QUANTA Lite LKM-1 ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite LKM-1 ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite LKM-1 είναι μία ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των αντισωμάτων LKM-1 στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων LKM-1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τα κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές δοκιμασίες στη διάγνωση της αυτοάνοσου ηπατίτιδας, τύπου 2. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η αυτοάνοσος ηπατίτιδα (AIH) είναι μία ετερογενής νόσος άγνωστης αιτιολογίας. 1 Η αυτοάνοσος ηπατίτιδα, τύπου 1 (λυκοειδής AIH) είναι ο συνηθέστερος τύπος AIH και χαρακτηρίζεται από αντιδραστικότητα σε αντιπυρηνικά αντιγόνα (ANA), αντιγόνα λείου μυός (SMA) και αντιγόνα ακτίνης. Η αυτοάνοσος ηπατίτιδα, τύ π ο υ 2 ( A I H -2) χαρακτηρίζεται από την παρουσία αντισωμάτων ηπατικών/νεφρικών μικροσωμάτων (LKM-1) ανιχνευόμενων σε τμήματα του νεφρικού και ηπατικού ιστού τρωκτικών μέσω έμμεσου ανοσοφθορισμού. Η αντιδραστικότητα LKM-1 χαρακτηρίζεται από τη χρώση του κυτοπλάσματος ηπατοκυττάρων και των εγγύς αλλά όχι των απώτερων νεφρικών σωληναρίων. Ασθενείς με νόσο AIH, τύπου 2a τείνουν να είναι νέες γυναίκες, βαριά πάσχουσες, με χαμηλά επίπεδα IgA, οι οποίες παρουσιάζουν καλή απόκριση σε ανοσοκατασταλτική θεραπεία και είναι αρνητικές στον ιό ηπατίτιδας C (HCV). 1,2 Το κύριο αντιγόνο-στόχος των αντισωμάτων LKM-1 έχει αναγνωριστεί ως κυτόχρωμα P450 2D6, μία μικροσωματική πρωτεΐνη που εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο. 3-6 Αντισώματα LKM-1 έχουν αναφερθεί σε ποσοστό έως 8% των ασθενών με χρόνια λοίμωξη HCV. 2,3,7-9 Οι επίτοποι που αναγνωρίζονται από ορούς ασθενών HCV είναι διαφορετικοί από εκείνους που αναγνωρίζονται από AIH-2 και μπορεί να είναι αυτοαντισώματα που παράγονται κατά τη διάρκεια της πορείας χρόνιας λοίμωξης HCV αντί για πραγματική AIH, τύπου 2. 6,7,10,11 Τυπικά, οι ασθενείς που είναι θετικοί τόσο για LKM-1 όσο και HCV είναι μεγαλύτερης ηλικίας, συχνότερα άνδρες και συνήθως παρουσιάζουν χαμηλότερα επίπεδα αντισώματος LKM-1 α π ό, τ ι α σ θ ε ν ε ί ς μ ε A I H -2a. 1,2 Ασθενείς που είναι θετικοί τόσο για HCV όσο και LKM-1 μπορεί να αποτελούν δύσκολη περίπτωση για τους θεράποντες ιατρούς καθώς οι θεραπευτικές αγωγές για HCV και AIH-2 διαφέρουν δραματικά. 9,11,12 Επιπρόσθετα στα αντισώματα LKM-1, έχουν αναγνωριστεί αντισώματα στο κυτόχρωμα P450 2C9 (LKM-2) σχετιζόμενα με ηπατίτιδα προκαλούμενη από τιενιλικό οξύ, και αντισώματα σε γλυκουρονοσυλτρανσφεράσες διφωσφορικής ουριδίνης (LKM-3) σχετιζόμενα με λοίμωξη ηπατίτιδας D. 3 Αντισώματα σε διαλυτό ηπατικό αντιγόνο (SLA) ή ηπατοπαγκρεατικό αντιγόνο (LP) έχουν αναφερθεί σε ορισμένους ασθενείς AIH οι οποίοι είναι αρνητικοί σε άλλα αυτοαντισώματα και μπορεί να περιγράφουν διαφορετική υποομάδα AIH. 1 Αρχη Μεθοδου Μερικώς καθαρό, πλήρους μήκους, αντιγόνο ανασυνδυασμένου ανθρώπινου κυτοχρώματος P450 2D6 έχει δεσμευτεί στα τοιχώματα μίας πλάκας μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου υπό συνθήκες που διατηρούν το αντιγόνο στην καθαρή του κατάσταση. Έτοιμοι μάρτυρες (control ) και αραιωμένος ορός ασθενούς προσθέτονται σε ξεχωριστά πηγαδάκια επιτρέποντας έτσι το όποιο αντι-lkm-1 αντίσωμα που υπάρχει να προσκολλήσει στο ακινητοποιημένο αντιγόνο κατά την πρώτη επώαση. Το υπόλοιπο του δείγματος ξεπλένεται και ένα ένζυμο από σεσημασμένο αντι-ανθρώπινο IgG (conjugate) αντίσωμα προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο να συνδεθεί με όποιο αντίσωμα του ασθενούς έχει προσκολληθεί στο υπόστρωμα του πηγαδιού. Με το δεύτερο ξέπλυμα των μη συνδεδεμένων συζυγών ενζύμων(conjugate), η υπόλοιπη ενζυματική δραστηριότητα μετράται με την πρόσθεση ενός χρωστικού διαλύματος (chromogen) μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσεται. Η επεξεργασία μπορεί να κριθεί με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια πρότυπων ορών ελέγχου (control). Αντ ι δ ρα σ τηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με μερικώς καθαρό, πλήρους μήκους, αντιγόνο ανασυνδυασμένου ανθρώπινου κυτοχρώματος P450 2D6 (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα κυτόχρωμα P450 2D6) 3. LKM-1 ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο κυτόχρωμα P450 2D6, προαραιωμένο, 1.2ml 4. LKM-1 ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο κυτόχρωμα P450 2D6, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 1

2 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsA g, H C V ό π ω ς ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μ ο λ ύ β δ ι ν ε ς ή χ ά λ κ ι ν ε ς σ ω λ η ν ώ σ ε ι ς μ ε αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2 8 ο C. 2

3 Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (NCCLS) Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 LKM-1 ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος LKM-1 ELISA Low Χαμηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος LKM-1 ELISA High Υψηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογία Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση ό λ ω ν τ ω ν διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θ α π ρ έ π ε ι ν α τ η ν κ λ ε ί σ ε τ ε κ α λ ά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 3

4 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 ο C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θ α π ρ έ π ε ι ε ί ν α ι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυ CLSI (NCCLS) για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του LKM-1 ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του LKM-1 ELISA Low. Η τιμή του LKM-1 ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X LKM-1 oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. LKM-1 ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανά λ υση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί στη συνέχεια να ταξινομηθεί ως αρνητικό, αμφίβολο ή θετικό σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Μονάδες Αρνητικό <20.0 Αμφίβολο θετικό >25 Τα αμφίβολα δείγματα πρέπει να αναλύονται ξανά πριν την αναφορά των αποτελεσμάτων. 4

5 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύει την παρουσία αντισωμάτων IgG σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο P450 2D6 και υποδηλώνει την πιθανότητα αυτοάνοσου ηπατίτιδας, τύπου Ένα δείγμα με αμφίβολα επίπεδα LKM-1 IgG δεν μπορεί να αξιολογηθεί για κατάσταση αντισωμάτων. Εάν τα αποτελέσματα παραμένουν αμφίβολα μετά από την επανάληψη της δοκιμασίας, το αποτέλεσμα πρέπει να αναφερθεί ως αμφίβολο ή/και να πραγματοποιηθεί επιπρόσθετη δειγματοληψία. 3. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων LKM-1 ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 4. Δ ε ί γ μ α τ α π ο υ δ ί ν ο υ ν τ ι μ έ ς O. A. πάνω από το αναγνώσιμο εύρος του συστήματος ανάγνωσης πλάκας μπορούν να αναφέρονται ως υψηλότερα από την υψηλότερη μετρήσιμη τιμή O.A. διαιρούμενη δια τη χαμηλή θετική τιμή O.A. επί 25 ή μπορούν να αραιωθούν, να αναλυθούν ξανά και να ληφθεί μία υπολογισμένη τιμή. 5. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite LKM-1 ELISA. Οι τιμές που προκύπτουν απο διαφορετικούς κ α τ α σ κ ε υ α σ τ έ ς δ έ ν ε ί ν α ι σ υ γ κ ρ ί σ ι μ ε ς. Ο ι τ ι μ έ ς δ έ ν μ π ο ρ ο ύ ν ν α σ υ σ χ ε τ ι σ θ ο ύ ν μ ε τ ό ν τ ε λ ι κ ό τ ί τ λ ο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα LKM-1 δεν αποκλείει την παρουσία αυτοάνοσου ηπατίτιδας, τύπου Ένα αρνητικό αποτέλεσμα αντισώματος LKM-1 δεν αποκλείει την παρουσία αντισωμάτων LKM-1, καθώς η συγκέντρωση αντισώματος ενδέχεται να είναι χαμηλότερη από το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης. 3. Ένα θετικό αποτέλεσμα δοκιμασίας υποδεικνύει μόνο την παρουσία αντισώματος σε ανθρώπινο ανασυνδυασμένο κυτόχρωμα P450 2D6 κ α ι δ ε ν υποδηλώνει απαραίτητα την παρουσία αυτοάνοσου ηπατίτιδας, τύπου Η διάγνωση της αυτοάνοσου ηπατίτιδας, τύπου 2 απαιτεί τη σωρευτική τεκμηρίωση των δημογραφικών στοιχείων, της κλινικής εικόνας και άλλων διαγνωστικών δοκιμασιών ενός ασθενούς. 5. Αντισώματα LKM-1 μπορεί να ανιχνευθούν σε μικρό αριθμό ασθενών ως αποτέλεσμα μόλυνσης HCV και μπορεί να μην προέρχονται από AIH-2. Δείγματα θετικά για LKM-1 πρέπει να εξετάζονται για μόλυνση HCV. 6. Τα αποτελέσματα της μεθόδου αυτής πρέπει να δίδονται σε συνδιασμό με τά κλινικά ευρήματα και τα ευρήματα από άλλες ορολογικές δοκιμασίες. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η εμφάνιση περιπτώσεων αυτοάνοσου ηπατίτιδας, τύπου 2 υπολογίζεται από 5 έως 30 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο. Η νόσος είναι συνηθέστερη στις ηλικίες 2-14 ετών και είναι συχνότερη σε κορίτσια παρά σε αγόρια (8:1). 14,15 Φυσιολογικές Τιμές Ένα σύνολο 194 δειγμάτων που συλλέχθηκαν από 151 ενήλικες και 43 παιδιά αναλύθηκαν με το κιτ QUANTA Lite LKM-1 ELISA. Ένα δείγμα ήταν οριακά αμφίβολο (20.7 μονάδες). Τα υπόλοιπα 193 δείγματα ερμηνεύτηκαν ως αρνητικά. Εξαιρουμένου του αμφίβολου δείγματος, η ειδικότητα ήταν 100% (193/193). Ο μέσος όρος για το συγκεκριμένο πληθυσμό ήταν 6.3 μονάδες, η διάμεση τιμή ήταν 5.7 μονάδες και η υψηλότερη τιμή ήταν 20.7 μονάδες. Το εύρος ηλικίας των ατόμων κυμάνθηκε από 1 έως 75 έτη. Ειδικά χαρακτηριστικά Κλινικές μελέτες Στην πρώτη μελέτη, ένα σύνολο 84 κλινικά καθορισμένων δειγμάτων συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν σε εξωτερική κλινική θέση. Οι λεπτομέρειες των δειγμάτων που αναλύθηκαν και τα αποτελέσματα της μελέτης συνοψίζονται στο Σχήμα 1. Η μέθοδος QUANTA Lite LKM-1 ELISA έδειξε 100% (22/22) ευαισθησία για δείγματα τα οποία ήταν θετικά για αυτοάνοσο ηπατίτιδα τύπου II, LKM-1 IFA θετικά και HCV αρνητικά. Χαμηλά επίπεδα αντιδραστικότητας LKM-1 παρατηρήθηκαν σε ασθενείς HCV θετικούς. Η μέθοδος QUANTA Lite LKM-1 ELISA βρήκε 70% (14/20) μίας επιλεγμένης ομάδας δειγμάτων LKM-1, IFA+/HCV+ να είναι QUANTA Lite LKM-1 ELISA θετικά. Η μέθοδος QUANTA Lite LKM-1 ELISA ήταν 100% ειδική (34/34) για 34 δείγματα τα οποία βρέθηκαν να είναι LKM-1, IFA θετικά, τα οποία όμως δεν ήταν κλινικά AIH-2 θετικά και δεν ήταν HCV θετικά. Επιπρόσθετα, 3 ασθενείς LKM-2 θετικοί και 5 ασθενείς LKM halothane θετικοί, βρέθηκαν QUANTA Lite LKM-1 ELISA αρνητικοί. Μία δεύτερη εξωτερική μελέτη εξέτασε ένα σύνολο 4 τεκμηριωμένων ασθενών AIH-2 (ηλικίας 2, 2, 4 1/2, και 6 ετών) και 41 άλλα δείγματα αυτοάνοσου και ηπατικής νόσου. Και τα 4 δείγματα AIH-2 ερμηνεύτηκαν ως θετικά. Τρία HCV θετικά δείγματα ήταν LKM-1 ELISA και IFA θετικά, ένα ήταν μόνο LKM ELISA θετικό. Βλ. "διασταυρούμενη αντιδραστικότητα" για άλλα δείγματα που αναλύθηκαν. 5

6 Σχήμα 1 QUANTA LITE LKM-1 ELISA Evaluation of Clinical Specimens 140 Μ Ο Ν Ά Δ Ε Σ LKM-1 Positive Autoimmune Hepatitis 2 positive HCV negative n=22 LKM-1 Positive - HCV positive n=20 LKM-1 Positive - NOT Autoimmune Hepatitis 2 - HCV negative n=34 LKM-2 Positive n=3 LKM- Halothane positive n=5 Η εσωτερική μελέτη ανέλυσε ένα συνδυασμένο σύνολο 79 δειγμάτων που συγκεντρώθηκαν από εργαστήρια αναφοράς και εσωτερικά αρχειοθετημένα δείγματα. Τα αποτελέσματα δοκιμασίας με τη μέθοδο QUANTA Lite LKM-1 ELISA και LKM-1 IFA συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Πίνακα 1: n=79 LKM-1 IFA θετικό Αμφίβολο Αρνητικό QUANTA LITE θετικό LKM-1 ELISA Αμφίβολο Αρνητικό Γενική συμφωνία = 91.5% (65/71) (εξαιρουμένων των αμφίβολων αποτελεσμάτων) Μελέτη διασταυρούμενης αντιδραστικότητας Δείγματα από διάφορες κλινικές ομάδες αξιολογήθηκαν για πιθανή διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τη μέθοδο QUANTA Lite LKM-1 ELISA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2: Μελέτη διασταυρούμενης αντιδραστικότητας Ομάδα ασθενών n= θετικό Αμ φ ίβ ο λ ο Αρνη τ ικ ό HCV * 40 5** 0 35 LKM LKM-halothane Διαλυτό ηπατικό αντιγόνο (SLA) Αυτοάνοσος ηπατίτιδα, τύπου Νόσος του Crohn Οξεία κολίτιδα Κίρρωση (μία αλκοολική, μία ακαθόριστη.) Κύρια χολική κίρρωση Κρυοσφαιριναιμία Μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα Μετα-αποφρακτική παγκρεατίτιδα Κοιλιακή νόσος Σκληροδερμία Νόσος του Addison (adreal pos.) Αντίσωμα κυττάρων νησιδίων (ICA) Αποκαρβοξυλάση γλουταμινικού οξέος (GAD) AMA SMA TPO Sm RNP SS-A SS-B Scl Jo Ριβόσωμα P Χρωματίνη PCNA ANA/DNA Κεντρόμερο * HCV θετικά δείγματα (μη επιλεγμένα για αντιδραστικότητα LKM-1 IFA) ** 4/5 είναι LKM-1 IFA θετικά 6

7 Ακρίβεια και Αναπαραγωγικότητα Η απόδοση κατά τη διάρκεια της ανάλυσης αξιολογήθηκε με δοκιμασία 6 δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένων ενός αρνητικού, αμφίβολου, οριακού θετικού, χαμηλού θετικού, μέτριου θετικού και υψηλού θετικού 12 φορές. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 3. Πίνακα 3 Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Δείγμα 6 Μέση τιμή S.D C.V.% Η απόδοση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε με δοκιμασία 10 δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένων αρνητικών, χαμηλών θετικών, μέτριων και υψηλών θετικών δειγμάτων για ένα σύνολο έξι φορών κατά τη διάρκεια τριών ημερών. Δύο εκτελέσεις ανά ημέρα, μία το πρωί και μία το απόγευμα. Τα αποτελέσματα, ό π ω ς συνοψίζονται στον Πίνακα 4, δείχνουν CV% κατά προσέγγιση 5% ή χαμηλότερο για όλα τα δείγματα με τιμές δοκιμασίας 5,5 ή υψηλότερες. Πίνακα 3 Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Δείγμα 6 Δείγμα 7 Δείγμα 8 Δείγμα 9 Δ ε ί γ μ α 1 0 Μέση τιμή S.D C.V.% Η διεργαστηριακή επαναληψιμότητα αξιολογήθηκε μέσω της σύγκρισης των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν στο τυφλό σύνολο 20 μελών στην εξωτερική κλινική θέση 2 με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν προηγουμένως στην INOVA Diagnostics. Η ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε εξαιρετική συμφωνία με μία τιμή R Γραμμικότητα Αραιώσεις 3 δειγμάτων έδειξαν ότι η ανάλυση παρουσίασε καλή γραμμικότητα όταν δοκιμάστηκε σε αραιώσεις 1:50 έως 1: (Σχήμα 2). Σχήμα 2 LINEARITY ASSAY QUANTA LITE TM LKM-1 ELISA y = x R 2 = Units :50 1:100 1:200 1:1600 1:800 1:400 y = x R 2 = y = x R 2 = Διάλυση 7

8 Βιβλιογραφία 1. McFarlane IG. The Relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune hepatitis. Gut 42: , Manns MP. Liver/kidney microsomal autoantigens. In: Autoantibodies, eds: Peter JB and Shoenfeld Y. Elsevier. pp , Manns MP and Obermayer-Straub P. Cytochromes P450 and uridine triphosphate-glucoronosyltransferases: model autoantigens to study drug-induced, virus-induced, and autoimmune liver disease. Hepatology 26(4): , Zanger UM, Hauri HP,Loeper J, Homberg JC and Meyer UA. Antibodies against human cytochrome P450 dbl in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: , Manns MP, Johnson EF, Griffin KJ, Tan EM and Sullivan KF. Major antigen of liver kidney microsomal autoantibodies in idiopathic autoimmune hepatitis is cytochrome P450 dbl. J. Clin. Invest. 83: , Gueguen M, Yamamoto AM, Bernhard O and Alvarez F. Anti-liver-kidney microsome antibody type 1 recognizes human cytochrome P450 dbl. Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: , Miyakawa H, Kitazawa E, Abe K, Kawaguchi N, Fuzikawa H, Kikuchi K, Kako M, Komatsu T, Hayashi N and Kiyosawa K. Chronic hepatitis C associated with anti-liver/kidney microsome-1 antibody is not a subgroup of autoimmune hepatitis. J. Gastroenterol. 32(6): , Clifford BD, Donahue D, Smith S, Cable E, Luettig B and Manns MP. High prevalence of serological markers of autoimmunity in patient with chronic hepatitis C. Hepatology 231: , Gregorio GV, Pensati P, Iorio R, Vegnente A, Mieli-Vergani G and Vergani D. Autoantibody prevalence in children with liver disease due to chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Clin. Exp. Immunol. 112(3): 471-6, Declos-Valee JC, Hajoui O, Yamamoto AM, Jacqz-Aigrin E and Alvarez F. Conformational epitopes on CYP2D6 are recognized by liver/kidney microsomal antibodies. Gastroenterology 108: , Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H and Manns MP. Epitope mapping of cytochrome P450 2D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alpha-interferon treatment. J. Hepatol. 30(3): , Todros L, Saracco G, Durazzo M, Abate ML, Touscoz G, Scaglione L, Verme G and M Tissetto. Efficacy and safety of interferon alfa therapy in chronic hepatitis C with autoantibodies to liver-kidney microsomes. Hepatology 22: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 14. Beaune P, Pessayre D, Dansette P, Mansuy D and Manns MP. Autoantibodies against cytochromes P450: a role in human diseases. Adv. Pharmacol. 30: , Homberg JC, Abuaf N, Bernard O, Islam S, Alvarez F, Khalil SH, Poupon R, Darnis F, Levy VG, Grippon P, et al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney microsome antibody type 1: a second type of autoimmune hepatitis. Hepatology 7(6): , Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: GRC March 2012 Revision 9 QUANTA Lite και INOVA Diagnostics είναι σήματα κατατεθέντα Copyright 2012 All Rights Reserved 8