KVANTITATIVNO ODREðIVANJE SADRŽAJA TIAMINA U UZORKU BRAŠNA

Transcript

1 KVANTITATIVNO ODREðIVANJE SADRŽAJA TIAMINA U UZORKU BRAŠNA 1. TEORETSKI DIO Vitamin B 1 se karakteriše pirimidinskim prstenom (4'-amino-2'-metilpirimidinil-5'metil) povezanim preko metilenskog mosta na 3-nitrogen u supstituiranom tiazolu (5-(2-hidroksietil)-4- metiltiazol). Struktura tiamina je data na Slici 1. Slika 1. Tiamin 3-((4'-amino-2'-metil-5'pirimidinil)metil)-5-(2-hidroksietil)-4-metiltiazol (Vitamin B 1 ) Tiamin postoji u više različitih formi, kao slobodni tiamin i kao fosforirane forme: tiaminmonofosfat (TMP), tiamindifosfat (TPP) i tiamintrifosfat (TTP). Bogati izvori tiamina su kvasci (suhi pivski kvasac, pekarski kvasac) i jetra (Tabela 1). U ljudskoj ishrani, najveći dnevni unos tiamina je sa žitaricama zbog većeg unosa proizvoda žitarica većine stanovništva. Tabela 1: Udio tiamina u različitim namirnicama Povrće mg/100g Voće mg/100g Mrkva 0,06 Kruška 0,03 Grašak 0,32 Narandža 0,10 Žitarice Meso Riža smeña 0,29 Svinjetina 1,10 Riža bijela 0,07 Junetina 0,08 Zob 0,55 Ostale namirnice Pšenica Pivski kvasac 15,6 Brašno cijelo zrno 0,55 Humano mlijeko 0,01 Bijelo brašno 0,06 Mlijeko 0,04 Jaja 0,12 Tiamin je najmanje stabilan hidrosolubilni vitamin kada je ph sredine u kojoj se nalazi neutralan. Maksimalna stabilnost u rastvorima je pri ph 2,0-4,0. Tiamin je veoma nestabilan pri alkalnom ph. Stabilnost zavisi od grijanja i karakteristika hrane. Sposobnost rastvaranja u vodi tiamina dovodi do prelaska u sokove tokom kuhanja. Sadržaj masti može biti važan faktor sa pozitivnim uticajem na zaštitu tiamina u toku termičke obrade. Pronañeno je da je termalna degradacija primarno vezana za rascjep metilenskog mosta izmeñu pirimidina i tiazola. Daljom razgradnjom tiazola oslobaña se hidrogensulfidtiamin je podložan i uticaju x-, γ- i UV zračenju. U namirnicama životinjskog porijekla tiamin se pojavljuje vezan za proteine i znatno je stabilniji.

2 Karakteristične hemijske reakcije tiamina u kiseloj i baznoj sredini su prikazane na Slici 2. Pored navedene oksidacije tiamina pomoću kalijheksacijanoferata (III) ili bromcijana u baznoj sredini, moguće je izvršiti oksidaciju i sa kalijpermanganatom u neutralnoj sredini, pri čemu takoñer nastaje tiohrom. Oksidacijom tiamina sa jodom ili vodikperoksidom nastaje tiamindisulfid koji takoñer ima odreñenu biološku aktivnost kao i tiamin. Molekula tiamina je osjetljiva na djelovanje sumpordioksida i sulfita. Ovi agensi cijepaju molekulu tiamina na dva dijela, koja ne pokazuju vitaminsku aktivnost. Slika 2. Reakcije tiamina Prije učestvovanja u biohemijskim i fiziološkim funkcijama, tiamin se konvertuje u TPP kao koenzim u ćelijama. Funkcija TPP-a kao koenzima je vezana za neke važne enzime u metabolizmu ugljikohidrata i aminokiselina, uključujući piruvatdehidrogenazu, oksoglutaratdehidrogenazu, transketolazu, α-kiselinsku dehidrogenazu, piruvatdekarboksilazu, i karboboksilatkarboligazu. U procesu oksidativne dekarboksilacije piruvata i oksoglutarata, funkcija TPP je prenošenje aktivnog aldehida u formu intermedijera hidroksietil-tpp i α- hidroksi-β-karboksipropil-tpp, koji se daljnim reakcijama transformiraju u koenzim A (CoA) da bi se mogao formirati acetil-coa. TPP i drugi tiamin fosforirani esteri imaju ulogu u prenosu nervnih impulsa. Tačna uloga tiamina u neurotransmisiji je nepoznata, ali je poznato da je TPP

3 uključen u sintezu acetilholina, primarnog neurotransmitera. TTP je uključen u u neku vrstu mehanizma anionskog transporta, ima regulatornu ulogu hloridne permeabilnosti mozga i aktivator je hloridnih kanala koji imaju veliku provodljivost. Tiaminski deficit dešava se kao marginalni deficit i u ekstremnim stanjima dovodi do beriberi i Wernicke-Korsakoff-ovog sindroma. Kritični deficit se karakterizira zamorom, razdražljivošću i manjkom koncentracije. Beriberi, obuhvata suhi beriberi koji je praćen slabošću mišića uključujući i srčani mišić, hipotenzijom, retencijom natrija, tahikardijom i mokri beriberi koji karakerizira edem, anoreksija, slabost mišića, ataksija, periferna paraliza. Wernicke-Korsakoffski sindrom je teško stanje karakterizirano sa mentalnom rastrešenošću uključujući zbunjenost, halucinacije, psihoze i smrt. Ovaj sindrom se sreće kod alkoholičara nakon dugog perioda uzimanja alkohola. Hipervitaminoza B vitamina je praktično odsutna. Spektrofluorimetrijske metode se temelje na oksidaciji tiamina u tiohrom (Slika 3), spoj koji u UV području fluorescira intezivnom plavom bojom, te se koncentracija tiamina odreñuje indirektno odreñivanjem intenziteta fluorescencije tiohroma. Tiohrom reakcija se koristi od njenog razvoja godine za analizu tiamina u biološkim uzorcima. Slika 3. Tiohrom reakcija Prilikom odreñivanje ukupnog tiamina treba se odabrati metoda koja uključuje i ekstrakciju tiamina, jer se vezani tiamin ili ne može direktno oksidirati u tiohrom ili ne može ekstrahirati pomoću izobutanola ili nekog drugog rastvarača u tu svrhu. Ekstrakcija tiamina vezanog za proteine provodi se zagrijavanje uzorka s kiselinom (H 2 SO 4, HCl) u autoklavu ili vodenom kupatilu. Potom se izvodi enzimska hidroliza tiaminpirofosfatam, a ph, temperatura i vrijeme inkubacije zavise o korištenom enzimu (klaraza, takadiastaza, milaza ili α-amilaza). Nakon provedene ekstrakcije, tiamin se oksidira u tiohrom, uz napomenu da je kod nekih metoda uključen i proces prečišćavanja ekstrakta prije same oksidacije. Čišćenje ekstrakta, primjenom adsorbensa ili katjonsih izmjenjivača, provodi se kad mogući utjecaj drugih prisutnih spojeva u uzorku nije riješen na drugi način, npr. primjenom unutrašnjeg standarda, prave slijepe probe. 2. EKSPERIMENTALNI DIO Materijal i metode Brašno Hemikalije i reagensi Izobutanol, C 4 H 10 O, Klara-Diastase (Clarase 300)

4 Kalijheskacijanoferat, K 3 [Fe(CH) 6 ] Natrijacetat, CH 3 COONa Natrijhidroksid, NaOH Sirćetna glacijalna kiselina, CH3COOH Sulfatna kiselina, H 2 SO 4 Tiaminhidrohlorid, C 12 H 17 N 4 OS + Cl -.HCl POSTUPAK Ekstrakcija tiamina U odmjernu tikvicu od 25 ml odvaže se 1g homogeniziranog uzorka. Doda se 10 ml 0,1 M sulfatne kiseline, tikvicu zatvoriti alu-folijom i zagrijava u sušnici u roku od 15 minuta, pri temperaturi od C. Da bi se postigao optimalni ph za enzimsku hidrolizu (ph=4,5) dodati 1,6 ml 2,5 M natrijacetata i promješati. Ohladiti pod vodom sadržaj tikvice na 45 C. Zatim dodati 0,04 g klaraze i promješati, nakon čega se tikvice termostatiraju u roku od sat vremena na 45 C. Ohladiti sadržaj do 20 C, dodati 1,6 ml natrijacetata i dopuniti tikvicu sa destilovanom vodom do oznake (ph=5,5). Promješati i filtrirati Dobijeni filtrati se koriste za odreñivanje sadržaja tiamina različitim metodama (fluorimetrijska metoda i HPLC metode sa različitim detektorima). Fluorimetrijska metoda odreñivanja tiamina Rastvor tiaminhidrohlorida poznate koncentracije 100 µg/ml, koji je prethodno sušen 2 sata u eksikatoru priprema se u 0,1 M sulfatnoj kiselini. Ovakav rastvor je stabilan oko mjesec dana, ako se čuva u tamnoj boci pri temperaturi od 0-4 C. Rastvor 10 µg/ml tiaminhidrohlorida pripremljen od prethodnog rastvora razrijeñivanjem sa destilovanom vodom je stabilan oko nedelju dana, ako se čuva u tamnoj boci kod 0-4 C. Odreñivanje sadržaja ukupnog tiamina fluorimetrijskom metodom se izvodi u tri posude koje su označene kao A (slijepa proba), B (uzorak) i C (unutrašnji standard). Posude sadrže reagense kao što je prikazano u Tabeli 2. Reagensi se dodaju redosljedom koji je navedeno. Tabela 2: Reagensi za izvoñenje tiohrom metode Slijepa proba (A) Uzorak (B) Uzorak + standard (C) 2 ml filtrata 2 ml filtrata 2 ml filtrata 0,5 ml vode 0,5 ml vode 0,5 ml standarda B1 1,5 ml 15% NaOH 1,5 ml oksid. reagensa 1,5 ml oksid. reagensa 5 ml izobutanola 5 ml izobutanola 5 ml izobutanola * oksidacioni reagens (1mL 1% K 3 [Fe(CN) 6 ] i 24 ml 15% NaOH) Dobijene smjese se mućkaju i sačeka da se odvoji sloj izobutanola koji se koristi za mjerenje inteziteta fluorescencije na 378 nm (talasna dužina ekscitacije ) i 430 nm (talasna dužina emisije). Sadržaj tiamina se računa na osnovu odnosa fluorescencije uzorka i fluorescencije

5 uzorka sa dodatom količinom tiamina, umanjenih za fluorescenciju pratećih komponenti (slijepa proba). 3. REZULTATI - Izvršiti eksperimentalni dio vježbe - Vrijednosti mjerenja apsorpcije Uzorak Inteszitet fluorescencije - Koncentracija nepoznatog uzorka OVJERA VJEŽBE