Neka od pitanja za početak... TUMORSKI MARKERI. Primeri iz brošura proizvođača reagenasa. Prof. dr Svetlana Ignjatović

Transcript

1 Neka od pitanja za početak... TUMORSKI MARKERI Prof. dr Svetlana Ignjatović Kako nastaje kancer? Šta su tumorski markeri? Koje su poželjne karakteristike tumorskih markera? Na koji se način koriste tumorski markeri? Za koje ste tumorske markere čuli? INCIDENCIJA I MORATALITET OD KANCERA Primeri iz brošura proizvođača reagenasa 3/69 4/134 PREŽIVLJAVANJE U TOKU OD PET GODINA U % PRIMARNI, SEKUNDARNI I TERCIJERNI TUMORSKI MARKERI 5/134 6/134

2 PRIMARNI I SEKUNDARNI TUMORSKI MARKERI Glavni uzroci smrti u USA Ukupan broj Procenti od ukupnog broja Svi uzroci Kardiovaskularna ,3 Karcinomi ,0 Cerebrovaskularna ,0 Hronicna opstrukivna ,2 oboljenja pluca Udesi ,1 7/134 OBOLJEVANJE OD MALIGNIH TUMORA U SRBIJI OBOLJEVANJE OD MALIGNIH TUMORA U SRBIJI ŽENE 9/134 10/134 OBOLJEVANJE OD MALIGNIH TUMORA U SRBIJI MUŠKARCI EPIDEMIOLOŠKI PODACI INCIDENCIJA I SMRTNOST U MUŠKARACA 11/134

3 INCIDENCIJA I SMRTNOST OD MALIGNIH BOLESTI U ŽENA Tumorske ćelije nastaju akumuliranjem mutacija (6 do 10) 14/134 KARAKTERISTIKE TUMORSKIH ĆELIJA Nastanak kancera Automan rast Nediferenciranost i primitivna građa Infiltrativni rast Promenjen metabolizam Sposobnost metastaziranja precizna regulacija proliferacije, diferencijacije i preživljavanja ćelije višećelijskog organizma posledica sloma regulacionih mehanizama koji upravljaju ponašanjem normalne ćelije u ćelijama kancera nema regulacije i one nekontrolisano rastu, dele se i šire po čitavom organizmu ometajući normalne funkcije zdravih ćelija 15/134 16/134 Nastanak kancera poremećaji aktivnosti mnogih proteina koji imaju ključnu ulogu u ćelijskoj signalizaciji, regulaciji ćelijskog ciklusa i kontroli programirane ćelijske smrti dovode do nekontrolisane proliferacije karakteristične za ćelije kancera nastaje kao posledica proliferacije bilo koje ćelije u organizmu više od sto vrsta kancera TUMOR svaka nenormalna proliferacija ćelija u organizmu VRSTE TUMORA benigni (dobroćudni) i maligni (zloćudni) tumori benigni ostaje ograničen na mestu na kome je nastao, ne širi se na okolna tkiva, kao i na udaljene delove organizma maligni možeda se proširinaokolnatkivaili udaljene delove organizma putem krvi ili limfe (metastaze) pojam KANCER odnosi se na isključivo maligne tumore 17/134 18/134

4 Benigni tumori slični zdravom tkivu lagan rast obično su kapsulirani u vezivnom tkivu ne stvaraju metastaze histološki: tipičan nalaz, ćelije su diferencirane Maligni tumori razlikuju se od okolnog tkiva nagli rast nisu kapsulirani: pokazuju infiltrativan i destruktivan rast stvaraju metastaze histološki: atipičan nalaz, polimorfnost ćelija Klasifikacija tumora prema vrsti ćelija iz kojih nastaju (i benigni i maligni tumori) tkivu iz kojeg nastaju (karcinom pluća ili dojke) vrsti zahvaćenih ćelija (fibrosarkomi fibroblasti, eritoblastna leukemija eritroblast) 19/134 20/134 Klasifikacija tumora KARCINOMI epitelne ćelije (90%) SARKOMI vezivna i potporna tkiva (mišići, kosti, hrskavice) (retki kod ljudi) LEUKEMIJE i LIMFOMI bolesti hematopoetskih ćelija i ćelija imuno sistema (7%) Uzroci nastanka tumora - KARCINOGENI izlaganje mutagenima (vreme i doza) hemijski modifikacija baza UV i X-zraci oštećenje DNK infekcija virusi hepatitis B, papiloma (HPV) bakterije Helicobacter pylori spontane mutacije (učestalost se naglo povećava starenjem) 21/134 22/134 Vreme kao faktor: kancer kao dugotrajan proces četiri obavezne faze FAZA INDUKCIJE može da traje više godina (30) uticaj kacinogena (3/4 tumora) INVAZIVNA FAZA maligne ćelije se umnožavaju prodiru u okolna tkiva putem krvi ili limfe In situ FAZA transformisana ćelija postaje zaista tumorska kancer ostaje lokalizovan na originalnom mestu FAZA ŠIRENJA (DISEMINACIJA) može da traje 1-5 godina maligne ćelije prodiru u tkiva koja su udaljena od mesta stvaranja TNM klasifikacija malignih oboljenja (Union Internationale Contre de la Cancer, UICC) PREOPERATIVNO STANJE T= TUMOR(stepen primarnog tumora) N = NODI LYMPHATICI (status regionalnih limfnih čvorova) M= METASTAZE(prisustvo udaljenih metastaza) 23/134

5 TNM klasifikacija T = primarni tumor T 1 = mali tumor, bez invazivnog rasta u okolno tkivo T 2 = tumor srednje veličine, sa malim invazivnim rastom u okolno tkivo T 3 = veliki tumor, sa značajnim invazivnim rastom u okolno tkivo T 4 = veoma veliki tumor, obiman invazivni rast u okolno tkivo TNM klasifikacija N = metastaze u limfnom čvoru N 0 = bez metastaza u limfnom čvoru N 1 = regionalne, u blizini, mobilne metastaze limfnog čvora N 2 = regionalne, nemobilne metastaze limfnog čvora N 3 = obimne, nemobilne metastaze limfnog čvora N 4 = regionalne, nedostupne metastaze limfnog čvora TNM klasifikacija M = udaljene metastaze M 0 = bez merljivih metastaza M 1 = prisustvo udaljenih metastaza M 2 = prisustvo udaljenih nedostupnih metastaza POSTOPERATIVNO STANJE histološka klasifikacija G (grading) - stepen diferencijacije tumora G 1 = dobro diferenciran G 2 = srednje diferenciran G 3 = loše diferenciran G 4 = nediferenciran G x = nemerljiv stepen diferenciranosti tumora POŽELJNE KARAKTERISTIKE TUMORSKIH MARKERA podesni za određivanje specifični za tumor uvek prisutan u prisutsvu tumora TUMORSKI MARKER + - KANCER + - STVARNO POZITIVNI LAŽNO NEGATIVNI LAŽNO POZITIVNI STVARNO NEGATIVNI = 100% ISPITANIKA SA + ODREĐIVANJEM = 100% ISPITANIKA SA - ODREĐIVANJEM 100% BOLESNI ISPITANICI 100% ZDRAVI ISPITANICI

6 DIJAGNOZA cena: LEČENJE TUMORSKI MARKER cena: NELEČENA BOLEST + - KANCER + - STVARNO POZITIVNI LAŽNO NEGATIVNI 100% BOLESNI ISPITANICI LAŽNO POZITIVNI STVARNO NEGATIVNI 100% ZDRAVI ISPITANICI cena: NEPOTREBNA TERAPIJA = 100% ISPITANIKA SA + ODREĐIVANJEM = 100% ISPITANIKA SA - ODREĐIVANJEM cena: KOLIKO KOŠTA ODREĐIVANJE Koncentracija markera - + oboljenje METODE ODREĐIVANJA TUMORSKIH MARKERA ANALITIČKE TEHNIKE Određivanje aktivnosti enzima Imunoodređivanje (kompetitivno, nekompetitivno) Testovi na receptore INSTRUMENTALNE TEHNIKE Hromatografija Elektoroforeza MS/HPLC/GH METODE ODREĐIVANJA RIA (Radioimmunoassay) EIA (Enzymioimmunoassay) ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) EMIT (Enzyme multiplied immunoassay Technique) CEDIA (Cloned enzyme donor immunoassay) MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay) FPIA (Fluorescence Polarization Immunoassay) CLIA (Chemiluminescence Immunoassay) CMIA (Chemiluminescent Magnetic Immunoassay) ECLIA (Electrochemiluminescence Immunoassay) 33/134 34/134 IMUNOODREĐIVANJE obeleženo antitelo IMUNOODREĐIVANJE obeležen antigen 35/134 36/134

7 Kompetitivno jednostepeno imunoodređivanje Kompetitivno dvostepeno imunoodređivanje 37/134 38/134 Nekompetitivno imunoodređivanje sendvič Razlika između kompetitivnog i nekompetitivnog imunoodređivanja 39/134 40/134 Homogeno i hetrogeno imunoodređivanja RIA 41/134 42/134

8 FPIA homogeno kompetitivno fluoroscentno imunoodređivanje KOMPONENTE MEIA Mikročestice-antitelo čvrsta faza: lateks mikročestice obložene antitelom koje vezuje specifični analit koji se meri; Antitelo-enzim konjugat: Alkalna fosfataza enzim konjugovana za antitelo; Enzim supstrat: Fluorescentni 4-metil umbeliferon fosfat (MUP) u rastvoru koji je raspoloživ za reakciju sa enzimom na antitelu. 43/134 44/134 MEIA CMIA Mikročestice kao čvrsta faza su obložene anitelom nasuprot antigenu koji se određuje i služe za vezivanje analita Hemiluminiscentni obeleživač je konjugovan za antitelo ili antigen i proizvodi svetlost kada se kombinuje sa svojim supstratom Antitelo za detekciju je obeleženo enzimom kao u EIA. Koncentracija analita je proporcionalna količini izmerenog signala Nekompetitivni sendvič format daje rezultate koji su direktno proporcionalni količini prisutnog analita 45/134 Metoda je slična MEIA, s time da hemiluminiscentna reakcija daje visoku osetljivost i jednostavno merenje Nekompetitivni sendvič format daje rezultate koji su direktno proporcionalni količini prisutnog analita 46/134 POREĐENJE MEIA I CMIA METODE ODREĐIVANJA koncentracija TM zavisi od upotrebljenih metoda za njihovo određivanje testovi različitih proizvođača daju različite vrednosti za TM u istom uzorku čak i kada se koriste ista antitela i metode (primer CA 19-9) treba uvek da se navede kojom metodom i kojimtestomjeodređen TM 47/134 48/134

9 METODE ODREĐIVANJA u slučaju promene metode i testa odrediti TM istovremeno i starom i novom metodom ili sačuvati uzorke pacijenta za eventualno određivanje i novom metodom zavisnost referentnih vrednosti od pola, fiziološkog stanja, navika itd. WHO standard za AFP (AFP 72/225) INTERFERENCIJA zbog oslobađanja iz trombocita dolazi do povišenja vrednosti NSE; serum treba da se odvoji u roku od 60 minuta hemoliza povišava vrednosti NSE zbog oslobađanja iz eritrocita kontakt kože sa unutrašnjošću epruveta za uzimanje uzoraka za određivanje skvamoznog ćelijskog kancera (SCC) dovodi do povišenja vrednosti 49/134 50/134 INTERFERENCIJA INTERFERENCIJA lekovi koji se koriste u terapiji su uzrok povišenih vrednosti PSA (dvo- i trovalentni metalni joni, analozi purina, indoli i gvanidini, vitamin C, cisplatin, mitomicin, estradiol, epirubicin) u ikteričnim uzorcima su povišene vrednosti PSA HAMA (human anti-mause antibodies) Heterofilna antitela U serumu prisutni Ig - kod pacijenata koji dobijaju mišje imunoglobuline u svrhu dijagnoze i terapije u toku imunoscintigrafskog postupka ili u toku imunoterapije 51/134 52/134 INTERFERENCIJA INTERFERENCIJA do lažno pozitivnih rezultata kada testovi za određivanje TM sadrže ovo monoklonsko antitelo ova heterofilna anti-ig antitela su samo prisutna i kod pacijenata koji primaju tzv. "sveže ćelije" (vrlo retko kod zdravih) biološki faktori kod zdravih osoba starih godina (40% ima povišene vrednosti CA 19-9, CEA, CA 72-4, CA 15-3, AFP i PSA) ovojeinače ciljna populacija zdravih gde se ovi TM rutinski određuju 53/134 54/134

10 Visoka doza hook efekat Preanalitički zahtevi za kvalitet u primeni tumorskih markera %vezanog antigena zahtev prema protokolima zasnovanim na nacionalnim i međunarodnim vodičima treba da se izbegava zahtev za panelom tumorskih markera poželjno uzorkovanje pre tretmana uzorkovanje (dnevne varijacije, klinička stanja, lekovi i drugo) odgovarajuća epruveta (npr. EDTA može da interferira čuvanje uzoraka - kratkoročno: 4 o C; dugoročno: -30 o C; duže vremensko razdoblje: -70 o C izbegavati tretiranje uzorka toplotom (npr. za PSA, hcg) imunohistohemijske analize (standardizacija uslova skupljanja i fiksacije uzoraka) Koncentracija antigena 55/134 56/134 Analitički zahtevi za kvalitet u primeni tumorskih markera analizatori za imunohemijske metode analitički kvalitet FDA, Food and Drug Administration; IVDD, In Vitro Diagnostics Directive sprovođenje unutrašnje kontrole kvaliteta (Internal Quality Control, IQC) sudelovanje u programima spoljašnje procene kvaliteta (External Quality Assessment, EQA) Važni postanalitički zahtevi za primenu tumorskih markera klinička informacija ordinirajućeg doktora odgovarajući referentni opsezi klinički važne promene definisanje protokola pri promeni metoda poluvreme života t.m. poređenje korisnosti tumorskog markera npr. postoperativno, posle hemoterapije važno za interpretaciju i za identifikuju slučajne laboratorijske greške opseg za zdravu populaciju; pacijentova bazalna vrednost je najvažnoji podatak za interpretaciju; porast čak i u okviru referentnog opsega klinički značajano; biološka i analitička varijacija; ili vrednosti markera od ±25% klinički važno; obaveštenje ako se promeni metoda; da li će promena metode uticati na interpretaciju rezultata; vreme potrebno da se koncentracije t.m. smanji za 50% posle potpunog uklanjanja tumorskog tkiva; važno za AFP i hcg; objektivna klinička informacije o korisnosti tumorskog markera je prioritet brojnih profesionalnih organizacija 57/134 58/134 Važni zahtevi pri izdavanju rezultata tumorskih markera kompletni pregled svih vrednosti, pošto trend kretanja u koncentraciji markera daje najbolju informaciju preporuke za frekvenciju određivanja preporuke za određivanje radi potvrde rezultata (porast u koncentraciji trebalo bi uvek potvrditi ponovnim merenjem) komunikacija između laboratorije i kliničkog osoblja Uzroci netačnog rezultata tumorskog markera efekat prozona kod identifikacija ovog efekta kako bi se izbeglo pogrešno izdavanje visokih koncentracija niskog rezultata; mogu se smanjiti korišćenjem antitela u čvrstoj fazi ili većeg vezujućeg kapaciteta, određivanjem uzorka u dva različita razblaženja ili korišćenjem određivanja u sekvencama koje uključuju ispiranje (wash step); carry-over uzorka interferencija heterofilnih antitela ili humanih anti-mišjih antitela (HAMA) potencijalni problem kad god se određuje uzorak jako visoke koncentracije lažno povišeni ili sniženi rezultati kod uzoraka pacijenata koji sadrže anti-igg antitela sposobna da reaguju sa antitelima koja se koriste u određivanju; kod pacijenata koji koriste mišja monoklonska At za terapeutske svrhe ili imaging procedure; mogu se otkriti ponovnim određivanjem uzorka posle tretmana sa blokirajućim agensom (imobilizovan na epruvetama), dodatkom ne-imuno mišjeg seruma reakcionoj smeši, ili ponovnim određivanjem uzorka drugom metodom; 59/134 60/134

11 Zahtevi unutrašnje kontrole kvaliteta Zahtevi spoljašnje kontrole kvaliteta procena reproducibilnosti ustanovljeni kriterijum za prihvatanje određivanja poželjna varijabilnost unutar određivanja <5%, a između određivanja <10%; kriterijumi za željenu preciznost određivanja mogu se zasnivati na biološkoj varijaciji; izbor odgovarajućeg kriterijuma za prihvatljivost IQC EQA uzorak sa odgovarajućom koncentracijom analita procena stabilnosti određivanja koncentracije koje pokrivaju radni opseg određivanja; povremeno uključiti više koncentracije da bi se proverilo ponašanje pri razblaživanju uzorka; za npr. AFP i hcg koristiti i normalni serum radi provere bazalnih vrednosti; ponovljenim merenjem uzoraka istog pool-a i poređenjem rezultata tokom vremena (npr meseci); kontrolni uzorci treba da odražavaju serum pacijenta koncentracije u kontrolnom uzorku treba da odgovaraju kliničkoj primeni procena interferencija u toku određivanja nije poželjno oslanjati se isključivo na kontrolni materijal dat u sklopu testa; koristiti i kontrolu sa autentičnim serumskim matriksom iz nezavisnog izvora, negativna i niska pozitivna kontrola treba da se koristi za sve tumorske markere, ali takođe postoji potreba i za širim koncentracionim opsegom, kao i za procenu tačnosti dilucionih etapa kod uzorka sa visokim koncentracijama; povremena provera mogućih interferencija (npr. od heterofilnih i dr. antitela, od aditiva u vakutajnerima i dr.) utvrđivanje tačnosti i stabilnosti ciljnih vrednosti interpretaciona praksa koriste se konsenzus srednje vrednosti (ne postoje referentne metode) koje se dokazuju procenom njihove: 1. stabilnosti (ponovljenom distribucijom istog pool-a) 2. tačnosti (recovery testom), koristi se pool sa poznatom količinom internacionalnog standarda (za AFP, hcg, CEA i PSA su BS 72/225, IS 75/537, IRP 63/601 i IS 96/670). omogućava poređenje rezultata iz različitih laboratorija 61/134 62/134 REFERENTNI INTERVAL REFERENTNI INTERVAL svaki pacijent sa tumorom ima svoj "bazni nivo" za različite tumorske markere vrednosti posle prve terapije se uzimaju kao specifične referentne vrednosti koje će služiti kao bazni nivo za naredno praćenje gornja referentna granica kod zdravih osoba igra malu ulogu mnogo je značajnije da se prate promene kod svakog pacijenta ponaosob jer one predstavljaju osetljiviji dijagnostički kriterijum od poređenja individualne vrednosti za svakog pacijenta sa gornjom referentnom granicom METASTATSKA OBOLJENJA maligna priroda različitih tumora se praktično zasniva na njihovoj osobini da metastaziraju primer: karcinom kolona METASTATSKA OBOLJENJA ako je tumor lokalizovan u intestinalnom zidu, očekivana dužina života posle operacije nije skraćena akosuzahvaćeni regionalni limfni čvorovi, samo će za jednu trećinu pacijenata očekivana dužina života odgovarati normalnoj u slučaju udaljenih metastaza organa najviše 5 godina iznosi dužina preživljavanja

12 METASTATSKA OBOLJENJA tendencija primarnih tumora ka metastazama na razvoj metastatskog oboljenja utiču: vrsta tkiva, lokalizacija organa i veličina tumora METASTATSKA OBOLJENJA karcinom prostate: rane metastaze na kostima karcinom ovarijuma: formiranje malignih ascita karcinom dojki: multiple metastaze (kosti, mozak, pluća) karcinom "malih ćelija"pluća: multiple metastaze karcinom kolona, karcinom stomaka, karcinom pankreasa: jetra je primarno mesto metastaza melanom: uglavnom u mozgu, jetri, plućima i ovarijumu Današnja primena tumorskih markera i njena ograničenja Detekcija ili skrining kancera ograničena (PSA) Potvrda ili dijagnoza (simptomatičnih pacijenata) ograničena Evaluacija prognoze ograničena Predviđanje terapeutskog odgovora važno Klasifikacija (stadijum i veličina tumora) ograničena Monitoring (praćenje efikasnosti terapije) važno Detekcija ponovnog javljanja oboljenja kontraverzno Lokakizacija tumora ograničena INDIKACIJE rano otkrivanje malignih tumora u grupi sa visokim rizikom familijarni rizik, simptomatski pacijenti sa visokom prevalencijom pojave tumora AFP kod pacijenata sa cirozom jetre AFP i hcg kod "germ cell" tumora (seminom) PSA kod muškaraca starijih od 50. godina sa adenomom prostate kalcitonin u slučaju medularnog karcinoma štitaste žlezde 69/134 INDIKACIJE za postavljanje primarne dijagnoze retko se koristi; klinički nalaz, endoskopski postupci, intraoperativni nalaz korelacija nekih markera sa veličinom tumora CEA i kolorektalni karcinom CA 125 i karcinom ovarijuma CYFRA 21-1 i karcinom pluća PREOPERATIVNO ODREĐIVANJE ukoliko je vrednost nekog TM pri postavljanju primarne dijagnoze visoka to može da bude relevantan marker za postoperativno praćenje i ova vrednost će biti "bazna"

13 PREOPERATIVNO ODREĐIVANJE ukoliko određivanje TM ima prediktivnu vrednost u prognozi izvesnih tumora: AFP i hcg kod "germ cell" tumora CEA i CA 19-9 kod kolorektalnog karcinoma CYFRA 21-1 kod karcinoma pluća CA 15-3 i CEA kod karcinoma dojke CA 125 kod karcinoma ovarijuma β 2 -mikroglobulin kod multiplog mijeloma PREOPERATIVNO ODREĐIVANJE ukoliko pad koncentracije TM može da posluži posle završetka terapije za procenu odnosa preostalog tumorskog tkiva prema nestalom INDIKACIJE za prognozu visoke vrednosti TM idu sa uznapredovalim stadijumima bolesti i govore o lošoj prognozi normalne ili blago povišene vrednosti su znak da će period za ponovnu pojavu tumora biti duži pa samim time i produžen period preživljavanja INDIKACIJE praćenje terapije postoperativni pad vrednosti preoperativno povišenih vrednosti TM je važan prognostički pokazatelj ako nema pada ili je on mali ukazuje na nekompletnu resekciju ili prisustvo multiplih tumora INDIKACIJE praćenje terapije ako nivo TM ne dostigne vrednosti kod zdravih posle završetka terapije ukazuje na neefikasnu terapiju i prisustvo rezidualnih tumora koje treba da se lokalizuju "imaging" tehnikama INDIKACIJE praćenje terapije važno poznavanje biološkog poluživota različitih TM za "timing" prvog određivanja posle primenjene terapije URL za CEA iznosi 3 µg/l, poluživot iznosi 3 dana, ako je preoperativna vrednost iznosila 100 µg/l treba da prođe 20 dana za prvo određivanje posle operacije

14 INDIKACIJE rano otkrivanje ponovnog javljanja tumora posle hirurške resekcije tumora određivanje TM predstavlja neinvazivnu formu praćenja pacijenata ukoliko je vrednost TM dobro određena ona u oko 50% slučajeva može da ukaže na promene u ponašanju tumora 10 i više meseci pre drugih dijagnostičkih postupaka INDIKACIJE rano otkrivanje ponovnog javljanja tumora praćenje toka terapije malignih tumora određivanjem dva ili više TM nisu pogodni za "screening"asimptomatskih osoba zbog niske organ i tumor specifičnosti kao i niske +PV testa DEFINICIJA TUMORSKIH MARKERA supstance koje mogu da nastanu: direktnom sintezom tumorskih ćelija ili sintezom u netumorskim ćelijama (izazvanom od strane tumorskih ćelija) KRATAK ISTORIJAT TUMORSKIH MARKERA godina Bence onkogeni Jones protein monoklonska antitela, sindrom ektopičnog ugljenohidratni antigeni hormona CA 125, CA 15-3, CA hcg analiza onkogena ACTH supresorski geni delecija antigena genomika, proteomika, krvnih grupa microarrays, MS, izoenzimi neuronske mreže, AFP multiparametarska analiza CEA 81/134 82/134 PODELA TUMORSKIH MARKERA HUMORALNI (CIRKULIŠUĆI) detektuju se u krvi ili u nekoj drugoj telesnoj tečnosti CELULARNI detektuju se u ili na ćeliji TUMORSKI MARKERI Enzimi Hormoni Onkofetalni antigeni Citokeratini Ugljenohidratni molekuli (mucini i antegini krvnih grupa) Proteini Receptori i ostali markeri Genetski markeri Raznovrsni markeri 83/134 84/134

15 ENZIMI KAO TUMORSKI MARKERI - Alkohol dehidrogenaza - Laktat dehidrogenaza - Aldolaza - Leucinaminopeptidaza - Alkalna fosfataza - Neuron specifična enolaza (NSE) - Alkalna fosfataza-placentalna (PLAP) - 5`-Nukleotidaza -Amilaza -Prostatična kisela fosfataza (PAP) - Aril sulfataza B - PSA - Kratin kinaza BB - Piruvat kinaza - Esteraza - Ribonukleaza - Galktozil trasferaza -Salicil transferaza - Gamaglutamil trasferaza - Terminalna deoksitransferaza - Heksokinaza -Timidin kinaza Prostata-specifični antigen (PSA) serin proteaza familije kalikreina isključivo potiče iz epitelijelnih ćelija prostate organ specifičan, ali ne i tumor specifičan tumorski marker (prostatitis, benigna hiperplazija) jedini TM za skrining 85/134 86/134 Molekularne forme PSA stvara komplekse sa α 1 -antihimotripisinom (ACT- PSA) ili sa α 2 -makroglobulinom (AMG-PSA) i nalazi se u slobodnoj formi (fpsa) većina imunoodređivanja mere fpsa i ACT- PSA, ali ne AMG-PSA Odnos slobodnog i vezanog PSA kod karcinoma prostate: viša koncentracija ACT-PSA kod benigne hiperplazije prostate (BPH): viša koncentracija fpsa Istovremeno određivanje fpsa i ukupnog PSA poboljšava specičnost; izražava se kao %fpsa > 25% fpsa, mogućnost tumora prostate je < 10% < 10% fpsa, mogućnost tumora prostate je >50% 87/134 88/134 Klinička primena PSA rano otkrivanje tumora, praćenje stadijuma razvoja tumora i praćenju terapije određivanje PSA kod muškaraca starijih od 50 godina, jednom godišnje gornja granica je 4 mg/l (danas se preporučuje i 2,5 mg/l) siva dijagnostička zona 4 10 mg/l zahteva povećanje dijagnostičke osjetljivosti i specifičnosti: referentni intervali prema godinama PSA density (podeliti koncentraciju PSA sa zapreminom prostate određenom transrektalnim UZ) PSA velocity (brzina povećanja PSA u funkciji vremena) HORMONI KAO TUMORSKI MARKERI -ACTH -hcg - Antiduretični hormon - Humani placentalni laktogen - Bombesin - Neurofizini - Kalcitonin - PTH - Gastrin - Prolaktin - Hormon rasta - Vazoaktivni intestinalni peptid 89/134 90/134

16 hcg glikoprotein koga sekretuju ćelije trofoblasta placente α subjedinica je ista kao kod LH, FSH, TSH β subjedinica je specifična za hcg može da se određuje intaktna subjedinica (ELISA) ili obe kod pacijenata sa karcinomom prisutne su obe subjedinice (intaktna hcg i β subjedinica) Primena hcg Trudnoća Povišen kod gotovo svih trofoblastičnih tumora Povišen kod 70% of neseminomatoznih testikularnih tumora 91/134 92/134 ONKOFETALNI ANTIGENI KAO TUMORSKI MARKERI Alfa-fetoprotein -AFP - β-onkofetalni antigen - Karcinofetalni feritin -CEA - Pankreasni onkofetalni - Skvamozni ćelijski antigen - Tenesi antigen - Tkivni polipeptidni antigen glavni fetalni protein (glikoprotein) sintetiše su u fetalnoj jetri, GI traktu, bubrezima strukturno odgovara albuminu marker defekta neuralne tube umereno povišen kod oboljenja jetre (hepatitis/ciroza) kod hepatocelularnog karcinoma koncentracija > 1000 µg/l 93/134 94/134 Karcinoembrioni antigen (CEA) Familija od 36 glikoproteina Povišen kod... 70% of kolorektalnih karcinoma 45% of karcinoma pluća 50% of karcinoma želuca 40% of karcinoma dojki 55% of karcinoma pankreasa 25% of karcinoma ovarijuma 40% of karcinoma bešike Karcinoembrioni antigen (CEA) glikoprotein (45 55% ugljenih hidrata; kda) za vreme embrionalnog razvoja sintetiše se uglavnom u gastrointestinalnom traktu i pankreasu kao ćelijski površinski antigen kao adhezioni molekul uključen u procese širenja i metastaziranja tumora kod odraslih sinteza ne prestaje u potpunosti 2,5 mg/l (imunološke metode) 2,5 10 mg/l (pušači i benigne bolesti) mg/l (maligni procesi) više od 20 mg/l (metastaze) porast sinteze u primarnim karcinomima kolona, rektuma, jednjaka, želuca, bronha, jetre, dojke, ovarija ne koristi se u screening programima jer se porast javlja i u benignim bolestima: hepatitis, kolitis, gastrointestinalne infekcije 95/134 96/134

17 Primena CEA povišen u nemalignim stanjima: ciroza, emfizem, rektalni polipi, benigna oboljenja dojki, ulcerativni kolitis CITOKERATINI KAO TUMORSKI MARKERI - Tkivni polipeptidni antigen (TPA) - Tkivni polipetidni specifični antigen (TPS) - Citokeratin 19 fragmenti (CIFRA 21-1) najvažnija primena pri evaluaciji stadijuma i praćenju ponovnog javljanja bolesti 97/134 98/134 Ugljenohidratni antigeni glikoproteini koji su antigeni na površini tumorske ćelije ili ih sekretuju tumorske ćelije (površinski ili ekskretorni) mucini visoke molekulske mase (mukopolisaharidni proteini) ili antigeni krvnih grupa UGLJENOHIDRATNI TUMORSKI MARKERI MUCINI ANTIGENI KRVNIH GRUPA - CA CA Episialini - CA 19-5 # CA CA 50 # CA CA 72-4 # CA CA 242 -MCA - DU-PAN-2 99/ /134 Specifičnost episialinih markera osetljivost CA % specifičnost pankreas, pluća, ovarijumi, kolorektalni, jetra CA % ovarijumi, prostata, pluća CA 125 glikoprotein visoke molekulske mase koji se prepoznaje od strane mab OC125 izolovan iz karcinoma ovarijuma povišen kod 50% pacijena sa karcinomom ovarijuma u stadijumu I, odnosno 90% u II, III i IV stadijumu osetljivost 95%; specifičnost 82%; PPV 78%; NPV 91% CA % 98% (za praćenje ponovne pojave) 101/ /134

18 CA 19-9 CA 19-5 CA 50 CA 72-4 CA 242 Ugljohidratni antigeni osetljivost 80% za karcinom pankreasa; 30% za kolorektalni karcinom GI, pankreas, karcinom ovarijuma osetljivost 90% za karcinom pankreasa; takođe povišen kod karcinoma ezofagusa, jetre, želuca osetljivost 40% u GI kanceru, 40% karcinom pluća, 36% karcinom ovarijuma osetljivost 75% za karcinom pankreasa, 70% za kolorektalni karcinom, 44% karcinom želuca PROTEINI KAO TUMORSKI MARKERI - β 2 -Mikroglobulin - C-peptid - Feritin - Imunoglobulin - Antigen udružen sa melanomom - Antigen udružen sa pankreasom - Specifični protein 1 trudnoće - Prekursor protrombina - Tripsin inhibitor udružen sa trudnoćom 103/ /134 RECEPTORI I OSTALI TUMORSKI MARKERI ONKOGENI GENETSKI MARKERI TUMOR SUPRESOR GENI - Estrogen i progesteron receptori - Metaboliti kateholamina - Sijalinska kiselina udružena sa lipidima - Poliamini 105/134 -N-ras mutacija -K-ras mutacija -c-myc translokacija -c-erb B-2 (HER-2) amplifikacija -c-abl/bcr translokacija -c-abl/bcr translokacija -N-myc amplifikacija - bcl-2 - VHL mutacija - APC mutacija - p16 (cdkn2) mutacija -WT1 mutacija - gubitak heterozigosti - BRCA2, RB1 -RB1 mutacija - P16 E-kaderin mutacija - BRCA1 mutacija - p53 mutacija - DCC mutacija -NF2 mutacija 106/134 Onkogeni RAZNOVRSNI TUMORSKI MARKERI N-ras K-ras c-myc HER-2/neu AML, neuroblastomi leukemija, limfomi B, T-ćelijski limfomi, karcinom malih ćelija pluća dojka, ovarijumi, GI karcinomi - Markeri angigeneze - Ćelije bez nukleinskih kiselina - Cirkulišuće ćelije kancera bcl-2 leukemija, limfomi 107/ /134

19 TM koji se primenjuju: PSA prostata povišen u benignoj hipertrofiji prostate, prostatitisu i sa godinama skrining i pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja TM koji se primenjuju: AFP jetra, germ cell karcinom ovarijuma ili testisa povišen i u trudnoći pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja CA 15-3 dojka; drugi karcinomi koji uključuju pluća, ovarijume povišen kod benignih promena u dojci može da se koriste CA 15-3 ili CA (dva različita određivanja za isti marker gradiranje bolesti, praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja TM koji se primenjuju: CA 19-9 pankrasni; ponekad kolorektalni ili žučnih puteva povišen i u pankreatitisu ili inflamatornim zapaljenjima creva gradiranje bolesti, praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja CA 125 ovarijumi povišen i u endometriozi, nekim drugim oboljenjima i ne preporučuje se za generalni skrining pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja TM koji se primenjuju: CEA kolorektalni, pluća, dojka, tiroidni, pankreasni, jetreni, cerviks, bešika povišen u hepatitisu, COPD, kolitisu, pankreatitisu i kod pušača praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja Estrogen receptori dojka povišen kod hormon zavisnih karcinoma prognoza i vođenje terapije TM koji se primenjuju: hcg testikularni i trofoblastični povišen u trudnoći, testukularnim poremećajima pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja Her-2/neu dojka Onkogen koji je prisutan u multiplim kopijama kod 20-30% invanzivnih karcinoma dojke prognoza i vođenje terapije TM koji se primenjuju: Monoklonski imunoglobulini multipli mijelom i Waldenstromova makroglobulinemija veliko stvaranje imunoglobulina ili antitela koje se detektuje elektroforezom proteina pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja Progesteron receptori dojka povišen kod hormon zavisnih karcinoma prognoza i vođenje terapije

20 TM koji se manje primenjuju: B2M (beta 2 mikroglobulin) multipli mijelom i limfomi BTA (bladder tumor antigen) bešika CA 72-4 ovarijumi Kalcitonin medularni tiroidni karcinom TM koji se manje primenjuju: NSE neuroblastom, karcinom malih ćelija pluća NMP22 bešika PSMA (prostate specific membrane antigen) prostata PAP (prostatic acid phosphatase) metastatski karcinomi prostate, mijelomi, karcinom pluća TM koji se manje primenjuju: S-100 metastatski melanom TA-90 metastatski melanom Tiroglobulin tiroidni Kancer pluća najčešći oblik karcinoma (prema incidenciji:1,2 milion novootkrivenih u svetu; prema smrtnosti: 1,1 milion umrlih u svetu) dva glavna histološka tipa: - nemikrocelularni (nesitnoćelijski, NSCLC) - mikrocelularni (sitnoćelijski, SCLC) NSCLC- obuhvata nekoliko podtipova, uglavnom karcinome skvamoznih ćelija, adenokarcinome i karcinome velikih ćelija SCLC - često podrazumeva neuroendokrini sastav 118/134 Kancer dojki najčešći karcinom kod žena u USA (kod 7% žena do 70-te godine života) ekspresija episialina od strane ćelija dojki CA (cancer antigen) CA 15-3, CA 549 i CA su tri odvojena epitopa na episialinu 119/134 Kancer prostate kod muškaraca po učestalosti na drugom mestu (19%), kao i po smrtnosti od kancera pri koncentraciji od 4,0 µg/l: osetljivost PSA iznosi 78%; specifičnost 33%; koncentracija PSA je u korelaciji sa kliničkim stadijumom kancera koristi se za praćenje terapije 120/134

21 Kolorektalni karcinom (CRC) na trećem mestu po učestalosti pojavljivanja u svetu najznačajniji faktori rizika za CRC su: ishrana bogata životinjskim mastima i proteinima, gojaznost, pušenje i genetska predispozicija CEA pre operacije kod pacijenata sa novo dijagnostikovanim CRC CEA ne može da se koristi za skrining u asimptomatskoj populaciji zbog nedostatka specifičnosti i osetljivosti i niske prevalencije CRC za skrining se najčešće koristi test na okultno krvarenje (FOBT); gvajak i imunohemijski test; Primarni hepatocelularni karcinom (HCC) jedan od najučestalijih karcinoma i često mu prethode hronični virusni hepatitis B ili C ili alkoholno oboljenje jetre ako lečenje počne dovoljno rano, rizik od razvoja HCC je smanjen ili ga nema kod pacijenata koji su već razvili HCC, resekcija ili transplantacija zahteva ranu lokalnu detekciju malih malignih područja određivanje koncentracije AFP zajedno s ostalim imaging tehnikama ima dobro utvrđenu kliničku korisnost razvoj molekularne genetike i proteomike može dovesti do poboljšane rane detekcije i tretmana bolesnika s HCC 121/ /134 Kancer pankreasa kod muškaraca na četvrtom mestu kao uzrok smrti od kancera (kod žena na petom) porast incidencije u svetu 2:1 češće kod muškaraca retka rana dijagnoza bol u epigastrijumu i značajan gubitak u težini su najčešći znaci preživljavanje: 1 godina <10%; 5 godina 2% Gestacioni trofoblastični tumor redak karcinom (kod žena) maligne ćelije rastu u tkivo koje se stvara odmah po oplođenju rast tumora počinje u unutrašnjosti uterusa javlja se kod žena koje godinama pokušavaju da zatrudne dva tipa: hidatidiformne mole i horiokarcinom 123/ /134 NACB: PRAKTIČNE SMERNICE I PREPORUKE ZA UPOTREBU TUMORSKIH MARKERA U KLINIČKOJ PRAKSI opšti zahtevi za kvalitet praktična upotreba tumorskih markera kod različitih kancera preporuke: svi trenutno dostupni markeri kancera faze razvoja svakog tumorskog markera snaga dokaza (engl. level of evidence, LOE) Nivo I II Nivo dokaza za klasifikaciju kliničke korisnosti tumorskih markera Tip dokaza Dokaz iz pojedinačnog jako moćnog prospektivnog ispitivanja koje je specifično dizajnirano kako bi se ispitao marker ili dokaz iz meta analize i/ili pregleda nivoa II ili nivoa III ispitivanja Dokaz iz ispitivanja u kome su podaci o markeru određeni u odnosu na prospektivno terapeutsko ispitivanje koje je izvedeno kako bi se testirala terapeutska hipoteza ali nije specifično dizajnirano da bi se testirala korisnost markera (tj. ispitivanje markera je sekundarni cilj protokola). III IV V Dokaz iz velikog ali retrospektivnog ispitivanja u kome su promenljivi broj uzoraka bili na raspolaganju ili su selektovani. Dokaz iz malog retrospektivnog ispitivanja koje nema prospektivno diktiranu terapiju, praćenje, odabiranje uzoraka ili statističku analizu. Dokaz iz malog pilot ispitivanja koje je dizajnirano da odredi ili proceni distribuciju nivoa markera u ispitivanoj populaciji. ational Academy of Clinical Biochemistry, NACB 125/ /134

22 Vodiči o tumorskim markerima TMUGS preporučuju se samo markeri na osnovu čijih rezultata može da se promeni klinička odluka zasnovanost na dokazima Tumor Marker Utility Grading Scale (TMUGS) Hayes, et al. J Nat Cancer Institute 1996; 88: uključuje semikvantitativnu klasifikacionu skalu sa šest tačaka (0 3+) 3+ ukazuje da taj marker može da se primeni nezavisno pri donošenju kliničkih odluka (kao što je βhcg kod horiokarcinoma) TMUGS 0 nema korisnost NA nije ispitivan +/- preliminarni podaci ukazuju da primena markera može da doprinese povoljnom kliničkom ishodu + marker kolerira sa biološkim procesom i/ili sa krajnjim ishodom; još uvek u statusu istraživanja ++ koristi za datu kliničku primenu i može da se razmatra u standardnoj praksi u izabranim situacijama +++ marker može da se koristi kao jedini kriterijum pri donošenju odluke za datu primenu Najbolji dizajn: Prospektivno, slepo poređenje tumorskog markera i referentnog standarda u uzastopnoj (ili slučajno selektovanoj) seriji pacijenata iz relevantne kliničke populacije za koju se sumnja da ima oboljenje Uzastopna serija pacijenata za koje se sumnja da imaju malignitet prostate + PSA HISTOPATOLOGIJA/ PRAĆENJE Zlatni standard HISTOPATOLOGIJA/ PRAĆENJE + _ + SP LP LN SN TMUGS PLUS PROGNOSTIČKI MARKER uključuje relativnu snagu PROGNOSTIČKOG ili PREDIKTIVNOG markera reflektuje osnovu biologije tumora govori o verovatnoći dakarcinom proliferira, napada i širi se Hayes DF, Trock B, Harris AL. Assessing the clinical impact of prognostic factors: when is statistically significant clinically useful? Breast Cancer Res Treat 1998;52:

23 PREDIKTIVNI MARKER ukazuju na relativnu osetljivost ili na rezistenciju na specifičan tretman ili intervenciju Materijal za učenje 1. Chan DW, Booth RA. Tumor markers. U: Burtis CA, Ashwood, Bruns D. Tietz textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics. 2006; Elsevier Saunders, St. Louis, Missouri, USA 2. Majkić-Singh N. Biohemija tumora i tumorski markeri. U: Majkić-Singh N. Medicinska biohemija, drugo izdanje, Društvo medicinskih biohemičara Srbije, Beograd, 2006; (ISBN ) 3. Ignjatović S. Tumorski markeri. (slajdovi sa predavanja, pdf fajl) 134/134