Računski zadaci. metoda internog standarda metoda eksternog standarda metoda normalizacije pika. Metoda internog standarda

Transcript

1 Računski zadaci metoda internog standarda metoda eksternog standarda metoda normalizacije pika Metoda internog standarda

2 Primenjuje se u slučaju da se ne može primeniti metoda eksternog standarda Najčešće razlog za primenu metode internog standarda je loš prinos ekstrakcije što je najčešće u slučaju masti i kremova, kao i drugih formulacija koje sadrže specifične nosače leka Zasniva se na dodatku odabrane supstance (interni standard) rastvorima standarda i rastvoru uzorka u potpuno istoj koncentraciji Podsetnik sa predavanja Podsetnik sa predavanja Određivanje sadržaja hidrokortizona u kremi metodom internog standarda uz kalibraciju u jednoj tački Primer sa predavanja kortikosteroidi se mogu odrediti na C18 koloni primenom mobilne faze koja sadrži odgovarajući odnos metanola i vode u navedenom primeru, određuje se hidrokortizon iz krema uz betametazon kao interni standard hidrokortizon betametazon 4

3 betametazon je lipofilniji i eluira se nakon hidrokortizona betametazon se dodaje u prvoj fazi ekstrakcije ekstrakcija je neophodna zbog visokog sadržaja masne faze u kremu koja bi otežala hromatografsku analizu krem se disperguje smešom metanol/voda ekstrakcija se izvodi heksanom u kome kortikosteroidi imaju nisku rastvorljivost u heksanu zaostaju komponente masne faze natrijum-hlorid se dodaje u smešu metanol/voda da bi se sprečilo formiranje emulzije pri ekstrakciji masne faze heksanom 5 Kratak opis postupka: Pripremiti smešu metanol - 15 %-tni vodeni rastvor natrijum-hlorida (2:1) Priprema Rastvora S: Pripremiti smešu standarda hidrokortizona i betametazona u metanolu (koncentracija r S 100 µg ml -1 hidrokortizona i 100 µg ml -1 betametazona). 6

4 Priprema Rastvora A: Odmeriti onu količinu krema koja sadrži 10 mg hidrokortizona, a zatim dispergovati u 30 ml smeše metanol - 15 %-tni vodeni rastvor natrijumhlorida (2:1) i 10 ml metanolnog rastvora standarda betametazona koncentracije 1 mg ml -1. Ekstrahovati dispergovani krem sa 50 ml zagrejanog heksana Ukloniti donji sloj (metanolno-vodeni sloj), a gornji heksanski sloj isprati dva puta sa po 10 ml smeše metanol - 15 %-tni vodeni rastvor natrijum-hlorida (2:1) Spojiti sve metanolno-vodene slojeve u sud od 100 ml, a zatim sud dopuniti vodom do oznake. NAPOMENA: Rastvor A sadrži hidrokortizon i betametazon (koncentracija r A 100 µg ml -1 hidrokortizona i 100 µg ml -1 betametazona). 7 Priprema Rastvora B: Odmeriti onu količinu krema koja sadrži 10 mg hidrokortizona, a zatim dispergovati u 30 ml smeše metanol - 15 %-tni vodeni rastvor natrijum-hlorida (2:1) i 10 ml metanola Ekstrahovati dispergovani krem sa 50 ml zagrejanog heksana Ukloniti donji sloj (metanolno-vodeni sloj), a gornji heksanski sloj isprati dva puta sa po 10 ml smeše metanol - 15 %-tni vodeni rastvor natrijum-hlorida (2:1) Spojiti sve metanolno-vodene slojeve u sud od 100 ml, a zatim sud dopuniti vodom do oznake. NAPOMENA: Rastvor 2 sadrži samo hidrokortizon (koncentracija r B 100 µg ml -1 hidrokortizona). Injekotovanjem Rastvora 2 proverava se selektivnost ekstrakcije odsustvo ekscipijenasa koji mogu interferirati sa pikom internog standarda. 8

5 Hromatografski uslovi: Kolona C18 Mobilna faza metanol voda (70:30 V/V) Talasna dužina detekcije 240 nm 9 Rastvor S Rastvor A Rastvor B 10

6 Primer izračunavanja: Deklarisan sadržaj hidrokortizona u kremu = 1% m/m Masa hidrokortizon krema odmerenog za pripremu Rastvora A = 1,173 g Površina pika hidrokortizona iz Rastvora S = Površina pika betametazona iz Rastvora S = Površina pika hidrokortizona iz Rastvora A = Površina pika betametazona iz Rastvora A = Koncentracija hidrokortizona u Rastvora S = 100,8 µg ml -1 Koncentracija betametazona u Rastvora S i Rastvora A = 100,3 µg ml NAPOMENA: Kod metoda internog standarda primenjuje se tzv. faktor odgovora (eng. Response Factor) radi minimiziranja greške koja može poticati od razlike odgovora detektora za rastvor uzorka i rastvor standarda Faktor odgovora za Rastvor S =P hidrokortizona u Rastvoru S /P betametazona u Rastvoru S Faktor odgovora za Rastvor A =P hidrokortizona u Rastvoru A /P betametazona u Rastvoru A Koncentracija hidrokortizona u r A = 12

7 Preračun: Koncentracija r S je 100,8 µg ml -1 hidrokortizona Faktor odgovora za Rastvor S = = 1, Faktor odgovara za Rastvor A = = 1, Koncentracija hidrokortizona u r A = 13 Deklarisani sadržaj hidrokortizona u kremu = 1 % m/m (10 mg g -1 ) Masa odmerenog krema = 1,173 g (teorijski odmereno 11,73 mg hidrokortizona) Zapremina r A = 100 ml Sadržaj hidrokortizona u kremu = NAPOMENA: Prema BP sadržaj hidrokortizona u kremu treba da bude 90,0% - 110,0% 14

8 Metoda eksternog standarda Često se koristi za kvantitativnu analizu Današnje instrumente karakteriše visoka preciznost a u većini slučajeva lekovi koji se analiziraju u gotovim proizvodima primenom odgovarajućeg postupka potpuno se ekstrahuju Ako je ekstrakcija kompletna, onda površina hromatografskog pika dobijenog iz određene količine formulacije može biti direktno upoređena sa kalibracionom krivom konstruisanom sa serijom rastvora koji sadrže različite koncentracije referentnog standarda Podsetnik sa predavanja 16

9 Određivanje sadržaja amoksicilin trihidrata u kapsulama metodom eksternog standarda uz kalibraciju u jednoj tački β-laktamski antibiotici mogu se odrediti HPLC metodom na C18 koloni primenom mobilne faze koja sadrži odgovarajući odnos metanola i vode u navedenom primeru, određuje se amoksicilin iz kapsula Amoksicilin trihidrat 17 Kratak opis postupka: Priprema Rastvora S: Pripremiti rastvor standarda amoksicilin trihidrata u destilovanoj vodi (koncentracija r S 0,53 mg ml -1 ). Pripremiti tri Rastvora S. 18

10 Priprema Rastvora A: Odmeriti onu količinu sadržaja kapsula koja sadrži 11,45 mg amoksicilina u obliku amoksicilin trihidrata. Odmerenu masu praška kvantitativno preneti sa 15 ml destilovane vode u odmerni sud od 25 ml i 15 minuta rastvarati u ultrazvučnom kupatilu. Nakon rastvaranja odmerni sud ohladiti, dopuniti vodom do oznake i profiltrirati Rastvor A. Koncentracija r A 0,53 mg ml -1 računato na amoskicilin trihidrat Koncentracija r A 0,46 mg ml -1 računato na amoksicilin 19 Primer izračunavanja: Deklarisan sadržaj amoksicilina u kapsulama = 250 mg/kaps. u obliku trihidrata Prosečna masa sadržaja kapsula = 0,3014 g Masa sadržaja kapsula odmerena za pripremu Rastvora r A = 0,0142 g Teorijska koncentracija r A 0,53 mg ml -1 računato na amoksicilin trihidrat! Nakon izvršene HPLC analize dobijene su sledeće površine ispod pikova: Površine pikova amoksicilin trihidrata iz Rastvora S = 57167, i Površine pikova amoksicilin trihidrata iz Rastvora A = 57651, 57614, 57632, i

11 Preračun: Koncentracija r S je 0,53 mg ml -1 amoksicilin trihidrata Srednja vrednost površina pikova amoksicilin trihidrata iz Rastvora S = ,33 Srednja vrednost površina pikova amoksicilin trihidrata iz Rastvora A = Cs Ps Ca Pa Pa Ca = Cs Ps Ca = 0,525mg / ml Zapremina r A = 25 ml 0,525mg 1mL x 25mL Količina amoksicilin trihidrata u Rastvoru A = 13,13 mg Nađena količina amoksicilin trihidrata se nalazi u 0,0142 g odmerene količine sadržaja kapsula za pripremu Rastvora A. 13,13 mg 0,0142g xmg 0,3014g x = 278,78mg / kapsuli Sadržaj amoksicilin trihidrata u jednoj kapsuli = 278,78 mg/kaps 22

12 Deklarisani sadržaj amsoksicilina = 250 mg/caps u obliku trihidrata Mr (amoksicilina) = 365,40 Mr (amoksicilin trihidrata) = 419,45 278,78 419,45 x 365,40 x = 242,86mg amoksicilina Sadržaj amoksicilina u jednoj kapsuli = 242,86 mg/kaps 242,86 Sadržaj(%) = 100 = 97,144% 250 Sadržaj amoksicilina u procentima u jednoj kapsuli = 97,144 % NAPOMENA: Prema USP sadržaj amoksicilina u kapsulama treba da bude 95,0% - 105,0% Metoda normalizacije pika

13 Dozvoljeni nivo nečistoća u aktivnim farmaceutskim supstancama propisuje ICH Q3A Ovaj definisani dozvoljeni nivo nečistoća naveden je i u Opštoj monografiji Farmaceutske supstance Propisan je na osnovu maksimalne dnevne doze Definisani su posebni limiti za prijavljivanje, identifikaciju i kvalifikaciju nečistoća 25 ICH Q3A: Impurities in new drug substances Maksimalna dnevna doza Limit za prijavljivanje nečistoće 1,2 Limit za identifikaciju nečistoće 2 Limit za kvalifikaciju 2 2 g/dnevno 0,05% 0,1% ili 1,0 mg/dnevno* 0,15% ili 1,0 mg/dnevno* > 2 g/dnevno 0,03% 0,05% 0,05% 1 Postavljanje više vrednosti limita za prijavljivanje nečistoća mora biti naučno obrazloženo 2 Niže vrednosti limita za prijavljivanje, identifikaciju u kvalifikaciju treba definisati kod nečistoća koje su izuzetno toksične *uzima se vrednost koja je niža 26

14 Limit za prijavljivanje nečistoća je koncentracija (% u odnosu na maksimalnu dnevnu dozu ) koja mora biti prijavljena Regulatornom telu. UKAZUJE SE NA PRISUSTVO SPECIFICIRANE NEČISTOĆE Limit za identifikaciju nečistoće je koncentracija (% u odnosu na maksimalnu dnevnu dozu) koja mora biti identifikovana primenom odgovarajuće metode. IDENTIFIKACIJA SPECIFICIRANE NEČISTOĆE Limit za kvalifikaciju nečistoća je koncentracija (% u odnosu na maksimalnu dnevnu dozu) specificirane nečistoće koja mora biti podvrgnuta toksikološkim ispitivanjima kako bi se potvrdila bezbednost. 27 Identifikovana nečistoća Svaka nečistoća čija je struktura poznata. Neidentifikovana nečistoća Svaka nečistoća čija struktura nije poznata, tako da je okarakterisana samo recimo retencionim vremenom ili relativnim retencionim vremenom. Specificirana nečistoća Svaka nečistoća koja se navodi pojedinačno i sa definisanim kriterijumom prihvatljivosti; može biti identifikovana ili neidentifikovana. Nespecificirana nečistoća Nečistoća koja se ne navodi pojedinačno i nema sopstveni definisani kriterijum prihvatljivosti, već je obuhvaćena generalnim kriterijumom prihvatljivosti (ne više od ( ) limita za identifikaciju). 28

15 RRT = t RC /t RB RRT = t RA /t RB 29 Metoda normalizacije pika -izračunavanje- Metoda normalizacije pika se koristi zbog Rezultat se izražava u procentima, a računa kao površina pika analita (nečistoće) u odnosu na zbir svih površina analita u smeši: P P P(%) = x100 P površina pika analita (nečistoće) P zbir svih površina analita u smeši i i