QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το κιτ QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό των μιτοχονδριακών αντισωμάτων, αντισωμάτων gp210 και sp100 της τάξης IgG και/ή IgA στον ορό ανθρώπων. Η παρουσία αντισωμάτων μιτοχονδρίων, gp210 και sp100 μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές δοκιμασίες για τη διάγνωση πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση (PBC) είναι μια χρόνια νόσος του ήπατος που χαρακτηρίζεται από την καταστροφή των μικρών ενδοηπατικών χοληφόρων. Η προοδευτική αποδόμηση των πόρων οδηγεί σε αυξανόμενη λειτουργική αδυναμία τους ήπατος, και με την πάροδο του χρόνου, μπορεί να προκαλέσει ηπατική ανεπάρκεια για την οποία είναι αναγκαία η μεταμόσχευση ήπατος. 1,2 Η αιτιολογία της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης παραμένει άγνωστη, αν και η γενετική προδιάθεση καθώς και άλλοι παράγοντες μπορεί να συμβάλλουν σημαντικά στην εξέλιξη της νόσου. 3,4 Η PBC εμφανίζεται συνήθως μεταξύ των ηλικιών 30 και 65 και επηρεάζει πιο συχνά τις γυναίκες από ό,τι τους άνδρες (εκτιμώμενος λόγος γυναικών/άνδρες = 9:1). 3,4 Η συχνότητα της PBC σε συγγενείς πρώτου βαθμού πασχόντων από PBC κυμαίνεται από 1.3 έως 6.4%. 4,5 Η PBC εμφανίζεται σε όλες τις φυλές και η κατανομή της είναι παγκόσμια. Έχουν αναφερθεί μεγάλες διαφορές στην γεωγραφική κατανομή της PBC, από εκτιμήσεις της τάξης του 2 ανά στην Ιαπωνία και την Αυστραλία έως 40 ανά στις Η.Π.Α. 3,6 Το οροδιαγνωστικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης είναι η παρουσία αντιμιτοχονδριακών αντισωμάτων (AMA) και μπορεί να εντοπιστεί στο 90-95% των πασχόντων από πρωτοπαθή χολική κίρρωση. Αντιμιτοχονδριακά αντισώματα εντοπίστηκαν σε ασυμπτωματικά άτομα με φυσιολογικά αποτελέσματα χημικών εξετάσεων ήπατος και φυσιολογική ιστολογία. Ορισμένα από αυτά τα άτομα εμφάνισαν PBC με την πάροδο του χρόνου. 7-9 Τα κύρια αυτοαντιγόνα που στοχεύονται από τα AMA, είναι οι υπομονάδες E2 του συμπλόκου πυροσταφυλική αφυδρογονάση (PDC-2E), του συμπλόκου 2-οξο-οξυ αφυδρογονάση διακλαδιζόμενης αλυσίδας (BCOADC-E2) και του συμπλόκου 2-οξο γλουταρική αφυδρογονάση (OGDC-E2). 10 Οι Gershwin και Leung ανέπτυξαν και κατοχύρωσαν με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έναν κλώνο υβριδίου τριπλής έκφρασης ( MIT3 ) ο οποίος εκφράζει τα ανοσοκυρίαρχα επίτοπα αυτών των τριών υπομονάδων. 11 Η αναλύσεις με βάση MIT3 καταδείχθηκε ότι έχουν βελτιωμένη απόδοση έναντι των συμβατικών αναλύσεων ELISA με βάση PDC-E2. 11,12 Επιπρόσθετα των AMA, περίπου 50-72% των ορών που ελήφθησαν από πάσχοντες από PBC περιέχουν αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA). Δύο μοτίβα ANA που συσχετίζονται συγκεκριμένα με την PBC είναι ένας πυρηνικός δακτύλιος/ μεμβρανική χρώση, χαρακτηριστικό της πρωτεΐνης gp210 της πυρηνικής μεμβράνης και ένα πολλαπλό μοτίβο χαρακτηριστικού πυρηνικής κουκκίδας (MND) της σχετιζόμενης πρωτεΐνης με το πυρηνικό σώμα sp100. Αντισώματα αντι-gp210 και αντι-sp100 βρέθηκαν σε περίπου 25% των πασχόντων από PBC και είναι πολύ ειδικά για το PBC. Επιπροσθέτως, αυτά τα αντισώματα εντοπίζονται στο 10-50% των AMA-αρνητικών πασχόντων από PBC και είναι τα μόνα αντισώματα ειδικά στην PBC που μπορούν να εντοπιστούν. Παρόλο που οι πιο συμβατικές αναλύσεις μπορούν να εντοπίσουν μόνο τα αντισώματα IgG AMA, τα IgA AMA βρίσκονται στον ορό, στη χολή, το σίελο και τα ούρα ατόμων με PBC. 13,14 Έχει προταθεί ότι αυτό το εκκριτικό αντι-pbc IgA μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στην παθογένεση της PBC. 14 Πάσχοντες με υποψία αυτοάνοσης ηπατικής νόσου, οι οποίοι δεν εμφανίζουν όλα τα τυπικά κριτήρια, μπορεί να παρουσιάζουν δυσκολία στην κλινική διάγνωση. Άτομα με AMA-αρνητική PBC εμπίπτουν σε αυτήν την ομάδα. Νέες αναλύσεις για τον εντοπισμό αντισωμάτων στα gp210, sp100, και AMA χρησιμοποιώντας το αντ πασχόντων από PBC χωρίς οροδιαγνωστικά ευρήματα PBC. Το QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA εντοπίζει αντισώματα στους ειδικούς δείκτες για την PBC, MIT3, sp100, και gp210. Το σύζευγμα διπλής ειδικότητας (IgG/IgA) προσφέρει αυξημένα ευαισθησία για τον εντοπισμό δειγμάτων τα οποία μπορεί να είναι ασθενή ή αρνητικά στην δοκιμασία με μονοειδικό σύζευγμα (μόνο IgG). Η συνδυασμένη δοκιμασία για αντισώματα IgG και IgA antibodies στα MIT3, gp210, και sp100 παρέχει ένα εργαλείο για τη δοκιμασία των ατόμων με υποψία PBC.ιγόνο βελτιωμένης ευαισθησίας MIT3, μείωσαν τον αριθμό των. Αρχη Μεθοδου Ένα μείγμα με κεκαθαρμένο από συγγένειες ανασυνδυασμένο αντιγόνο (MIT3) που περιέχει ανοσοκυρίαρχα μέρη PDC-E2, BCOADC-E2 και OGDC-E2, ένα κεκαθαρμένο τμήμα της πρωτεΐνης sp100 ένα κεκαθαρμένο τμήμα της πρωτεΐνης gp210, δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν τα αντιγόνα στην αμιγή τους κατάσταση. Προαραιωμένοι οροί ελέγχου και αραιωμένοι οροί ασθενούς προστίθενται σε ξεχωριστά πηγαδάκια, επιτρέποντας στα μιτοχονδριακά αντισώματα και τα αντισώματα sp100 ή gp210, να δεσμευθούν στο ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG/IgA αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG/IgA αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. 1

2 Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο PBC Screen (μείγμα κεκαθαρμένου) MIT3, sp100 και GP210 αντιγόνο s (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου (έτοιμο για χρήση) διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα PBC Screen αντιγόνο) 3. PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο PBC Screen, προαραιωμένο, (έτοιμο για χρήση) 1.2ml 4. PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο PBC Screen, προαραιωμένο, (έτοιμο για χρήση) 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP PBC Screen Conjugate IgG/IgA (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG/IgA, 1 φιαλίδιο άχρωμος, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 2

3 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 16 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 PBC Screen IgG/IgA ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2mL αραιωμένος PBC Screen IgG/IgA ELISA High Υψηλός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Χαμηλός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP PBC Screen IgG/IgA Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG/IgA (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. 3

4 Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Το PBC Screen IgG/IgA ELISA (Low Positive), το PBC Screen IgG/IgA ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) θα πρέπει να εξετάζονται με κάθε φορά για να επιβεβαιωθεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες γίνονται κανονικά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το PBC Screen IgG/IgA ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το PBC Screen IgG/IgA ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προαραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους < -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της εξέτασης, πρέπει να ισχύουν όλα τα παρακάτω κριτήρια. Εάν δεν ισχύει κάποιο από αυτά, το τεστ πρέπει να θεωρηθεί άκυρα και να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive, του οποίου η απορροφητικότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από αυτή του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control. β. Το προ-αραιωμένο PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive πρέπει να έχει O.A. μεγαλύτερο από 1.0, ενώ η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από το 0.2. γ. Η απορροφητικότητα του PBC Screen IgG/IgA ELISA Low Positive πρέπει να είναι δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή του ELISA Negative Control ή πάνω από δ. Το ELISA Negative Control και το PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. To PBC Screen IgG/IgA ELISA High Positive δεν θα επιβεβαιώσει την ακρίβεια στην αποκοπή της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να αναφέρεται στο CLSI (NCCLS) Document C24-A2 για επιπλέον οδηγίες. 17 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του PBC Screen IgG/IgA ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του PBC Screen IgG/IgA ELISA Low. Η τιμή του PBC Screen IgG/IgA ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. 4

5 Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X PBC Screen IgG/IgA oρού ελέγχου O.A. PBC Screen IgG/IgA ορού ελέγχου (μονάδες) Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η δοκιμασία ELISA είναι πολύ ευαίσθητη τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει τα δικά του όρια βασισμένα πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί στη συνέχεια να ταξινομηθεί ως αρνητικό (για αντίσωμα IgG σε PBC Screen IgG/IgA), αμφίβολο ή θετικό (ανιχνεύθηκε αντίσωμα IgG σε PBC Screen IgG/IgA) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Μονάδες Αρνητικό 20.0 Αμφίβολο Θετικό >25 Τα αμφίβολα δείγματα πρέπει να αναλύονται ξανά πριν την αναφορά των αποτελεσμάτων. 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα φανερώνει την παρουσία των αντισωμάτων τηςpbc Screen και προτείνει την πιθανότητα κακοήθους αναιμίας η σχετικής νόσου. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δηλώνει ότι δεν υπάρχουν αντισώματα για μιτοχόνδρια, gp210 και sp100 ή συγκεντρώσεις κάτω από την οριακή τιμή για αρνητικό δείγμα της ανάλυσης. 3. Τα δείγματα με θετικά αποτελέσματα μπορούν να δοκιμαστούν για την παρουσία ατομικών αντισωμάτων MIT3, gp210, και sp100 με αναλύσεις MIT3, gp210, και sp100 ειδικές για ELISA. 4. Ένα δείγμα με ισότιμες συγκεντρώσεις αντισωμάτων δεν μπορεί να αξιολογηθεί για την κατάσταση των αντισωμάτων. Συνίσταται να επαναληφθεί η δοκιμασία σε φρέσκο δείγμα ή αργότερα. 5. Συνιστάται τα αποτελέσματα που βγαίνουν από το εργαστήριο να περιλαμβάνουν την εξής δήλωση: «Τα παρακάτω αποτελέσματα αποκτήθηκαν με τη μέθοδο INOVA QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA. Οι τιμές PBC Screen που αποκτήθηκαν με διαφορετικές μεθόδους ανάλυσης του κατασκευαστή μπορεί να μην χρησιμοποιηθούν αμοιβαία. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων του IgG/IgA δεν μπορούν να συσχετιστούν με την τελευταία τιτλοποίηση.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων συσσωρευμάτων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο από μη-συγκεκριμένο δέσιμο και να παράγει ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση. 2. Δεν ήταν όλοι οι ασθενείς με κύρια χολική κίρρωση θετικοί για αντισώματα στα αντιγόνα που χρησιμοποιήθηκαν στο PBC screen. 3. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα για Γαστρικό Βρεγματικό Κυτταρικό Αντίσωμα δεν αποκλείει την ύπαρξη της κακοήθους αναιμίας. 4. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης δεν ισχύουν για άλλα καλούπια εκτός από ορό. Αναμενόμενες Τιμές Ευαισθησία και Ειδικότητα Εξετάστηκε ομάδα 520 ασυμπτωματικών, υγιών ατόμων που κατοικούν στις ΗΠΑ με το QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA. Η ηλικία και το φύλο ήταν διαθέσιμο για 307 δείγματα. Οι ηλικίες κυμαίνονταν μεταξύ ετών. Εξετάστηκαν 150 άνδρες και 157 γυναίκες. Η μέση τιμή γι αυτόν τον πληθυσμό ήταν 6.6 μονάδες, η διάμεσος ήταν 4.6 μονάδες. Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 98.1 % (510/520) για τα φυσιολογικά άτομα. Από τα 10 θετικά δείγματα, 7 έδειξαν αντιδραστικότητα με το M2 EP(MIT3) IgG ELISA και ένα δείγμα έδειξε αντιδραστικότητα όταν έγινε δοκιμή για αντισώματα M2 EP(MIT3) IgA. Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Κλινικές μελέτες Συνολικά 440 πάσχοντες από PBC και 769 μη πάσχοντες από PBC, στους οποίες συμπεριλαμβάνονταν 520 υγιή άτομα, αναλύθηκαν με το QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA για να αξιολογηθεί η ειδικότητα και η ευαισθησία της δοκιμής. Τα δείγματα με γνωστούς AMA-αρνητικούς πάσχοντες ή πάσχοντες από PBC με μη επιβεβαιωμένη υποψία πάθησης και πάσχοντες AIH, εξαιρέθηκαν. Η ομάδα PBC (440) συμπεριελάμβανε δείγματα από 426 άτομα καθορισμένα με PBC και 14 με επικάλυψη AIH/PBC. Η ομάδα μη PBC συμπεριελάμβανε δείγματα από 520 υγιή άτομα ελέγχου και δείγματα από άτομα με ιογενή ηπατίτιδα (HBV ή HCV) (149), PSC (48) και ηπατική νόσο μη PBC (23) και μολυσματικές ή άλλες αυτοάνοσες νόσους (29). Η μέση και διάμεση τιμή για την ομάδα μη PBC ήταν 8.1 και 5.3 μονάδες αντιστοίχως. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1 παρακάτω. 5

6 Πίνακας 1: Ευαισθησία και Ειδίκευση QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA N=1209 n θετικός διφορούμενος αρνητικός PBC Ομάδα Non PBC Ομάδα Ευαισθησία: 95.9% (422/440); 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI): 93.6% to 97.6% Ειδίκευση: 96.1% (739/769); 95% CI: 94.5% to 97.4% Γενική συμφωνία (τα ισότιμα αποτελέσματα θεωρούνται αρνητικά): 96.0% (1161/1209) Σύγκριση με ομοειδείς συσκευές Το QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA συγκρίθηκε με το ατομικό QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA, το QUANTA Lite TM gp210 ELISA, και το QUANTA Lite TM sp100 ELISAs. Συνολικά 1209 δείγματα (440 πάσχοντες από PBC, 249 μη πάσχοντες από PBC και 520 ασυμπτωματικά υγιή άτομα), αναλύθηκαν με το PBC Screen και το ατομικό QUANTA Lite MIT3, sp100, και gp210 ELISAs. Μεμονωμένος QUANTA Lite TM Δοκιμή N= 1209 θετικός Διφορούμενος* Aρνητικός θετικός QUANTA Lite TM PBC Διφορούμενος * Screen IgG/IgA ELISA Aρνητικός *Τα ισότιμα αποτελέσματα εξαιρούνται στην ανάλυση. Η θετική συμφωνία και η αρνητικά συμφωνία υπολογίστηκαν συγκρίνοντας τα αποτελέσματα του PBC Screen με τα αποτελέσματα των ατομικών αναλύσεων. θετικός συμφωνία (αποκλεισμός διφορούμενος) = 99.5% (437/439) Aρνητικός συμφωνία (αποκλεισμός διφορούμενος) = 98.9% (730/738) Γενική συμφωνία αποκλεισμός διφορούμενος): = 99.2% (1167/1177) Μελέτη Aληλεπίδρασης Οροί από 463 ασθενείς με ηπατική νόσο διαφορετική από PBC (213 AIH-1, 48 PSC, 10 AIH/PSC, 8 AIC, 9 κρυπτογενή ηπατίτιδα, 11 VBDS, 3 AIH-2, 11 αλκοολική πάθηση του ήπατος, 1 φαρμακογενής ηπατίτιδα, 71 HBV και 78 HCV) και 29 πάσχοντες με αυτοάνοση ή μολυσματική νόσο (7 H. pylori, 3 ASCA, 4 ANA, 3 ttg, 2 GPA, 2 GBM και 8 CMV) εξετάστηκαν με την QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA με σκοπό την αξιολόγηση της ειδικότητας της ανάλυσης. Από την αυτοάνοση/μολυσματική ομάδα πασχόντων (29 πάσχοντες) εντοπίστηκε μόνο ένα θετικό δείγμα CMV (34.4 μονάδες) στο PBC screen. Ο εν λόγω πάσχων είχε ασθενή πυρηνική και κυτοπλασμική χρώση σε IFA χωρίς όμως να είναι ειδική σε οποιοδήποτε από τα μοτίβα του αντιγόνου PBC. Στην ηπατική ομάδα μη PBC που αποτελούνταν από 463 πάσχοντες, 53 πάσχοντες ήταν θετικοί στο PBC screen. 42 από τους 53 θετικούς πάσχοντες έδειξαν κάποια αντιδραστικότητα σε μια ή περισσότερες από τις ατομικές δοκιμές, ενώ 9 πάσχοντες ήταν αρνητικοί για όλους τους δείκτες. Είναι πιθανό ότι και οι 53 θετικοί πάσχοντες από την ηπατική ομάδα μη PBC, μπορεί να είχαν κάποια μη διαγνωσμένη ή εξελισσόμενη νόσο επικάλυψης PBC. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε εξετάζοντας 7 δείγματα, τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ και τον αρνητικό ορό ελέγχου (NC) 5 φορές συνολικά. Πίνακας 2: Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA HPC NC A B C D E F G Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης % Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε ελέγχοντας εις διπλούν 8 δείγματα, τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ και τον αρνητικό ορό ελέγχου (NC) δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες. Πίνακας 3: Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA HPC NC A B C D E F G H Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης %

7 Βιβλιογραφία 1. Heathcote EJ. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 2000;31: Kaplan MM, Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 2005;353: Feld JJ, Heathcote EJ. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 2003;18: Talwalkar JA, Lindor KD. Primary biliary cirrhosis. Lancet 2003;362:53: Jones DE, Watt FE, Metcalf JV, Bassendine MF, James OF. Familial primary biliary cirrhosis reassessed; a geographically-based population study. J Hepatol 1999;30: Kim W.R. et.al Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology (2000) 119, Kisand KE, Metskula K, Kisand KV, Kivik T, Gershwin ME, Uibo R. The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 2001;36: Metcalf JV, Mitchison HC, Plamer JM, Jones DE, Bassendine MF, James OF. Natural history early primary biliary cirrhosis. Lancet 1996;348: Prince M, Chetwynd A, Newman W, Metcalf JV, James OF. Survival and symptom progression in a geographically based cohort with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 2002:123: Fussey SP, Guest JR, James OF, Bassendine MF, Yeaman SJ. Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Moteki S, Leung PS, Cappel RL, Dickson ER, Kaplan MM, Munoz S, Gershwin ME. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 1996;24: Miyakawa H, Tanaka A, Kikuchi K, Matsushita M, Kitazawa E, Kawaguchi N, Fujikawa H, et al. Detection of antimiochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMA-negative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantibodies autoantigens. Hepatology 2001;34: Milkiewicz P, Buwaneswaran H, Lee L, Coltescu C, Shums Z, Norman GL, Heathcote EJ. Value of "new" autoantibody testing in the differential diagnosis of autoimmune liver conditions. Hepatology 2005;42:292A. 14. Tanaka A, Nalbandian G, Leung PS, Benson GD, Munoz S, Findor JA, Branch AD, et al. Mucosal immunity and primary biliary cirrhosis: presence of antimitochondrial antibodies in urine. Hepatology 2000;32: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5), Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service GRC June 2009 Revision 1 7