QUANTA Lite TM gp Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM gp Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM gp210 αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό του αντισώματος anti-gp210 της τάξης IgG στον ορό ανθρώπων. Αυτή η δοκιμασία προορίζεται για την υποβοήθηση της διάγνωσης πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση (PBC). Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση (PBC) είναι μια χρόνια νόσος του ήπατος που χαρακτηρίζεται από την αποδόμηση των μικρών ενδοηπατικών χοληφόρων. Η προοδευτική αποδόμηση των πόρων οδηγεί σε αυξανόμενη λειτουργική αδυναμία τους ήπατος, και με την πάροδο του χρόνου, μπορεί να προκαλέσει ηπατική ανεπάρκεια για την οποία είναι αναγκαία η μεταμόσχευση ήπατος. 1,2 Η αιτιολογία της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης παραμένει άγνωστη, αν και η γενετική προδιάθεση καθώς και άλλοι παράγοντες μπορεί να συμβάλλουν σημαντικά στην εξέλιξη της νόσου. 1,3,4 Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση εμφανίζεται συνήθως μεταξύ των ηλικιών 30 και 65 και επηρεάζει πιο συχνά τις γυναίκες από ό,τι τους άνδρες (εκτιμώμενος λόγος γυναικών/ανδρών = 9:1). 1,3 Ο επιπολασμός της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης σε συγγενείς πρώτου βαθμού πασχόντων από PBC κυμαίνεται μεταξύ 1.3 έως 6.4%. 3,5,6 Η PBC εμφανίζεται σε όλες τις φυλές και η κατανομή της είναι παγκόσμια. Έχουν αναφερθεί μεγάλες διαφορές στον γεωγραφικό επιπολασμό της PBC, από εκτιμήσεις 2 ανά στην Ιαπωνία και την Αυστραλία έως 40 ανά στις Η.Π.Α. 7,8 Οι ορολογικές αναλύσεις αποτελούν σημαντικά βοηθήματα για την αναγνώριση και τη διάγνωση PBC, καθώς πολλά αντισώματα που συσχετίζονται με την PBC είναι παρόντα στον ορό πριν από την εκδήλωση των συμπτωμάτων. 9 Τα αντιμιτοχονδριακά αντισώματα (AMA) που εντοπίζονται με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFA) είναι οι κλασικοί ορολογικοί δείκτες της PBC. Τα AMA εντοπίζονται σε ποσοστό 90-95% των πασχόντων από PBC. Ενώ το κλασικό μοτίβο IFA μπορεί να ερμηνευθεί εύκολα, η ερμηνεία είναι δύσκολη ιδιαίτερα όταν είναι παρόντα αντισώματα άλλων ειδικοτήτων. Οι πρωτεύοντες στόχοι της αντιδραστικότητας των AMA είναι οι πρωτεΐνες των σύμπλοκων 2-οξο οξικής δεϋδρογονάσης που βρίσκονται στη μιτοχονδριακή μεμβράνη. Οι αναλύσεις ELISA που στοχεύουν σε αυτές τις πρωτεΐνες είναι πιο ευαίσθητες από τη μέθοδο IFA για τον εντοπισμό AMA. 4,10,11 Ωστόσο, τουλάχιστον 5-10% των πασχόντων από PBC είναι αρνητικοί για AMA με τη μέθοδο IFA και ELISA. Η αποτυχία εντοπισμού των AMA ή άλλων δεικτών για PBC μπορεί να συμβάλλει στην καθυστερημένη διάγνωση της PBC και στο ενδεχόμενο περαιτέρω ζημιάς του ήπατος. Σχεδόν 50% των ορών που ελήφθησαν από πάσχοντες από PBC περιέχουν αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA). 12,13 Ένα ANA που συσχετίζεται συγκεκριμένα με την PBC είναι ένας πυρηνικός δακτύλιος/ μεμβρανική χρώση, χαρακτηριστικό της πρωτεΐνης gp210 της πυρηνικής μεμβράνης. 12,14 Αυτή η πρωτεΐνη ανήκει σε ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών που σχηματίζουν πόρους στην πυρηνική μεμβράνη. Τα αντισώματα anti-gp210 εντοπίζονται σε περίπου 25% των πασχόντων από PBC και σε 10-50% των πασχόντων από PBC που είναι αρνητικοί στην εξέταση AMA Αν και τα αντισώματα έναντι gp210 δεν είναι πολύ ευαίσθητα για τον εντοπισμό PBC, η ειδικότητα φαίνεται να είναι μεγαλύτερη από 99%. 12,15-17 Επιπλέον, τα αντισώματα έναντι gp210 μπορεί να προσδιορίσουν υποομάδα πασχόντων με πιο σοβαρή εξέλιξη της νόσου. 13,18-20 Η παρουσία αντισωμάτων έναντι gp210 μπορεί να ενισχύσει τη διάγνωση για PBC στις περιπτώσεις όπου η κλινική παρουσίαση μπορεί να είναι ασαφής. Η παρουσία αντισωμάτων AMA και gp210 μπορεί να προηγείται της ανάπτυξης συμπτωματικής νόσου. 9,20,21 Η δυνατότητα για πιο ακριβή και γρήγορο προσδιορισμό της PBC στους εξεταζόμενους επιτρέπει την παρακολούθηση και την έγκαιρη έναρξη της θεραπευτικής αγωγής, με συνεπακόλουθο την επιβράδυνση της πορείας της νόσου. Συχνά, ο εντοπισμός του μοτίβου πυρηνικού δακτυλίου που συσχετίζεται με τα αντισώματα anti-gp210 ερμηνεύεται δύσκολα ως αποτέλεσμα της συνυπάρχουσας χρώσης AMA ή ANA που μπορεί να είναι επίσης το αποτέλεσμα άλλων ειδικοτήτων εκτός gp ,22 Ο εντοπισμός anti-gp210 με την ανοσοτύπωση πρωτεϊνών (Western blot) είναι χρονοβόρα διαδικασία, απαιτητική από τεχνικής άποψης και στηρίζεται στην υποκειμενική ερμηνεία της έντασης της ζώνης. 15 Οι μοριακές μελέτες έχουν προσδιορίσει ένα επικρατές επίτοπο του gp210 στην καρβοξυτελική κυτταροπλασματική ουρά της πρωτεΐνης gp210 και αυτό επέτρεψε την ανάπτυξη αναλύσεων ELISA για τον εντοπισμό των αντισωμάτων έναντι gp ,17,22,23 Αρχη Μεθοδου Ένα κεκαθαρμένο πεπτίδιο που αντιστοιχεί σε τμήμα της πρωτεΐνης gp210 δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στις πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντισώματα gp210 να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. 1

2 Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με πεπτίδιο gp210 (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα gp210) 3. gp210 ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο gp210, προαραιωμένο, 1.2ml 4. gp210 ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο gp210, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HS HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος πορφυρός, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 2

3 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 gp210 ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος gp210 Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος gp210 High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HS HRP IgG Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας) 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 3

4 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HS HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm και αναφοράς 620 nm. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A2 toυnccls για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 25 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του gp210 ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του gp210 ELISA Low. Η τιμή του gp210 ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X gp210 oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. gp210 ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. 4

5 Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθισμού κ.λ.π. Τα δείγματα ερμηνεύονται ως αρνητικά (αρνητικά για το αντίσωμα IgG έναντι gp210), ισότιμα ή θετικά (εντοπίζεται αντίσωμα IgG έναντι gp210) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Αρνητικό Μονάδες Ισότιμο Μονάδες Θετικό 25 Μονάδες 1. Το θετικό αποτέλεσμα δηλώνει την παρουσία αντισωμάτων IgG έναντι gp210 και υποδηλώνει το ενδεχόμενο πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης. 2. Ένα δείγμα με ισότιμες συγκεντρώσεις IgG έναντι gp210 δεν μπορεί να αξιολογηθεί για την κατάσταση των αντισωμάτων. Αν τα αποτελέσματα παραμένουν ισότιμα μετά την επαναληπτική δοκιμασία, το αποτέλεσμα πρέπει να αναφερθεί ως ισότιμο ή/και πρέπει να ληφθεί πρόσθετο δείγμα. 3. Το αρνητικό δείγμα δηλώνει ότι δεν υπάρχει αντίσωμα IgG έναντι gp210 ή ότι υπάρχουν συγκεντρώσεις κάτω από το όριο εντοπισμού της ανάλυσης. 4. Τα δείγματα που παρέχουν μετρήσεις Ο.Α. πάνω από τις μετρήσιμες τιμές του φωτόμετρου μικροπλάκας μπορεί να αναφερθούν ως μεγαλύτερες από την υψηλότερη μετρήσιμη Ο.Α. δια της μικρότερης θετικής Ο.Α. επί 25 ή μπορούν να αραιωθούν, να εξεταστούν ξανά και να επιτευχθεί μια υπολογισμένη τιμή. 5. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM gp210 ELISA. Οι τιμές gp210 που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η εύρεση αρνητικού αποτελέσματος για gp210 δεν αποκλείει την παρουσία πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση. 2. Η εύρεση αρνητικού αποτελέσματος για αντισώματα έναντι gp210 δεν αποκλείει την παρουσία αντισωμάτων έναντι gp210, καθώς η συγκέντρωση αντισωμάτων μπορεί να είναι χαμηλότερη από το ανιχνεύσιμο όριο της ανάλυσης. 3. Το θετικό αποτέλεσμα της εξέτασης δηλώνει μόνο την παρουσία αντισωμάτων έναντι gp210 και όχι απαραίτητα την παρουσία πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση. 4. Για τη διάγνωση πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση είναι απαραίτητη η συγκέντρωση σχετικής τεκμηρίωσης για τον εξεταζόμενο, όπως τα δημογραφικά στοιχεία, η κλινική παρουσίαση και άλλοι διαγνωστικοί έλεγχοι. 5. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Ο επιπολασμός της PBC κυμαίνεται από 2 ανά 100,000 στην Ιαπωνία και στην Αυστραλία έως 40 ανά 100,000 στις Η.Π.Α. 7,8 Οι μελέτες που χρησιμοποιούν τη μέθοδο IFA, τη μέθοδο Western blot και διάφορες μεθόδους ELISA αναφέρουν ότι τα αντισώματα anti-gp210 εντοπίζονται σε περίπου 26% των πασχόντων από PBC. 15 Η ειδικότητα για την PBC αγγίζει το 100%. 12 Ευαισθησία και Ειδικότητα Τα αντισώματα gp210 σε ασυμπτωματικά, υγιή άτομα Εξετάστηκε ομάδα 236 ασυμπτωματικών, υγιών ατόμων για τον εντοπισμό αντισωμάτων έναντι gp210, χρησιμοποιώντας το QUANTA Lite TM gp210 ELISA. Τα στοιχεία για την ηλικία και το φύλλο ήταν διαθέσιμα για 188 δείγματα, το φύλο μόνο για 28 δείγματα ενώ για 20 δείγματα δεν υπήρξαν διαθέσιμα στοιχεία. Οι ηλικίες κυμαίνονταν μεταξύ ετών. Εξετάστηκαν 55 άνδρες και 78 γυναίκες. Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 100% (236/236). Η μέση τιμή για αυτόν τον πληθυσμό ήταν 3.7 μονάδες, η διάμεσος ήταν 3.4 μονάδες. Εξαιρουμένου ενός δείγματος με τιμή 16.5 μονάδων, οι τιμές για τα υπόλοιπα 235 δείγματα ήταν κάτω από 9.2 μονάδες. Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Στον Πίνακα 1 απεικονίζεται η συχνότητα εμφάνισης αντισωμάτων έναντι gp210, όπως ανιχνεύτηκε με το QUANTA Lite TM gp210 ELISA επί 343 δειγμάτων πασχόντων από PBC και 5 δειγμάτων πασχόντων από PBC/αυτοάνοση ηπατίτιδα (AIH). Η ανάλυση αξιοποίησε τα αποτελέσματα που βρέθηκαν με το QUANTA Lite TM gp210 ELISA για 3 κλινικές ομάδες. Η συνολική ευαισθησία της ανάλυσης ήταν 26.1% (91/348). Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 100%. Η θετική προβλεπόμενη τιμή ήταν 100% και η αρνητική προβλεπόμενη τιμή ήταν 62%. Η μέση και διάμεση τιμή για όλα τα δείγματα που δεν προέρχονταν από πάσχοντες από PBC ή PBC/AIH ήταν 3.59 και 3.71 αντιστοίχως. 5

6 Πίνακα 1: Ευαισθησία του QUANTA Lite TM gp210 ELISA QUANTA Lite TM gp210 ELISA Ομάδα ασθενών αρ= θετ ισοτ αρνητ PBC PBC/AIH Σύνολο Ευαισθησία: 26.1% (91/348) Εξετάστηκαν δείγματα ορών από 183 εξεταζόμενους που δεν έπασχαν από ηπατική νόσο PBC, αυτοάνοσο νόσημα και άλλες καταστάσεις. Χρησιμοποιήθηκε το QUANTA Lite TM gp210 ELISA για αξιολόγηση της ειδικότητας της ανάλυσης. Το QUANTA Lite TM gp210 ELISA ερμήνευσε τα δείγματα από εξεταζόμενους που δεν πάσχουν από PBC ή PBC/AIH ως θετικά, όπως απεικονίζεται στον Πίνακα 2. Συνεπώς, η συνολική ειδικότητα για την ανάλυση QUANTA Lite TM gp210, συμπεριλαμβανομένων υγιών ορών ελέγχου και ορών εξεταζόμενων που δεν πάσχουν από PBC, ήταν 100% (419/419). Πίνακας 2: Ειδικότητα του QUANTA Lite TM gp210 ELISA QUANTA Lite TM gp210 ELISA Ομάδα ασθενών αρ= θετ ισοτ αρνητ HBV HCV ΣΕΛ AIH AIH Ρευματοειδής αρθρίτιδα Πρωτοπαθής σκληρυντική χολαγγειίτιδα Σκληροδερμία Φυσιολογικοί Σύνολο Ειδικότητα (όλα τα δείγματα από εξεταζόμενους που δεν πάσχουν από PBC ή PBC/AIH) = 100% (419/419) Θετική προβλεπόμενη τιμή: 100% Αρνητική προβλεπόμενη τιμή: 62% Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε εξετάζοντας 10 δείγματα 6 φορές συνολικά. Πίνακας 3: Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM gp210 ELISA Specimens A B C D E F G H I J Mean unit SD CV % Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε ελέγχοντας εις διπλούν 5 δείγματα, δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες. Πίνακας 4: Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM gp210 ELISA Spec. A Spec. B Spec. C Spec. D Spec. E Mean units SD CV % Βιβλιογραφία 1. Kaplan, M. M. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 335: , Heathcote, E. J. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 31: , Talwalkar, J. A., Lindor, K. D. Primary biliary cirrhosis. Lancet 362: 53-61, Vergani, D., Bogdanos, D. P. Positive markers in AMA-negative PBC. Am J Gastroenterol 98: , Jones, D. E., Watt, F. E., Metcalf, J. V., Bassendine, M. F., James, O. F. Familial primary biliary cirrhosis reassessed: a geographically-based population study. J Hepatol 30: , Agarwal, K., Jones, D. E., Bassendine, M. F. Genetic susceptibility to primary biliary cirrhosis. Eur J Gastroenterol Hepatol 11: , Kim, W. R. et al. Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 119: , Feld, J. J., Heathcote, E. J. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 18: , Metcalf, J. V. et al. Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet 348: , Miyakawa, H. et al. Detection of antimitochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMAnegative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology 34: ,

7 11. Moteki, S. et al. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 24: , Worman, H. J., Courvalin, J. C. Antinuclear antibodies specific for primary biliary cirrhosis. Autoimmun Rev 2: , Muratori, P. et al. Characterization and clinical impact of antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol 98: , Fritzler, M. J., Manns, M. P. Anti-mitochondrial autoantibodies. Clin Appl Immunol Rev 3: , Miyachi, K. et al. Profile and clinical significance of anti-nuclear envelope antibodies found in patients with primary biliary cirrhosis: a multicenter study. J Autoimmun 20: , Bandin, O. et al. Specificity and sensitivity of gp210 autoantibodies detected using an enzyme-linked immunosorbent assay and a synthetic polypeptide in the diagnosis of primary biliary cirrhosis. Hepatology 23: , Nickowitz, R. E., Wozniak, R. W., Schaffner, F., Worman, H. J. Autoantibodies against integral membrane proteins of the nuclear envelope in patients with primary biliary cirrhosis. Gastroenterology 106: , Itoh, S. et al. Autoantibodies against a 210 kda glycoprotein of the nuclear pore complex as a prognostic marker in patients with primary biliary cirrhosis. J Gastroenterol Hepatol 13: , Invernizzi, P. et al. Autoantibodies against nuclear pore complexes are associated with more active and severe liver disease in primary biliary cirrhosis. J Hepatol 34: , Miyachi, K. et al. A male patient who developed late-onset primary biliary cirrhosis presenting with antinuclear envelope antibodies. Mod Rheumatol 12: , Prince, M., Chetwynd, A., Newman, W., Metcalf, J. V., James, O. F. Survival and symptom progression in a geographically based cohort of patients with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 123: , Shibata, M. et al. Detection of anti-gp210 antibodies in primary biliary cirrhosis by enzyme-linked immunosorbent assay with a synthesized polypeptide. Progress in Hepatology 5: , Tartakovsky, F., Worman, H. J. Detection of gp210 autoantibodies in primary biliary cirrhosis using a recombinant protein containing the predominant autoepitope. Hepatology 21: , Biosafety in Microbiologal and Biomedical Laboratories. CDC/NIH, Fourth Edition. (HHS Pub.#(CDC) ), National Committee for Clinical Laboratory Standards, Internal Quality Control: Principles and Definitions; Approved Guideline. NCCLS Document C24-A2 11(6): Summary of test procedure Before you begin: 1. Bring all reagents to room temperature (20-26 o C). 2. Dilute the HRP Wash Concentrate 1:40 by adding 975mL of distilled or deionized water to the concentrate. 3. Dilute the patient samples 1:101 with HRP Sample Diluent. Test Procedure: 1. Pipette 100μL of the Low Positive, High Positive, Negative and diluted patient samples into the wells. 2. Incubate at room temperature for 30 minutes. 3. Aspirate the contents of each well. Add μL of diluted wash concentrate and aspirate. Repeat two more times. 4. Add 100μL of Conjugate to each well. 5. Incubate at room temperature for 30 minutes. 6. Aspirate the contents of each well. Add μL of diluted wash concentrate and aspirate. Repeat two more times. 7. Add 100μL of TMB to each well. 8. Incubate the plate at room temperature, in the dark, for 30 minutes. 9. Add 100μL of Stop Solution to each well. 10. Read the plate at 450nm/620nm. Lo Lo HI HI - - P1 P1 P2 P2 7

8 Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service GRC October 2005 Revision 3 8