EPO. For use on IMMULITE 2000 systems

Transcript

1 EPO For use on IMMULITE 2000 systems

2 IMMULITE 2000 EPO English Intended Use: For in vitro diagnostic use with the IMMULITE 2000 Systems Analyzers for the quantitative measurement of erythropoietin (EPO) in serum or heparinized plasma, as an aid in the diagnosis of anemias and polycythemias. With the advent of the administration of recombinant EPO as a biological therapy to increase red blood cell mass, an EPO assay may be used also to aid in the prediction and monitoring of response to recombinant EPO treatment in persons with anemias. Catalog Number: L2KEPN2 (200 tests), L2KEPN6 (600 tests) Test Code: EPN Color: Dark Green Summary and Explanation Erythropoietin (EPO) is a glycoprotein hormone consisting of 165 amino acids, with four complex carbohydrate chains attached to the peptide at four linkage sites. 1 It has a molecular weight of 36,000 daltons, 40% of this attributed to the carbohydrate chains. EPO is the primary regulator of erythropoiesis, stimulating the proliferation and differentiation of erythroid precursor cells in bone marrow. In mammals, the fetal liver produces nearly all of the hormone; in adults, hepatic production drops to under 10% and renal secretion accounts for over 90%. 2,3 The production site is believed to be the proximal renal tubular cells or the peritubular capillary endothelial cells of the renal cortex and outer medulla. The clearance of circulating EPO has not been fully explained, but it is accomplished, in small part, by urinary excretion, and possibly also by hepatic elimination and by uptake into target cells in bone marrow. EPO adjusts red blood cell production to meet the tissue oxygen demand. 1 It exerts its effect in a complex feedback system, in which renal secretion of the hormone is controlled by an oxygen sensor in the kidney that responds to the partial pressure of oxygen in blood. Under conditions of increased peripheral oxygen, EPO levels diminish. This is seen after correction of hypoxia in healthy subjects (as in descent from a high elevation) and after hypertransfusion. Anemias may be divided into two categories with respect to EPO levels in blood: those that are primary to EPO levels and those that are secondary. Primary anemias are characterized by an increase of EPO in the blood to attempt to restore red blood cell production levels to normal. Examples of anemias in which EPO levels are elevated include iron deficiency anemia, reduction of blood flow to the kidney (as in blood loss) and hemoglobinopathies with increased affinity of hemoglobin for oxygen. 1 The EPO production rate is seen to increase exponentially with the decrease in available oxygen and with falling hematocrit in nonrenal anemias; in the latter, EPO levels 1,000 times normal have been reported. 2 Anemia can be secondary to inflammation, rheumatoid arthritis, neoplasm, and chronic renal disease. The "secondary anemias" may, however, be at least partly attributable to underproduction of EPO. 4 A failure to produce sufficient EPO accounts for the moderate to severe anemias observed in end-stage renal disease. Decreased EPO production is attributed to destruction of renal production sites; the renal oxygen sensor may also be affected. Levels of the hormone slightly exceed the reference range at most, and are inadequate to counter the blood loss due to dialysis, shortened red blood cell life, iron and folate deficiency, impaired iron transfer to erythyroid progenitor cells, and other challenges faced by such patients. Anephric patients demonstrate especially low EPO levels. A few patients with chronic kidney failure, however, exhibit normal hematocrits or less serious anemia, and elevated EPO. Some of these patients have cystic kidneys or viral hepatitis; in the latter, increased EPO may have resulted from enhanced hepatic production. 2 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

3 Overproduction of red blood cells is called polycythemia. Polycythemias may also be divided into two categories depending on whether the condition is primary or secondary to EPO levels. In polycythemia vera, EPO levels are diminished, and erythropoiesis is primary to and independent of stimulation by EPO. Variation in EPO values can be as much as tenfold for different patients with the same hematocrit. Certain other conditions may be characterized by the loss of feedback control of oxygen concentration over EPO production, causing an increase in EPO levels. 3 These include renal cell carcinomas, in which 2 percent of patients demonstrate erythrocytosis, and some benign renal lesions, such as single or multiple renal cysts, renal artery stenosis and microvascular abnormalities. In addition, approximately 10 percent of renal transplant patients develop erythrocytosis, sometimes from autologous diseased kidney. Secondary polycythemia is characterized by elevated EPO levels which lead to increased red blood cell mass. This condition may result from a variety of factors, including defective hemoglobin, smoking, pulmonary fibrosis, cardiac disease, tumors, and kidney stones. 5 When assaying EPO for the differential diagnosis of polycythemias, the possible overlap of values for secondary erythrocytosis or for polycythemia vera with those in the reference range must be considered. 3 Principle of the Procedure IMMULITE 2000 EPO is a solid-phase, enzyme-labeled chemiluminescent immunometric assay. The solid phase (bead) is coated with anti-ligand derived from streptavidin. The liquid phase consists of ligand-labeled monoclonal murine anti-epo antibody and alkaline phosphatase (bovine calf intestine) conjugated to monoclonal murine anti-epo antibody. The patient sample and the reagent are incubated together with the coated bead for 30 minutes. During this time, EPO in the sample binds to the ligand-labeled monoclonal murine anti-epo antibody and to the enzyme conjugated murine monoclonal anti-epo antibody forming a sandwich complex. The immune complex is, in turn, captured by the streptavidin on the bead via the biotinylated anti-epo antibody. The unbound enzyme conjugate is removed by centrifugal washes. Finally, chemiluminescent substrate is added to the Reaction Tube containing the bead and the signal is generated in proportion to the bound enzyme. Incubation Cycles: 1 30 minutes Time to First Result: 35 minutes Specimen Collection There are several reports of diurnal variation of erythropoietin in literature references. 7-9 It is important to collect samples at a consistent time of day. Morning samples taken between 7:30 am and 12:00 noon have been recommended. A variation in values may occur if the sample is not clotted at room temperature (15 28 C). Because EDTA would have a significant effect on results, it cannot be used as an anticoagulant. The use of an ultracentrifuge is recommended to clear lipemic samples. Hemolyzed or grossly contaminated samples may give erroneous results. Centrifuging serum samples before a complete clot forms may result in the presence of fibrin. To prevent erroneous results due to the presence of fibrin, ensure that complete clot formation has taken place prior to centrifugation of samples. Some samples, particularly those from patients receiving anticoagulant therapy, may require increased clotting time. Blood collection tubes from different manufacturers may yield differing values, depending on materials and additives, including gel or physical barriers, clot activators and/or anticoagulants. IMMULITE 2000 EPO has not been tested with all possible variations of tube types. Consult the section on Alternate Sample Types for details on tubes that have been tested. Volume Required: 100 µl serum or heparinized plasma. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 3

4 Storage: 7 days at 2 8 C or 2 months at 20 C. Avoid repeated freeze/thaw cycles. Warnings and Precautions For in vitro diagnostic use. CAUTION! POTENTIAL BIOHAZARD Contains human source material. Each donation of human blood or blood component was tested by FDA-approved methods for the presence of antibodies to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and type 2 (HIV-2) as well as for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibody to hepatitis C virus (HCV). The test results were negative (not repeatedly reactive). No test offers complete assurance that these or other infectious agents are absent; this material should be handled using good laboratory practices and universal precautions CAUTION: This device contains material of animal origin and should be handled as a potential carrier and transmitter of disease. H302 + H312, H412 P280, P273, P301 + P312, P302 + P312, P501 Warning! Harmful if swallowed or in contact with skin. Harmful to aquatic life with long lasting effects. Wear protective gloves/ protective clothing/eye protection/face protection. Avoid release to the environment. IF SWALLOWED: Call a POISON CENTER or doctor/physician if you feel unwell. IF ON SKIN: Call a POISON CENTER or doctor/physician if you feel unwell. Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, and national regulations. Contains: sodium azide; EPO Adjustors Reagents: Store at 2 8 C. Dispose of in accordance with applicable laws. Follow universal precautions, and handle all components as if capable of transmitting infectious agents. Source materials derived from human blood were tested and found nonreactive for syphilis; for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis B surface antigen; and for antibodies to hepatitis C. Sodium azide, at concentrations less than 0.1 g/dl, has been added as a preservative. On disposal, flush with large volumes of water to prevent the buildup of potentially explosive metal azides in lead and copper plumbing. Chemiluminescent Substrate: Avoid contamination and exposure to direct sunlight (see insert). Water: Use distilled or deionized water. Materials Supplied Components are a matched set. Labels on the inside box are needed for the assay. EPO Bead Pack (L2EPN12) With barcode. 200 beads, coated with anti-ligand derived from streptavidin. Stable at 2 8 C until expiration date. L2KEPN2: 1 pack L2KEPN6: 3 packs EPO Reagent Wedge (L2EPNA2) With barcode ml ligand-labeled murine monoclonal anti-epo antibody and alkaline phosphatase (bovine calf intestine) conjugated to murine monoclonal anti-epo antibody, in buffer. Stable at 2 8 C until expiration date. L2KEPN2: 1 wedge L2KEPN6: 3 wedges Before use, tear off the top of the label at the perforations, without damaging the barcode. Remove the foil seal from the top of wedge; snap the sliding cover down into the ramps on the reagent lid. EPO Adjustors (LEPNL, LEPNH) Two vials (Low and High) containing lyophilized recombinant human EPO in a nonhuman serum matrix, with preservative. At least 30 minutes before use: reconstitute each vial with 4.0 ml distilled or deionized water. Mix by gentle swirling or inversion until the lyophilized material is fully dissolved. Stable at 2 8 C for 30 days after reconstitution, or for 6 months (aliquotted) at 20 C. L2KEPN2: 1 set L2KEPN6: 2 sets Before making an adjustment, place the appropriate Aliquot Labels (supplied with the kit) on test tubes so that the barcodes can be read by the on-board reader. 4 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

5 Kit Components Supplied Separately Multi-Diluent 2 (L2M2Z, L2M2Z4) For the on-board dilution of patient samples. One vial, concentrated (ready-touse), nonhuman protein/buffer matrix, with preservative. Storage: 30 days (after opening) at 2 8 C or 6 months (aliquotted) at 20 C. L2M2Z: 25 ml L2M2Z4: 55 ml Barcode labels are provided for use with the diluent. Before use, place an appropriate label on a mm test tube, so that the barcodes can be read by the on-board reader. L2M2Z: 3 labels L2M2Z4: 5 labels L2SUBM: Chemiluminescent Substrate L2PWSM: Probe Wash L2KPM: Probe Cleaning Kit LRXT: Reaction Tubes (disposable) L2ZT: 250 Sample Diluent Test Tubes ( mm) L2ZC: 250 Sample Diluent Tube Caps LEPCM: Tri-level EPO Control Module Also Required Distilled or deionized water; test tubes; controls Assay Procedure Note that for optimal performance, it is important to perform all routine maintenance procedures as defined in the IMMULITE 2000 Systems Operator's Manual. See the IMMULITE 2000 Systems Operator's Manual for: preparation, setup, dilutions, adjustment, assay and quality control procedures. Recommended Adjustment Interval: 2 weeks Quality Control Samples: Use controls or sample pools with at least two levels (low and high) of EPO. Expected Values A study performed with the IMMULITE 2000 EPO kit on 170 apparently healthy adult laboratory volunteers, with normal hematocrit values, yielded a median of 10.6 mlu/ml and a central 95% range of 4.3 to 29 mlu/ml. Caution should be exercised in interpreting EPO results for patients with diseases other than anemia. In patients with erythrocytosis due to uncompensated hypoxia, circulating EPO is elevated; in those with compensated hypoxia, the EPO level is usually within the range of normal, and in patients with polycythemia vera, EPO is either normal or low. Thus, while an elevated EPO level suggests that erythrocytosis is a secondary phenomenon and a low EPO level supports the possibility of autonomous erythropoiesis, a normal EPO level excludes neither hypoxia nor autonomous EPO production as the cause of erythrocytosis. Consider these limits as guidelines only. Each laboratory should establish its own reference ranges. Limitations Variations in EPO results have been seen in the presence of anti-species antibodies. No drugs have been tested for assay interference. The results of this assay should be used in conjunction with information available from clinical evaluations and other diagnostic procedures. Because results obtained with any EPO assay may differ significantly from any other, it is recommended that any serial testing performed on the same patient over time should be performed with the same EPO test. Lower EPO levels than expected have been seen with anemias associated with the following conditions: rheumatoid arthritis, acquired immunodeficiency syndrome, cancer, ulcerative colitis, sickle cell disease, and in premature neonates. After allogeneic bone marrow transplant, impaired erythropoietin response may delay erythropoietin recovery. Patients with hypergammaglobulinemia associated with multiple myeloma or Waldenstrom's disease have impaired production of erythropoietin in relation to hemoglobin concentration, and this has been linked to increased plasma viscosity. EPO levels of persons living at high altitudes with erythrocytosis may rapidly fall to normal after returning to low altitudes. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 5

6 EDTA plasma cannot be used as a sample type. (See Alternate Sample Type section.) Heterophilic antibodies in human serum can react with the immunoglobulins included in the assay components causing interference with in vitro immunoassays. [See Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem 1988:34: ] Samples from patients routinely exposed to animals or animal serum products can demonstrate this type of interference potentially causing an anomalous result. These reagents have been formulated to minimize the risk of interference; however, potential interactions between rare sera and test components can occur. For diagnostic purposes, the results obtained from this assay should always be used in combination with the clinical examination, patient medical history, and other findings. Performance Data See Tables and Graphs for data representative of the assay's performance. Results are expressed in miu/ml. Reportable Range: miu/ml (WHO 2nd IRP 67/343) Analytical Sensitivity: Limit of Blank (highest value expected for a sample with no analyte; determined in accordance with CLSI EP17-A 11 ): 0.5 miu/ml Limit of Detection (lowest consistently detectable concentration; determined in accordance with CLSI EP17-A 11 ): 1.0 miu/ml Functional Sensitivity: (concentration with 20% coefficient of variation (CV) determined in accordance with CLSI EP5-A2 12 ): 1.5 miu/ml Precision: Samples were assayed in duplicate over the course of 20 days, two runs per day for a total of 40 runs and 80 replicates for each of three kit lots and two instruments per lot. (See "Precision" table for representative statistics.) High-dose Hook Effect: None up to > 100,000 miu/ml Linearity: Samples were assayed under various dilutions. (See "Linearity" table for representative data.) Recovery: Samples spiked 1 to 19 with three EPO solutions (37.5, 75 and 150 miu/ml) were assayed. (See "Recovery" table for representative data.) Specificity/Interferences: The assay is highly specific for EPO. (See "Specificity/Interferences" table.) Bilirubin: Presence of conjugated and unconjugated bilirubin in concentrations up to 200 mg/l has no effect on results, within the precision of the assay. Hemolysis: Presence of hemoglobin in concentrations up to 597 mg/dl has no effect on results, within the precision of the assay. Lipemia: Presence of triglycerides in concentrations up to 3,000 mg/dl has no effect on results, within the precision of the assay. Alternate Sample Type: To assess the effect of alternate sample types, blood was collected from 52 volunteers into plain, heparinized, and Becton Dickinson SST vacutainer tubes. Some of the matched samples were spiked with EPO to obtain results throughout the calibration range of the assay. All samples were analyzed by the IMMULITE 2000 EPO procedure, with the following results: (Li Heparin) = 1.07 (Serum) miu/ml r = (SST ) = 1.03 (Serum) miu/ml r = Means: 116 miu/ml (Serum) 125 miu/ml (Li Heparin) 119 miu/ml (SST ) In another study, blood was collected from 52 volunteers into plain and EDTA Becton Dickinson vacutainer tubes. Some of the matched samples were spiked with EPO to obtain results throughout the calibration range of the assay. All samples were analyzed by the IMMULITE 2000 EPO procedure, with the following results: (EDTA) = (Serum) miu/ml r = Means: 143 miu/ml (Serum) 104 miu/ml (EDTA) Because EDTA would have a significant effect on results, it cannot be used as an anticoagulant. 6 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

7 Method Comparison: The assay was compared to Access 2 EPO kit from Beckman Coulter Inc. on 173 endogenous serum samples. (Concentration range: from 1.1 to 701 miu/ml. See graph.) By linear regression: (IML 2000) = 1.07 (Access) 1.87 miu/ml r = Means: 84.3 miu/ml (IMMULITE 2000) 80.4 miu/ml (Access) References 1) Eckardt KU, Bauer C. Erythropoietin in health and disease. Europ J Clin Invest 1989;19: ) Eschbach J, Adamson J. Recombinant human erythropoietin: implications for nephrology. Am J Kidney Dis 1988;11: ) Koch KM, Kuhn K, Nonnast- Daniel B, Scigalla P, volume editors. Treatment of renal anemia with recombinant human erythropoietin. In: Berlyne GM, Giovannetti S, series editors. Contributions to Nephrology. New York: Karger, 1988; 66:1-15 and ) Mengel et al. Hematology: principles and practice. Chicago: Year Book Medical Publishers Inc., ) Braunwald E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Wilson JD, Martin JB, Fanci AS, editors. Harrison's principles of internal medicine. 11th ed. New York: McGraw-Hill, 1987:149, ) Raine AEG. Hypertension, blood viscosity, and cardiovascular morbidity in renal failure: implications of erythropoietin therapy. Lancet 1988;1: ) Miller ME, Garcia JF, Cohen RA, Cronkite EP, Moccia G, Acevado J. Diurnal levels of immunoreactive erythropoietin in normal subjects and subjects with chronic lung disease. Br J Haematol 1981;49: ) Wide L, Bengtsson C, Birgegard G. Circadian Rhythm of erythropoietin in human serum. Br J Haematol 1989;72: ) Cahan C, Decker MJ, Arnold JL, Washington LH, Veldhuis JD, Goldwasser E, Strohl DP. Diurnal Variations in serum erythropoietin levels in healthy subjects and sleep apnea patients. J Appl Physiol 1992;72: ) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture; approved standard. 4th ed. NCCLS Document H3-A4, Wayne, PA: NCCLS, ) CLSI. Protocols for the Dtermination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline. CLSI document EP17-A Vol. 24 (No. 34). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania , USA, ) Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline-Second Edition. CLSI document EP5-A2. CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania , USA, ) Centers for Disease Control. Update: Universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus and other bloodborne pathogens in healthcare settings. MMWR, 1988;37:377 82, ) Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline - Third Edition. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; NCCLS Document M29-A3. 15) Federal Occupational Safety and Health Administration, Bloodborne Pathogens Standard, 29 CFR Technical Assistance For technical assistance, contact your National Distributor. The Quality System of Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. is certified to ISO 13485:2003. Tables and Graphs Precision (miu/ml) Within-Run 1 Total 2 Mean 3 SD 4 CV 5 SD CV % % % % % % % % % % % % % % Česky. 1 V rámci stanovení, 2 Celkem, 3 Střední hodnota, 4 Směrodatná odchylka, 5 Variační koeficient. Ελληνικά. 1 Κατά την ίδια περίοδο, 2 Συνολικά, 3 Μέσος όρος, 4 SD, 5 CV. Polski. 1 W serii, 2 Całość, 3 Średnie, 4 SD, 5 CV. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 7

8 Linearity (miu/ml) Dilution 1 Observed 2 Expected 3 %O/E in in % 2 in % 1 in % 2 8 in in % 2 in % 1 in % 3 8 in in % 2 in % 1 in % 4 8 in in % 2 in % 1 in % 5 8 in in % 2 in % 1 in % 6 8 in in % 2 in % 1 in % Česky. 1 Ředění, 2 Naměřená, 3 Očekávaná, 4 % Naměřená / Očekávaná, 5 8 v 8. Ελληνικά. 1 Αραίωση, 2 Παρατηρούμενη (O), 3 Αναμενόμενη (E), 4 % O/E, 5 8 στα 8. Polski. 1 Rozcieńczenie, 2 Zmierzone (Z), 3 Oczekiwane (O), 4 % Z/O, 5 8 w 8. Recovery (miu/ml) Solution 1 Observed 2 Expected 3 %O/E A % B % C % A % B % C % A % B % C % A % B % C % A % B % C % A % B % C % Česky. 1 Roztok, 2 Naměřená, 3 Očekávaná, 4 Naměřená / Očekávaná. Ελληνικά. 1 Διάλυμα, 2 Παρατηρούμενη (O), 3 Αναμενόμενη (E), 4 % O/E. Polski. 1 Roztwór, 2 Zmierzone (Z), 3 Oczekiwane (O), 4 % Z/O. 8 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

9 Specificity/Interferences Compound 1 Human Serum Albumin µg/ml Added 2 % Crossreactivity 3 35,000 ND α-1 Antitrypsin 5,000 ND α-acid Glycoprotein 1,400 ND Human α-globulin 50,000 ND Human Transferrin (iron-saturated) 4,000 ND Human Transferrin (nonsaturated) 4,000 ND Acetaminophen 1,000 ND Acetylsalicylic Acid 1,000 ND Ibuprofen 2,000 ND α-2 Macroglobulin 3,750 ND Gamma Globulin 500 ND EPO receptor 0.05 ND Recombinant Human Thrombopoietin 0.05 ND Rheumatoid Factor 1.22 ND ND: Not detectable. 4 Česky. 1 Sloučenina, 2 Přidané množství, 3 % Zkřížená reaktivita, 4 ND: nezjistitelné. Ελληνικά. 1 Μείγμα, 2 Προστέθηκαν, 3 % Διασταυρ.Αντίδραση, 4 ND: Μη ανιχνεύσιμη ποσότητα. Polski. 1 Składnik, 2 Ilość dodana, 3 % reaktywności Krzyżowej, 4 ND: Nieoznaczlne. Method Comparison IMMULITE 2000 EPO, miu/ml Beckman Access 2 EPO, miu/ml (IML 2000) = 1.07 (Access) 1.87 miu/ml r = English. EPO Česky. EPO. Ελληνικά. EPO. Polski. EPO. Česky IMMULITE 2000 EPO Použití: Pro in vitro diagnostické použití na analyzátorech IMMULITE 2000 ke stanovení koncentrace erytropoetinu (EPO) v séru nebo heparinizované plazmě, jakožto pomůcky při diagnostice anémií a polycytémií. S rozvojem podávání rekombinantního EPO jako biologické terapie ke zvýšení objemu erytrocytů lze stanovení EPO také použít jako pomůcku při stanovení prognózy a monitoraci odpovědi na léčbu touto látkou u anemiků. Katalogové číslo: L2KEPN2 (200 stanovení), L2KEPN6 (600 stanovení) Kód metody: EPN Barva: tmavì zelená Shrnutí a vysvětlení Erytropoetin (EPO) je glykoproteinový hormon skládající se z 165 aminokyselin, který má čtyři komplexní karbohydrátové řetězce připojené na čtyřech vazebných místech na peptid. 1 Jeho molekulová hmotnost je daltonů, z toho 40% připadá na karbohydrátové řetězce. EPO je primárním regulátorem erytropoézy, stimuluje proliferaci a diferenciaci erytroidních prekurzorových buněk v kostní dřeni. U savců ve fetálním stadiu produkují tento hormon téměř výlučně játra. U dospělých tvorba EPO v játrech klesá na méně než 10% a více než 90% tvorby zajišťují ledviny. 2,3 Místem tvorby jsou pravděpodobně proximální tubulární buňky ledvin nebo peritubulární kapilární endoteliální buňky ledvinové kůry a vnější dřeně. Odstraňování EPO z cirkulace není zcela objasněno, ale částečně souvisí s vylučováním moči a možná též s eliminací v játrech a absorpcí do terčových buněk kostní dřeně. EPO upravuje produkci červených krvinek tak, aby uspokojily poptávku tkání po kyslíku. 1 Jeho vliv se uplatňuje skrze komplexní systém se zpětnou vazbou. Sekrece tohoto hormonu je regulována kyslíkovým senzorem v ledvinách, který reaguje na parciální tlak kyslíku v krvi. Za stavu zvýšeného množství vnějšího kyslíku se hladina EPO snižuje. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 9

10 To nastává po korekci hypoxie u zdravých osob (například při sestupu z vysokých výšek) a po hypertransfuzi. Anémie můžeme s ohledem na koncentraci EPO v krvi rozdělit do dvou kategorií: podle toho, zda jsou vůči koncentraci EPO primární nebo sekundární. Primární anémie se vyznačují nárůstem hladiny EPO v krvi ve snaze obnovit tvorbu červených krvinek na normální hodnotu. Mezi tento typ anémií se zvýšenou hladinou EPO patří například anémie z nedostatku železa, redukce krevního toku do ledvin (jako při ztrátě krve) a hemoglobinopatie se zvýšenou afinitou hemoglobinu ke kyslíku. 1 Míra tvorby EPO roste exponenciálně s poklesem využitelného kyslíku a s klesajícím hematokritem u neledvinových anémií. U těchto neledvinových anémií byly zjištěny hodnoty EPO zvýšené až tisíckrát. 2 Anémie může být sekundárním onemocněním při zánětech, revmatoidní artritidě, novotvarech a při chronickém onemocnění ledvin. I "sekundární anémie" mohou ale být alespoň částečně způsobené nedostatečnou tvorbou EPO. 4 Neschopnost tvořit dostatečné množství EPO je příčinou mírných až těžkých anémií pozorovaných v konečném stadiu ledvinového onemocnění. Pokles tvorby EPO je způsobený poškozením míst tvorby EPO v ledvinách a zasažený může být i kyslíkový senzor. Hladina tohoto hormonu přinejlepším mírně převyšuje referenční rozmezí a nestačí tak vyrovnávat ztrátu krve způsobenou dialýzou, zkrácenou dobou života červených krvinek, nedostatkem železa a kyseliny listové, poruchou přenosu železa do erytroidních progenitorových buněk a ostatními nároky, kterým musí tito pacienti čelit. Zvláště nízká koncentrace EPO se vyskytuje zejména u anefrických pacientů. U některých pacientů s chronickým selháním ledvin je ale hematokrit normální, anémie není natolik závažná a koncentrace EPO je zvýšená. Někteří z těchto pacientů mají cystické ledviny nebo virovou hepatitidu, přičemž u hepatitidy zvýšenou tvorbu EPO může způsobit jeho zvýšená tvorba v játrech. Nadprodukce červených krvinek se nazývá polycytémie. Polycytémie se rovněž dají rozdělit do dvou kategorií s ohledem na to, zda je tento stav primární nebo sekundární vůči množství EPO. U polycytémie vera se hladina EPO snižuje a erytropoéza je primární a nezávislá na stimulaci hormonem EPO. Rozdíly v množství EPO můžou být u jednotlivých pacientů se stejným hematokritem až desetinásobné. Pro některé stavy může být charakteristická ztráta zpětné vazby při regulaci koncentrace kyslíku prostřednictvím tvorby EPO, což má za následek zvýšené množství EPO. 3 Sem patří karcinomy ledvinových buněk, při kterých 2% pacientů vykazují erytrocytózu, a některé zhoubné ledvinové léze, jako jsou samostatné nebo vícečetné ledvinové cysty, zúžení ledvinové tepny a mikrovaskulární abnormality. Dále se u asi 10% pacientů po transplantaci ledvin vyvine erytrocytóza, někdy z autologního onemocnění ledvin. Sekundární polycytémie je charakteristická zvýšením koncentrace EPO, která vede k nárůstu množství červených krvinek. Tento stav může být důsledkem celé řady faktorů včetně porušeného hemoglobinu, kouření, fibrózy plic, srdečního onemocnění, nádorů a ledvinových kamenů. 5 Při stanovení množství EPO z důvodu určení diferenční diagnózy u nadbytku červených krvinek je třeba zvážit případné překrývání hodnot sekundární erytrocytózy a polycytémie vera s hodnotami v rámci referenčního rozmezí. 3 Princip Stanovení IMMULITE 2000 EPO je chemiluminiscenèní imunometrické enzymem znaèené stanovení na pevné fázi. Pevná fáze (kulièka) je potažena protilátkou proti ligandu odvozenému ze streptavidinu. Kapalná fáze se skládá z ligandem oznaèené monoklonální myší protilátky proti EPO a alkalické fosfatázy (z telecích støev) konjugované se stejnou protilátkou. Vzorek paciena je inkubován s reagencií a potaženou kulièkou po 30 minut. Bìhem této doby se EPO ve vzorku naváže na ligandem oznaèenou monoklonální myší protilátku proti EPO a na protilátku s konjugovaným enzymem a vytvoøí tak sendvièový komplex. Tento imunokomplex je pak zachycen streptavidinem na kulièce 10 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

11 pomocí protilátky proti EPO s navázaným biotinylem. Nevázaný konjugát enzymu je odstranìn opakovaným promytím a centrifugací. Nakonec je do reakèní zkumavky s kulièkou pøidán chemiluminiscenèní substrát a smìs generuje svìtelný signál pøímo úmìrný množství vázaného enzymu. Inkubaèní cykly: 1 x 30 minut Doba do prvního výsledku: 35 minut Odebírání vzorků V literatuře existuje několik zmínek o kolísání množství EPO v během dne. 7-9 Je proto důležité vzorky odebírat vždy ve stejnou hodinu. Ranní vzorky se mají odebírat mezi 7:30 a 12:00. Hodnoty můžou kolísat, když vzorek není vysrážen při pokojové teplotě. (15 28 C). EDTA nelze používat jako antikoagulant došlo by k významnému zkreslení výsledkù. K úpravě lipemických vzorků se doporučuje použití ultracentrifugy. Hemolyzované nebo značně kontaminované vzorky můžou poskytovat chybné výsledky. Centrifugace vzorků séra ještě před úplným vysrážením může mít za následek přítomnost fibrinu. Chybným výsledkům způsobeným přítomností fibrinu lze zamezit úplným vysrážením vzorků před jejich centrifugací. Některé vzorky, zejména od pacientů podstupujících antikoagulační léčbu, může srážlivost vyžadovat více času. Použití zkumavek pro odběr krve od různých výrobců může poskytovat rozličné hodnoty v závislosti na materiálech a přísadách, včetně gelových nebo fyzických bariér, aktivátorů srážení a/nebo antikoagulačních činidel. Stanovení EPO na analyzátorech IMMULITE 2000 nebylo testováno se všemi možnými varianty jednotlivých typů zkumavek. Informace o testovaných zkumavkách najdete v části o alternativních typech vzorků. Potřebný objem vzorku: 100 μl séra nebo heparinizované plazmy Skladování: 7 dní při teplotě 2 8 C nebo 2 měsíce při 20 C. Zamezte opakovanému rozmrazování a zmrazování. Upozornění a bezpečnostní opatření Pro in vitro diagnostické použití. POZOR! POTENCIÁLNÍ BIOHAZARD Obsahuje materiál lidského původu. Každé darování krve nebo jejích složek bylo testováno metodami schválenými FDA na přítomnost protilátek proti viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) a typu 2 (HIV-2) a také na povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg) a protilátky proti viru hepatitidy C (HCV). Výsledky testu byly negativní (opakovaně nereaktivní). Žádný test však není absolutní zárukou nepřítomnosti uvedených nebo jiných infekčních zárodků; s materiálem proto zacházejte podle zásad správné laboratorní praxe a dbejte obecných bezpečnostních opatření UPOZORNĚNÍ : Souprava obsahuje material živočišného původu, se kterým je třeba zacházet jako s potenciálním nosičem a přenašečem nemocí H302 + H312, H412 P280, P273, P301 + P312, P302 + P312, P501 Výstraha! Zdraví škodlivý při požití a při styku s kůží. Škodlivý pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. Používejte ochranné rukavice/ochranný oděv/ ochranné brýle/obličejový štít. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte TOXIKO- LOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. PŘI STYKU S KŮŽÍ: Necítíte-li se dobře, volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, regionálními a národními předpisy. Obsahuje: azid sodný; EPO kalibrátory Reagencie: Skladujte při teplotě 2 8 C. Likvidujte v souladu s platnými předpisy. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 11

12 Řiďte se obecnými pravidly bezpečnosti práce a se všemi komponenty nakládejte, jako by byly potenciálně infekční. Zdrojové materiály získané z lidské krve byly testovány a shledány nereaktivní na syfilis, na protilátky proti HIV 1 a 2, na povrchový antigen hepatitidy typu B (HBsAg), a na protilátky proti hepatitidě typu C. Jako konzervační látka byl přidán azid sodný v koncentracích menších než 1 g/l. Při likvidaci vypláchněte velkým množstvím vody, aby se zamezilo nahromadění potenciálně výbušných azidů kovů v olověném a měděném potrubí. Chemiluminiscenční substrát: Vyvarujte se kontaminace a nevystavujte přímému slunečnímu světlu (viz připojený letáček). Voda: Použijte destilovanou nebo deionizovanou vodu. Dodaný materiál Komponenty představují ucelenou sadu. Pro stanovení jsou zapotřebí štítky s čárovým kódem na krabici. EPO zásobník s kuličkami (L2EPN12) Opatřeno čárovým kódem. 200 kulièek potažených protilátkou proti ligandu odvozenému ze streptavidinu. Stabilní pøi teplotì 2 8 C až do data exspirace. L2KEPN2: 1 balení L2KEPN6: 3 balení EPO reagencie (L2EPNA2) Opatřeno čárovým kódem. 11,5 ml ligandem oznaèené monoklonální myší protilátky proti EPO a alkalické fosfatázy (z telecích støev) konjugované se stejnou protilátkou, to vše v pufru. Stabilní pøi teplotì 2 8 C až do data exspirace. L2KEPN2: 1 nádobka L2KEPN6: 3 nádobky Před použitím utrhněte vršek štítku v perforovaném místě, ale nepoškoďte čárový kód. Z vrchu nádobky odstraňte uzavírací fólii; posuvný uzávěr zaklapněte do ramp na víčku reagencie. EPO kalibrátory (LEPNL, LEPNH) Dvì lahvièky (nízká a vysoká koncentrace) obsahující lyofilizovaný rekombinantní lidský EPO v nehumánním séru, s konzervaèní látkou. Alespoň 30 minut před použitím rekonstituujte každou ampulku přidáním 4,0 ml destilované nebo deionizované vody. Míchejte jemným kroužením nebo překlápěním až do úplného rozpuštění lyofilizovaného materiálu. Stabilní 30 dní po rekonstituci při teplotě 2 8 C nebo rozdělené na alikvotní části 6 měsíců při teplotě 20 C. L2KEPN2: 1 sada L2KEPN6: 2 sady Před adjustací nalepte na testovací zkumavky příslušné alikvotní štítky (dodané se soupravou) tak, aby zabudovaný snímač mohl přečíst čárové kódy. Materiál dodávaný zvlášť Multidiluent 2 (L2M2Z, L2M2Z4) Pro automatické ředění vzorků analyzátorem. Jedna ampulka koncentrované (připravené k použití), nehumánní bílkovino/pufrové matrice, s konzervačním prostředkem. Stabilní 30 dní po otevření při teplotě 2 8 C nebo rozdělené na alikvotní části 6 měsíců při 20 C. L2M2Z: 25 ml L2M2Z4: 55 ml Štítky s čárovými kódy jsou určeny pro diluent. Před použitím nalepte příslušný štítek na testovací zkumavku mm tak, aby zabudovaný snímač mohl přečíst čárové kódy. L2M2Z: 3 štítky. L2M2Z4: 5 štítků. L2SUBM: Chemiluminiscenční substrát L2PWSM: Promývací roztok L2KPM: Čistící roztok na jehly LRXT: Reakční zkumavky (na jedno použití) L2ZT: 250 testovacích zkumavek na diluent vzorků ( mm) L2ZC: 250 uzávěrů na testovací zkumavky na diluent vzorků LEPCM: Trojúrovňový EPO kontrolní modul Dále potřebujete: Destilovanou nebo deionizovanou vodu; testovací zkumavky, kontroly 12 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

13 Postup stanovení K dosažení optimálního výkonu je důležité provádět veškerou pravidelnou údržbu stanovenou v manuálu k analyzátorům IMMULITE V manuálu k analyzátorům IMMULITE 2000 najdete postupy: přípravy, nastavení, ředění, adjustace, stanovení vzorků a kontrol. Doporučený interval mezi adjustacemi: 2 týdny Vzorky ke kontrole kvality: Použijte kontroly nebo směsné vzorky s alespoň dvěmi koncentracemi (vysokou a nízkou) EPO. Očekávané hodnoty Pøi studii provádìné pomocí stanovení IMMULITE 2000 EPO u 170 zdravých dospìlých dobrovolníkù v laboratoøi (normální hodnoty hematokritu) byl zjištìn medián 10,6 miu/ml se støedním 95 % rozsahem 4,3 29 miu/ml. Při interpretaci výsledků měření EPO u pacientů s jiným onemocněním než je anémie je třeba dbát opatrnosti. Pacienti s erytrocytózou způsobenou nekompenzovanou hypoxií mají zvýšenou hladinu imunoreaktivního EPO v séru. U pacientů s kompenzovanou hypoxií je koncentrace imunoreaktivního EPO v séru obyčejně v rámci normálního rozmezí a u pacientů s polycytémií vera je hladina imunoreaktivního EPO v séru buď normální nebo nízká. Zatímco tedy zvýšená koncentrace EPO v séru nasvědčuje, že erytrocytóza je sekundárním jevem a snížená koncentrace EPO podporuje možnost existence autonomní erytropoézy, normální hladina EPO v séru nevylučuje ani hypoxii, ani autonomní tvorbu EPO jakožto příčinu erytrocytózy. Uvedené hranice považujte pouze za orientační. Každá laboratoř by si měla stanovit svoje vlastní referenční rozmezí. Omezení Výkyvy v hodnotách EPO se objevily v přítomnosti proti-druhových protilátek. Interference tohoto stanovení s léky nebyla prověřována. Výsledek tohoto stanovení je nutné použít ve spojení s informacemi z klinického hodnocení a ostatních diagnostických metod. Protože výsledky obdržené použitím různých EPO testů se můžou navzájem významně lišit, doporučuje se, aby jakékoliv sériové vyšetření vzorků od jedno pacienta v určitém časovém období bylo prováděno vždy pomocí stejného testu EPO. Nižší než očekávané koncentrace EPO se vyskytly u následujících stavů: revmatoidní artritida, získaný syndrom nedostatečné imunity, rakovina, ulcerativní kolitída, onemocnění srpkovitých buněk a u předčasně narozených dětí. Po alogenní transplantaci kostní dřeně může narušená erytropoetinová odezva způsob zpoždění obnovení erytropoetinu. Pacienti s hypergamaglobulinémii spojenou s četnými myelomy nebo Waldenstromovou nemocí mají narušenou tvorbu EPO ve spojitosti s koncentrací hemoglobinu, což doprovází zvýšená viskozita plazmy. Hladina EPO u lidí s erytrocytózou žijících ve velkých nadmořských výškách může po jejich návratu do nižších výšek prudce klesnout na normální úroveň. Ke stanovení nelze použít EDTA plazmu (viz èást Alternativní typ vzorku). Heterofilní protilátky v lidském séru můžou reagovat s imunoglobuliny obsaženými v komponentech soupravy a způsobit interference s in vitro imunologickým stanovením. [Viz Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all imunologickým stanovením. Clin Chem 1988:34:27-33.] Vzorky pacientů rutinně vystavených kontaktu se zvířaty nebo produkty zvířecího séra můžou vykázat tento typ interference a potenciálně způsobit anomální výsledky. Tyto reagencie byly vyvinuty tak, aby bylo riziko interference minimalizováno; nicméně případné interakce mezi ojedinělými séry a komponenty testu se můžou vyskytnout. Pro diagnostické účely by se výsledky tohoto stanovení měly vždy používat v kombinaci s klinickými zkouškami, zdravotní historií pacienta a ostatními nálezy. IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 13

14 Znaky metody Reprezentativní výsledky stanovení najdete v části Tabulky a grafy. Výsledky se udávají v miu/ml. Pracovní rozsah: 1,0 750 miu/ml (WHO 2nd IRP 67/343) Analytická citlivost: limit blanku (nejvyšší hodnota oèekávaná u vzorku bez stanovované látky; zjištìna v souladu s CLSI EP17-A 11 ): 0,5 miu/ml Detekèní limit (nejnižší konzistentnì detekovatelná hodnota; zjištìna v souladu s CLSI EP17-A 11 ): 1,0 miu/ml Funkèní citlivost: (koncentrace s variaèním koeficientem (CV) 20 %, zjištìna v souladu s CLSI EP5-A2 12 ): 1,5 miu/ml Pøesnost: Vzorky byly testovány v duplikátech po 20 dní, ve 2 bìzích za den (celkem 40 bìhù a 80 replikátù) s každou ze 3 šarží soupravy a dvìma pøístroji na šarži. (Reprezentativní statistické údaje viz tabulka Pøesnost.) High-dose Hook Effect: Do koncentrace > miu/ml žádný Linearita: Stanovení vzorků bylo provedeno při rozličném ředění. (Reprezentativní hodnoty najdete v tabulce Linearita.) Zpětná výtěžnost: Bylo provedeno stanovení vzorků séra s přídavkem tří roztoků EPO (37,5, 75 a 150 miu/ml) v poměru 1:19. (Reprezentativní hodnoty najdete v tabulce Zpětná výtěžnost.) Specificita a interference: Toto stanovení je vysoce specifické pro EPO. (Viz tabulka Specificita a interference.) Bilirubin: Přítomnost konjugovaného a nekonjugovaného bilirubinu v koncentracích do 200 mg/l nemá v rámci přesnosti stanovení žádný vliv na výsledky. Hemolýza: Přítomnost hemoglobinu v koncentracích do 597 mg/dl nemá v rámci přesnosti stanovení žádný vliv na výsledky. Lipémie: Přítomnost triglyceridů v koncentracích do 3000 mg/dl nemá v rámci přesnosti stanovení žádný vliv na výsledky. Alternativní typ vzorku: K posouzení vlivu alternativních typù vzorkù byla krev odebrána od 52 dobrovolníkù do obyèejných zkumavek, zkumavek heparinizovaných, a zkumavek Becton Dickinson SST Vacutainer. Nìkteré série vzorkù byly obohaceny EPO k zajištìní výsledkù v celém kalibraèním rozsahu stanovení. Všechny vzorky byly analyzovány metodou IMMULITE 2000 EPO, a to s následujícími výsledky: (Li Heparin) = 1,07 (Sérum) + 0,695 miu/ml r = 0,998 (SST ) = 1,03 (Sérum) + 0,297 miu/ml r = 0,998 Střední hodnoty: 116 miu/ml (Sérum) 125 miu/ml (Li Heparin) 119 miu/ml (SST ) V další studii byla krev od 52 dobrovolníků odebrána do obyčejných zkumavek nebo EDTA Becton Dickinson. Nìkteré série vzorkù byly obohaceny EPO k zajištìní výsledkù v celém kalibraèním rozsahu stanovení. Všechny vzorky byly analyzovány metodou IMMULITE 2000 EPO, a to s následujícími výsledky: (EDTA) = 0,729 (Sérum) 0,376 miu/ml r = 0,994 Střední hodnoty: 143 miu/ml (Sérum) 104 miu/ml (EDTA) EDTA nelze používat jako antikoagulant došlo by k významnému zkreslení výsledkù. Srovnání metod: Výsledky stanovení byly porovnávány se soupravou Access 2 EPO od firmy Beckman Coulter Inc., a to na 173 endogenních sérových vzorcích. Rozsah koncentrace: 1,1 701 miu/ml. Viz graf. Výpoèet lineární regrese: (IML 2000) = 1,07 (Access) 1,87 miu/ml r = 0,983 Střední hodnoty: 84,3 miu/ml (IMMULITE 2000) 80,4 miu/ml (Access) Technická Podpora Pro technickou podporu kontaktujte vašeho národního distributora. Systém kontroly jakosti společnosti Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. je certifikovaný podle ISO 13485: IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

15 Ελληνικά IMMULITE 2000 EPO Ενδεδειγμένη χρήση: Για in vitro διαγνωστική χρήση με τα συστήματα αναλυτών IMMULITE 2000 για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ερυθροποιητίνης (ΕΡΟ) στον ορό ή το ηπαρινισμένο πλάσμα, ως βοήθημα στη διάγνωση της αναιμίας και της πολυκυτταραιμίας. Με την εμφάνιση της χορήγησης ανασυνδυασμένης EPO ως βιολογικής θεραπείας για την αύξηση της μάζας των ερυθροκυττάρων, μια ανάλυση EPO μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να βοηθήσει στην πρόβλεψη και παρακολούθηση της απόκρισης στην αγωγή ανασυνδυασμένης EPO σε άτομα με αναιμία. Αριθμός καταλόγου: L2KEPN2 (200 εξετάσεις), L2KEPN6 (600 εξετάσεις) Κωδικός Ανάλυσης: EPN Χρώμα: Σκούρο πράσινο Περίληψη και επεξήγηση: Η ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ) είναι μια ορμόνη γλυκοπρωτεΐνη, η οποία αποτελείται από 165 αμινοξέα, με τέσσερις αλυσίδες σύνθετων υδατανθράκων που προσαρτώνται στο πεπτίδιο σε τέσσερα σημεία σύνδεσης. 1 Έχει μοριακό βάρος dalton, το 40% του οποίου αποδίδεται στις αλυσίδες υδατανθράκων. Η ΕΡΟ είναι ο βασικός ρυθμιστής της ερυθροποίησης και διεγείρει την αναπαραγωγή και διαφοροποίηση των πρόδρομων ερυθρών κυττάρων του μυελού των οστών. Στα θηλαστικά, το ήπαρ του εμβρύου παράγει το σύνολο σχεδόν των ορμονών. Στους ενήλικες, η παραγωγή από το ήπαρ μειώνεται σε ποσοστά κάτω του 10%, ενώ οι νεφροί εκκρίνουν ποσοστά άνω του 90%. 2,3 Πιστεύεται ότι η παραγωγή γίνεται στα κύτταρα των εγγύς νεφρικών σωληναρίων ή στα ενδοθηλιακά κύτταρα των περισωληνοειδών τριχοειδών του νεφρικού φλοιού και του εξωτερικού τμήματος του μυελού. Η κάθαρση της κυκλοφορούσας ΕΡΟ δεν έχει εξηγηθεί πλήρως, ωστόσο επιτυγχάνεται κατά ένα μικρό μέρος με αποβολή δια των ούρων, ενδεχομένως με ηπατική εξουδετέρωση και με την πρόσληψή της σε κύτταρα στόχους του μυελού. Η EPO ρυθμίζει την παραγωγή ερυθροκυττάρων, ώστε να καλύπτει τις απαιτήσεις οξυγόνωσης των ιστών. 1 Επηρεάζει ένα σύνθετο σύστημα ανατροφοδότησης, στο οποίο η νεφρική έκκριση της ορμόνης ελέγχεται από έναν αισθητήρα οξυγόνου στο νεφρό, που αντιδρά στη μερική πίεση του οξυγόνου του αίματος. Τα επίπεδα ΕΡΟ μειώνονται, όταν αυξάνεται το περιφερειακό οξυγόνο. Κάτι τέτοιο παρατηρείται μετά την διόρθωση της υποξίας σε υγιή άτομα (μετά από κάθοδο από υψηλό υψόμετρο) και μετά από υπερμετάγγιση. Οι αναιμίες διακρίνονται σε δύο κατηγορίες ως προς τα επίπεδα της ΕΡΟ στο αίμα: τις πρωτοπαθείς που εξαρτώνται από τα επίπεδα της ΕΡΟ και τις δευτεροπαθείς. Οι πρωτοπαθείς αναιμίες χαρακτηρίζονται από αύξηση της ΕΡΟ στο αίμα, σε μια προσπάθεια αποκατάστασης των φυσιολογικών επιπέδων παραγωγής ερυθροκυττάρων. Ορισμένα παραδείγματα αναιμίας με αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ είναι η σιδηροπενική αναιμία, η μείωση της ροής αίματος στους νεφρούς (π.χ. απώλεια αίματος) και οι αιμοσφαιρινοπάθειες με αυξημένη συγγένεια της αιμοσφαιρίνης με το οξυγόνο. 1 Ο ρυθμός παραγωγής ΕΡΟ φαίνεται να αυξάνεται ραγδαία κατά τη μείωση του διαθέσιμου οξυγόνου και την πτώση του αιματοκρίτη στις μη νεφρογενείς αναιμίες. Στην τελευταία περίπτωση, έχουν καταγραφεί επίπεδα ΕΡΟ φορές υψηλότερα από τα φυσιολογικά. 2 Η αναιμία μπορεί να είναι δευτεροπαθείς σε περιπτώσεις φλεγμονών, ρευματοειδούς αρθρίτιδας, νεοπλασμάτων και χρόνιας νεφροπάθειας. Ωστόσο, οι "δευτεροπαθείς αναιμίες" αποδίδονται τουλάχιστον εν μέρει στη μειωμένη παραγωγή ΕΡΟ. 4 Η αδυναμία παραγωγής επαρκών ποσοτήτων ΕΡΟ ευθύνεται για τις μέτριες έως σοβαρές αναιμίες που παρατηρούνται στις νεφροπάθειες τελικού σταδίου. Η μειωμένη παραγωγή ΕΡΟ οφείλεται στην καταστροφή των σημείων παραγωγής στο νεφρό. Επίσης, μπορεί να παρατηρηθεί βλάβη στον αισθητήρα οξυγόνου του νεφρού. Τα επίπεδα της ορμόνης υπερβαίνουν ελαφρά τις τιμές αναφοράς και δεν επαρκούν για τη μέτρηση της IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 15

16 απώλειας αίματος λόγω της αιμοδιύλυσης, του μειωμένου χρόνου ζωής των ερυθροκυττάρων, της έλλειψης σιδήρου και φυλικού οξέως, της ελλιπούς μεταφοράς σιδήρου στα πρόδρομα ερυθρά κύτταρα και άλλων προβλημάτων που αντιμετωπίζουν αυτοί οι ασθενείς. Οι ασθενείς χωρίς νεφρούς παρουσιάζουν ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα ΕΡΟ. Ωστόσο, κάποιοι ασθενείς με χρόνια νεφρική ανεπάρκεια έχουν φυσιολογικό αιματοκρίτη ή λιγότερο σοβαρή αναιμία και αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ. Ορισμένοι από αυτούς τους ασθενείς έχουν πολυκυστικούς νεφρούς ή ιογενή ηπατίτιδα. Στους τελευταίους, τα αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ μπορεί να οφείλονται στην αυξημένη ηπατική παραγωγή. Η υπερπαραγωγή ερυθροκυττάρων ονομάζεται πολυκυτταραιμία. Η πολυκυτταραιμία διακρίνεται σε δύο κατηγορίες ανάλογα με το εάν είναι πρωτοπαθής ή δευτεροπαθής ως προς τα επίπεδα EPO. Στην αληθή πολυκυτταραιμία, τα επίπεδα ΕΡΟ είναι σχεδόν μηδενικά και η ερυθροποίηση είναι πρωτογενής και ανεξάρτητη από τη διέγερση που προκαλεί η ΕΡΟ. Η απόκλιση των τιμών ΕΡΟ μπορεί να είναι δεκαπλάσια μεταξύ ασθενών με τα ίδια επίπεδα αιματοκρίτη. Ορισμένες άλλες νόσοι μπορεί να χαρακτηρίζονται επίσης από την απώλεια του αναδραστικού ελέγχου των συγκεντρώσεων οξυγόνου εκτός της παραγωγής ΕΡΟ, προκαλώντας αύξηση των επιπέδων EPO. 3 Σε αυτές περιλαμβάνονται τα καρκινώματα των νεφρικών κυττάρων, όπου το 2% των ασθενών παρουσιάζει ερυθροκυττάρωση, καθώς και ορισμένες καλοήθεις νεφρικές βλάβες, όπως οι μεμονωμένες ή πολλαπλές νεφρικές κύστες, η στένωση της νεφρικής αρτηρίας και οι μικροαγγειακές ανωμαλίες. Επιπλέον, περίπου 10% των ασθενών που έχουν υποβληθεί σε μεταμόσχευση νεφρού παρουσιάζουν ερυθροκυττάρωση, ορισμένες φορές από τον αυτόλογο νοσούντα νεφρό. Η δευτερογενής πολυκυτταραιμία χαρακτηρίζεται από αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ με συνεπαγόμενη αύξηση της μάζας των ερυθροκυττάρων. Αυτή η κατάσταση μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της παθολογικής αιμοσφαιρίνης, του καπνίσματος, της πνευμονικής ίνωσης, της καρδιακής νόσου, όγκων και λίθων στους νεφρούς. 5 Κατά την εξέταση της ΕΡΟ για τη διαφορική διάγνωση της πολυκυτταραιμίας, να λαμβάνεται υπόψη η ενδεχόμενη αλληλοεπικάλυψη των τιμών της δευτεροπαθούς ερυθροκυττάρωσης ή της αληθούς πολυκυτταραιμίας με τις τιμές αναφοράς. 3 Αρχή της διαδικασίας Η IMMULITE 2000 EPO είναι μια στερεής φάσης, ενζυμική, χημειοφωταυγής, ανοσομετρική ανάλυση. Η στερεή φάση (σφαιρίδιο) επικαλύπτεται από αντι-ligand που παράγεται από στρεπταβιδίνη. Η στερεή φάση (σφαιρίδιο) επικαλύπτεται από anti-ligand που παράγεται από στρεπταβιδίνη. Η υγρή φάση αποτελείται από σημασμένο με ligand μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-epo ποντικού και αλκαλική φωσφατάση (βόειο έντερο) συζευγμένη με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-epo ποντικού. Το δείγμα του ασθενούς και το αντιδραστήριο επωάζονται μαζί με το επικαλυμμένο σφαιρίδιο για 30 λεπτά. Σε αυτό το διάστημα, η EPO στο δείγμα συνδέεται με το σημασμένο με ligand μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-epo ποντικού και με το συζευμένο με ένζυμο μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-epo ποντικού σχηματίζοντας ένα σύμπλεγμα τύπου σάντουιτς. Το ανοσοσύμπλεγμα, με τη σειρά του, δεσμεύεται από τη στρεπταβιδίνη στο σφαιρίδιο μέσω του βιοτινυλιωμένου αντισώματος αντι-epo. Το μη προσδεδεμένο ένζυμο απομακρύνεται με φυγοκεντρικές εκπλύσεις. Τελικά, το χημειοφωταυγές υπόστρωμα προστίθεται στο σωληνάριο της αντίδρασης που περιέχει το σφαιρίδιο και το σήμα παράγεται σε αναλογία με το δεσμευμένο ένζυμο. Κύκλοι επώασης: 1 30 λεπτά Χρόνος έως το πρώτο αποτέλεσμα: 35 λεπτά Συλλογή δειγμάτων Στη βιβλιογραφία υπάρχουν αρκετές αναφορές για διακύμανση της ερυθροποιητίνης κατά τη διάρκεια της ημέρας. 7-9 Είναι σημαντικό τα δείγματα να συλλέγονται σε σταθερή ώρα. Δεν 16 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

17 συνιστάται η λήψη δειγμάτων μεταξύ 7:30 το πρωί και 12:00 το μεσημέρι. Διακύμανση των τιμών μπορεί να παρατηρηθεί, εάν το δείγμα δεν πήξει σε θερμοκρασία δωματίου (15 28 C). Επειδή το EDTA μπορεί να επηρεάσει σημαντικά τα αποτελέσματα, δεν πρέπει να χρησιμοποιείται ως αντιπηκτικό. Συνιστάται η χρήση της υπερφυγοκέντρου για να καθαριστούν τα λιπιδαιμικά δείγματα. Τα αιμολυμένα ή τα πολύ μολυσμένα δείγματα μπορεί να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. Η φυγοκέντριση των δειγμάτων ορού πριν την πλήρη πήξη μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία θρόμβων. Για να αποφευχθούν λανθασμένα αποτελέσματα εξαιτίας της παρουσίας θρόμβων, βεβαιωθείτε ότι πριν τη φυγοκέντριση, το αίμα έχει πήξει πλήρως. Κάποια δείγματα, ιδιαιτέρως αυτά των ασθενών που λαμβάνουν αντιπηκτική θεραπεία, ίσως απαιτούν μεγαλύτερο χρόνο πήξης. Οι σωλήνες συλλογής αίματος διαφορετικών εταιρειών μπορεί να δώσουν αποκλίνουσες τιμές, ανάλογα με τα υλικά και τα συμπληρώματα, συμπεριλαμβανομένων των με τζελ ή φυσικών σωληναρίων, των ενεργοποιητών πήξεως και/ή των αντιπηκτικών. Η IMMULITE 2000 ΕΡΟ δεν έχει δοκιμαστεί με όλους τους τύπους σωληναρίων. Συμβουλευθείτε την παράγραφο για τους εναλλακτικούς τύπους δειγμάτων για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα σωληνάρια που έχουν δοκιμαστεί. Απαιτούμενος όγκος: 100 µl ορού ή ηπαρινισμένου πλάσματος Φύλαξη: 7 ημέρες στους 2 8 C ή 2 μήνες στους 20 C. Αποφύγετε τους επανειλημμένους κύκλους κατάψυξης/απόψυξης. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση. ΠΡΟΣΟΧΗ! ΔΥΝΗΤΙΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΚΙΝΔΥΝΟΣ Περιέχει υλικό ανθρώπινης προέλευσης. Κάθε δωρεά ανθρώπινου αίματος ή συστατικού αίματος ελέγχθηκε με μεθόδους εγκεκριμένες από τον FDA για την ύπαρξη αντισωμάτων ενάντια στους ιούς της ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου τύπου 1 (HIV-1) και τύπου 2 (HIV-2), καθώς και για επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBsAg) και για αντισώματα ενάντια στον ιό της ηπατίτιδας C (HCV). Τα αποτελέσματα των εξετάσεων ήταν αρνητικά (όχι επανειλημμένα αντιδραστικά). Επειδή καμία εξέταση δεν παρέχει πλήρη διασφάλιση για την απουσία αυτών ή άλλων μολυσματικών παραγόντων, ο χειρισμός αυτού του υλικού θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές και γενικές προφυλάξεις ΠΡΟΣΟΧΗ: Η συσκευή αυτή περιέχει υλικό ζωικής προέλευσης και ο χειρισμός της πρέπει να γίνεται ως εάν επρόκειτο περί δυνητικού φορέα και παράγοντα μετάδοσης νόσου. H302 + H312, H412 P280, P273, P301 + P312, P302 + P312, P501 Προειδοποίηση! Επιβλαβές σε περίπτωση κατάποσης ή σε επαφή με το δέρμα. Επιβλαβές για τους υδρόβιους οργανισμούς, με μακροχρόνιες επιπτώσεις. Να φοράτε προστατευτικά γάντια/προστατευτικά ενδύματα/μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια/ πρόσωπο. Να αποφεύγεται η ελευθέρωση στο περιβάλλον. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε το ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή ένα γιατρό εάν αισθανθείτε αδιαθεσία. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΔΕΡΜΑ: Καλέστε το ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή ένα γιατρό εάν αισθανθείτε αδιαθεσία. Απορρίψτε το περιεχόμενο και τον περιέκτη σε συμμόρφωση με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς και εθνικούς κανονισμούς. Περιέχει: αζίδιο νατρίου, Ρυθμιστές EPO IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 17

18 Αντιδραστήρια: Διατήρηση στους 2 8 C. Απόρριψη σύμφωνα με την ισχύουσα νομοθεσία. Ακολουθήστε τις γενικές προφυλάξεις και χειριστείτε όλα τα συστατικά σαν να ήταν φορείς μολυσματικών παραγόντων. Όλα τα υλικά της μεθόδου που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα έχουν ελεγχθεί και βρέθηκαν αρνητικά για σύφιλη, για αντισώματα στον HIV 1 και 2, για επιφανειακά αντιγόνα της ηπατίτιδας Β και για αντισώματα της ηπατίτιδας C. Αζίδιο του νατρίου σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 0,1 g/dl έχει προστεθεί ως συντηρητικό. Κατά την απόρριψη, ξεπλύνετε με άφθονο νερό για την αποφυγή σχηματισμού πιθανών εκρηξιογόνων μεταλλικών αζιδίων στις αποχετεύσεις από μόλυβδο και χαλκό. Χημειοφωταυγές υπόστρωμα: Αποφύγετε τη μόλυνση και την έκθεση στο άμεσο ηλιακό φως. (βλ. Ένθετο.) Νερό: Χρησιμοποιείτε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Υλικά που διατίθενται Τα συστατικά αποτελούν ένα ολοκληρωμένο σετ. Οι ετικέτες στο εσωτερικό κουτί είναι απαραίτητες για την ανάλυση. Συσκευασία σφαιριδίων ΕΡΟ (L2EPN12) Με ραβδοκώδικα. 200 σφαιρίδια επικαλυμμένα με αντι-ligand από στρεπταβιδίνη. Σταθερό στους 2 8 C έως την ημερομηνία λήξης. L2KEPN2: 1 συσκευασία L2KEPN6: 3 συσκευασίες Δοχείο αντιδραστηρίου ΕΡΟ (L2EPNA2) Με ραβδοκώδικα. 11,5 ml σημασμένου με ligand μονοκλωνικού αντισώματος αντι- EPO ποντικού και αλκαλικής φωσφατάσης (από βόειο έντερο) συζευγμένης με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-epo ποντικού, σε ρυθμιστικό διάλυμα. Σταθερ ο στους 2 8 C έως την ημερομηνία λήξης. L2KEPN2: 1 δοχείο L2KEPN6: 3 δοχεία Πριν τη χρήση, σχίστε την πάνω ετικέτα στο σημείο διάτρησης, χωρίς να καταστρέψετε το ραβδοκώδικα. Αφαιρέστε (ξεκολλήστε) προσεκτικά το κάλυμμα από την επάνω επιφάνεια του δοχείου, και πιέστε το κάλυμμα κάτω προς τους κεκλιμένους οδηγούς-ράγες. Ρυθμιστές EPO (LEPNL, LEPNH) Δύο φιαλίδια (χαμηλής και υψηλής τιμής) που περιέχουν λυοφιλοποιημένη ανθρώπινη ανασυνδυασμένη ΕΡΟ σε μήτρα μη ανθρώπινου ορού, με συντηρητικό. Τουλάχιστον 30 λεπτά πριν τη χρήση: Κάντε ανασύσταση κάθε φιαλιδίου με 4,0 ml απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Αναμείξτε με απαλές κινήσεις ή με αναστροφή, έως ότου διαλυθεί πλήρως το λυοφιλοποιημένο υλικό. Σταθεροί στους 2 8 C για 30 μέρες μετά την ανασύσταση ή για 6 μήνες (διαχωρισμένοι) στους 20 C. L2KEPN2: 1 σετ L2KEPN6: 2 σετ Πριν κάνετε κάποια ρύθμιση, τοποθετείστε τις κατάλληλες ετικέτες των διαλυμάτων (παρέχονται με το kit) σε δοκιμαστικούς σωλήνες, έτσι, ώστε οι ραβδοκώδικες να μπορούν να διαβαστούν από το σύστημα του αναλυτή. Συστατικά του Kit που προμηθεύονται ξεχωριστά Πολυ-αραιωτικό 2 (L2M2Z, L2M2Z4) Για την αραίωση των δειγμάτων των ασθενών. Ένα φιαλίδιο, συμπυκνωμένο (έτοιμο για χρήση) σε μη ανθρώπινη μήτρα πρωτεΐνης/ρυθμιστικού, με συντηρητικό. Φύλαξη: 30 μέρες (μετά το άνοιγμα) στους 2 8 C ή 6 μήνες (διαχωρισμένα) στους 20 C. L2M2Z: 25 ml L2M2Z4: 55 ml Ετικέτες με ραβδοκώδικες παρέχονται για χρήση με το αραιωτικό. Πριν από τη χρήση, τοποθετήστε μια κατάλληλη ετικέτα σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα 16 x 100 mm, έτσι ώστε οι ραβδοκώδικες να μπορούν να διαβαστούν από το σύστημα του αναλυτή. L2M2Z: 3 ετικέτες. L2M2Z4: 5 ετικέτες. L2SUBM: Χημειοφωταυγές υπόστρωμα L2PWSM: Πλυστικό του ανιχνευτή L2KPM: Kit καθαρισμού του ανιχνευτή LRXT: Σωλήνες αντίδρασης (μιας χρήσεως) L2ZT: 250 δοκιμαστικοί σωλήνες για διάλυση του δείγματος (16 x 100 mm) L2ZC: 250 καπάκια για σωλήνες διάλυσης δείγματος LEPCM: Μονάδα ελέγχου ΕΡΟ τριών επιπέδων 18 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

19 Απαιτούνται επίσης Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό, δοκιμαστικοί σωλήνες, δείγματα ελέγχου Διαδικασία της ανάλυσης Σημειώστε ότι για το βέλτιστο αποτέλεσμα, είναι σημαντικό να ακολουθηθούν όλες οι τυπικές διαδικασίες όπως ορίζονται στο εγχειρίδιο χρήστη συστημάτων IMMULITE Βλέπε το εγχειρίδιο χρήστη συστημάτων IMMULITE 2000 για: προετοιμασία, στήσιμο, αραιώσεις, ρυθμίσεις, ανάλυση και διαδικασίες ποιοτικού έλέγχου. Συνιστώμενος χρόνος μεταξύ των ρυθμίσεων: 2 εβδομάδες Δείγματα ποιοτικού ελέγχου: Χρησιμοποιείτε δείγματα ελέγχου σε δύο τουλάχιστον επίπεδα ΕΡΟ (χαμηλό και υψηλό). Αναμενόμενες τιμές Μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε με το κιτ IMMULITE 2000 EPO σε 170 φαινομενικά υγιείς ενήλικες εθελοντές εργαστηρίου, με φυσιολογικές τιμές αιματοκρίτη, έδωσε διάμεση τιμή 10,6 miu/ml και κεντρικό εύρος 95% με τιμές 4,3 έως 29 miu/ml. Προσοχή να δίδεται στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων της ΕΡΟ για ασθενείς που δεν πάσχουν από αναιμία. Σε ασθενείς με ερυθροκυττάρωση λόγω μη διορθωμένης υποξίας, τα επίπεδα ανοσοαντιδραστικής ΕΡΟ στον ορό είναι αυξημένα. Σε ασθενείς με διορθωμένη υποξία, τα επίπεδα ανοσοαντιδραστικής ΕΡΟ βρίσκονται συνήθως εντός του φυσιολογικού εύρους, ενώ σε ασθενείς με αληθή πολυκυτταραιμία, η ανοσοαντιδραστική ΕΡΟ στον ορό είναι είτε φυσιολογική είτε μειωμένη. Συνεπώς, αν και τα αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ στον όρο υποδηλώνουν ότι η ερυθροκυττάρωση είναι δευτεροπαθής και τα χαμηλά επίπεδα ΕΡΟ υποστηρίζουν την πιθανότητα αυτόνομης ερυθροποίησης, τα φυσιολογικά επίπεδα ΕΡΟ δεν αποκλείουν την περίπτωση υποξίας ή αυτόνομης παραγωγής ΕΡΟ ως αίτιο της ερυθροκυττάρωσης. Θεωρήστε αυτά τα όρια μόνο ως κατευθυντήριες γραμμές. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να θεσπίσει τα δικά του εύρη αναφοράς. Περιορισμοί Διακυμάνσεις των αποτελεσμάτων ΕΡΟ έχουν παρατηρηθεί σε παρουσία αντισωμάτων αντί-ειδών. Η επίδραση φαρμάκων στην ανάλυση δεν έχει δοκιμαστεί. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης πρέπει να συνεκτιμώνται με τα δεδομένα των κλινικών εκτιμήσεων και άλλων διαγνωστικών μεθόδων. Επειδή τα αποτελέσματα που επιτυγχάνονται με όλες τις εξετάσεις EPO μπορούν να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους, συνιστάται οι σειρές εξετάσεων σε κάθε ασθενή να εκτελούνται με την ίδια μέθοδο μέτρησης της ΕΡΟ. Χαμηλότερα επίπεδα ΕΡΟ από τα αναμενόμενα έχουν παρατηρηθεί σε αναιμίες που συνδέονται με τις ακόλουθες νόσους: ρευματοειδής αρθρίτιδα, σύνδρομο επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας, καρκίνος, ελκώδης κολίτιδα, νόσος δρεπανοειδών κυττάρων και στα πρώιμα νεογνά. Μετά από μεταμόσχευση εξωγενούς μυελού των οστών, η μειωμένη αντίδραση ερυθροποιητίνης μπορεί να καθυστερήσει την ανάκτηση της ερυθροποιητίνης. Οι ασθενείς με υπερ-γ-σφαιριναιμία συνοδευτική πολλαπλού μυελώματος ή νόσου του Waldenstrom, παρουσιάζουν μειωμένη παραγωγή ερυθροποιητίνης σε σύγκριση με τις συγκεντρώσεις αιμοσφαιρίνης, και αυτό έχει συσχετιστεί με αυξημένο ιξώδες του πλάσματος. Τα επίπεδα της ΕΡΟ σε άτομα που διαβιούν σε υψηλό υψόμετρο και πάσχουν από ερυθροκυττάρωση μπορεί να κατέβουν ταχέως σε φυσιολογικά επίπεδα, όταν τα άτομα αυτά επιστρέψουν σε χαμηλό υψόμετρο. Το πλάσμα EDTA δεν πρέπει να χρησιμοποιείται ως τύπος δείγματος. (Βλ. ενότητα Εναλλακτικός τύπος δείγματος.) Ετεροφυλικά αντισώματα στον ανθρώπινο ορό μπορεί να αντιδράσουν με τις ανοσοσφαιρίνες που περιέχονται στα συστατικά της μεθόδου προκαλώντας αλληλεπιδράσεις με in vitro ανοσοαναλύσεις. [Βλ. Boscato LM, Stuart MC. Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays. Clin Chem 1988:34: ] Δείγματα ασθενών που εκτίθενται συστηματικά σε ζώα ή προϊόντα ζωικού IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 19

20 ορού μπορούν να παρουσιάσουν αυτού του τύπου την αλληλεπίδραση που προκαλεί δυνητικά ένα 'ανώμαλο' αποτέλεσμα. Αυτά τα αντιδραστήρια έχουν μορφοποιηθεί έτσι, ώστε να ελαχιστοποιούν τον κίνδυνο της αλληλοεπίδρασης. Παρόλ' αυτά, πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ σπάνιων ορών και των συστατικών της μεθόδου μπορεί να εμφανιστούν. Για διαγνωστικούς σκοπούς, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με αυτή τη μέθοδο θα πρέπει πάντα να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τις κλινικές εξετάσεις, το ιατρικό ιστορικό του ασθενούς και άλλα ευρήματα. Απόδοση Βλέπε Πίνακες και Γραφήματα για αντιπροσωπευτικά δεδομένα της απόδοσης της μεθόδου. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε miu/ml. Εύρος αναφοράς: 1,0 750 miu/ml (WHO 2nd IRP 67/343) Αναλυτική ευαισθησία: Όριο τυφλού δείγματος (η μέγιστη αναμενόμενη τιμή ενός δείγματος χωρίς αναλύτη, η οποία καθορίζεται κατά CLSI EP17-A 11 ): 0,5 miu/ml Όριο ανίχνευσης (η σταθερά ελάχιστη ανιχνεύσιμη συγκέντρωση, η οποία καθορίζεται κατά CLSI EP17-A 11 ): 1,0 miu/ml Λειτουργική ευαισθησία: (συγκέντρωση με συντελεστή διακύμανσης (CV) 20%, ο οποίος καθορίζεται κατά CLSI EP5-A2 12 ): 1,5 miu/ml Ακρίβεια: Δείγματα εξετάστηκαν εις διπλούν για 20 ημέρες, σε δύο κύκλους μέτρησης ανά ημέρα για ένα σύνολο 40 κύκλων μέτρησης και 80 επαναλήψεων για κάθε μία από 3 παρτίδες κιτ και σε 2 όργανα ανά παρτίδα. (Βλ. πίνακα Ακρίβεια για αντιπροσωπευτικά στατιστικά στοιχεία.) Υψηλή δόση φαινομένου Hook: Καμία επίδραση έως και > mlu/ml Γραμμικότητα: Τα δείγματα αναλύθηκαν σε διάφορες αραιώσεις. (Βλ. Πίνακα "Linearity" για αντιπροσωπευτικά δεδομένα.) Ανάκτηση: Κάποια δείγματα (1 με 19) εμπλουτίστηκαν με τρία διαλύματα ΕΡΟ (37,5, 75 και 150 miu/ml) και αναλύθηκαν. (Βλ. πίνακα "Recovery" για αντιπροσωπευτικά δεδομένα.) Ειδικότητα/Παρεμβολές: Η ανάλυση παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα στην ΕΡΟ. (Βλ. πίνακα Ειδικότητα/Παρεμβολές.) Χολερυθρίνη: Η παρουσία χολερυθρίνης (συνδεδεμένης και έμμεσης) σε συγκεντρώσεις έως 200 mg/l δεν έχει επιδράσεις στα αποτελέσματα της εξέτασης. Αιμόλυση: Παρουσία αιμοσφαιρίνης σε συγκεντρώσεις μέχρι 597 mg/dl δεν επιδρά στα αποτελέσματα της εξέτασης, μέσα στα όρια ακρίβειας της ανάλυσης. Λιπιδαιμία: Η παρουσία τριγλυκεριδίων σε συγκεντρώσεις έως 3000 mg/dl δεν έχει επιδράσεις στα αποτελέσματα της εξέτασης, μέσα στα όρια ακρίβειας αυτής της ανάλυσης. Εναλλακτικός τύπος δείγματος: Για να εκτιμηθεί η επίδραση των εναλλακτικών τύπων δείγματος, συλλέχθηκε αίμα από 52 εθελοντές σε απλούς, ηπαρινισμένους, και Becton Dickinson SST δοκιμαστικούς (vacutainer) σωλήνες. Σε ορισμένα από τα αντιστοιχισμένα δείγματα προστέθηκε ΕΡΟ, προκειμένου να ληφθούν αποτελέσματα σε όλο το εύρος βαθμονόμησης της ανάλυσης. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν με τη διαδικασία IMMULITE 2000 EPO και έδωσαν τα ακόλουθα αποτελέσματα: (Li Ηπαρίνη) = 1,07 (Ορός) + 0,695 miu/ml r = 0,998 (SST ) = 1,03 (Ορός) + 0,297 miu/ml r = 0,998 Μέσοι όροι: 116 miu/ml (Ορός) 125 miu/ml (Li Ηπαρίνη) 119 miu/ml (SST ) Σε μία άλλη μελέτη, συλλέχθηκε αίμα από 52 εθελοντές σε απλά και EDTA σωληνάρια (vacutainer) Becton Dickinson. Σε ορισμένα από τα αντιστοιχισμένα δείγματα προστέθηκε ΕΡΟ, προκειμένου να ληφθούν αποτελέσματα σε όλο το εύρος βαθμονόμησης της ανάλυσης. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν με τη διαδικασία IMMULITE 2000 EPO και έδωσαν τα ακόλουθα αποτελέσματα: (EDTA) = 0,729 (Ορός) 0,376 miu/ml r = 0,994 Μέσοι όροι: 143 miu/ml (Ορός) 104 miu/ml (EDTA) 20 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

21 Επειδή το EDTA μπορεί να επηρεάσει σημαντικά τα αποτελέσματα, δεν πρέπει να χρησιμοποιείται ως αντιπηκτικό. Σύγκριση της μεθόδου: Η ανάλυση συγκρίθηκε με το κιτ Access 2 EPO της Beckman Coulter Inc. σε 173 δείγματα ενδογενούς ορού. (Εύρος συγκέντρωσης: από 1,1 έως 701 miu/ml. Βλ. γράφημα.) Η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα: (IML 2000) = 1,07 (Access) 1,87 miu/ml r = 0,983 Μέσοι όροι: 84,3 miu/ml (IMMULITE 2000) 80,4 miu/ml (Access) Τεχνική Υποστήριξη Για τεχνική υποστήριξη αποταθείτε στον αντιπρόσωπο της χώρας σας. Το Σύστημα Ποιότητας της Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. είναι επικυρωμένο με ISO 13485:2003. Polski IMMULITE 2000 EPO Przeznaczenie: Test diagnostyczny in vitro dla analizatorów systemów IMMULITE 2000 do ilościowego oznaczenia poziomu erytropoetyny (EPO) w surowicy lub osoczu heparynowym, przydatny w diagnozowaniu anemii i czerwienic (policytemii). W związku z rozpowszechnieniem stosowaniarekombin antowej erytropoetyny jako środka bioterapeutycznego w celu zwiększenia masy czerwonych krwinek, test EPO można stosować również w prognozowaniu i monitorowaniu odpowiedzi na leczenie rekombinantową erytropoetyną osób cierpiących na niedokrwistość. Numery katalogowe: L2KEPN2 (200 testów) L2KEPN6 (600 testów) Kod testu: EPN Kolor: Ciemnozielony Wprowadzenie Erytropoetyna (EPO) jest glikoproteinowym hormonem składającym się ze 165 aminokwasów, z czterema kompleksami łańcuchów węglowodanowych przyłączonych do peptydu w czterech miejscach wiążących. 1 Jej masa molekularna wynosi D, z czego 40% przypada na łańcuchy węglowodanowe. EPO stymulując proliferację i różnicowanie erytriodalnych komórek prekursorowych w szpiku kostnym jest głównym regulatorem erytropoezy. U ssaków, prawie całą EPO produkuje wątroba płodu, u dorosłych udział wątroby spada poniżej 10%, a nerkowe wydzielanie osiąga ponad 90%. 2,3 Za miejsce produkcji przyjmuje się komórki proksymalnego odcinka kanalika nerkowego lub komórki śródbłonkowe w kory nerkowej i zewnętrznego rdzenia nerki. Nie został do końca wyjaśniony proces klirensu krążącej EPO z osocza, ale wiadomo, że w niewielkim stopniu jest ona wydalana z moczem, dochodzi także zapewne do eliminacji w wątrobie i wychwytu przez komórki docelowe w szpiku kostnym. EPO dostosowuje produkcję erytrocytów do tlenowego zapotrzebowania tkanek. 1 Dochodzi do tego na drodze złożonego efektu sprzężenia zwrotnego wydzielanie hormonu w nerkach jest zależne od czujników tlenowych w tym narządzie reagujących na ciśnienie parcjalne tlenu we krwi. W stanach podniesionego ciśnienia obwodowego tlenu dochodzi do osłabienia produkcji EPO. Widoczne jest to na przykład po wyrównaniu hipoksji u zdrowych osób schodzących z dużych wysokości (lądowanie samolotem) i po przetoczeniu dużych objętości krwi. Ze względu na poziomy EPO we krwi anemie można podzielić na dwie grupy: anemie pierwotne i wtórne. Anemie pierwotne charakteryzuje wzrost EPO we krwi w celu przywrócenia poziomów krwinek czerwonych do wartości prawidłowych. Przykładami anemii z podniesionymi stężeniami EPO są: anemia z niedoboru żelaza, ograniczenie przepływu krwi przez nerki (na skutek utraty krwi) oraz hemoglobinopatie ze zwiększonym powinowactwem hemoglobiny do tlenu. 1 Poziom produkcji EPO wzrasta gwałtownie przy spadku IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 21

22 dostępu tlenu oraz przy obniżonym hematokrycie w anemiach nie zależnych od nerek; w tym ostatnim przypadku poziom EPO wzrasta nawet ponad 1000-krotnie. 2 Anemia może być zjawiskiem wtórnym do stanu zapalnego, reumatoidalnego zapalenia stawów, nowotworu lub przewlekłej choroby nerek. Występowanie anemii wtórnych może być jednak częściowo przypisywane nadmiernej produkcji erytropoetyny. 4 W ostatnim stadium choroby nerek upośledzenie produkcji wystarczającej ilości EPO prowadzi do anemii (od postaci umiarkowanych do ostrych). Obniżenie produkcji hormonu związane jest ze zniszczeniem miejsc jego syntezy w nerkach; może także dojść do uszkodzenia czujników tlenowych. W sytuacjach takich jak: utrata krwi w przypadku dializowania, skrócony czas przeżycia krwinek czerwonych, niedobory żelaza i kwasu foliowego, upośledzony transport żelaza do komórek erytroidalnych i wielu innych, wartości EPO nieznacznie przewyższają wartości referencyjne nie odzwierciedlając faktycznego stanu chorobowego. U chorych beznerkowych wartości EPO są szczególnie niskie. Niemniej jednak niewielka liczba chorych na przewlekłe schorzenia nerek ma prawidłowy hematokryt lub występuje u nich mniej poważna anemia z podniesionym poziomem EPO. Dotyczy to na przykład osób z cystami na nerkach lub z wirusowym zapaleniem wątroby. U tych ostatnich podniesione stężenie EPO może być wynikiem nasilonej produkcji wątrobowej hormonu. Nadmierna produkcja erytrocytów nazywana jest czerwienicą (policytemią). Czerwienice możemy podzielić na dwie grupy w zależności od tego, czy mamy do czynienia ze stanem pierwotnym czy wtórnym w stosunku do poziomu EPO. W czerwienicy prawdziwej stężenie EPO jest obniżone, a erytropoeza jest procesem pierwotnym i niezależnym od stymulacji EPO. Różnice w poziomach hormonu u poszczególnych chorych z takim samym hematokrytem mogą być dziesięciokrotne. Wiele innych stanów może charakteryzować podniesione stężenie EPO będące wynikiem utraty kontroli poziomu O 2 nad produkcją EPO (kontrolne sprzężenie zwrotne). 3 Ma to miejsce na przykład w rakach komórek nerkowych (u 2% chorych występuje czerwienica), w niektórych niezłośliwych uszkodzeniach nerek (pojedyncze lub mnogie cysty nerek), przy zwężeniu tętnicy nerkowej i nieprawidłowościach budowy mikronaczyniek. Ponadto u około 10% chorych po przeszczepie nerki rozwija się czerwienica, czasami na skutek autologicznej choroby nerki. Czerwienica wtórna charakteryzuje się podniesionym poziomem EPO, które prowadzi do wzmożonej produkcji erytrocytów. Może się ona rozwinąć w wyniku różnych czynników, włączając w to uszkodzenie hemoglobiny, palenie papierosów, zwłóknienie płuc, choroby serca, nowotwory i kamienie nerkowe. 5 W przypadku oznaczania EPO w celu różnicowania czerwienic należy brać pod uwagę możliwość nałożenia się norm dla wtórnej czerwienicy i czerwienicy prawdziwej. 3 Zasada testu IMMULITE 2000 EPO to chemiluminescencyjny test immunodiagnostyczny znakowany enzymem, z fazą stałą. Faza stała (kulka) opłaszczona jest przeciwligandem wytworzonym ze streptawidyny. Faza ciekła składa się ze znakowanego ligandem szczurzego monoklonalnego przeciwciała przeciw EPO i fosfatazy zasadowej (z jelita cielęcego) skoniugowanych ze szczurzym monoklonalnym przeciwciałem przeciw EPO. Próbka i odczynnik razem są poddawane 30 minutowej inkubacji z opłaszczoną kulką. W tym czasie EPO z próbki wiąże się ze znakowanym ligandem szczurzym monoklonalnym przeciwciałem przeciw EPO i ze skoniugowanym z enzymem szczurzym monoklonalnym przeciwciałem przeciw EPO, tworząc kompleks typu sandwich. Powstały kompleks jest następnie wychwytywany przez streptawidynę na kulce, za pośrednictwem biotynylowanego przeciwciała przeciw EPO. Niezwiązany koniugat enzymu usuwany jest podczas cyklów płukania i odwirowania. Na koniec do próbówki reakcyjnej 22 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

23 zawierającej kulkę dodawany jest substrat reakcji chemiluminescencyjnej; wytworzony sygnał świetlny ma natężenie proporcjonalne do ilości związanego enzymu. Cykle inkubacji: 1 30 minut Czas do pierwszego wyniku: 35 minut Preparatyka próbek W piśmiennictwie znaleźć można wiele artykułów na temat dobowych wahań poziomu erytropoetyny. 7-9 Ważne jest, aby materiał do badania pobierać o stałej porze dnia. Zalecany jest czas pomiędzy 7:30 rano a 12:00 w południe. Mogą wystąpić różnice w wynikach w przypadku, gdy wykrzepianie nie jest prowadzone w temperaturze pokojowej (15 28 C). Ponieważ EDTA zasadniczo wpływa na wyniki nie może być stosowana jako antykoagulant. Zalecane jest klarowanie próbek lipemicznych przez ultrawirowanie. W próbkach hemolizowanych i z silną kontaminacją wyniki testu mogą być błędne. Odwirowanie próbki krwi przed zakończeniem wykrzepiania może spowodować, że w supernatancie pozostanie fibryna stanowiąca przyczynę fałszywych wyników. Przed przystąpieniem do wirowania należy mieć pewność, że skrzep jest ostatecznie uformowany. Niektóre próbki, a zwłaszcza pochodzące od osób poddanych leczeniu antykoagulantami, wymagają dłuższego czasu na wytworzenie skrzepu. Na wynik oznaczenia może wpływać rodzaj probówek do których pobierana jest krew. Istotne znaczenia mają: producent i tworzywo oraz obecność lub brak bariery żelowej lub innego środka ułatwiającego oddzielenie surowicy, obecność aktywatorów skrzepu oraz brak/obecność antykoagulantów. Wpływ wszystkich wymienionych czynników na wynik testu IMMULITE 2000 EPO nie jest znany. Informacje o przetestowanych wariantach podano w akapicie Rodzaje pobieranego materiału. Wymagana objętość próbki: 100 µl surowicy lub osocza heparynowego. Przechowywanie materiału: 7 dni w 2 8 C lub 2 miesiące w 20 C (unikać rozmrażania i ponownego zamrażania). Ostrzeżenia i warunki wstępne Test diagnostyczny in vitro. PRZESTROGA! POTENCJALNE ZAGROŻENIE BIOLOGICZNE Zawiera materiał pochodzenia ludzkiego. Każdą porcję ludzkiej krwi lub składnika krwi pochodzącą od dawców przetestowano metodami zaaprobowanymi przez FDA na obecność przeciwciał przeciwko ludzkiemu wirusowi nabytego niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) i typu 2 (HIV-2), antygenu powierzchniowego zapalenia wątroby typu B (HBsAg) i przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV). Wyniki tych badań były ujemne (nie wykazały powtarzalnej reaktywności). Jednak żadne badanie nie gwarantuje całkowitej pewności, że te lub inne czynniki chorobotwórcze nie są obecne w materiale; z tym materiałem należy postępować zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej i stosować uniwersalne środki ostrożności PRZESTROGA: Materiał pochodzenia zwierzęcego. Postępować tak jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. H302 + H312, H412 P280, P273, P301 + P312, P302 + P312, P501 Ostrzeżenie! Działa szkodliwie po połknięciu lub w kontakcie ze skórą. Działa szkodliwie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ ochronę oczu/ochronę twarzy. Unikać uwolnienia do środowiska. W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ: W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. Pojemnik i zawartość usuwać zgodnie z wszystkimi lokalnymi, regionalnymi i krajowymi przepisami. Zawiera: azydek sodu; EPO - kalibratory zestawu IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 23

24 Odczynniki: Przechowywać w 2 8 C. Usuwać zgodnie z instrukcją. Zachowywać środki ostrożności konieczne przy pracy z materiałem potencjalnie zakaźnym. W materiałach pochodzących z krwi ludzkiej wykluczono reaktywność w kierunku syfilisu, obecność przeciwciał anty-hiv1/2, HBsAg i przeciwciał anty-hcv. Niektóre składniki zestawu mogą zawierać azydek sodu w stężeniu mniejszym niż 0,1 g/dl, użyty jako konserwant. Wykorzystane odczynniki usuwać w dużej ilości wody, by zapobiec osadzaniu azydku sodu w rurach miedzianych lub ołowianych, co może doprowadzić do wytworzenia potencjalnie wybuchowych azydków tych metali. Substrat chemiluminescencyjny: Unikać zanieczyszczenia i chronić przed bezpośrednim światłem słonecznym (patrz ulotka). Woda: Dejonizowana lub destylowana. Elementy zestawu Elementy zestawu tworzą całość. Kody na wewnętrznych pokrywach pudełka są niezbędne do wykonania oznaczenia. EPO - pojemnik z kulkami (L2EPN12) Z kodem paskowym. 200 kulek opłaszczonych przeciwligandem wytworzonym ze streptawidyny. Stabilne w temperaturze 2 8 C do daty ważności. L2KEPN2: 1 opakowanie L2KEPN6: 3 opakowania EPO - klin z odczynnikiem (L2EPNA2) Z kodem paskowym. 11,5 ml znakowanego ligandem szczurzego monoklonalnego przeciwciała przeciw EPO i fosfatazy zasadowej (z jelita cielęcego) skoniugowanych ze szczurzym monoklonalnym przeciwciałem przeciw EPO. Stabilne w temperaturze 2 8 C do daty ważności. L2KEPN2: 1 klin L2KEPN6: 3 kliny Nie uszkadzając kodu kreskowego klina zerwij taśmę zabezpieczającą w okresie transportu przesuwne zamknięcie komór z odczynnikiem. Usuń tymczasowe foliowe uszczelnienie komór i wsuń zamknięcie komór na prowadnice w pokrywie klina. EPO - kalibratory zestawu (LEPNL, LEPNH) Dwie fiolki (stężenie niskie i wysokie) zawierające liofilizowaną ludzką rekombinantową EPO w matrycy surowicy zwierzęcej z konserwantem. Co najmniej 30 minut przed oznaczeniem zawartość każdej fiolki rekonstytuować 4,0 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Wymieszać delikatnie przez toczenie i odwracanie aż do całkowitego rozpuszczenia. Stabilne w temp. 2 8 C przez 30 dni (po rozpuszczeniu) lub 6 miesięcy w 20 C (rozpipetowane). L2KEPN2: 1 zestaw L2KEPN6: 2 zestawy Przed przystąpieniem do kalibracji umocuj na probówkach odpowiednie nalepki z kodem kreskowym (dostarczane z zestawem) rozpoznawane przez czytnik kodów kreskowych aparatu. Materiały dostarczane oddzielnie Rozcieńczalnik próbek - multidiluent 2 (L2M2Z, L2M2Z4) Do automatycznego rozcieńczania próbek. Jedna fiolka skoncentrowanej, gotowej do użycia, buforowanej białkowej matrycy zwierzęcej, z konserwantami. Stabilny w temp. 2 8 C przez 30 dni (po otwarciu) lub 6 miesięcy w 20 C (rozpipetowany). L2M2Z: 25 ml L2M2Z4: 55 ml Nalepki z odpowiednimi kodami kreskowymi są dostarczane wraz z rozcieńczalnikiem. Nalepkę umieścić na probówce (16 100mm), by umożliwić jej rozpoznanie przez czytnik kodów aparatu. L2M2Z: 3 nalepki L2M2Z4: 5 nalepek L2SUBM: Substrat chemiluminescencyjny L2PWSM: Roztwór płuczący L2KPM: Roztwór czyszczący LRXT: Probówki reakcyjne (jednorazowe) L2ZT: 250 probówek do rozcieńczania próbek mm L2ZC: 250 korków do probówek na rozcieńczalnik LEPCM: Trzypoziomowa multikontrola EPO Ponadto Niezbędne woda destylowana lub dejonizowana, probówki, kontrole 24 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

25 Procedura oznaczenia Przestrzeganie procedur dotyczących utrzymania aparatu, zawartych w Podręczniku operatora do obsługi systemów IMMULITE 2000 poprawia charakterystykę uzyskiwanych wyników. Procedury: przygotowania aparatu, ustawień aparatu, przygotowania i rozcieńczania próbek, rekalibracji, oznaczenia i kontroli jakości zgodnie z Podręcznikiem operatora do obsługi systemów IMMULITE Zalecany odstęp pomiędzy rekalibracjami: 2 tygodnie Próbki kontrolne: stosować kontrole lub pule surowic co najmniej o niskim i wysokim poziomie EPO. Oczekiwane wartości Testy wykonane zestawem IMMULITE 2000 EPO na 170 dorosłych ochotnikach bez objawów chorobowych, o wartości hematokrytu w normie, dały medianę 10,6 mlu/ml, a środkowy zakres 95% wartości przypadł na 4,3 do 29 mlu/ml. Należy zachować szczególną uwagę podczas interpretowania wyników u chorych na schorzenia inne niż anemia. U chorych z czerwienicą spowodowaną nie wyrównaną hipoksją poziom EPO w surowicy jest podniesiony; przy hipoksji wyrównanej poziom EPO jest zazwyczaj w granicach wartości prawidłowych, natomiast u chorych na czerwienicę prawdziwą stężenie EPO jest prawidłowe lub niskie. Dlatego też, podniesiony poziom EPO sugeruje, że czerwienica jest zjawiskiem drugorzędnym, a niski poziom EPO wskazuje na możliwość niezależnej erytropoezy. Prawidłowe stężenie EPO wyklucza zarówno hipoksję jak i niezależną produkcję EPO będącą wynikiem czerwienicy. Powyższe wartości należy traktować jako orientacyjne. Każde laboratorium powinno wyznaczyć własne zakresy referencyjne. Ograniczenia W obecności autoprzeciwciał mogą wystąpić różnice w wynikach oznaczeń EPO. Nie przebadano żadnych leków pod kątem interferencji. Wyniki uzyskane tą metodą powinny być zawsze interpretowane w połączeniu z badaniem klinicznym pacjenta oraz wynikami innych badań. Ze względu na różnice wyników uzyskanych innymi metodami zaleca się, aby seryjne pomiary u tego samego chorego wykonywane były przy użyciu tego samego testu. Wyniki niższe niż oczekiwano zaobserwowano u chorych z anemiami związanymi z następującymi schorzeniami: gośćcowe zapalenie stawów, nabyty zespół braku odporności, rak, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, anemia sierpowata oraz u wcześniaków. Po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego zaburzona odpowiedź erytropoetynowa może opóźnić jej odzysk. U chorych z hipergammaglobulinemią związaną ze szpiczakiem mnogim lub chorobą Waldenstroma zaburzona jest produkcja erytropoetyny w stosunku do stężenia hemoglobiny, co ma związek z obniżoną lepkością osocza. U osób mieszkających na dużych wysokościach nad poziomem morza wysokie stężenie EPO może się gwałtownie obniżyć do wartości prawidłowych przy zejściu na niższe wysokości. Osocze z EDTA nie może być stosowane do tego testu. (Zob. część o alternatywnych typach próbek.) Przeciwciała heterofilne obecne w surowicy ludzkiej mogą wchodzić w reakcję z immunoglobulinami będącymi reagentami testu immunologicznego, wpływając na przebieg oznaczenia in vitro. [Porównaj: Boscato LM., Stuart MC: Heterophilic antibodies: a problem for all immunoassays Przeciwciała heterofilne - problem wszystkich testów immunologicznych. Clin Chem 1988:34:27-33.]. Wpływ przeciwciał heterofilnych może ujawnić się w oznaczeniach wykonywanych w surowicy osób mających ciągły kontakt ze zwierzętami lub zwierzęcymi produktami krwiopochodnymi, stanowiąc potencjalną przyczynę błędnych wyników. W teście ryzyko interferencji przeciwciał heterofilnych zostało zminimalizowane przez odpowiedni dobór proporcji odczynników, tym niemniej interferencja IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 25

26 taka może potencjalnie nastąpić w rzadkich przypadkach. W postępowaniu diagnostycznym wyniki uzyskane tą metodą powinny być z zasady interpretowane w połączeniu z badaniem klinicznym pacjenta, jego historią choroby oraz innymi okolicznościami. Parametry testu Dane charakteryzujące test przedstawiono w tabelach. Wyniki podano w miu/ml. Zakres wyników: 1,0 750 miu/ml (WHO 2 nd IRP 67/343) Czułość analityczna: Granica stężenia zerowego (najwyższa wartość oczekiwana dla próbki bez analitu, określone zgodnie z CLSI EP17-A 11 ): 0,5 miu/ml Granica wykrywalności (najniższe powtarzalnie wykrywalne stężenie; określone zgodnie z CLSI EP17-A 11 ): 1,0 miu/ml Czułość funkcjonalna: (stężenie, przy którym współczynnik zmienności (CV) wynosi 20%; określone zgodnie z CLSI EP5-A2 12 ): 1,5 miu/ml Precyzja: Próbki oznaczano dwukrotnie w dwóch cyklach dziennie przez 20 dni - łącznie w 40 cyklach i 80 powtórzeniach - dla każdej z 3 serii odczynnika i 2 analizatorów na serię. (Reprezentatywne dane statystyczne - zob. tabela Precyzji.) Efekt wysokiej dawki Hook Effect: Nie występuje do stężenia > miu/ml Liniowość: Oznaczano próbki poddane kolejnym rozcieńczeniom. (Patrz: tabela Liniowość.) Odzysk: Badano próbki wzbogacane w stosunku objętościowym 1 do 19 roztworami EPO o stężeniach, kolejno: 37,5, 75 i 150 miu/ml. (Patrz: tabela Odzysk.) Swoistość/ interferencje: Ten test jest wysoce swoisty w kierunku EPO. (Zob. tabela Swoistość/ interferencje.) Bilirubina: Obecność bilirubiny związanej lub wolnej w stężeniu do 200 mg/l nie wpływa na wynik w charakterystycznym dla testu zakresie precyzji. Hemoliza: Obecność hemoglobiny w ilości do 597 mg/dl nie wpływa na wynik w charakterystycznym dla testu zakresie precyzji. Lipemia: Obecność trójglicerydów w ilości do 3000 mg/dl nie wpływa na wynik w charakterystycznym dla testu zakresie precyzji. Alternatywny typ próbki: Aby ocenić wpływ różnych typów próbek na wyniki, krew 52 ochotników pobrano do próbówek zwykłych, heparynizowanych, i próbówek próżniowych typu Becton Dickinson SST. Do niektórych zestawów próbek dodano EPO w celu uzyskania wyników obejmujących cały zakres kalibracji testu. Wszystkie próbki oznaczono testem IMMULITE 2000 EPO i uzyskano następujące wyniki: (Li Heparyna) = 1,07 (Surowica) + 0,695 miu/ml r = 0,998 (SST ) = 1,03 (Surowica) + 0,297 miu/ml r = 0,998 Średnie: 116 miu/ml (Surowica) 125 miu/ml (Li Heparyna) 119 miu/ml (SST ) W innym badaniu krew 52 ochotników pobrano do próbówek zwykłych i próbówek próżniowych typu Becton Dickinson EDTA. Do niektórych zestawów próbek dodano EPO w celu uzyskania wyników obejmujących cały zakres kalibracji testu. Wszystkie próbki oznaczono testem IMMULITE 2000 EPO i uzyskano następujące wyniki: (EDTA) = 0,729 (Surowica) 0,376 miu/ml r = 0,994 Średnie: 143 miu/ml (Surowica) 104 miu/ml (EDTA) Ponieważ EDTA zasadniczo wpływa na wyniki nie może być stosowana jako antykoagulant. Porównanie metod: Ten test porównano z testem Access 2 EPO produkcji firmy Beckman Coulter Inc., który przeprowadzono na 173 endogennych próbkach surowicy. (Zakres stężeń: od 1,1 do 701 miu/ml. Zob. wykres) Metodą regresji liniowej: (IML 2000) = 1,07 (Access) 1,87 miu/ml r = 0,983 Średnie: 84,3 miu/ml (IMMULITE 2000) 80,4 miu/ml (Access) 26 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )

27 Pomoc techniczna i konsultacje Krajowy Dystrybutor udziela wszechstronnej pomocy technicznej. System Kontroli Jakości Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. posiada Certyfikat Jakości ISO 13485:2003. IMMULITE is a trademark of Siemens Healthcare Diagnostics Siemens Healthcare Diagnostics. All rights reserved. Made in: UK Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd. Glyn Rhonwy, Llanberis, Gwynedd LL55 4EL United Kingdom PIEL2KEPN 3 {4} Changes in this Edition: cc#eu22529, cc#eu22529a: 1) Under Warnings and Precautions, added biohazard symbol and potential biohazard statement, caution statement, required GHS pictograms/ signal words/hazard and precautionary codes and statements, offending chemicals and sources. 2) Under References, added citations from the potential biohazard statement. 3) Changed Origin: UK to Made in: UK. 4) Updated the manufacturer address to include Glyn Rhonwy. 5) In Understanding the Symbols, revised the symbol for catalog number, added a GHS pictogram for health hazard, and updated existing symbols with GHS pictograms and terminology for exclamation mark, corrosion, skull and crossbones, and environment. Understanding the Symbols Understanding the Symbols En English Vysvětlivky symbolů Επεξήγηση των συμβόλων Znaczenie symboli Cz Česky El Ελληνικά Pl Polski The following symbols may appear on the product labeling: / Na štítku výrobku mohou být uvedeny následující symboly: / Τα ακόλουθα σύμβολα ενδέχεται να εμφανίζονται στην επισήμανση του προϊόντος: / Na etykietach produktu mogą pojawiać się poniższe symbole: Symbol Definition En: In vitro diagnostic medical device Cz: Zdravotnický prostředek pro in vitro diagnostiku El: In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή Pl: Sprzęt do medycznej diagnostyki in vitro En: Catalog Number Cz: Katalogové číslo El: Αριθμός καταλόγου Pl: Numer katalogowy En: Manufacturer Cz: Výrobce El: Κατασκευαστής Pl: Producent En: Authorized Representative in the European Community Cz: Autorizované zastoupení v Evropské unii El: Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Pl: Autoryzowany przedstawiciel w Unii Europejskiej En: CE Mark Cz: CE značka El: Σήμανση CE Pl: Znak CE En: CE Mark with identification number of notified body Cz: CE značka s identifikačním číslem notifikovaného orgánu El: Σήμανση CE με αριθμό αναγνώρισης του φορέα πιστοποίησης Pl: Znak CE z numerem identyfikacyjnym jednostki notyfikowanej En: Consult instructions for use Cz: Postupujte podle návodu k použití El: Συμβουλευτείτε τις οδηγίες λειτουργίας Pl: Zapoznać się z instrukcją użycia En: Caution! Potential Biohazard Cz: Pozor! Potenciální biohazard El: Πρoσοχή! Δυνητικός βιολογικός κίνδυνος Pl: Uwaga! Potencjalne zagrożenie biologiczne IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, ) 27

28 Symbol Definition En: Temperature limitation (2 8 C) Cz: Teplotní rozsah (2 8 C) El: Περιορισμός θερμοκρασίας (2 8 C) Pl: Zakres temperatury (2 8 C) En: Upper limit of temperature ( -20 C) Cz: Horní teplotní limit ( -20 C) El: Ανώτερο όριο θερμοκρασίας ( -20 C) Pl: Górny zakres temperatury ( -20 C) En: Lower limit of temperature ( 2 C) Cz: Spodní teplotní limit ( 2 C) El: Κατώτερο όριο θερμοκρασίας ( 2 C) Pl: Dolny zakres temperatury ( 2 C) En: Do not freeze (> 0 C) Cz: Nezmrazovat (> 0 C) El: Μην καταψυχετε (> 0 C) Pl: Nie zamrażać (> 0 C) En: Do not reuse Cz: Pro jednorázové použití El: Μην κάνετε επαναληπτική χρήση Pl: Nie używać powtórnie Symbol Definition En: Use by Cz: Spotřebujte do El: Ημερομηνία λήξης Pl: Wykorzystać do En: Health Hazard Cz: Zdravotní riziko El: Κίνδυνος για την υγεία Pl: Zagrożenie dla zdrowia En: Exclamation Mark Cz: Vykřičník El: Θαυμαστικό Pl: Wykrzyknik En: Corrosion Cz: Koroze El: Διάβρωση Pl: Działanie żrące En: Skull and Crossbones Cz: Lebka se zkříženými hnáty El: Νεκροκεφαλή με διασταυρούμενα οστά Pl: Czaszka i skrzyżowane piszczele En: Environment Cz: Prostředí El: Περιβάλλον Pl: Środowisko En: Keep away from sunlight Cz: Chraňte před slunečním světlem El: Διατηρείτε μακριά από το ηλιακό φως Pl: Chronić przed światłem słonecznym BEAD PACK En: Bead Pack Cz: Zásobník s kuličkami El: Συσκευασία σφαιριδίων Pl: Pojemnik z kulkami LOT En: Batch code Cz: Šarže El: Κωδικός παρτίδας Pl: Kod serii TEST UNIT En: Test Unit Cz: Testovací Jednotky El: Μονάδες ανάλυσης Pl: Jednostki testowe En: Contains sufficient for (n) tests Cz: Dostatečné množství pro (n) testů El: Περιεχόμενο επαρκές για (n) εξετάσεις Pl: Zawartość wystarczająca na (n) testów REAG WEDGE REAG WEDGE A REAG WEDGE B REAG WEDGE D En: Reagent Wedge Cz: Reagencie El: Δοχείο Αντιδραστηρίων Pl: Klin odczynnikowy En: Date format (year-month) Cz: Formát data (rok-měsíc) El: Μορφή ημερομηνίας (έτος-μήνας) Pl: Zapis daty (rok-miesiąc) ADJUSTOR En: Adjustor Cz: Kalibrátor El: Ρυθμιστής Pl: Kalibrator 28 IMMULITE 2000 EPO (PIEL2KEPN-3 {4}, )