(Liquid Chromatography LC)

Transcript

1 Tečna hromatografija (Liquid Chromatography LC) - niz metoda kod kojih je pokretna faza tečna: tečno-čvrsta hromatografija tečno-tečna hromatografija jonoizmenjivačka hromatografija gelna hromatografija hromatografija na hartiji hromatografija u tankom sloju

2 Tečna hromatografija

3 Vrste tečne hromatografije Adsorpciona hromatografija Podeona hromatografija Jonoizmenjivačka hromatografija Gel-filtraciona hromatografija

4 Vrste hromatografije Adsorpciona hromatografija Podeona hromatografija

5 Jonoizmenjivačka hromatografija

6 Gel-filtraciona hromatografija

7 Gel-filtraciona hromatografija

8 PRINCIP LC razdvajanje se vrši na osnovu različite raspodele komponenti između dve tečne faze MF i SF moraju biti nemešljive tečnosti SF se nanosi u vidu tankog filma na čvrst nosač čvrsti nosač silika-gel ili staklene kuglice koeficijenti raspodele komponenti iz smeše treba da budu što različitiji za odabrani par rastvarača veliki izbor rastvarača veoma univerzalna metoda

9 Vrste SF i MF Adsorpciona hromatografija (čvrsto/tečno) A. Normano fazna (SF polarna/mf nepolarna) B. Reversno fazna (SF nepolarna/mf polarna) Podeona hromatografija (tečno/tečno) A. Normano fazna (SF polarna/mf nepolarna) B. Reversno fazna (SF nepolarna/mf polarna)

10 Eluiranje

11 Nedostaci i unapređenje LC 1. dve tečnosti nikada nisu potpuno nemešljive MF polako rastvara SF i ispira je iz kolone problem se ublažava primenom predkolone koja ima isti sastav kao kolona kroz predkolonu se propušta MF, pri čemu se ona zasićuje sa SF kada uđe u kolonu, MF više ne može da rastvara SF, jer je njome zasićena

12 Nedostaci i unapređenje LC 2. difuzija komponenti iz jedne tečne faze u drugu je spora analiza dugo traje MF treba da bude što manjeg viskoziteta (heksan, acetonitril, metanol) smanjuje se veličina čestica nosača put koji komponenta prelazi je kraći, ali se povećava otpor protoku, pa se mora primeniti povišeni pritisak modifikacija tečne hromatografije HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY ili HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

13 HPLC Razvoj silikagel čestica srednjeg prečnika 5 m (prva generacija kolona za HPLC, 1969.) Razvoj idealno sfernih čestica ispod 5 m (druga generacija kolona za HPLC, 1973.)

14 HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) Tečna hromatografija pod visokim pritiskom

15

16 Rastvarači Polarni rastvarači voda>metanol>acetonitril> etanol Nepolarni rastvarači n-dekan>n-heksan>n-pentan>cikloheksan

17

18 Filteri

19 Injektor

20 AUTOSEMPLER Manuelni injektori - volumen petlje može biti različit (10 µl, 20µl, 100 µl itd.) i njegov izbor zavisi od tipa analize koja se izvodi. Nedostatak je što se svaki uzorak mora injektovati. Autosempleri - automatski injektorski sistem - volumen injektovanja se može podesiti od 1 µl pa do 100 µl i više što zavisi od vrste analize. Može se obezbediti da se bez prisustva analitičara uradi 100 i više analiza.

21 Kolona Kolona stacionarna faza predstavlja najvažniji deo HPLC sistema, mesto svih hromatografskih dešavanja. Stacionarne faze pakovane su u kolone od nerđajućeg čelika i njihov izbor zavisi od fizičko-hemijskih osobina supstanci koje se ispituju. Kolone mogu biti različite dužine, od 2,5 do 25 i više centimetara sa različitim unutrašnjim prečnikom, najčešće 4,6 mm i prečnikom čestica od 3 µm do 10 µm. Temperatura kolone održava se konstantnom u toku analize pomoću termostata za kolonu, jer promena temperature utiče na koeficijent raspodele, rastvorljivost komponenti i viskozitet mobilne faze.

22 Kolone

23 HPLC Razvoj idealno sfernih čestica ispod 3 m sa specifičnim površinskim osobinama

24 STACIONARNA FAZA kolona sa česticama od 3 μm, dužine 6 cm čestice 10 μm, dužina 20 cm Performanse su poboljšane korišćenjem čestica malog prečnika : analiza je u drugom slučaju gotova za 15 minuta, dok se u prvom odvija deset puta brže

25 OSOBINE DETEKTORA visoko osetljiv detektor je utoliko bolji ukoliko je signal koji daje intenzivniji, a koncentracija analita manja. Osetljivost detektora zavisi od prirode analita. odgovara svim analitima u smeši širok opseg linearnosti da se odgovor ne menja sa promenama u sastavu mobilne faze i temperature lak i jednostavan za upotrebu da odgovor proporcionalno raste sa povećanjem koncentracije analita da ga rastvori ne mogu oštetiti da daje kvalitativne informacije za detektovani pik da brzo daje odgovor.

26 Detektori Detektor koji meri indeks refrakcije Univerzalan - detekcija se zasniva na promeni indeksa refrakcije pri prolasku analita kroz ćeliju za uzorak u detektoru dok se u referentnoj detektorskoj ćeliji nalazi mobilna faza. Veoma je osteljiv na sastav mobilne faze. UV-VIS detektor (uglavnom nm ili 254 nm) Fluorescentni Elektrohemijski detektori Maseni spektrometar

27 UV-VIS detektor Najpopularniji i najviše korišćeni detektori, posebno u kontroli kvaliteta lekova. Detektuju samo supstance koje apsorbuju UV ili VIS zračenje. Supstance koje u sebi imaju aromatični prsten, dvostruke veze između O, S, N ili C kao i druge hromofore, apsorbuju UV ili VIS zračenje i mogu se određivati ovim detektorima. Količina svetlosti koju supstanca apsorbuje srazmerna je koncentraciji, prema Lamber-Beerovom zakonu.

28 UV detektor DAD1, (61.0 mau, - ) of STRUJA01.D mau nm

29 Fluorescentni detektor Detekcija komponente koja fluorescira zasnovana je na emisiji fluorescencije koja je praćena ekscitacijom na određenoj talasnoj dužini. Robusan i selektivan detektor koji je pogodan za komponente koje fluoresciraju kao i one koje se derivatizacijom mogu prevesti u supstancu koja ima sposobnost fluorescencije.

30 UV i fluorescentni detektori

31 Elektrohemijski detektor Uglavnom se koristi kulometrijska detekcija. Tačno određeni potencijal se primenjuje izmeđ radne i referentne elektrode. Detekcija se zasniva na oksido-redukcionim procesima. Često se koristi za analizu lekova i bioloških materijala. Detektor visoke osetljivosti.

32 HPLC analiza Response B D Kvalitativna analizaretenciono vreme A C Kvantitativna analizapovršina pika Retention Time

33 Peak area Kalibraciona kriva Concentration Area A 1 Calibration curve C 1 A 4 C 2 A 2 A 3 A 2 A 3 C 3 A 1 C 4 A 4 C 1 C 2 C 3 Concentration C 4 46

34 Uticaj ph

35 HPLC-MS

36 Pesticidi N. Dujakovic et al., Analytica Chimica Acta 678 (2010) 63 72

37 Mesta uzorkovanja

38 Primena uzorak lekovi pesticidi reka 4-FAA, 4-AAA, karbamazepin, azitromicin, lorazepam, metoprolol, bisoprolol, trimethoprim karbendazim, atrazin, dimetoat, propazin, karbofuran podzemna voda 4-FAA, 4-AAA, karbamazepin karbendazim, atrazin sediment karbamazepin, diazepam, klopidogrel, eritromicin dimethoat, atrazin, propazin, malation, karbofuran