηριακά χημικά, όπως φορμαλίνη, λευκαντικό, αιθανόλη ή απορρυπαντικό προκαλούν υποβάθμιση του φθορίζοντος συζεύγματος με την πάροδο του χρόνου. Ξεπλένετε τελείως όλον τον εξοπλισμό ή τα όργανα με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό μετά τη χρήση χημικών καθαριστικών/απολυμαντικών. 2

3 Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (στο παρελθόν NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 Celiac IgA Profile μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) (ασημένια σφραγίδα στο χρώμα) με βάση 1 1.2mL αραιωμένος έτοιμο για χρήση QUANTA Plex Negative Control πρότυπος ορός ελέγχου 1 1.2mL αραιωμένος έτοιμο για χρήση Celiac IgA Calibrator πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος έτοιμο για χρήση Celiac IgA Positive Control 1 50mL HRP Sample Diluent (χρησιμοποιείται επίσης στο Διάλυμα Ελέγχου Ελεύθερο Ορού) 1 Φιαλίδιο λυοφιλοποιημένου φθορίζοντος συζεύγματος (κατσίκας), αντιανθρώπινη IgA 1 QUANTA Plex Conjugate Diluent 7mL Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5 και 500 μl 8κάναλη πιπέτα ρυθμιζόμενου όγκου Δοκιμαστικοί σωλήνες για αραιώσεις δειγμάτων ασθενών, όγκος 1 έως 4mL Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό Υγρό Ελύτρου για συσκευή κυτταρομετρίας ροής Luminex 100 ή 200 Συσκευή ανάλυσης ροής Luminex 100 ή 200 Ηλεκτρονική πιπέττα 8 καναλιών για την παροχή 5, 30, 45, 50 και 60µL ή αυτόματη συσκευή πιπεττών/αραιωτής Χρήση του κυτταρόμετρου ροής Luminex 100 ή Βλ. το εγχειρίδιο χρήσης που παρέχεται με το Luminex για λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία του συσκευή ανάλυσης ροής Luminex 100 ή 200 και την έκδοση Luminex Integrated System (IS) ή την έκδοση λογισμικού 2.0 ή ανώτερος. Για πρόσθετες πληροφορίες και για πληροφορίες αντιμετώπισης προβλημάτων με την ανάλυση, επικοινωνήστε με την υπηρεσία τεχνικής υποστήριξης της INOVA Diagnostics, Inc. στη διεύθυνση ή στον αριθμό τηλεφώνου που παρέχεται στην τελευταία σελίδα του ένθετου οδηγιών. Συνοπτικές οδηγίες λειτουργίας για το συσκευή ανάλυσης ροής Luminex 100 ή 200 παρέχονται παρακάτω. 2. Βαθμονομείτε το Luminex χρησιμοποιώντας τους κόμβους πρότυπου ορού που διατίθενται από τη Luminex Corporation τουλάχιστον μία φορά το μήνα και επαληθεύετε ότι η βαθμονόμηση ήταν επιτυχής. Επίσης, βαθμονομείτε το Luminex εάν η διαφορά θερμοκρασίας βαθμονόμησης είναι μεγαλύτερη από 3 βαθμούς, εάν οι οροί ελέγχου ανάλυσης βρίσκονται εκτός εύρους ή όπως απαιτείται. 3. Το Luminex χρειάζεται 30 λεπτά για να προθερμανθεί μετά την ενεργοποίησή του. Όταν η περίοδος προθέρμανσης ολοκληρωθεί, εκτελέστε τις συνιστώμενες από τον κατασκευαστή λειτουργίες προετοιμασίας, έκπλυσης με αλκοόλη και πλύσης. 4. Εάν χρησιμοποιείτε λογισμικό έκδοσης IS ή ανώτερης, φορτώστε το πρότυπο "QP Celiac IgA Profile" και διασφαλίστε ότι όλες οι πληροφορίες παρτίδας είναι σωστές. Εάν είναι απαραίτητο, ενημερώστε τις πληροφορίες παρτίδας. Οι παράμετροι του υποδείγματος έχουν ως εξής:τα χρώματα κόμβων είναι h-ttg = 27, DGP = 28, anti-iga = 29, IgA = 30. Τα συμβάντα ανά κόμβο είναι 50, το μέγεθος δείγματος σε 50μL, το ρυθμό ροής σε 60μL/λεπτό (γρήγορο) και την πύλη σε περίπου 7500 έως Οι διάμεσες τιμές χρησιμοποιούνται για τη Διάμεση ένταση φθορισμού (Median Fluorescent Intensity MFI). 5. Εισάγετε τα ονόματα δείγματος είτε χειροκίνητα και είτε κάνοντας κλικ στο "Load Pa List". 6. Φορτώστε την πλάκα στην πλατφόρμα XY του Luminex. 7. Εκκινήστε το Luminex κάνοντας κλικ στο κουμπί "Start Plate" ή Start. 8. Όταν ολοκληρώσετε τις εργασίες σας για την ημέρα, εκτελέστε τις λειτουργίες υγιεινής και μουσκέματος πριν απενεργοποιήσετε το όργανο. 3

4 Μεθοδολογια: Πριν ξεκινήσετε 1. Για πληροφορίες προγραμματισμού για αυτόματο εξοπλισμό, επικοινωνήστε με τις υπηρεσίες τεχνικής υποστήριξης της INOVA Diagnostics, Inc. 2. Ενεργοποιήστε το συσκευή ανάλυσης ροής Luminex 100 ή 200, διασφαλίστε ότι έχει προθερμανθεί και εκτελέστε όλες τις λειτουργίες ημερήσιας συντήρησης όπως περιγράφηκαν παραπάνω. Εάν είναι απαραίτητο, βαθμονομήστε το όργανο και επαληθεύστε ότι η βαθμονόμηση ήταν επιτυχής. 3. Φέρτε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα ασθενών σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 o C) και αναμίξτε τα καλά. 4. Εάν το φθορίζον σύζευγμα αντι-ανθρώπινης IgA δεν έχει ανασυσταθεί, προσθέστε 6mL QUANTA Plex Conjugate Diluent στο φιαλίδιο χρώματος κεχριμπαρί που περιέχει τη λυοφιλοποιημένη σκόνη και στοβιλίστε το δοχείο για περίπου 30 δευτερόλεπτα για να διαλύσετε το περιεχόμενο. Το ανασυσταθέν φθορίζον σύζευγμα είναι σταθερό για 3 μήνες σε θερμοκρασία 2-8 C. Μην καταψύχετε. 5. Βεβαιωθείτε ότι ο περιέκτης υγρού ελύτρου στη συσκευή Luminex είναι γεμάτος με Υγρό Ελύτρου που διατίθεται από την Luminex Corporation και ότι η φιάλη αποβλήτων είναι κενή. 6. Προετοιμάστε μια αραίωση 1:101 κάθε δείγματος ασθενούς προσθέτοντας 5µL από κάθε ορό σε 500µL αραιωτικού δείγματος HRP, και στη συνέχεια περιδινίστε για να αναμίξετε τελείως το διάλυμα. Τα αραιωμένα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 8 ωρών από την ανασύσταση. ΜΗΝ ΑΡΑΙΩΝΕΤΕ τον QUANTA Plex Negative Control, Celiac IgA Calibrator and Positive Control. 7. Ο προσδιορισμός της παρουσίας ή της απουσίας των αντισωμάτων IgA anti-h-ttg και anti-dgp χρησιμοποιώντας αυθαίρετες μονάδες και η ανίχνευση επιλεκτικής ανεπάρκειας IgA, απαιτεί δύο πηγαδάκια για το Διάλυμα Βαθμονόμησης και ένα πηγαδάκι για το Αρνητικό, Θετικό και Ελεύθερο Ορού Διάλυμα Ελέγχου αντίστοιχα. Συνιστάται τα δείγματα να αναλύονται ένα-ένα χωριστά. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να έλθουν σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 C) πριν την έναρξη της ανάλυσης. Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό μικροκοιλοτήτων/ταινιών στη θήκη. Επιστρέψτε αμέσως τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στο σάκο που περιέχει τα αφυγραντικά μέσα και σφραγίστε καλά για να ελαχιστοποιήσετε την έκθεση σε υδρατμούς και φως. 2. Προσθέστε 45µL Αραιωτικού Δείγματος HRP σε κάθε μικροπηγαδάκι που θα περιέχει δείγμα ασθενούς (και το Ελεύθερο Ορού Διάλυμα Ελέγχου). Μην προσθέσετε Αραιωτικό Δείγματος HRP στα πρώτα τέσσερα μικροπηγαδάκια, διότι θα περιέχουν το Αρνητικό Διάλυμα Ελέγχου QUANTA Plex, το Διάλυμα Βαθμονόμησης Κοιλιακού IgA (εις διπλούν) και το Θετικό Διάλυμα Ελέγχου Κοιλιακού IgA. Μην προσθέτετε τα αραιωμένα δείγματα ασθενών στις μικροκοιλότητες αυτή τη στιγμή. 3. Τηρήστε μία από τις παρακάτω χρονικές ακολουθίες κατά την πρόσθεση ορών ελέγχου, δειγμάτων και συζεύγματος στις μικροκοιλότητες. Επειδή τα δείγματα διαβάζονται διαδοχικά με ρυθμό περίπου 1 δείγματος ανά 19 δευτερόλεπτα (ή μία ταινία 8 κοιλοτήτων ανά περίπου 2½ λεπτά) από το Luminex, τα δείγματα ασθενών και επίσης το σύζευγμα πρέπει να προστίθενται στις μικροκοιλότητες με αυτόν το ρυθμό, ώστε να ελαχιστοποιείται η διακύμανση της ανάλυσης από εμπρός προς τα πίσω. Εάν οι οροί ελέγχου, τα δείγματα ή το σύζευγμα προστίθενται το καθένα ξεχωριστά, καθυστερήστε κάθε πρόσθεση των παραπάνω στην επόμενη μικροκοιλότητα κατά 19 δευτερόλεπτα. Εάν οι οροί ελέγχου, τα δείγματα ή το σύζευγμα προστίθενται 8 κάθε φορά σε μια ταινία, καθυστερήστε κάθε πρόσθεση οποιουδήποτε από αυτά στην επόμενη ταινία κατά 2 ½ λεπτά. Καθένα από αυτά τα χρονικά σχήματα χρειάζεται περίπου 30 λεπτά για την πρόσθεση των δειγμάτων και στις 12 ταινίες μιας ολόκληρης πλάκας και ελαχιστοποιεί τη διακύμανση της ανάλυσης από εμπρός προς τα πίσω. 4. Περιδινίστε και στη συνέχεια προσθέστε 50μL από καθέναν από τους εξής προαραιωμένους ορούς ελέγχου: Το Αρνητικό Διάλυμα Ελέγχου QUANTA Plex στο πρώτο μικροπηγαδάκι, το Διάλυμα Βαθμονόμησης Κοιλιακού IgA στο δεύτερο και τρίτο μικροπηγαδάκι και το Θετικό Διάλυμα Ελέγχου Κοιλιακού IgA στο τέταρτο μικροπηγαδάκι. Κατά τη χειροκίνητη πρόσθεση δειγμάτων και ανάμιξη κόμβων, πρέπει να χρησιμοποιείται ηλεκτρονική πιπέττα. Χρησιμοποιήστε μία από τις χρονικές ακολουθίες για την πρόσθεση των ορών ελέγχου που περιγράφεται στο βήμα 3. Πιπετάρετε δυνατά τουλάχιστον 30μL του QUANTA Plex Negative Control, Celiac IgA Calibrator ή Positive Control πάνω-κάτω τέσσερις φορές για να αναμιχθούν οι κόμβοι και τα διαλύματα ελέγχου σε κάθε μικροπηγαδάκι. Η περίοδος επώασης των 30 λεπτών αρχίζει μετά την πρόσθεση του QUANTA Plex Negative Control στην πρώτη μικροκοιλότητα. 5. Αμέσως συνεχίστε την ανάλυση προσθέτοντας 5μL Αραιωτικού Δείγματος HRP στο πέμπτο πηγαδάκι (διάλυμα ελέγχου ελεύθερο ορού) και 5μL αραιωμένου ορού ασθενούς στα κατάλληλα παραμονή μικροπηγαδάκια (σημειώστε: αυτό δίνει 1:1010 τελική αραίωση του ορού ασθενούς). Διατηρήστε την ίδια χρονική ακολουθία που χρησιμοποιήθηκε στο βήμα 4. Αναμίξτε το αραιωμένο δείγμα ασθενούς και το αραιωτικό δείγματος στην μικροκοιλότητα ανακινώντας έντονα με πιπέττα τουλάχιστον 30μL του περιεχομένου της μικροκοιλότητας πάνω-κάτω τέσσερις φορές. Προσθέστε 50 μl του προαραιωμένου ANCA Profile χαμηλού θετικού στην κατάλληλη μικροκοιλότητα μετά την πρόσθεση του τελευταίου δείγματος ασθενούς και αναμίξτε όπως παραπάνω. Συνεχίστε να χρονομετράτε την επώαση για 30 λεπτά από το χρόνο της πρόσθεσης του QUANTA Plex Negative Control. Τοποθετήστε τις ταινίες μικροκοιλοτήτων σε θερμοκρασία δωματίου, σε επίπεδη επιφάνεια και μακριά από άμεσο ηλιακό φως για το υπόλοιπο της περιόδου επώασης. 6. Στο τέλος της πρώτης περιόδου επώασης, προσθέστε 50μL του φθορίζοντος συζεύγματος σε κάθε μικροκοιλότητα και ανακινήστε με πιπέττα τουλάχιστον 60μL του περιεχομένου της 4

5 μικροκοιλότητας πάνω-κάτω τέσσερις φορές. Διατηρήστε την ίδια χρονική ακολουθία για την πρόσθεση του συζεύγματος που χρησιμοποιήθηκε στα βήματα 4 και 5. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρείται από τη φιάλη υπό τυπικές ασηπτικές συνθήκες και ακολουθώντας καλές εργαστηριακές τεχνικές. Αφαιρείτε από τη φιάλη μόνο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΓΙΑ ΝΑ ΑΠΟΦΥΓΕΤΕ ΤΗΝ ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΠΟΤΕ ΜΗΝ ΕΠΙΣΤΡΕΦΕΤΕ ΜΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΜΕΝΟ ΣΥΖΕΥΓΜΑ ΣΤΗ ΦΙΑΛΗ. Επωάστε τις ταινίες μικροκοιλοτήτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, σε επίπεδη επιφάνεια και μακριά από άμεσο ηλιακό φως. Ο χρόνος επώασης αρχίζει μετά από την πρώτη πρόσθεση συζεύγματος. 7. Εντός μίας ώρας από την ολοκλήρωση της επώασης φθορίζοντος συζεύγματος διάρκειας 30 λεπτών, διαβάστε την πλάκα Celiac IgA Profile στο Luminex, όπως περιγράφεται στο παραπάνω τμήμα Χρήση του Συσκευή ανάλυσης ροής Luminex 100 ή 200. Ποιοτικός έλεγχος 1. Το Celiac IgA Calibrator (εις διπλούν), το Celiac IgA Positive Control, το QUANTA Plex Negative Control Ελέγχου και το Διάλυμα Ελέγχου Ελεύθερο Ορού πρέπει να χρησιμοποιούνται με κάθε παρτίδα δειγμάτων, ώστε να διασφαλίζεται ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες έχουν διενεργηθεί σωστά. 2. Προσέξτε ότι δεδομένου ότι το Celiac IgA Calibrator, το Celiac IgA Positive Control και το QUANTA Plex Negative Control Ελέγχου είναι προαραιωμένα, δεν ελέγχουν μεθόδους διαδικασίας που σχετίζονται με αραιώσεις δειγμάτων. 3. Μπορεί να απαιτείται η ανάλυση πρόσθετων ορών ελέγχου, σύμφωνα με τις οδηγίες ή τις απαιτήσεις των τοπικών ή/και εθνικών διατάξεων ή των οργανισμών διαπίστευσης. Πρόσθετοι κατάλληλοι οροί ελέγχου μπορούν να ανασυσταθούν διαιρώντας σε υποπολλαπλάσια δείγμα ανθρώπινου ορού πολλαπλών δοτών και αποθηκεύοντάς το σε θερμοκρασία < -20 C. 4. Για να θεωρούνται έγκυρα τα αποτελέσματα της δοκιμασίας, πρέπει να τηρούνται όλα τα κριτήρια που παρατίθενται παρακάτω. Σε περίπτωση μη τήρησης κάποιου από αυτά, η δοκιμασία πρέπει να θεωρηθεί άκυρη και η ανάλυση να επαναληφθεί. Η τιμή σε Luminex Units (LU) του διακριβωτής για κάθε αντιγόνο αναγράφεται στην ετικέτα του κουτιού για το συγκεκριμένο κιτ. Ανατρέξτε στον τύπο στο τμήμα Υπολογισμός των αποτελεσμάτων, για να καθορίσετε τις LU του QUANTA Plex Negative Control, Celiac IgA Positive Control και Ελεύθερων Ορού Διαλυμάτων Ελέγχου. α. Η τιμή του QUANTA Plex Negative Control πρέπει να είναι < 20 LU για h-ttg και DGP. Πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 10 και 40 LU τόσο για τον κόμβο ελέγχου IgA όσο και για τον αντι-iga. β. Η τιμή για το Celiac IgA Positive Control πρέπει να είναι > 30 LU για h-ttg και μεταξύ 30 LU και 130 LU για DGP. Πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 10 και 40 LU τόσο για τον κόμβο ελέγχου IgA όσο και για τον αντι-iga. γ. Η τιμή του Διαλύματος Ελέγχου Ελεύθερου Ορού πρέπει να είναι < 20 LU για h-ttg και DGP. Για τον κόμβο αντι-iga, η τιμή πρέπει να είναι < 5.0 LU και για τον κόμβο IgA πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 10 και 40 LU. δ. Ο λόγος των LU για αντι-iga/iga πρέπει να είναι >0.50 για το QUANTA Plex Negative Control και το Celiac IgA Positive Control, και <0.50 για το Διάλυμα Ελέγχου Ελεύθερο Ορού. ε. Οι κόμβοι ελέγχου αντι-iga και IgA προορίζονται να ανιχνεύουν επιλεκτική ανεπάρκεια IgA και να διασφαλίζουν την ανίχνευση ψευδών θετικών αποτελεσμάτων ασθενούς λόγω λειτουργικών σφαλμάτων. Εάν κάποιος από τους δύο κόμβους ελέγχου έχει υπολογισμένο αποτέλεσμα μικρότερο από 5 LU για έναν συγκεκριμένο ασθενή, εμφανίζεται το αποτέλεσμα Retest (Επανάληψη δοκιμασίας) στην έκδοση IS 2.0 και ανώτερη. i. Υπάρχει πιθανότητα ο ασθενής να έχει επιλεκτική ανεπάρκεια IgA εάν τα αποτελέσματα για αντι-h-ttg και DGP είναι αρνητικά (δηλ. κάτω από 20 LU) και ο κόμβος αντι-iga είναι κάτω από 5 LU, ενώ ταυτόχρονα η τιμή του κόμβου ελέγχου IgA είναι πάνω από 20 LU, δίνοντας ένα λόγο αντι-iga LU/IgA LU <0.5. Προσέξτε ότι αυτό το ίδιο αποτέλεσμα μπορεί να παραχθεί εάν δεν προστεθεί ορός ασθενούς στο ii. πηγαδάκι. Εάν και οι δύο κόμβοι αντι-iga και IgA είναι κάτω από 5.0 LU, υπάρχει πιθανότητα να μην προστέθηκε σύζευγμα στο πηγαδάκι. Αυτό να επαναληφθεί η δοκιμασία του ασθενούς, για να επιβεβαιωθεί το αρνητικό αποτέλεσμα. 5. Ο QUANTA Plex Negative Control το Celiac IgA Calibrator και Positive Control και υψηλό θετικό το Serum Free Control προορίζονται για την ανίχνευση της περίπτωσης σημαντικής αστοχίας του αντιδραστηρίου. Ο χρήστης πρέπει να ανατρέξει στο CLSI (στο παρελθόν NCCLS) Document C24- A3 για πρόσθετες οδηγίες σχετικά με τις κατάλληλες πρακτικές ελέγχου ποιότητας. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Τα MFI για όλα τα διαλύματα ελέγχου και τα δείγματα ασθενούς για κάθε αντιγόνο και τους δύο κόμβους ελέγχου προσδιορίζονται πρώτα.η αντιδραστικότητα σε LU ενός δεδομένου δείγματος για κάθε τύπο αντιγόνου μπορεί στη συνέχεια να υπολογιστεί μέσω του ακόλουθου τύπου. Διαιρέστε το MFI του δείγματος δια το MFI του Διαλύματος Βαθμονόμησης Θετικού Κοιλιακού IgA Προφίλ για το συγκεκριμένο αντιγόνο ή κόμβο ελέγχου, και πολλαπλασιάστε το αποτέλεσμα επί τον αριθμό των LUs που έχουν εκχωρηθεί στο Διάλυμα Βαθμονόμησης Κοιλιακού IgA Προφίλ γι αυτό το αντιγόνο. Η τιμή LU αξία του Διαλύματος Βαθμονόμησης για κάθε αντιγόνο αναγράφεται στην επισήμανση στο κουτί για το συγκεκριμένο κιτ. Το ακόλουθο παράδειγμα αφορά τον προσδιορισμό της αντιδραστικότητας αντι-h-ttg. Χρησιμοποιήστε τον ισότιμο τύπο για τον κόμβο DGP και για τους δύο κόμβους ελέγχου. 5

6 MFI δείγματος για h-ttg Τιμή δείγματος (σε LU) = x τιμή h-ttg διακριβωτής (σε LU) MFI h-ttg διακριβωτής Η αντιδραστικότητα του αντισώματος IgA για h-ttg και DGP μπορεί στη συνέχεια να ταξινομηθεί σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. LU Αρνητικό <20 Ασθενές θετικό θετικό >30 Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα αυτοαντισώματος που είναι παρούσα στον κόμβο με μη γραμμικό τρόπο. Ενώ αυξήσεις και μειώσεις στις συγκεντρώσεις αντισώματος ασθενούς αντικατοπτρίζονται σε αντίστοιχη αύξηση ή μείωση στη δραστηριότητα φθορισμού, η μεταβολή δεν είναι ανάλογη (δηλ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης αντισώματος δε διπλασιάζει την αντιδραστικότητα). Επιπρόσθετα, η ποσότητα ολικής IgA στον ορό του ασθενούς επηρεάζει το μετρούμενο MFI. Εάν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση του αυτοαντισώματος του ασθενούς, το δείγμα πρέπει να αναλύεται με ποσοτική δοκιμασία. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Το QUANTA Plex δοκιμή είναι πολύ ευαίσθητο στην τεχνική και είναι ικανό να ανιχνεύει μικρές διαφορές σε πληθυσμούς ασθενών. Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθιερώσει το δικό του εύρος φυσιολογικών τιμών με βάση τις δικές του τεχνικές, ορούς ελέγχου, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις εσωτερικές καθιερωμένες διαδικασίες του εργαστηρίου. Συνιστάται τα αποτελέσματα που δίνονται από το εργαστήριο να περιλαμβάνουν τη δήλωση: Τα ακόλουθα αποτελέσματα ελήφθησαν με χρήση του INOVA QUANTA Plex TM Celiac IgA Profile. Τιμές που λαμβάνονται με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών ενδέχεται να μην μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων αυτοαντισώματος IgG δεν μπορεί πάντοτε να συσχετίζεται με έναν τίτλο τελικού σημείου. Για να προσδιοριστεί εάν ο ασθενής έχει επαρκή ή ανεπαρκή ποσότητα IgA στον ορό, διαιρέστε την τιμή LU του κόμβου αντι-iga δια την τιμή LU του κόμβου IgA. Εάν το αποτέλεσμα είναι κάτω από 0.5 και ο ασθενής είναι αρνητικός τόσο για αντι-h-ttg όσο και για αντι-dgp, το δείγμα πρέπει να αναλυθεί εκ νέου για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα. Εάν επιβεβαιωθεί ότι ο ασθενής έχει ανεπαρκή ποσότητα IgA, το δείγμα πρέπει να φαίνεται αντίστοιχα στις δοκιμασίες IgG αντι-h-ttg και IgG αντι-dgp. Εάν απαιτείται επιβεβαίωση της ανεπάρκειας IgA, το δείγμα πρέπει να αναλυθεί εκ νέου με μια ποσοτική δοκιμασία IgA. Όρια της Διαδικασίας 1. H παρουσία άνοσων συμπλόκων ή άλλων συσσωρευμάτων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενούς μπορεί να προκαλέσει αυξημένο επίπεδο μη ειδικής δέσμευσης και να παράγει ψευδή θετικά στη συγκεκριμένη ανάλυση. 2. Δεν εμφανίζουν όλοι οι ασθενείς κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. θετικό αποτέλεσμα για αυτοαντισώματα h-ttg ή DGP IgA. 3. Tα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τα κλινικά ευρήματα και άλλες οροδιαγνωστικές δοκιμασίες. 4. H ατελής ανάμειξη των ορών ελέγχου ή/και των αραιωμένων δειγμάτων ορού με τους διατηρημένους κόμβους στην πλάκα μπορεί να δώσει υψηλότερες τιμές %C.V. από εκείνες που απαντώνται τυπικά σε αναλύσεις ELISA. 5. Μετά από την περίοδο επώασης μισής ώρας με το φθορίζον σύζευγμα, υπάρχει μια περίπου 10% περαιτέρω αύξηση στο φθορισμό για κάθε πρόσθετη μισή ώρα χρόνου επώασης. 6. Τα χαρακτηριστικά απόδοσης αυτής της ανάλυσης δεν έχουν τεκμηριωθεί για μήτρες διαφορετικές από ορό. 7. Η μη τήρηση ακρίβειας των χρόνων πρόσθεσης του αντιδραστηρίου μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη διακύμανση της ανάλυσης από εμπρός προς τα πίσω. Αναμενόμενες τιμές Η ικανότητα της δοκιμασίας QUANTA Plex TM Celiac IgA Profile δοκιμή να ανιχνεύει αντισώματα αντι-h-ttg και αντι-dgp αξιολογήθηκε σε σύγκριση με εμπορικά διαθέσιμες δοκιμασίες ELISA από την INOVA Diagnostics, Inc. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων ELISA και καθεμίας από τις δοκιμασίες QUANTA Plex Celiac IgA Profile, προσδιορίστηκαν ως θετικά εάν το δείγμα του ασθενούς ήταν μεγαλύτερο από ή ίσο με 20 Μονάδες Luminex ή Μονάδες ELISA και αρνητικό εάν ήταν χαμηλότερο από 20 LU ή EU. Εύρος φυσιολογικών τιμών Εκτελέστηκαν 278 δείγμα από υγιείς αιμοδότες με την εξέταση QUANTA Plex Celiac IgA Profile. 277 υγιή δείγματα, πλην ενός, (99.6%) ήταν αρνητικά στο σκέλος h-ttg της εξέτασης QUANTA Plex. Το υψηλότερο δείγμα έδωσε τιμή 29 LU. H μέση τιμή ήταν 3.2 LU με τυπική απόκλιση (SD) 1.5. Η τιμή αποκλεισμού είναι 11 SD υψηλότερη του μέσου όρου. Όλα εκτός από 3 από τα 278 φυσιολογικά δείγματα (98.9%) ήταν αρνητικά στο μέρος DGP της δοκιμασίας QUANTA Plex Celiac IgA Profile. Το υψηλότερο δείγμα είχε τιμή 88 LU. Το ίδιο πράγμα δείγματα ήταν επίσης θετικό με την ανάλυση DGP ELISA. Χωρίς να συμπεριλαμβάνεται το διπλό θετικό δείγμα, η τιμή μέσου όρου ήταν 4.4 LU με SD 5.8. Η τιμή αποκλεισμού είναι 2.7 SD υψηλότερη του μέσου όρου. Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση Για τον προσδιορισμό της κλινικής ευαισθησίας των αναλύσεων αυτοαντισωμάτων, 29 δείγματα από 6

7 ασθενείς με ενεργή κοιλιακή νόσο, οι οποίοι είχαν επαρκή IgA αναλύθηκαν με το QUANTA Plex Celiac IgA Profile και τις αντίστοιχες αναλύσεις ELISA. Η κλινική ευαισθησία για IgA αντι-h-ttg ήταν 93% (με 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης [CI] από 77-99%). Η κλινική ευαισθησία για IgA αντι-dgp ήταν 73% (95% CI από 53-92%). Για τον προσδιορισμό της κλινικής ειδικότητας, αναλύθηκαν 494 ασθενείς που δεν είχαν διαγνωστεί με κοιλιακή νόσο. Αυτή η ομάδα περιλάμβανε φυσιολογικούς δότες αίματος, καθώς και ασθενείς με ρευματικές, ηπατικές, γαστρεντερικές και μολυσματικές νόσους. Η κλινική ειδικότητα για αντι-h-ttg ήταν 98%, με 95% CI 96-99%. Η κλινική ειδικότητα του αντι-dgp ήταν επίσης 98% ([Cl] 96-99%). Κλινική Ευαισθησία και Ειδικότητα για τις δοκιμασίες IgA αντι-h-ttg και DGP στο Celiac IgA Pfofile Διάγνωση h-ttg IgA Θετικός (Κοιλιακή Νόσος [CD] με επαρκή IgA και χωρίς διατροφή ελεύθερη γλουτένης) Αρνητικός (Άτομα ελέγχου που δεν διαγνώστηκαν με Κοιλιακή Νόσο [CD]) Σύνολο Luminex Θετικός 27 11** 38 Αρνητικός 2* Σύνολο *Και τα δύο αυτά δείγματα ήταν αρνητικά με το ttg ELISA. ** Οι δέκα από αυτούς είναι θετικοί κοντά ELISA. Ευαισθησία: 27/(27+2)x100 = 93.1% ([Cl] 77-99%) Ειδίκευση: 483/(11+483)x100 = 97.8% ([Cl]96-99%) Διάγνωση DGP IgA Θετικός (Κοιλιακή Νόσος [CD] με επαρκή IgA και χωρίς διατροφή ελεύθερη γλουτένης) Αρνητικός (Άτομα ελέγχου που δεν διαγνώστηκαν με Κοιλιακή Νόσο [CD]) Σύνολο Luminex Θετικός 18 12** 30 Αρνητικός 11* Σύνολο * Τα δέκα από αυτά τα δείγματα είναι αρνητικά κοντά ELISA. ** Οι δέκα από αυτούς είναι θετικοί κοντά ELISA. Ευαισθησία: 18/(18+11)x100 = 62.1% ([Cl] 53-92%). Ειδίκευση: 482/(12+482)x100 = 97.6% ([Cl] 96-99%) Σύγκριση μεταξύ αναλύσεων QUANTA Plex και ELISA Η σχετική θετική, αρνητική και ολική ποσοστιαία συμφωνία (με 95% Διαστήματα Εμπιστοσύνης) των αναλύσεων αυτοαντισωμάτων QUANTA Plex σε σύγκριση με τις αναλύσεις ELISA υπολογίστηκαν για όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν και παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες. h-ttg IgA ELISA Θετικός Αρνητικός Σύνολο Luminex Θετικός Αρνητικός Σύνολο Ποσοστό συμφωνίας θετικών: 174/(174+21)x100 = 89.2% (84-93%) Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών: 757/(2+757)x100 = 99.7% (99-100%) Ποσοστό συμφωνίας σύνολο: ( )/( )x100 = 97.6% DGP IgA ELISA Θετικός Αρνητικός Σύνολο Luminex Θετικός Αρνητικός Σύνολο Ποσοστό συμφωνίας θετικών: 136/(136+31)x100 = 81.4% (75-87%) Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών: 783/(4+783)x100 = 99.5% (99-100%) Ποσοστό συμφωνίας σύνολο: ( )/( )x100 = 96.3% Ανίχνευση ανεπαρκούς ποσότητας IgA Οροί από 5 ασθενείς οι οποίοι ήταν γνωστό ότι είχαν επιλεκτική IgA ανεπάρκεια αναλύθηκαν με το Celiac IgA Profile, όπως και 949 άλλοι ασθενείς όπως περιγράφεται παραπάνω. Αυτοί οι 5 συν 21 επιπλέον ασθενείς έδωσαν λόγους αντι-iga LU/IgA LU κάτω από 0.5 και συνεπώς είχαν ανεπαρκή IgA για το Celiac IgA Profile. Ευαισθησία και Ειδικότητα για το λόγο αντι-iga LU/IgA στο QUANTA Plex Celiac IgA Profile Θετικός Έλεγχοι N=5 QUANTA Plex >0.5 QUANTA Plex <0.5 Κλινικές Ευαισθησία QUANTA Plex (95% CI) Όλοι Αρνητικός Έλεγχοι N=949 QUANTA Plex >0.5 QUANTA Plex <0.5 Κλινικές Ειδίκευση QUANTA Plex (95% CI) Anti-IgA/IgA % (82-100%)** Anti-IgA/IgA * 99% (98-100%)** *Με βάση τις οροδιαγνωστικές παραμέτρους, 12 από αυτά φάνηκε ότι ήταν ασθενείς με κοιλιακή νόσο με ανεπάρκεια IgA και 7 ήταν σε μεγάλο βαθμό αραιωμένα δείγματα ελέγχου ενώ 1 ήταν γνωστό ότι είχε χαμηλή ολική IgA ορού. Με βάση τη συχνότητα εμφάνισης 1 στα 500 IgA ανεπαρκής, 2 επιπλέον δείγματα θα ήταν αναμενόμενα ως θετικά. **Υπολογισμοί με βάση 18 αναμενόμενους ορούς με ανεπάρκεια. 7

8 Ακρίβεια και επαναληψιμότητα Διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων και εντός της ανάλυσης. Για τη διακύμανση εντός της ανάλυσης, 18 δείγματα αναλύθηκαν 10 φορές το καθένα με μία μοναδική ανάλυση. Η διακύμανση στα 3 έως 5 αντιπροσωπευτικά δείγματα για κάθε δοκιμασία παρατίθεται στον παρακάτω πίνακα. Για τη διακύμανση μεταξύ αναλύσεων, 20 αναλύθηκαν σε 6 δοκιμασίες οι οποίες εκτελέστηκαν σε 6 διαφορετικές ημέρες. Η διακύμανση στα 3 έως 5 αντιπροσωπευτικά δείγματα για κάθε δοκιμασία παρατίθεται στον παρακάτω πίνακα. Για τη διακύμανση εντός της ανάλυσης Για τη διακύμανση μεταξύ αναλύσεων Αντιγόνο Μέσος όρος % C.V. Αντιγόνο Μέσος όρος % C.V. LU LU h-ttg 22 6% h-ttg 23 9% h-ttg 23 7% h-ttg 26 8% h-ttg 31 7% h-ttg 31 8% h-ttg 89 9% h-ttg 102 3% h-ttg 255 4% h-ttg 263 3% DGP 17 12% DGP 19 4% DGP 22 8% DGP 23 11% DGP 25 8% DGP 26 5% DGP 59 4% DGP 65 9% DGP 38 8% DGP 44 9% anti-iga 5 5% anti-iga 5 8% anti-iga 11 4% anti-iga 11 5% anti-iga 20 2% anti-iga 20 5% IgA 27 5% IgA 28 4% IgA 10 4% IgA 10 5% IgA 21 2% IgA 23 4% 8

9 Βιβλιογραφία 1. Trier JS: Celiac Sprue: N Engl J Med 325: , Strober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestinal tract. J. Allergy Clin. Immunol. 78: , McMillan SA, Haughton DJ, Biggart JD, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: , Valdimarsson T, Franzen L, Grodzinsky E, et al.: Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science 41: 83-87, Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J, et al.: Revised criteria for diagnosis of celiac disease: Report of working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood 65: , Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al.: Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: , Sardy M, Odenthal U, Karpati S, et al.: Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of gluten-sensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, Sblattero D, Berti I, Trevisiol C, et al.: Human recombinant tissue transglutaminase ELISA : an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: , Osman AA, Gϋnnel T, Dietl A, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: , Aleanzi M, Demonte AM, Esper C, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidated gliadin peptides. Clin Chem 47: , Schwertz E, Kahlenberg F, Sack U, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clin Chem 50: , Prince HE: Evaluation of the INOVA Diagnostics enzyme-linked immunosorbent assay kits for measuring serum immunoglobulin G (IgG) and IgA to deamidated gliadin peptides. Clin Vaccine Immunol 13: , Sugai E, Vazquez H, Nachman F, et al.: Accuracy of testing for antibodies to synthetic gliadinrelated peptides in celiac disease. Clin Gastroenterol Hepatol 4: , Collin P, Maki M, Keyrilainen O, et al.: Selective IgA deficiency and celiac disease. Scand J Gastroenterol 27: , Cataldo F, Marino V, Ventura A, et al.: Prevalence and clinical features of selective immunoglobulin A deficiency in coeliac disease: an Italian multicentre study. Gut 42: , Fernandez E, Blanco C, Garcia S, et al.: Use of low concentrations of human IgA anti-tissue transglutaminase to rule out selective IgA deficiency in patients with suspected celiac disease. Clin Chem 51: , Dahlbom I, Olsson M, Forooz NK, et al.: Immunoglobulin G (IgG) anti-tissue transglutaminase antibodies used as markers for IgA-deficient celiac disease patients. Clin Diag Lab Immunol 12: , Chorzelski TP, Sulej J, Tcherzewska H, et al.: IgA class endomysium antibodies in dermatitis herpetiformis and celiac disease. Ann NY Acad Sci 420: , Martins TB, Burlingame R, von Mühlen CA, et al.: Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens. Clin Diagn Lab Immunol 11: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service July 2007 Revision GRC0 9