EPO. For use on IMMULITE 2000 systems

Transcript

1 EPO For use on IMMULITE 2000 systems

2 IMMULITE 2000 EPO English Intended Use: For in vitro diagnostic use with the IMMULITE 2000 Systems Analyzers for the quantitative measurement of erythropoietin (EPO) in serum or heparinized plasma, as an aid in the diagnosis of anemias and polycythemias. Catalog Number: L2KEP2 (200 tests), L2KEP6 (600 tests) Test Code: EPO Color: Light Green Summary and Explanation Erythropoietin (EPO) is a glycoprotein hormone consisting of 165 amino acids, with four complex carbohydrate chains attached to the peptide at four linkage sites. 1 It has a molecular weight of 36,000 daltons, 40% of this attributed to the carbohydrate chains. EPO is the primary regulator of erythropoiesis, stimulating the proliferation and differentiation of erythroid precursor cells in bone marrow. In mammals, the fetal liver produces nearly all of the hormone; in adults, hepatic production drops to under 10% and renal secretion accounts for over 90%. 2,3 The production site is believed to be the proximal renal tubular cells or the peritubular capillary endothelial cells of the renal cortex and outer medulla. The clearance of circulating EPO has not been fully explained, but it is accomplished, in small part, by urinary excretion, and possibly also by hepatic elimination and by uptake into target cells in bone marrow. EPO adjusts red blood cell production to meet the tissue oxygen demand. 1 It exerts its effect in a complex feedback system, in which renal secretion of the hormone is controlled by an oxygen sensor in the kidney that responds to the partial pressure of oxygen in blood. Under conditions of increased peripheral oxygen, EPO levels diminish. This is seen after correction of hypoxia in healthy subjects (as in descent from a high elevation) and after hypertransfusion. Anemias may be divided into two categories with respect to EPO levels in blood: those that are primary to EPO levels and those that are secondary. Primary anemias are characterized by an increase of EPO in the blood to attempt to restore red blood cell production levels to normal. Examples of anemias in which EPO levels are elevated include iron deficiency anemia, reduction of blood flow to the kidney (as in blood loss) and hemoglobinopathies with increased affinity of hemoglobin for oxygen. 1 The EPO production rate is seen to increase exponentially with the decrease in available oxygen and with falling hematocrit in nonrenal anemias; in the latter, EPO levels 1,000 times normal have been reported. 2 Anemia can be secondary to inflammation, rheumatoid arthritis, neoplasm, and chronic renal disease. The "secondary anemias" may, however, be at least partly attributable to underproduction of EPO. 4 A failure to produce sufficient EPO accounts for the moderate to severe anemias observed in end-stage renal disease. Decreased EPO production is attributed to destruction of renal production sites; the renal oxygen sensor may also be affected. Levels of the hormone slightly exceed the reference range at most, and are inadequate to counter the blood loss due to dialysis, shortened red blood cell life, iron and folate deficiency, impaired iron transfer to erythyroid progenitor cells, and other challenges faced by such patients. Anephric patients demonstrate especially low EPO levels. A few patients with chronic kidney failure, however, exhibit normal hematocrits or less serious anemia, and elevated EPO. Some of these patients have cystic kidneys or viral hepatitis; in the latter, increased EPO may have resulted from enhanced hepatic production. Overproduction of red blood cells is called polycythemia. Polycythemias may also be divided into two categories depending on whether the condition is primary or secondary to EPO levels. In polycythemia vera, EPO levels are diminished, and erythropoiesis is primary to and independent of stimulation by EPO. Variation in EPO values can be as much 2 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, )

3 as tenfold for different patients with the same hematocrit. Certain other conditions may be characterized by the loss of feedback control of oxygen concentration over EPO production, causing an increase in EPO levels. 3 These include renal cell carcinomas, in which 2 percent of patients demonstrate erythrocytosis, and some benign renal lesions, such as single or multiple renal cysts, renal artery stenosis and microvascular abnormalities. In addition, approximately 10 percent of renal transplant patients develop erythrocytosis, sometimes from autologous diseased kidney. Secondary polycythemia is characterized by elevated EPO levels which lead to increased red blood cell mass. This condition may result from a variety of factors, including defective hemoglobin, smoking, pulmonary fibrosis, cardiac disease, tumors, and kidney stones. 5 When assaying EPO for the differential diagnosis of polycythemias, the possible overlap of values for secondary erythrocytosis or for polycythemia vera with those in the reference range must be considered. 3 Principle of the Procedure IMMULITE 2000 EPO is a solid-phase, chemiluminescent immunometric assay. Incubation Cycles: 2 30 minutes. Specimen Collection There are several reports of diurnal variation of erythropoietin in literature references. 7-9 It is important to collect samples at a consistent time of day. Morning samples taken between 7:30 am and 12:00 noon have been recommended. A variation in values may occur if the sample is not clotted at room temperature (15 28 C). Because EDTA would have a significant effect on results, it should not be used as an anticoagulant. The use of an ultracentrifuge is recommended to clear lipemic samples. Hemolyzed or grossly contaminated samples may give erroneous results. Centrifuging serum samples before a complete clot forms may result in the presence of fibrin. To prevent erroneous results due to the presence of fibrin, ensure that complete clot formation has taken place prior to centrifugation of samples. Some samples, particularly those from patients receiving anticoagulant therapy, may require increased clotting time. Blood collection tubes from different manufacturers may yield differing values, depending on materials and additives, including gel or physical barriers, clot activators and/or anticoagulants. IMMULITE 2000 EPO has not been tested with all possible variations of tube types. Consult the section on Alternate Sample Types for details on tubes that have been tested. Volume Required: 100 µl serum or heparinized plasma. Storage: 7 days at 2 8 C or 2 months at 20 C. Avoid repeated freeze/thaw cycles. Warnings and Precautions For in vitro diagnostic use. Reagents: Store at 2 8 C. Dispose of in accordance with applicable laws. Follow universal precautions, and handle all components as if capable of transmitting infectious agents. Source materials derived from human blood were tested and found nonreactive for syphilis; for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis B surface antigen; and for antibodies to hepatitis C. Sodium azide, at concentrations less than 0.1 g/dl, has been added as a preservative. On disposal, flush with large volumes of water to prevent the buildup of potentially explosive metal azides in lead and copper plumbing. Chemiluminescent Substrate: Avoid contamination and exposure to direct sunlight. (See insert.) Water: Use distilled or deionized water. Materials Supplied Components are a matched set. Labels on the inside box are needed for the assay. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, ) 3

4 EPO Bead Pack (L2EP12) With barcode. 200 beads, coated with anti-ligand derived from streptavidin. Stable at 2 8 C until expiration date. L2KEP2: 1 pack. L2KEP6: 3 packs. EPO Reagent Wedge (L2EPA2) With barcode ml ligand-labeled murine monoclonal anti-epo antibody, with preservative ml alkaline phosphatase (bovine calf intestine) conjugated to goat polyclonal anti-epo antibody, in buffer, with preservative. Stable at 2 8 C until expiration date. L2KEP2: 1 wedge. L2KEP6: 3 wedges. Before use, tear off the top of the label at the perforations, without damaging the barcode. Remove the foil seal from the top of wedge; snap the sliding cover down into the ramps on the reagent lid. EPO Adjustors (LEPL, LEPH) Two vials (Low and High) containing lyophilized human recombinant EPO in a nonhuman serum matrix, with preservative. At least 30 minutes before use: Reconstitute each vial with 4.0 ml distilled or deionized water. Mix by gentle swirling or inversion until the lyophilized material is fully dissolved. Stable at 2 8 C for 30 days after reconstitution, or for 6 months (aliquotted) at 20 C. L2KEP2: 1 set. L2KEP6: 2 sets. Before making an adjustment, place the appropriate Aliquot Labels (supplied with the kit) on test tubes so that the barcodes can be read by the on-board reader. Kit Components Supplied Separately Multi-Diluent 2 (L2M2Z, L2M2Z4) For the on-board dilution of patient samples. One vial, concentrated (ready-touse), nonhuman protein/buffer matrix, with preservative. Storage: 30 days (after opening) at 2 8 C or 6 months (aliquotted) at 20 C. L2M2Z: 25 ml L2M2Z4: 55 ml Barcode labels are provided for use with the diluent. Before use, place an appropriate label on a mm test tube, so that the barcodes can be read by the on-board reader. L2M2Z: 3 labels. L2M2Z4: 5 labels. L2SUBM: Chemiluminescent Substrate L2PWSM: Probe Wash L2KPM: Probe Cleaning Kit LRXT: Reaction Tubes (disposable) L2ZT: 250 Sample Diluent Test Tubes ( mm) L2ZC: 250 Sample Diluent Tube Caps LEPCM: Tri-level EPO Control Module Also Required Distilled or deionized water; test tubes; controls. Assay Procedure Note that for optimal performance, it is important to perform all routine maintenance procedures as defined in the IMMULITE 2000 Systems Operator's Manual. See the IMMULITE 2000 Systems Operator's Manual for: preparation, setup, dilutions, adjustment, assay and quality control procedures. Recommended Adjustment Interval: 2 weeks. Quality Control Samples: Use controls or sample pools with at least two levels (low and high) of EPO. Expected Values A study performed with IMMULITE 2000 EPO on 167 apparently healthy laboratory volunteers yielded a median of 10.2 miu/ml, a 95th percentile of 19.6 miu/ml and an absolute range of 3.7 to 31.5 miu/ml. Caution should be exercised in interpreting the EPO results for patients with diseases other than anemia. In patients with erythrocytosis due to uncompensated hypoxia, serum immunoreactive EPO is elevated; in those with compensated hypoxia, the serum immunoreactive EPO level is usually within the range of normal, and in patients with polycythemia vera, serum immunoreactive EPO is either normal or low. Thus, while an elevated serum EPO level suggests that erythrocytosis is a secondary phenomenon and a low EPO level supports the possibility of autonomous erythropoiesis, a normal serum EPO level excludes neither hypoxia nor autonomous EPO production as the cause of erythrocytosis. 4 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, )

5 Consider these limits as guidelines only. Each laboratory should establish its own reference ranges. Limitations Variations in EPO results have been seen in the presence of anti-species antibodies. No drugs have been tested for assay interference. The results of this assay should be used in conjunction with information available from clinical evaluations and other diagnostic procedures. Because results obtained with any EPO assay may differ significantly from any other, it is recommended that any serial testing performed on the same patient over time should be performed with the same EPO test. Lower EPO levels than expected have been seen with anemias associated with the following conditions: rheumatoid arthritis, acquired immunodeficiency syndrome, cancer, ulcerative colitis, sickle cell disease, and in premature neonates. After allogeneic bone marrow transplant, impaired erythropoietin response may delay erythropoietin recovery. Patients with hypergammaglobulinemia associated with multiple myeloma or Waldenstrom's disease have impaired production of erythropoietin in relation to hemoglobin concentration, and this has been linked to increased plasma viscosity. EPO levels of persons living at high altitudes with erythrocytosis may rapidly fall to normal after returning to low altitudes. EDTA plasma should not be used as a sample type. (See Alternate Sample Type section). Heterophilic antibodies in human serum can react with the immunoglobulins included in the assay components causing interference with in vitro immunoassays. [See Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem 1988:34:27-33.] Samples from patients routinely exposed to animals or animal serum products can demonstrate this type of interference potentially causing an anomalous result. These reagents have been formulated to minimize the risk of interference; however, potential interactions between rare sera and test components can occur. For diagnostic purposes, the results obtained from this assay should always be used in combination with the clinical examination, patient medical history, and other findings. Performance Data See Tables and Graphs for data representative of the assay's performance. Results are expressed in miu/ml. Calibration Range: Up to 200 miu/ml (WHO 2nd IRP 67/343). Analytical Sensitivity: 1.0 miu/ml High-dose Hook Effect: None up to >100,000 miu/ml. Precision: Samples were assayed in duplicate over the course of 20 days, two runs per day, for a total of 40 runs and 80 replicates. (See "Precision" table.) Linearity: Samples were assayed under various dilutions. (See "Linearity" table for representative data.) Recovery: Samples spiked 1 to 19 with three EPO solutions (25, 50 and 75 miu/ml) were assayed. (See "Recovery" table for representative data.) Specificity: The assay is highly specific for EPO. (See "Specificity" table). Bilirubin: Presence of conjugated and unconjugated bilirubin in concentrations up to 200 mg/l has no effect on results, within the precision of the assay. Hemolysis: Presence of hemoglobin in concentrations up to 512 mg/dl may cause a slight depression of values. (See "Hemolysis" table). Lipemia: Presence of triglycerides in concentrations up to 3,000 mg/dl has no effect on results, within the precision of the assay. Alternate Sample Type: To determine if samples other than serum samples are suitable for analysis in the IMMULITE 2000 EPO procedure, blood was collected from 22 volunteers into plain, heparinized, EDTA and Becton Dickinson SST vacutainer tubes. Some of the matched sample types were supplemented with EPO in order to obtain results throughout the calibration range of the assay. All samples were analyzed by IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, ) 5

6 the IMMULITE 2000 EPO procedure, with the following results: (Heparin) = 1.02 (Serum) 0.7 miu/ml r = (EDTA) = 0.61 (Serum) 1.1 miu/ml r = (SST ) = 0.97 (Serum) miu/ml r = Means: 81.5 miu/ml (Serum) 82.6 miu/ml (Heparin) 48.7 miu/ml (EDTA) 79.6 miu/ml (SST ) Because EDTA would have a significant effect on results, it should not be used as an anticoagulant. Method Comparison: The assay was compared to IMMULITE EPO on 160 samples. (Concentration range: approximately up to 200 miu/ml. See graph.) By linear regression: (IML 2000) = 1.02 (IML) miu/ml r = Means: 34.3 miu/ml (IMMULITE 2000) 33.4 miu/ml (IMMULITE) References 1) Eckardt KU, Bauer C. Erythropoietin in health and disease. Europ J Clin Invest 1989;19: ) Eschbach J, Adamson J. Recombinant human erythropoietin: implications for nephrology. Am J Kidney Dis 1988;11: ) Koch KM, Kuhn K, Nonnast-Daniel B, Scigalla P, volume editors. Treatment of renal anemia with recombinant human erythropoietin. In: Berlyne GM, Giovannetti S, series editors. Contributions to Nephrology. New York: Karger, 1988; 66:1-15 and ) Mengel et al. Hematology: principles and practice. Chicago: Year Book Medical Publishers Inc., ) Braunwald E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Wilson JD, Martin JB, Fanci AS, editors. Harrison's principles of internal medicine. 11th ed. New York: McGraw-Hill, 1987:149, ) Raine AEG. Hypertension, blood viscosity, and cardiovascular morbidity in renal failure: implications of erythropoietin therapy. Lancet 1988;1: ) Miller ME, Garcia JF, Cohen RA, Cronkite EP, Moccia G, Acevado J. Diurnal levels of immunoreactive erythropoietin in normal subjects and subjects with chronic lung disease. Br J Haematol 1981;49: ) Wide L, Bengtsson C, Birgegard G. Circadian Rhythm of erythropoietin in human serum. Br J Haematol 1989;72: ) Cahan C, Decker MJ, Arnold JL, Washington LH, Veldhuis JD, Goldwasser E, Strohl DP. Diurnal Variations in serum erythropoietin levels in healthy subjects and sleep apnea patients. J Appl Physiol 1992;72: ) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture; approved standard. 4th ed. NCCLS Document H3-A4, Wayne, PA: NCCLS, Technical Assistance For technical assistance, contact your National Distributor. The Quality System of Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. is certified to ISO 13485:2003. Tables and Graphs Precision (miu/ml) Within-Run 1 Total 2 Mean 3 SD 4 CV 5 SD CV % % % % % % % % % % % % % % Česky. 1 V rámci stanovení, 2 Celkem, 3 Střední hodnota, 4 Směrodatná odchylka, 5 Variační koeficient. Ελληνικά. 1 Κατά την ίδια περίοδο, 2 Συνολικά, 3 Μέσος όρος, 4 SD, 5 CV. Polski. 1 W serii, 2 Całość, 3 Średnie, 4 SD, 5 CV. Specificity µg/ml % Cross- Compound 1 Added 2 reactivity 3 Human Serum Albumin 60 ND α-1 Antitrypsin % α-acid Glycoprotein 100 ND Human α-globulin 100 ND Human Transferrin (iron-saturated) 100 ND Human Transferrin (nonsaturated) 100 ND ND: Not detectable. 4 Česky. 1 Sloučenina, 2 Přidané množství, 3 % Zkřížená reaktivita, 4 ND: nezjistitelné. 6 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, )

7 Ελληνικά. 1 Μείγμα, 2 Προστέθηκαν, 3 % Διασταυρ.Αντίδραση, 4 ND: Μη ανιχνεύσιμη ποσότητα. Polski. 1 Składnik, 2 Ilość dodana, 3 % reaktywności Krzyżowej, 4 ND: Nieoznaczlne. Linearity (miu/ml) Dilution 1 Observed 2 Expected 3 %O/E in in % 2 in % 1 in % 2 8 in in % 2 in % 1 in % 3 8 in in % 2 in % 1 in % 4 8 in in % 2 in % 1 in % 5 8 in in % 2 in % 1 in % 6 8 in in % 2 in % 1 in % Česky. 1 Ředění, 2 Naměřená, 3 Očekávaná, 4 % Naměřená / Očekávaná, 5 8 v 8. Ελληνικά. 1 Αραίωση, 2 Παρατηρούμενη (O), 3 Αναμενόμενη (E), 4 % O/E, 5 8 στα 8. Polski. 1 Rozcieńczenie, 2 Zmierzone (Z), 3 Oczekiwane (O), 4 % Z/O, 5 8 w 8. Recovery (miu/ml) Solution 1 Observed 2 Expected 3 %O/E A % B % C % A % B % C % A % B % C % A % B % C % A % B % C % A % B % C % Česky. 1 Roztok, 2 Naměřená, 3 Očekávaná, 4 Naměřená / Očekávaná. Ελληνικά. 1 Διάλυμα, 2 Παρατηρούμενη (O), 3 Αναμενόμενη (E), 4 % O/E. Polski. 1 Roztwór, 2 Zmierzone (Z), 3 Oczekiwane (O), 4 % Z/O. Hemolysis Hemoglobin 1 Unspiked mg/dl 256 mg/dl 512 mg/dl Česky. 1 Hemoglobin, 2 Bez přídavku. Ελληνικά. 1 Αιμοσφαιρίνη, 2 Χωρίς εμπλουτισμό. Polski. 1 Hemoglobiny, 2 Wyjściowa. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, ) 7

8 Method Comparison IMMULITE 2000 EPO IMMULITE EPO, miu/ml (IML 2000) = 1.02 (IML) miu/ml r = English. EPO Česky. EPO. Ελληνικά. EPO. Polski. EPO. Česky IMMULITE 2000 EPO Použití: Pro in vitro diagnostické použití na analyzátorech IMMULITE 2000 ke stanovení koncentrace erytropoetinu (EPO) v séru nebo heparinizované plazmě, jakožto pomůcky při diagnostice anémií a polycytémií. Katalogové číslo: L2KEP2 (200 stanovení), L2KEP6 (600 stanovení) Kód metody: EPO Barva: Světle zelená Shrnutí a vysvětlení Erytropoetin (EPO) je glykoproteinový hormon skládající se z 165 aminokyselin, který má čtyři komplexní karbohydrátové řetězce připojené na čtyřech vazebných místech na peptid. 1 Jeho molekulová hmotnost je daltonů, z toho 40% připadá na karbohydrátové řetězce. EPO je primárním regulátorem erytropoézy, stimuluje proliferaci a diferenciaci erytroidních prekurzorových buněk v kostní dřeni. U savců ve fetálním stadiu produkují tento hormon téměř výlučně játra. U dospělých tvorba EPO v játrech klesá na méně než 10% a více než 90% tvorby zajišťují ledviny. 2,3 Místem tvorby jsou pravděpodobně proximální tubulární buňky ledvin nebo peritubulární kapilární endoteliální buňky ledvinové kůry a vnější dřeně. Odstraňování EPO z cirkulace není zcela objasněno, ale částečně souvisí s vylučováním moči a možná též s eliminací v játrech a absorpcí do terčových buněk kostní dřeně. EPO upravuje produkci červených krvinek tak, aby uspokojily poptávku tkání po kyslíku. 1 Jeho vliv se uplatňuje skrze komplexní systém se zpětnou vazbou. Sekrece tohoto hormonu je regulována kyslíkovým senzorem v ledvinách, který reaguje na parciální tlak kyslíku v krvi. Za stavu zvýšeného množství vnějšího kyslíku se hladina EPO snižuje. To nastává po korekci hypoxie u zdravých osob (například při sestupu z vysokých výšek) a po hypertransfuzi. Anémie můžeme s ohledem na koncentraci EPO v krvi rozdělit do dvou kategorií: podle toho, zda jsou vůči koncentraci EPO primární nebo sekundární. Primární anémie se vyznačují nárůstem hladiny EPO v krvi ve snaze obnovit tvorbu červených krvinek na normální hodnotu. Mezi tento typ anémií se zvýšenou hladinou EPO patří například anémie z nedostatku železa, redukce krevního toku do ledvin (jako při ztrátě krve) a hemoglobinopatie se zvýšenou afinitou hemoglobinu ke kyslíku. 1 Míra tvorby EPO roste exponenciálně s poklesem využitelného kyslíku a s klesajícím hematokritem u neledvinových anémií. U těchto neledvinových anémií byly zjištěny hodnoty EPO zvýšené až tisíckrát. 2 Anémie může být sekundárním onemocněním při zánětech, revmatoidní artritidě, novotvarech a při chronickém onemocnění ledvin. I "sekundární anémie" mohou ale být alespoň částečně způsobené nedostatečnou tvorbou EPO. 4 Neschopnost tvořit dostatečné množství EPO je příčinou mírných až těžkých anémií pozorovaných v konečném stadiu ledvinového onemocnění. Pokles tvorby EPO je způsobený poškozením míst tvorby EPO v ledvinách a zasažený může být i kyslíkový senzor. Hladina tohoto hormonu přinejlepším mírně převyšuje referenční rozmezí a nestačí tak vyrovnávat ztrátu krve způsobenou dialýzou, zkrácenou dobou života červených krvinek, nedostatkem železa a kyseliny listové, poruchou přenosu železa 8 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, )

9 do erytroidních progenitorových buněk a ostatními nároky, kterým musí tito pacienti čelit. Zvláště nízká koncentrace EPO se vyskytuje zejména u anefrických pacientů. U některých pacientů s chronickým selháním ledvin je ale hematokrit normální, anémie není natolik závažná a koncentrace EPO je zvýšená. Někteří z těchto pacientů mají cystické ledviny nebo virovou hepatitidu, přičemž u hepatitidy zvýšenou tvorbu EPO může způsobit jeho zvýšená tvorba v játrech. Nadprodukce červených krvinek se nazývá polycytémie. Polycytémie se rovněž dají rozdělit do dvou kategorií s ohledem na to, zda je tento stav primární nebo sekundární vůči množství EPO. U polycytémie vera se hladina EPO snižuje a erytropoéza je primární a nezávislá na stimulaci hormonem EPO. Rozdíly v množství EPO můžou být u jednotlivých pacientů se stejným hematokritem až desetinásobné. Pro některé stavy může být charakteristická ztráta zpětné vazby při regulaci koncentrace kyslíku prostřednictvím tvorby EPO, což má za následek zvýšené množství EPO. 3 Sem patří karcinomy ledvinových buněk, při kterých 2% pacientů vykazují erytrocytózu, a některé zhoubné ledvinové léze, jako jsou samostatné nebo vícečetné ledvinové cysty, zúžení ledvinové tepny a mikrovaskulární abnormality. Dále se u asi 10% pacientů po transplantaci ledvin vyvine erytrocytóza, někdy z autologního onemocnění ledvin. Sekundární polycytémie je charakteristická zvýšením koncentrace EPO, která vede k nárůstu množství červených krvinek. Tento stav může být důsledkem celé řady faktorů včetně porušeného hemoglobinu, kouření, fibrózy plic, srdečního onemocnění, nádorů a ledvinových kamenů. 5 Při stanovení množství EPO z důvodu určení diferenční diagnózy u nadbytku červených krvinek je třeba zvážit případné překrývání hodnot sekundární erytrocytózy a polycytémie vera s hodnotami v rámci referenčního rozmezí. 3 Princip Stanovení Stanovení EPO na analyzátorech IMMULITE 2000 je chemiluminiscenční imunochemická reakce v pevné fázi. Inkubační cykly: 2 30 minut. Odebírání vzorků V literatuře existuje několik zmínek o kolísání množství EPO v během dne. 7-9 Je proto důležité vzorky odebírat vždy ve stejnou hodinu. Ranní vzorky se mají odebírat mezi 7:30 a 12:00. Hodnoty můžou kolísat, když vzorek není vysrážen při pokojové teplotě. (15 28 C). Protože vliv EDTA na výsledky je značný, nepoužívejte toto činidlo proti srážení krve. K úpravě lipemických vzorků se doporučuje použití ultracentrifugy. Hemolyzované nebo značně kontaminované vzorky můžou poskytovat chybné výsledky. Centrifugace vzorků séra ještě před úplným vysrážením může mít za následek přítomnost fibrinu. Chybným výsledkům způsobeným přítomností fibrinu lze zamezit úplným vysrážením vzorků před jejich centrifugací. Některé vzorky, zejména od pacientů podstupujících antikoagulační léčbu, může srážlivost vyžadovat více času. Použití zkumavek pro odběr krve od různých výrobců může poskytovat rozličné hodnoty v závislosti na materiálech a přísadách, včetně gelových nebo fyzických bariér, aktivátorů srážení a/nebo antikoagulačních činidel. Stanovení EPO na analyzátorech IMMULITE 2000 nebylo testováno se všemi možnými varianty jednotlivých typů zkumavek. Informace o testovaných zkumavkách najdete v části o alternativních typech vzorků. Potřebný objem vzorku: 100 μl séra nebo heparinizované plazmy. Skladování: 7 dní při teplotě 2 8 C nebo 2 měsíce při 20 C. Zamezte opakovanému rozmrazování a zmrazování. Upozornění a bezpečnostní opatření Pro in vitro diagnostické použití. Reagencie: Skladujte při teplotě 2 8 C. Likvidujte v souladu s platnými předpisy. Řiďte se obecnými pravidly bezpečnosti práce a se všemi komponenty nakládejte, IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, ) 9

10 jako by byly potenciálně infekční. Zdrojové materiály získané z lidské krve byly testovány a shledány nereaktivní na syfilis, na protilátky proti HIV 1 a 2, na povrchový antigen hepatitidy typu B (HBsAg), a na protilátky proti hepatitidě typu C. Jako konzervační látka byl přidán azid sodný v koncentracích menších než 1 g/l. Při likvidaci vypláchněte velkým množstvím vody, aby se zamezilo nahromadění potenciálně výbušných azidů kovů v olověném a měděném potrubí. Chemiluminiscenční substrát: Vyvarujte se kontaminace a nevystavujte přímému slunečnímu světlu. (Viz připojený letáček.) Voda: Použijte destilovanou nebo deionizovanou vodu. Dodaný materiál Komponenty představují ucelenou sadu. Pro stanovení jsou zapotřebí štítky s čárovým kódem na krabici. EPO zásobník s kuličkami (L2EP12) Opatřeno čárovým kódem. 200 kuliček potažených antiligandem odvozeným od streptavidinu. Stabilní při teplotě 2 8 C do expirace. L2KEP2: 1 balení. L2KEP6: 3 balení EPO reagencie (L2EPA2) Opatřeno čárovým kódem. 11,5 ml ligandem značené myší monoklonální protilátky proti EPO, s konzervačním prostředkem. 11,5 ml alkalické fosfatázy (z telecího střeva) konjugované s kozí polyklonální protilátkou proti EPO v pufru, s konzervačním prostředkem. Stabilní při teplotě 2 8 C do expirace. L2KEP2: 1 nádobka. L2KEP6: 3 nádobky. Před použitím utrhněte vršek štítku v perforovaném místě, ale nepoškoďte čárový kód. Z vrchu nádobky odstraňte uzavírací fólii; posuvný uzávěr zaklapněte do ramp na víčku reagencie. EPO kalibrátory (LEPL, LEPH) Dvě ampulky s vysokou a nízkou koncentrací lyofilizovaného lidského rekombinantního EPO v nehumánní sérové matrici, s konzervačním prostředkem. Alespoň 30 minut před použitím rekonstituujte každou ampulku přidáním 4,0 ml destilované nebo deionizované vody. Míchejte jemným kroužením nebo překlápěním až do úplného rozpuštění lyofilizovaného materiálu. Stabilní 30 dní po rekonstituci při teplotě 2 8 C nebo rozdělené na alikvotní části 6 měsíců při teplotě 20 C. L2KEP2: 1 sada. L2KEP6: 2 sady. Před adjustací nalepte na testovací zkumavky příslušné alikvotní štítky (dodané se soupravou) tak, aby zabudovaný snímač mohl přečíst čárové kódy. Materiál dodávaný zvlášť Multidiluent 2 (L2M2Z, L2M2Z4) Pro automatické ředění vzorků analyzátorem. Jedna ampulka koncentrované (připravené k použití), nehumánní bílkovino/pufrové matrice, s konzervačním prostředkem. Stabilní 30 dní po otevření při teplotě 2 8 C nebo rozdělené na alikvotní části 6 měsíců při 20 C. L2M2Z: 25 ml L2M2Z4: 55 ml Štítky s čárovými kódy jsou určeny pro diluent. Před použitím nalepte příslušný štítek na testovací zkumavku mm tak, aby zabudovaný snímač mohl přečíst čárové kódy. L2M2Z: 3 štítky. L2M2Z4: 5 štítků. L2SUBM: Chemiluminiscenční substrát L2PWSM: Promývací roztok L2KPM: Čistící roztok na jehly LRXT: Reakční zkumavky (na jedno použití) L2ZT: 250 testovacích zkumavek na diluent vzorků ( mm) L2ZC: 250 uzávěrů na testovací zkumavky na diluent vzorků LEPCM: Trojúrovňový EPO kontrolní modul Dále potřebujete: Destilovanou nebo deionizovanou vodu; testovací zkumavky, kontroly. Postup stanovení K dosažení optimálního výkonu je důležité provádět veškerou pravidelnou údržbu stanovenou v manuálu k analyzátorům IMMULITE V manuálu k analyzátorům IMMULITE 2000 najdete postupy: přípravy, nastavení, ředění, adjustace, stanovení vzorků a kontrol. 10 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, )

11 Doporučený interval mezi adjustacemi: 2 týdny. Vzorky ke kontrole kvality: Použijte kontroly nebo směsné vzorky s alespoň dvěmi koncentracemi (vysokou a nízkou EPO. Očekávané hodnoty Studie provedená na 167 vzorcích od zjevně zdravých jedinců pomocí stanovení EPO na analyzátorech IMMULITE 2000 poskytla medián 10,2 miu/ml, 95. percentil 19,6 miu/ml a absolutní rozmezí 3,7 až 31,5 miu/ml. Při interpretaci výsledků měření EPO u pacientů s jiným onemocněním než je anémie je třeba dbát opatrnosti. Pacienti s erytrocytózou způsobenou nekompenzovanou hypoxií mají zvýšenou hladinu imunoreaktivního EPO v séru. U pacientů s kompenzovanou hypoxií je koncentrace imunoreaktivního EPO v séru obyčejně v rámci normálního rozmezí a u pacientů s polycytémií vera je hladina imunoreaktivního EPO v séru buď normální nebo nízká. Zatímco tedy zvýšená koncentrace EPO v séru nasvědčuje, že erytrocytóza je sekundárním jevem a snížená koncentrace EPO podporuje možnost existence autonomní erytropoézy, normální hladina EPO v séru nevylučuje ani hypoxii, ani autonomní tvorbu EPO jakožto příčinu erytrocytózy. Uvedené hranice považujte pouze za orientační. Každá laboratoř by si měla stanovit svoje vlastní referenční rozmezí. Omezení Výkyvy v hodnotách EPO se objevily v přítomnosti proti-druhových protilátek. Interference tohoto stanovení s léky nebyla prověřována. Výsledek tohoto stanovení je nutné použít ve spojení s informacemi z klinického hodnocení a ostatních diagnostických metod. Protože výsledky obdržené použitím různých EPO testů se můžou navzájem významně lišit, doporučuje se, aby jakékoliv sériové vyšetření vzorků od jedno pacienta v určitém časovém období bylo prováděno vždy pomocí stejného testu EPO. Nižší než očekávané koncentrace EPO se vyskytly u následujících stavů: revmatoidní artritida, získaný syndrom nedostatečné imunity, rakovina, ulcerativní kolitída, onemocnění srpkovitých buněk a u předčasně narozených dětí. Po alogenní transplantaci kostní dřeně může narušená erytropoetinová odezva způsob zpoždění obnovení erytropoetinu. Pacienti s hypergamaglobulinémii spojenou s četnými myelomy nebo Waldenstromovou nemocí mají narušenou tvorbu EPO ve spojitosti s koncentrací hemoglobinu, což doprovází zvýšená viskozita plazmy. Hladina EPO u lidí s erytrocytózou žijících ve velkých nadmořských výškách může po jejich návratu do nižších výšek prudce klesnout na normální úroveň. Použití EDTA plazmy jako typu vzorku se nedoporučuje. (Viz část Alternativní typ vzorku). Heterofilní protilátky v lidském séru můžou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. [Viz Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all imunologickým stanovením. Clin Chem 1988:34:27-33.] Vzorky pacientů rutinně vystavených kontaktu se zvířaty nebo produkty zvířecího séra můžou vykázat tento typ interference a potenciálně způsobit anomální výsledky. Tyto reagencie byly vyvinuty tak, aby bylo riziko interference minimalizováno; nicméně případné interakce mezi ojedinělými séry a komponenty testu se můžou vyskytnout. Pro diagnostické účely by se výsledky tohoto stanovení měly vždy používat v kombinaci s klinickými zkouškami, zdravotní historií pacienta a ostatními nálezy. Znaky metody Reprezentativní výsledky stanovení najdete v části Tabulky a grafy. Výsledky se udávají v miu/ml. Kalibrační rozsah: Do 200 miu/ml (WHO 2nd IRP 67/343). Analytická citlivost: 1,0 miu/ml High-dose Hook Effect: Do koncentrace > miu/ml žádný. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, ) 11

12 Přesnost: Vzorky byly stanovovány dvojmo v průběhu 20 dní, dva testy denně, celkem 40 testů a 80 replikátů. (Viz tabulka Přesnost".) Linearita: Stanovení vzorků bylo provedeno při rozličném ředění. (Reprezentativní hodnoty najdete v tabulce Linearita.) Zpětná výtěžnost: Bylo provedeno stanovení vzorků séra s přídavkem tří roztoků EPO (25, 50 a 75 miu/ml) v poměru 1:19. (Reprezentativní hodnoty najdete v tabulce Zpětná výtěžnost.) Specificita: Stanovení je silně specifické vůči EPO. (Viz tabulka Specificita"). Bilirubin: Přítomnost konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu v koncentracích do 200 mg/l nemá v rámci přesnosti stanovení žádný vliv na výsledky. Hemolýza: Přítomnost hemoglobinu v koncentracích do 512 mg/dl může způsobit mírné snížení výsledků. (Viz tabulka "Hemolýza"). Lipémie: Přítomnost triglyceridů v koncentracích do mg/dl nemá v rámci přesnosti stanovení žádný vliv na výsledky. Alternativní typ vzorku: Ke zjištění zda i jiné typy vzorků než sérové jsou vhodné pro metodu EPO na analyzátorech IMMULITE 2000 jsme odebrali vzorky krve od 22 dobrovolníků do obyčejných, heparinizovaných, EDTA a Becton Dickinson SST vacutainer zkumavek. Abychom získali hodnoty napříč celým kalibračním rozsahem, byly některé z odpovídajících typů vzorků doplněny hormonem EPO. Všechny vzorky byly následně stanoveny pomocí testu EPO na analyzátorech IMMULITE 2000 výše uvedenou metodou s následujícími výsledky: (Heparin) = 1,02 (Sérum) 0,7 miu/ml r = 0,996 (EDTA) = 0,61 (Sérum) 1,1 miu/ml r = 0,986 (SST ) = 0,97 (Sérum) + 0,4 miu/ml r = 0,998 Střední hodnoty: 81,5 miu/ml (Sérum) 82,6 miu/ml (Heparin) 48,7 miu/ml (EDTA) 79,6 miu/ml (SST ) Použití EDTA jako činidla proti srážlivosti se nedoporučuje, protože by mohlo dojít k podstatnému ovlivnění výsledků. Srovnání metody: Stanovení bylo porovnáno s testem EPO na analyzátoru IMMULITE EPO od na 160 vzorcích. (Koncentrační rozsah: přibližně do 200 miu/ml. Viz graf.) Podle lineární regrese: (IML 2000) = 1,02 (IML) + 0,1 miu/ml r = 0,992 Střední hodnoty: 34,3 miu/ml (IMMULITE 2000) 33,4 miu/ml (IMMULITE) Technická Podpora Pro technickou podporu kontaktujte vašeho národního distributora. Systém kontroly jakosti společnosti Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. je certifikovaný podle ISO 13485:2003. Ελληνικά IMMULITE 2000 EPO Ενδεδειγμένη χρήση: Για in vitro διαγνωστική χρήση με τα συστήματα αναλυτών IMMULITE 2000 για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ερυθροποιητίνης (ΕΡΟ) στον ορό ή το ηπαρινισμένο πλάσμα, ως βοήθημα στη διάγνωση της αναιμίας και της πολυκυτταραιμίας. Αριθμός καταλόγου: L2KEP2 (200 εξετάσεις), L2KEP6 (600 εξετάσεις) Κωδικός Ανάλυσης: EPO Χρώμα: Ανοικτό Πράσινο Περίληψη και επεξήγηση: Η ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ) είναι μια ορμόνη γλυκοπρωτεΐνη, η οποία αποτελείται από 165 αμινοξέα, με τέσσερις αλυσίδες σύνθετων υδατανθράκων που προσαρτώνται στο πεπτίδιο σε τέσσερα σημεία σύνδεσης. 1 Έχει μοριακό βάρος dalton, το 40% του οποίου αποδίδεται στις αλυσίδες υδατανθράκων. Η ΕΡΟ είναι ο βασικός ρυθμιστής της ερυθροποίησης και διεγείρει την 12 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, )

13 αναπαραγωγή και διαφοροποίηση των πρόδρομων ερυθρών κυττάρων του μυελού των οστών. Στα θηλαστικά, το ήπαρ του εμβρύου παράγει το σύνολο σχεδόν των ορμονών. Στους ενήλικες, η παραγωγή από το ήπαρ μειώνεται σε ποσοστά κάτω του 10%, ενώ οι νεφροί εκκρίνουν ποσοστά άνω του 90%. 2,3 Πιστεύεται ότι η παραγωγή γίνεται στα κύτταρα των εγγύς νεφρικών σωληναρίων ή στα ενδοθηλιακά κύτταρα των περισωληνοειδών τριχοειδών του νεφρικού φλοιού και του εξωτερικού τμήματος του μυελού. Η κάθαρση της κυκλοφορούσας ΕΡΟ δεν έχει εξηγηθεί πλήρως, ωστόσο επιτυγχάνεται κατά ένα μικρό μέρος με αποβολή δια των ούρων, ενδεχομένως με ηπατική εξουδετέρωση και με την πρόσληψή της σε κύτταρα στόχους του μυελού. Η EPO ρυθμίζει την παραγωγή ερυθροκυττάρων, ώστε να καλύπτει τις απαιτήσεις οξυγόνωσης των ιστών. 1 Επηρεάζει ένα σύνθετο σύστημα ανατροφοδότησης, στο οποίο η νεφρική έκκριση της ορμόνης ελέγχεται από έναν αισθητήρα οξυγόνου στο νεφρό, που αντιδρά στη μερική πίεση του οξυγόνου του αίματος. Τα επίπεδα ΕΡΟ μειώνονται, όταν αυξάνεται το περιφερειακό οξυγόνο. Κάτι τέτοιο παρατηρείται μετά την διόρθωση της υποξίας σε υγιή άτομα (μετά από κάθοδο από υψηλό υψόμετρο) και μετά από υπερμετάγγιση. Οι αναιμίες διακρίνονται σε δύο κατηγορίες ως προς τα επίπεδα της ΕΡΟ στο αίμα: τις πρωτοπαθείς που εξαρτώνται από τα επίπεδα της ΕΡΟ και τις δευτεροπαθείς. Οι πρωτοπαθείς αναιμίες χαρακτηρίζονται από αύξηση της ΕΡΟ στο αίμα, σε μια προσπάθεια αποκατάστασης των φυσιολογικών επιπέδων παραγωγής ερυθροκυττάρων. Ορισμένα παραδείγματα αναιμίας με αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ είναι η σιδηροπενική αναιμία, η μείωση της ροής αίματος στους νεφρούς (π.χ. απώλεια αίματος) και οι αιμοσφαιρινοπάθειες με αυξημένη συγγένεια της αιμοσφαιρίνης με το οξυγόνο. 1 Ο ρυθμός παραγωγής ΕΡΟ φαίνεται να αυξάνεται ραγδαία κατά τη μείωση του διαθέσιμου οξυγόνου και την πτώση του αιματοκρίτη στις μη νεφρογενείς αναιμίες. Στην τελευταία περίπτωση, έχουν καταγραφεί επίπεδα ΕΡΟ φορές υψηλότερα από τα φυσιολογικά. 2 Η αναιμία μπορεί να είναι δευτεροπαθείς σε περιπτώσεις φλεγμονών, ρευματοειδούς αρθρίτιδας, νεοπλασμάτων και χρόνιας νεφροπάθειας. Ωστόσο, οι "δευτεροπαθείς αναιμίες" αποδίδονται τουλάχιστον εν μέρει στη μειωμένη παραγωγή ΕΡΟ. 4 Η αδυναμία παραγωγής επαρκών ποσοτήτων ΕΡΟ ευθύνεται για τις μέτριες έως σοβαρές αναιμίες που παρατηρούνται στις νεφροπάθειες τελικού σταδίου. Η μειωμένη παραγωγή ΕΡΟ οφείλεται στην καταστροφή των σημείων παραγωγής στο νεφρό. Επίσης, μπορεί να παρατηρηθεί βλάβη στον αισθητήρα οξυγόνου του νεφρού. Τα επίπεδα της ορμόνης υπερβαίνουν ελαφρά τις τιμές αναφοράς και δεν επαρκούν για τη μέτρηση της απώλειας αίματος λόγω της αιμοδιύλυσης, του μειωμένου χρόνου ζωής των ερυθροκυττάρων, της έλλειψης σιδήρου και φυλικού οξέως, της ελλιπούς μεταφοράς σιδήρου στα πρόδρομα ερυθρά κύτταρα και άλλων προβλημάτων που αντιμετωπίζουν αυτοί οι ασθενείς. Οι ασθενείς χωρίς νεφρούς παρουσιάζουν ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα ΕΡΟ. Ωστόσο, κάποιοι ασθενείς με χρόνια νεφρική ανεπάρκεια έχουν φυσιολογικό αιματοκρίτη ή λιγότερο σοβαρή αναιμία και αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ. Ορισμένοι από αυτούς τους ασθενείς έχουν πολυκυστικούς νεφρούς ή ιογενή ηπατίτιδα. Στους τελευταίους, τα αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ μπορεί να οφείλονται στην αυξημένη ηπατική παραγωγή. Η υπερπαραγωγή ερυθροκυττάρων ονομάζεται πολυκυτταραιμία. Η πολυκυτταραιμία διακρίνεται σε δύο κατηγορίες ανάλογα με το εάν είναι πρωτοπαθής ή δευτεροπαθής ως προς τα επίπεδα EPO. Στην αληθή πολυκυτταραιμία, τα επίπεδα ΕΡΟ είναι σχεδόν μηδενικά και η ερυθροποίηση είναι πρωτογενής και ανεξάρτητη από τη διέγερση που προκαλεί η ΕΡΟ. Η απόκλιση των τιμών ΕΡΟ μπορεί να είναι δεκαπλάσια μεταξύ ασθενών με τα ίδια επίπεδα αιματοκρίτη. Ορισμένες άλλες νόσοι μπορεί να χαρακτηρίζονται επίσης από την απώλεια του αναδραστικού ελέγχου των συγκεντρώσεων οξυγόνου εκτός της παραγωγής ΕΡΟ, προκαλώντας αύξηση των επιπέδων EPO. 3 Σε αυτές περιλαμβάνονται τα καρκινώματα των νεφρικών κυττάρων, όπου το 2% των IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, ) 13

14 ασθενών παρουσιάζει ερυθροκυττάρωση, καθώς και ορισμένες καλοήθεις νεφρικές βλάβες, όπως οι μεμονωμένες ή πολλαπλές νεφρικές κύστες, η στένωση της νεφρικής αρτηρίας και οι μικροαγγειακές ανωμαλίες. Επιπλέον, περίπου 10% των ασθενών που έχουν υποβληθεί σε μεταμόσχευση νεφρού παρουσιάζουν ερυθροκυττάρωση, ορισμένες φορές από τον αυτόλογο νοσούντα νεφρό. Η δευτερογενής πολυκυτταραιμία χαρακτηρίζεται από αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ με συνεπαγόμενη αύξηση της μάζας των ερυθροκυττάρων. Αυτή η κατάσταση μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της παθολογικής αιμοσφαιρίνης, του καπνίσματος, της πνευμονικής ίνωσης, της καρδιακής νόσου, όγκων και λίθων στους νεφρούς. 5 Κατά την εξέταση της ΕΡΟ για τη διαφορική διάγνωση της πολυκυτταραιμίας, να λαμβάνεται υπόψη η ενδεχόμενη αλληλοεπικάλυψη των τιμών της δευτεροπαθούς ερυθροκυττάρωσης ή της αληθούς πολυκυτταραιμίας με τις τιμές αναφοράς. 3 Αρχή της διαδικασίας Η IMMULITE 2000 EPO είναι μια στερεής φάσης, χημειοφωταυγής, ανοσομετρική ανάλυση. Κύκλοι επώασης: 2 x 30 λεπτά. Συλλογή δειγμάτων Στη βιβλιογραφία υπάρχουν αρκετές αναφορές για διακύμανση της ερυθροποιητίνης κατά τη διάρκεια της ημέρας. 7-9 Είναι σημαντικό τα δείγματα να συλλέγονται σε σταθερή ώρα. Δεν συνιστάται η λήψη δειγμάτων μεταξύ 7:30 το πρωί και 12:00 το μεσημέρι. Διακύμανση των τιμών μπορεί να παρατηρηθεί, εάν το δείγμα δεν πήξει σε θερμοκρασία δωματίου (15 28 C). Επειδή το EDTA μπορεί να έχει σημαντική επίδραση στα αποτελέσματα, δεν πρέπει να χρησιμοποιείται ως αντιπηκτικό. Συνιστάται η χρήση της υπερφυγοκέντρου για να καθαριστούν τα λιπιδαιμικά δείγματα. Τα αιμολυμένα ή τα πολύ μολυσμένα δείγματα μπορεί να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. Η φυγοκέντριση των δειγμάτων ορού πριν την πλήρη πήξη μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία θρόμβων. Για να αποφευχθούν λανθασμένα αποτελέσματα εξαιτίας της παρουσίας θρόμβων, βεβαιωθείτε ότι πριν τη φυγοκέντριση, το αίμα έχει πήξει πλήρως. Κάποια δείγματα, ιδιαιτέρως αυτά των ασθενών που λαμβάνουν αντιπηκτική θεραπεία, ίσως απαιτούν μεγαλύτερο χρόνο πήξης. Οι σωλήνες συλλογής αίματος διαφορετικών εταιρειών μπορεί να δώσουν αποκλίνουσες τιμές, ανάλογα με τα υλικά και τα συμπληρώματα, συμπεριλαμβανομένων των με τζελ ή φυσικών σωληναρίων, των ενεργοποιητών πήξεως και/ή των αντιπηκτικών. Η IMMULITE 2000 ΕΡΟ δεν έχει δοκιμαστεί με όλους τους τύπους σωληναρίων. Συμβουλευθείτε την παράγραφο για τους εναλλακτικούς τύπους δειγμάτων για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα σωληνάρια που έχουν δοκιμαστεί. Απαιτούμενος όγκος: 100 µl ορού ή ηπαρινισμένου πλάσματος. Φύλαξη: 7 ημέρες στους 2 8 C ή 2 μήνες στους 20 C. Αποφύγετε τους επανειλημμένους κύκλους κατάψυξης/απόψυξης. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση. Αντιδραστήρια: Διατήρηση στους 2 8 C. Απόρριψη σύμφωνα με την ισχύουσα νομοθεσία. Ακολουθήστε τις γενικές προφυλάξεις και χειριστείτε όλα τα συστατικά σαν να ήταν φορείς μολυσματικών παραγόντων. Όλα τα υλικά της μεθόδου που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα έχουν ελεγχθεί και βρέθηκαν αρνητικά για σύφιλη, για αντισώματα στον HIV 1 και 2, για επιφανειακά αντιγόνα της ηπατίτιδας Β και για αντισώματα της ηπατίτιδας C. Αζίδιο του νατρίου σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 0,1 g/dl έχει προστεθεί ως συντηρητικό. Κατά την απόρριψη, ξεπλύνετε με άφθονο νερό για την 14 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, )

15 αποφυγή σχηματισμού πιθανών εκρηξιογόνων μεταλλικών αζιδίων στις αποχετεύσεις από μόλυβδο και χαλκό. Χημειοφωταυγές υπόστρωμα: Αποφύγετε τη μόλυνση και την έκθεση στο άμεσο ηλιακό φως. (βλ. ένθετο). Νερό: Χρησιμοποιείτε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Υλικά που διατίθενται Τα συστατικά αποτελούν ένα ολοκληρωμένο σετ. Οι ετικέτες στο εσωτερικό κουτί είναι απαραίτητες για την ανάλυση. Συσκευασία σφαιριδίων ΕΡΟ (L2EP12) Με ραβδοκώδικα. 200 σφαιρίδια με επικάλυψη anti-ligand από στρεπταβιδίνη. Σταθερά στους 2 8 C έως την ημερομηνία λήξης. L2KEP2: 1 συσκευασία. L2KEP6: 3 συσκευασίες. Δοχείο αντιδραστηρίου ΕΡΟ (L2EPA2) Με ραβδοκώδικα. 11,5 ml ligandσεσημασμένο μονοκλωνικό αντίσωμα αντί-epo από ποντικό, με συντηρητικό. 11,5 ml αλκαλικής φωσφατάσης (από έντερο μόσχου) συνδεδεμένης με πολυκλωνικό αντίσωμα αντί-ερο κατσίκας σε ρυθμιστικό διάλυμα, με συντηρητικό. Σταθερ ο στους 2 8 C έως την ημερομηνία λήξης. L2KEP2: 1 δοχείο. L2KEP6: 3 δοχεία. Πριν τη χρήση, σχίστε την πάνω ετικέτα στο σημείο διάτρησης, χωρίς να καταστρέψετε το ραβδοκώδικα. Αφαιρέστε (ξεκολλήστε) προσεκτικά το κάλυμμα από την επάνω επιφάνεια του δοχείου, και πιέστε το κάλυμμα κάτω προς τους κεκλιμένους οδηγούς-ράγες. Ρυθμιστές EPO (LEPL, LEPH) Δύο φιαλίδια (χαμηλό και υψηλό) λυοφιλοποιημένης ανθρώπινης ανασυνδυασμένης ΕΡΟ σε μήτρα μη ανθρώπινου ορού, με συντηρητικό. Τουλάχιστον 30 λεπτά πριν τη χρήση: Κάντε ανασύσταση κάθε φιαλιδίου με 4,0 ml απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Αναμείξτε με απαλές κινήσεις ή με αναστροφή, έως ότου διαλυθεί πλήρως το λυοφιλοποιημένο υλικό. Σταθεροί στους 2 8 C για 30 μέρες μετά την ανασύσταση ή για 6 μήνες (διαχωρισμένοι) στους 20 C. L2KEP2: 1 σετ. L2KEP6: 2 σετ. Πριν κάνετε κάποια ρύθμιση, τοποθετείστε τις κατάλληλες ετικέτες των διαλυμάτων (παρέχονται με το kit) σε δοκιμαστικούς σωλήνες, έτσι, ώστε οι ραβδοκώδικες να μπορούν να διαβαστούν από το σύστημα του αναλυτή. Συστατικά του Kit που προμηθεύονται ξεχωριστά Πολυ-αραιωτικό 2 (L2M2Z, L2M2Z4) Για την αραίωση των δειγμάτων των ασθενών. Ένα φιαλίδιο, συμπυκνωμένο (έτοιμο για χρήση) σε μη ανθρώπινη μήτρα πρωτεΐνης/ρυθμιστικού, με συντηρητικό. Φύλαξη: 30 μέρες (μετά το άνοιγμα) στους 2 8 C ή 6 μήνες (διαχωρισμένα) στους 20 C. L2M2Z: 25 ml L2M2Z4: 55 ml Ετικέτες με ραβδοκώδικες παρέχονται για χρήση με το αραιωτικό. Πριν από τη χρήση, τοποθετήστε μια κατάλληλη ετικέτα σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα 16 x 100 mm, έτσι ώστε οι ραβδοκώδικες να μπορούν να διαβαστούν από το σύστημα του αναλυτή. L2M2Z: 3 ετικέτες. L2M2Z4: 5 ετικέτες. L2SUBM: Χημειοφωταυγές υπόστρωμα L2PWSM: Πλυστικό του ανιχνευτή L2KPM: Kit καθαρισμού του ανιχνευτή LRXT: Σωλήνες αντίδρασης (μιας χρήσεως) L2ZT: 250 δοκιμαστικοί σωλήνες για διάλυση του δείγματος (16 x 100 mm) L2ZC: 250 καπάκια για σωλήνες διάλυσης δείγματος LEPCM: Μονάδα ελέγχου ΕΡΟ τριών επιπέδων Απαιτούνται επίσης Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό, δοκιμαστικοί σωλήνες, δείγματα ελέγχου. Διαδικασία της ανάλυσης Σημειώστε ότι για το βέλτιστο αποτέλεσμα, είναι σημαντικό να ακολουθηθούν όλες οι τυπικές διαδικασίες όπως ορίζονται στο εγχειρίδιο χρήστη συστημάτων IMMULITE Βλέπε το εγχειρίδιο χρήστη συστημάτων IMMULITE 2000 για: προετοιμασία, στήσιμο, αραιώσεις, ρυθμίσεις, ανάλυση και διαδικασίες ποιοτικού έλέγχου. Συνιστώμενος χρόνος μεταξύ των ρυθμίσεων: 2 εβδομάδες. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, ) 15

16 Δείγματα ποιοτικού ελέγχου: Χρησιμοποιείτε δείγματα ελέγχου σε δύο τουλάχιστον επίπεδα ΕΡΟ (χαμηλό και υψηλό). Αναμενόμενες τιμές Μια μελέτη που διενεργήθηκε με τον αναλυτή IMMULITE 2000 EPO σε 167 φαινομενικά υγιείς εθελοντές εργαστηρίου έδωσε μέση τιμή 10,2 miu/ml, με εκατοστιαία αναλογία 95 στα 19,6 miu/ml και απόλυτο εύρος 3,7 έως 31,5 miu/ml. Προσοχή να δίδεται στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων της ΕΡΟ για ασθενείς που δεν πάσχουν από αναιμία. Σε ασθενείς με ερυθροκυττάρωση λόγω μη διορθωμένης υποξίας, τα επίπεδα ανοσοαντιδραστικής ΕΡΟ στον ορό είναι αυξημένα. Σε ασθενείς με διορθωμένη υποξία, τα επίπεδα ανοσοαντιδραστικής ΕΡΟ βρίσκονται συνήθως εντός του φυσιολογικού εύρους, ενώ σε ασθενείς με αληθή πολυκυτταραιμία, η ανοσοαντιδραστική ΕΡΟ στον ορό είναι είτε φυσιολογική είτε μειωμένη. Συνεπώς, αν και τα αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ στον όρο υποδηλώνουν ότι η ερυθροκυττάρωση είναι δευτεροπαθής και τα χαμηλά επίπεδα ΕΡΟ υποστηρίζουν την πιθανότητα αυτόνομης ερυθροποίησης, τα φυσιολογικά επίπεδα ΕΡΟ δεν αποκλείουν την περίπτωση υποξίας ή αυτόνομης παραγωγής ΕΡΟ ως αίτιο της ερυθροκυττάρωσης. Θεωρήστε αυτά τα όρια μόνο ως κατευθυντήριες γραμμές. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να θεσπίσει τα δικά του εύρη αναφοράς. Περιορισμοί Διακυμάνσεις των αποτελεσμάτων ΕΡΟ έχουν παρατηρηθεί σε παρουσία αντισωμάτων αντί-ειδών. Η επίδραση φαρμάκων στην ανάλυση δεν έχει δοκιμαστεί. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης πρέπει να συνεκτιμώνται με τα δεδομένα των κλινικών εκτιμήσεων και άλλων διαγνωστικών μεθόδων. Επειδή τα αποτελέσματα που επιτυγχάνονται με όλες τις εξετάσεις EPO μπορούν να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους, συνιστάται οι σειρές εξετάσεων σε κάθε ασθενή να εκτελούνται με την ίδια μέθοδο μέτρησης της ΕΡΟ. Χαμηλότερα επίπεδα ΕΡΟ από τα αναμενόμενα έχουν παρατηρηθεί σε αναιμίες που συνδέονται με τις ακόλουθες νόσους: ρευματοειδής αρθρίτιδα, σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας, καρκίνος, ελκώδης κολίτιδα, νόσος δρεπανοειδών κυττάρων και στα πρώιμα νεογνά. Μετά από μεταμόσχευση εξωγενούς μυελού των οστών, η μειωμένη αντίδραση ερυθροποιητίνης μπορεί να καθυστερήσει την ανάκτηση της ερυθροποιητίνης. Οι ασθενείς με υπερ-γ-σφαιριναιμία συνοδευτική πολλαπλού μυελώματος ή νόσου του Waldenstrom, παρουσιάζουν μειωμένη παραγωγή ερυθροποιητίνης σε σύγκριση με τις συγκεντρώσεις αιμοσφαιρίνης, και αυτό έχει συσχετιστεί με αυξημένο ιξώδες του πλάσματος. Τα επίπεδα της ΕΡΟ σε άτομα που διαβιούν σε υψηλό υψόμετρο και πάσχουν από ερυθροκυττάρωση μπορεί να κατέβουν ταχέως σε φυσιολογικά επίπεδα, όταν τα άτομα αυτά επιστρέψουν σε χαμηλό υψόμετρο. Το πλάσμα EDTA δεν πρέπει να χρησιμοποιείται ως τύπος δείγματος. Βλ. τμήμα "Εναλλακτικός τύπος δείγματος"). Ετεροφυλικά αντισώματα στον ανθρώπινο ορό μπορεί να αντιδράσουν με τις ανοσοσφαιρίνες που περιέχονται στα συστατικά της μεθόδου προκαλώντας αλληλεπιδράσεις με in vitro ανοσοαναλύσεις. [Βλ. Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem 1988:34:27-33.] Δείγματα ασθενών που εκτίθενται συστηματικά σε ζώα ή προϊόντα ζωικού ορού μπορούν να παρουσιάσουν αυτού του τύπου την αλληλεπίδραση που προκαλεί δυνητικά ένα 'ανώμαλο' αποτέλεσμα. Αυτά τα αντιδραστήρια έχουν μορφοποιηθεί έτσι, ώστε να ελαχιστοποιούν τον κίνδυνο της αλληλοεπίδρασης. Παρόλ' αυτά, πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ σπάνιων ορών και των συστατικών της μεθόδου μπορεί να εμφανιστούν. Για διαγνωστικούς σκοπούς, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με αυτή τη μέθοδο θα πρέπει πάντα να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τις κλινικές εξετάσεις, το ιατρικό ιστορικό του ασθενούς και άλλα ευρήματα. 16 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEP-1 {10}, )