QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA (HumanTissue Transglutaminase) Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA (HumanTissue Transglutaminase) Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η ανοσοενζυμική μέθοδος QUANTA Lite TM h-ttg χρησιμοποιείται για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό αντισωμάτων IgG στον ιστό τρανσγλουταμινάσης (ενδομύϊο) στον ανθρώπινο ορό. Η ανίχνευση αυτών των αντισωμάτων, σε συνδυασμό με τα αντισώματα IgA βοηθούν στην διάγνωση συγκεκριμένων γλουτενών ευαίσθητων εντεροπαθειών, όπως η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. Αυτό το τεστ παρέχει επιπρόσθετη ευαισθησία όταν εξετάζονται ασθενείς με IgA ανεπάρκεια. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα, οι δύο αναγνωρισμένες μορφές της ευαίσθητης εντεροπάθειας γλουτένης (GSE), χαρακτηρίζονται από χρόνια φλεγμονή του εντερικού βλεννογόνου αδένα και ισοπέδωση του επιθηλίου ή θετικής λαχνωτής ατροφίας. 1,2 Μη-ανεκτικότητα στη γλουτένη, την πρωτεϊνη του σιταριού, της σίκαλης και του κριθαριού προκαλούν GSE. Οι ασθενείς με κοιλιοκάκη μπορεί να υποφέρουν από διάρροια, γαστρεντερικά προβλήματα, αναιμία, κόπωση, ψυχιατρικά προβλήματα, και άλλες διάφορες παρενέργειες ή μπορεί να είναι χωρίς συμπτώματα. 2 Η ερπητοειδής δερματίτιδα είναι μια δερματική ασθένεια που σχετίζεται με την GSE. Όλοι οι ασθενείς με GSE έχουν αυξημένο κίνδυνο για λέμφωμα. 3 Μια δίαιτα χωρίς γλουτένη ελέγχει τη GSE και τα σχετιζόμενα με αυτή προβλήματα. Γύρω στο 1950 η ανακάλυψη ότι η γλουτένη προκαλεί κοιλιοκάκη έκανε ικανή τη θεραπεία με την επιβολή των ασθενών σε δίαιτα χωρίς γλουτένη. Μετά την ανάπτυξη μιας μεθόδου, κατά την οποία γίνεται η λήψη μικρών βιοψιών του εντέρου, οι γιατροί μπόρεσαν να ελέγξουν για λαχνωτή ατροφία. Ενώ η θετική λαχνωτή ατροφία μπορεί να συμβεί σε άλλες διαταραχές, η GSE μπορεί να αποδειχθεί με το να ακολουθηθούν τα αρχικά κριτήρια της Ευρωπαϊκής Κοινότητας για Παιδιατρική Γαστρεντερολογία και Διατροφή (ESPGAN). Αυτά τα κριτήρια θέλουν περίπου ένα χρόνο αυστηρών μελετών για: α) μια αρχική θετική βιοψία του εντέρου, β) 6 μήνες με διατροφή χωρίς γλουτένη, γ) μια αρνητική δεύτερη βιοψία του εντέρου, δ) πρόκληση της γλουτένης για 6 μήνες, ε) μια θετική τρίτη βιοψία του εντέρου. Η ανάπτυξη των εξετάσεων του ορού για τρία διαφορετικά αντισώματα του ισότυπου IgA έκανε ικανή την παραγωγή πιο γρήγορων, διορθωμένων κριτηρίων ESPGAN για την κοιλιοκάκη, όπως αναφέρθηκε το Αυτές οι εξετάσεις περιλαμβάνουν ενδομυϊκά αντισώματα IgA (ΕΜΑ) 4, αντισώματα αντιγλιαδίνης IgA (AGA) και αντισώματα αντιρετικουλίνης R1 (ARA). Τα διορθωμένα κριτήρια ESPGAN θέλουν: α) μια και μοναδική θετική βιοψία του εντέρου και β) επίδειξη τουλάχιστον δύο από τις τρεις τάξεις των αντισωμάτων IgA, που αναφέρθηκαν πιο πάνω. Από τότε, διάφορες μελέτες έχουν επιδείξει ότι οι εξετάσεις IgA EMA έχουν ακρίβεια άνω του 99% για την GSE και μεγαλύτερη ευαισθησία από τις εξετάσεις ARA ή AGA Εφόσον το IgA ΕΜΑ εξαφανίζεται όταν οι ασθενείς με κοιλιοκάκη ή ερπητοειδή δερματίτιδα μένουν πιστοί σε μια διατροφή χωρίς γλουτένη, εξετάσεις για αυτά τα αντισώματα βοηθούν επίσης στον έλεγχο της προσκόλλησης των ασθενών στην δίαιτά τους 4,5,12. Πρόσφατα, το ενδομυϊκό αντιγόνο έχει αναγνωριστεί ως το πρωτεϊνικό ένζυμο διασταύρωσης-σύζευξης γνωστό ως τρανσγλουταμινάση ιστού (ttg) 14,15. Οι μέθοδοι ειδικού αντιγόνου ELISA που έχει ενσωματωμένο το ttg παρέχουν μια αξιόπιστη, αντικειμενική, εναλλακτική στις βασισμένες στον ανοσοφθορισμό παραδοσιακές μεθόδους λύσεις, ενσωματώνοντας τις λεπτές τομές οισοφάγου θηλαστικών ως υπόστρωμα. Η διαδικασία ELISA μπορεί να προσαρμοστεί και με μεγάλο και με μικρό αριθμό των δειγμάτων των ασθενών. Μέσα στα τελευταία δύο χρόνια το ανθρώπινο αντιγόνο ttg έχει παραχθεί με την ανασυνδυασμένη τεχνολογία. Το ανασυνδυασμένο ανθρώπινο αντιγόνο μπορεί να έχει ορισμένα πλεονεκτήματα σε συνδυασμό με το πιο παραδοσιακό ηπατικό αντιγόνο του ινδικού χοιριδίου. 16,17,20 Οι δύο πιο πρόσφατες εξελίξεις της κοιλιοκάκης ορολογικώς είναι η χρήση φυσικού ανθρώπινου ιστού τρανσγλουταμινάσης που απομονώνεται από τα ερυθρά αιμοσφαίρια και η χρήση των εξετάσεων που είναι ικανές να ανιχνεύουν την τρανσγλουταμινάση ιστού τάξεως IgG. Η χρήση, περισσότερο, των φυσικών ανθρώπινων ερυθρών αιμοσφαιρίων ttg παρά αυτών του ινδικού χοιριδίου ή του ανασυνδυασμένου παραγόμενου ανθρώπινου αντιγόνου έχει το πλεονέκτημα της ευκολίας στην καθαροτητα και των αποτελεσμάτων, που είναι ελεύθερα από στην προετοιμασία από βακτήρια, έντομα ή άλλες μολυσματικές πρωτεϊνες. 21,22,23,24 Οι μέθοδοι ELISA με το ανθρώπινο αντιγόνο ttg που παρουσιάζονται στην βιβλιογραφία φαίνονται να δουλεύουν καλά σε σύγκριση με τις πιο παραδοσιακές εξετάσεις που βασίζονται στο αντιγόνο του ινδικού χοιριδίου 16,17,20-23 Ένα κοινό πρόβλημα που συναντάται στις εξετάσεις των ασθενών για κοιλιοκάκη με ορολογικά μέσα είναι ότι δεν είναι ασυνήθιστο για τους ασθενείς με κοιλιοκάκη να έχουν έλλειψη του IgA. Αυτή η έλλειψη του IgA είναι ίσως ο μοναδικός μεγάλος συντελεστής σε ένα ψευδές αρνητικό ορολογικό αποτέλεσμα στην βιοψία των ασθενών με κοιλιοκάκη. 25 Προς αντιστάθμιση, πολλά εργαστήρια εκτελούν προσδιορισμούς IgG διαφόρων κοινώς εξεταζόντων για αντισώματα κοιλιοκάκης όπως η ρετικουλίνη και η γλιαδίνη. 25 Οι περισσότεροι ασθενείς με κοιλιοκάκη που έχουν έλλειψη IgA βρίσκονται ότι είναι θετικοί στην τάξη IgG της ρετικουλίνης και γλιαδίνης. 18 Διάφορες ομάδες έχουν κυκλοφορήσει για χρήση μια έκδοση του IgG για την ανάλυση ttg για να βελτιώσουν την έλλειψη του IgA στους ασθενείς. 17,18,20,21 Σε μια από αυτές τις μελέτες, η ευαισθησία της εξέτασης αυξήθηκε από το 91.5% για το αντίσωμα IgA μόνο του, στο 98.5% όταν λήφθηκαν υπόψιν και τα αποτελέσματα του IgA και τα αποτελέσματα του IgG. 18 1

2 Αρχη Μεθοδου Το κεκαθαρμένο φυσικό ανθρώπινο αντιγόνο h-ttg απομονώμένο από τα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι συνδεδεμένο στα πηγαδάκια της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας στα h-ttg IgG αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων ορών αναφοράς. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο h-ttg, (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς IgG ανθρώπινα αντισώματα h-ttg) 3. h-ttg IgG ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο IgG ανθρώπινο h-ttg, προαραιωμένο, 1.2ml 4. h-ttg IgG ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο IgG ανθρώπινο h-ttg, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Soulution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBsAg, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το HRP σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. 2

3 Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 h-ttg ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2mL αραιωμένος h-ttg IgG ELISA Low Χαμηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος h-ttg IgG ELISA High Υψηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm 3

4 Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 0.7 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από

5 δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυnccls για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του h-ttg IgG ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του h-ttg IgG ELISA Low. Η τιμή του h-ttg IgG ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X h-ttg IgG oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. h-ttg IgG ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί να χαρακτηρισθεί σάν αρνητικό,ασθενές θετικό, ισχυρώς θετικό. Αρνητικό Ασθενώς θετικό Ισχυρώς θετικό Μονάδες <20 μονάδες μονάδες >30 μονάδες 1. Ενα θετικό αποτέλεσμα δείχνει τη παρουσία h-ttg IgG αντισωμάτων καί την πιθανότητα εντεροπαθειας ευαίσθητη στη γλουτένη, όπως η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων h-ttg IgG ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA. Οι τιμές h-ttg IgG που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων ανοσοσφαίρινων συσσωρευμάτων στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο από μη-συγκεκριμένο δέσιμο και να παράγει ψεύτικα θετικά σε αυτή την ανάλυση. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα h-ttg IgG σε έναν ασθενή που δεν έχει κάνει θεραπεία δεν εξαίρει την εντεροπάθεια την ευαίσθητη στη γλουτένη. Ο ασθενής μπορεί να είναι IgA θετικός ή να μην έχει καθόλου αντίσωμα στο ttg. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα της μεθόδου QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA να ανιχνεύει αντισώματα IgG ιστού τρανσγλουταμινάσης αξιολογήθηκε σε σύγκριση με ένα άλλο τεστ ανίχνευσης για αντίσωμα IgG ttg, καθώς επίσης και με σύγκριση αποτελεσμάτων με πραγματικές κλινικές διαγνώσεις σε δύο εξωτερικές κλινικές αξιολογήσεις και μια εσωτερική μελέτη. Φυσιολογικές τιμές Η μελέτη του κανονικού πεδίου έγινε στο εργαστήριο μελέτης στην INOVA Diagnostics. Εξετάστηκαν ένας συνολικός αριθμός από 185 δείγματα. Εξετάστηκε ένας συνολικός αριθμός 102 ανδρών. Η ηλικία ποίκιλλε από 6-60 χρόνια με μια μέση ηλικία 34 χρόνων. Εξετάστηκε ένας συνολικός αριθμός 83 γυναικών, που ποίκιλλαν σε ηλικία από 7-63 χρόνια με μια μέση ηλικία 31 χρόνων. Όταν αυτά τα 185 δείγματα εξετάστηκαν με τη μέθοδο QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA kit, μόνο ένα δείγμα (0.5%) ήταν θετικό. Αυτό το ένα δείγμα έπεσε ακριβώς πάνω από την διακοπή στις 21 μονάδες. Εκτός από αυτό το ένα εβδομαδιαίο θετικό δείγμα, το επόμενο υψηλότερο αντιδραστικό δείγμα είχε τιμή 8 μονάδες. Η μέση τιμή για αυτή την ομάδα των κανονικών δειγμάτων ήταν 3.7 μονάδες. 5

6 Κλινική Ευαισθησία και Ακρίβεια Το QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA antibody kit αξιολογήθηκε εσωτερικά με κλινικά προσδιορισμένα δείγματα. Ο παρακάτω πίνακας συνοψίζει τα ευρήματα. Ομάδα Ασθενών Νο. Νο. Θετικών (%) Κανονικοί 185 1* (0.5%) Με κοιλιοκάκη (62.5%) Με κοιλιοκάκη (παιδιατρική) 11 1 (9%) Με κοιλιοκάκη ελλιπείς IgA 16 15** (94%) Με ελκώδη κολίτιδα 14 0 Με ασθένεια του Crohn 6 0 Με κακοήθη αναιμία 6 0 Με χρόνια ενεργή ηπατίτιδα 9 0 Θετικοί με αυτοαντισώματα συνδετικού ιστού 55 0 * Αυτό το ένα δείγμα ήταν ασθενώς θετικό στις 21 μονάδες ** Το ένα αρνητικό δείγμα ήταν από έναν ασθενή που έκανε διατροφή χωρίς γλουτένη. Το δείγμα επίσης ήταν αρνητικό ενδομυϊκά στο IgG. Μελέτη Aλληλεπίδρασης Για περαιτέρω εκτίμηση, εξετάστηκαν η ακρίβεια του QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA kit, ένα σύνολο από 90 ασθενείς με άλλα γαστρεντερικά προβλήματα, καθώς επίσης και ασθενείς με μια ποικιλία από ασθένεια υψηλής τιτλοποίησης συνδετικού ιστού που έχει σχέση με τα αυτοαντισώματα. Εξετάστηκε ένα σύνολο από 14 ορούς από ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα, 6 με ασθένεια του Crohn, 6 με κακοήθη αναιμία, 9 με χρόνια ενεργή ηπατίτιδα. Επίσης εξετάστηκε μια ομάδα από ορούς από μια συλλογή ορών που χρησιμοποιούνται για να κατασκευάσουν άλλα INOVA αυτοαντισώματα ELISA kits. Εξετάστηκε ένα σύνολο από 55 ορούς, συμπεριλαμβανομένων 8 θετικών για SS-A, 6 θετικών για SS-B, 9 θετικών για Sm, 11 θετικών για RNP, 13 θετικών για Scl-70 και 8 θετικών για Jo-1. Από αυτά τα 90 δείγματα, κανένα δεν ήταν θετικό για αντισώματα IgG στο ανθρώπινο ttg. Στην πραγματικότητα, κανένα δείγμα δεν παρήγαγε αποτέλεσμα υψηλότερο από 7 μονάδες εκτός από 1 σε ασθενή του Crohn, το οποίο ήταν 15 μονάδες, πιο χαμηλό, έτσι και αλλιώς, από τις 20 μονάδες της αποκοπής. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα της δοκιμασίας μετρήθηκε με την εξέταση έξι διπλών, ένα ισχυρώς θετικό, ασθενές θετικό και ένα αρνητικό δείγμα σε έξι ξεχωριστές αναλύσεις. Η μέση αντιδραστικότητα του ισχυρώς θετικού ήταν 85 μονάδες, του ασθενώς θετικού ήταν 25.0 μονάδες, ενώ η μέση τιμή για το αρνητικό ήταν Η κανονική απόκλιση και ο συντελεστής της αποκλισης για κάθε δείγμα συνοψίζονται παρακάτω. Αρνητικό Ισχυρώς Θετικό Ασθενώς Θετικό SD CV SD CV SD CV Ολικό % % % Κατά την διάρκεια της ανάλυσης % % % Μεταξύ των αναλύσεων % % % Βιβλιογραφία 1. Meuweisse GW. Diagnostic criteria in celiac disease. Acta Paediatr Scand 59: 461, Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J, Shmerling DH, Visakorpi JK. Revised criteria for diagnosis of celiac disease: Report of working group of Euorpean Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood 65: , Chorzelski TP, Beutner EH, Zalewski TK, et al. editors. Serologic diagnosis of celiac disease. Boca Raton (FL): CRC Press, Chorzelski TP, Sulej J, Tcherzewska H, et al. IgA class endomysium antibodies in dermatitis herpetiformis and celiac disease. Ann NY Acad Sci 420: , Volta U, Molinar N, De Franchis R, et al. Correlation between IgA antiendomysial antibodies and subtotal villous atrophy in dermatitis herpetiformis. J Clin Gastroenterol 14: , Valdimarsson T, Franzen L, Grodzinsky E, Skogh T, Strom M. Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science 41: 83-87, Unsworth FJ. Serologic diagnosis of gluten sensitive enteropathy. J Clin Path 49: , Volta U, Molinaro M, Fusconi M, Cassani F, Bianchi FB. IgA antiendomysial antibody test: A step forward in celiac disease screening. Digestive Diseases & Science 36: , Wilfang S, Knauss M, Stern M. IgA endomysiumantikorper. Montsschr Kinderkeilkd 140: , Muscart-Lemone F, Van den Broek J, Cadranel S, Colombel JF. Serologic aspects of celiac disease. Acta Gastro-Enterologica Belgica 55: , Grodzinsky E, Hed J, Skogh T. IgA antiendomysium antibodies have a high predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy 49: , Sategna-Guidetti C, Pulitano R, Grosso S, Ferfoglia G. Serum IgA antiendomysium antibody titers as a marker of intestinal involvement and diet compliance in adult celiac sprue. J Clin Gastroenterol 17: , Catassi C. Screening of coeliac disease. In: Maki M, Collin P, Visakorpi JK. editors. Coeliac disease. Tampere (Finland): Coeliac Disease Study Group; p ,

7 14. Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: , Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al. Autoantibodies in coeliac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: , Beutner EH, et al. A case of dermatitis herpetiformis with IgA endomysial antibodies but negative direct immunofluorescent findings. J Am Acad Dermatol 43: 329, Sardy M, et al. Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of glutensensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, Sblattero D, et al. Human recombinant tissue transglutaminase ELISA: an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, Sugai E, et al. Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: , Lampasona V, et al. Tissue transglutaminase and combined screening for coeliac disease and type 1 diabetes-associated autoantibodies. Lancet 352: , Hansson T, et al. Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, Andersson AS, et al. Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Axiö-Frekricksson UB, et al. Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Signorini M, et al. Human erythrocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, Collin P, Mäki M, et al. Selective IgA deficiency and Coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: 367, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service GRC October 2009 Revision 10 7