Uvod u kromatografske separacije

Transcript

1 Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: elektroforetske i kromatografske separacije Uvod u kromatografske separacije Dario Mandić, KBC Osijek

2 1. Povijest kromatografije chroma & graphein = KROMATOGRAFIJA

3 2. Kromatografija osnovni pojmovi KROMATOGRAFIJA - metoda razdvajanja smjese na osnovu različite raspodjele između stacionarne i mobilne faze Stacionarna faza Komponenta smjese koja se najviše zadržava na SP Mobilna faza Komponenta smjese koja se najmanje zadržava na SP

4 2. Kromatografija osnovni pojmovi

5 3. Fizikalno-kemijske osnove kromatografije Načini poboljšanja separacije: povećanje selektivnosti (brzina odjeljivanja) B povećanje djelotvornosti (širenje zona) C

6 3.1. Selektivnost kromatografske separacije selektivnost razlika u brzini gibanja analita faktor zadržavanja (retencije) (k) odnosno faktor kapaciteta (k ) idealno 1-5 k = k = q S q M = c SV S c M V M k = t R t M t M = t R t M koeficijent selektivnosti (α) α = K B K A = k B k A α = t R B t M t R A t M = t R B t R A

7 3.2. Djelotvornost kromatografske separacije djelotvornost stupanj širenja kromatografskih vršaka (zona) broj teorijskih tavana (N) i visina teorijskog tavana (H) N = L H N = 16 t R W 2 H = LW2 16t R 2

8 3.2. Djelotvornost kromatografske separacije Van Deemterova jednadžba djelomice objašnjava pojavu širenja kromatografskih zona (gubitak djelotvornosti kolone) gibanjem kroz kolonu H = A + B u + C Su + C M u Varijable koje utječu na djelotvornost kolone linearna brzina mobilne faze (brzina protoka) u koeficijent difuzije analita u mobilnoj fazi koeficijent difuzije analita u stacionarnoj fazi faktor zadržavanja analita promjer zrna punila stacionarne faze debljina tekućeg sloja na stacionarnoj fazi D M D S k d p d f

9 4. Optimizacija kromatografske separacije Razlučivanje mjera odjeljivanja dvaju analita R S = 2 t R B t R A W A + W B R S = N 4 α 1 α k B 1 + k B opći problem eluacije

10 4. Kromatografske analize Kvalitativne Kromatografske analize t R, detektor (MS) Kvantitativne visina (h), površina (A) Vanjska kalibracija Unutarnja kalibracija Matriks kalibratori Matriks kontrole derivatizacija biološki uzorci Priprema! unutarnji standard taloženje proteina (PPT) ekstrakcija tekućetekuće (LLE) ekstrakcija na čvrstoj fazi (SPE) online SPE

11 5. Podjela kromatografije Nosač Planarna (plošna) kromatografija Mobilna faza Plinska Plinska kromatografija kromatografija (GC) (GC) Stacionarna faza Kromatografija na papiru Tankoslojna kromatografija (TLC) Plinsko-adsorpcijska kromatografija (GSC) Plinsko-tekućinska kromatografija (GLC) Kromatografija na stupcu (koloni) Tekućinska kromatografija (LC) Kromatografija sa superkritičnom tekućinom (SFC) Adsorpcijska Razdjelna Ionsko-izmjenjivačka Kromatografija isključenjem Afinitetna kromatografija

12 5.1. Plinska kromatografija mobilna faza (MP) inertni plin (N 2, He, Ar, H 2 ) separacija na temelju hlapljivosti i interakcije sa stacionarnom fazom (SP) Regulator protoka plina Injektor Kolona (SP) Pećnica Detektor Izvor plina nositelja (MP)

13 5.1. Plinska kromatografija Mikrolitarska staklena injekcija INJEKTOR Plin nositelj Septum prevodi hlapljive sastojke uzorka u plinovito stanje temperatura C veća od vrelišta najmanje hlapljivog sastojka split/splitless programabilni (PTV) headspace Komora za isparavanje Kolona

14 5.1. Plinska kromatografija Punjene KOLONE (packed) Kapilarne (capillary) PEĆNICA Izotermalna eluacija Temperaturno programiranje

15 5.1. Plinska kromatografija vrsta detektora selektivnostinjektor linearnost granica detekcije detektor toplinske vodljivosti (TCD) plameno ionizacijski detektor (FID) detektor apsorpcije elektrona (ECD) Detektor univerzalan Pećnica g organski spojevi g spojevi s elektronegativnim skupinama ugljika g spektrometar masa (MS) univerzalan g MS detekcija analita struktura analita (m/z) analiza alkohola i drugih lakohlapljivih analita sveobuhvatni toksikološki probir i identifikacija lijekova, sredstava ovisnosti i njihovih metabolita

16 5.2. Tekućinska kromatografija mobilna faza (MP) tekućina (eluens) separacija na temelju interakcije sa stacionarnom fazom (SP) i mobilnom fazom (MP) C 18, C 8, C 6, C 4 Razdjelna kromatografija Reverzna (reverse phase) Normalna (normal phase) SP nepolarna, MP polarna SP polarna, MP nepolarna

17 5.2. Tekućinska kromatografija Pumpa Pećnica i kolona (SP) Detektor Izokratična eluacija Gradijentna eluacija Spremnik MP promjena sastava mobilne faze Autosampler: injektorska petlja i ventil

18 5.2. Tekućinska kromatografija ECD-1 vrsta detektora primjena granica detekcije detektor apsorbancije (UV/VIS, PDA) analiti koji sadrže kromofore koji apsorbiraju svjetlost u UV ili vidljivom području g Degasser Pumpa-1 FLD UV/VIS detektor fluorescencije (FLD) analiti koji sadrže fluorofore g Pumpa-2 Pećnica i kolona elektrokemijski detektor (ECD) elektrokemijski aktivni analiti g Autosampler: injektorska petlja i ventil ECD-2 Spremnik MP

19 5.2. Tekućinska kromatografija detektor apsorbancije hemoglobinske varijante oksalati, citrati lijekovi i metaboliti lijekova vitamin D detektor fluorescencije vitamini lijekovi DPD porfirini elektrokemijski detektor kateholamini primarni metaboliti kateholamina sekundarni metab. kateholamina serotonin i metabolit

20 5.2. Tekućinska kromatografija maseni detektor LC-MS/MS QQQ TDM (AED, BZO, NL, AD, TCA, imunosupresivi, antibiotici ) metanefrini u plazmi MMA vitamin D steroidni hormoni toksikologija HPLC IONIZACIJA MASENA ANALIZA DETEKCIJA ESI APCI

21 Kromatografija u kliničkom laboratoriju? osjetljivost specifičnost raznovrsnost simultano određivanje više analita odjednom mogućnost samostalnog razvoja metoda cijena? (po analizi) cijena instrumenta nedostatak random-access načina rada TAT? (priprema uzorka + analiza + obrada podataka) automatizacija! osoblje

22