ODREĐIVANJE ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI METODOM REDUKVIJE Fe(III) JONA

HTML
DOWNLOAD

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ODREĐIVANJE ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI METODOM REDUKVIJE Fe(III) JONA"

Ἀμών Λόντος
6 χρόνια πριν
Προβολές:

1 ODREĐIVANJE ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI METODOM REDUKVIJE Fe(III) JONA TEORIJSKI DIO Reakcije oksidacije, redukcije i helatacije jona prelaznih elemenata organskim molekulama poznata je još od davnina. Međutim, tek otkrivanjem tzv. Fentonovog reagensa započinje epoha intenzivnog razvoja organo-metalne hemije. Naime, godine otkriveno je da Fe 2+ jon u prisustvu H 2 O 2 rezultira konačnim nastankom superoksidnog radikala. U narednim godinama izveden je veliki broj eksperimenata pri kojima su sintetisani različiti organski spojevi upotrebom jona prelaznih elemenata. Oni su uglavnom dobiveni oksidacijom ili redukcijom istih, ali i helatacijom od strane heteroatoma sa organske molekule. Pomenute reakcije su danas od velikog značaja u sintetskoj organskoj hemiji, kao i u raznim istraživanjima. Jedna od primjena jeste pračenje antioksidativne aktivnosti različitih spojeva. Polazeći od definicije antioksidansa, da je to molekula koja inhibira oksidaciju neke druge molekule, očita je povezanost pojma antioksidansa i redoks procesa, kao i helatacije. Do današnjeg dana razvijen je veliki broj metoda određivanja antioksidativne aktivnosti redukcijom, oksidacijom ili helatacijom jona prelaznih metala. Neke najznačajnije su: Fericijanid metoda/metoda Pruskog plavog, Metoda redukcije Mo(VI), Metoda helatacije Fe(II). Mehanizam redukcije jona prelaznih metala antioksidansima Metode određivanje antioksidativne aktivnosti redukcijom jona prelaznih metala teku po tzv. SET mehanizmu. SET mehanizam podrazumjeva jednostavan transfer elektrona sa antioksidansa na aktivnu vrstu. Prema tome, metode bazirane na SET mehanizmu mjere potencijal antioksidansa da prenese elektron na neku reaktivnu vrstu, uključujući i metale, karbonile i radikale. ( )

2 Relativna reaktivnost prema SET mehanizmu određena je korakom deprotonacije i IP (Ionization potential) vrijednošću funkcionalne grupe, koja nastupa kao donor pa su reakcije koje teku po SET mehanizmu jako ph ovisne. U opštem slučaju IP vrijednost se smanjuje povećanjem ph medija, što održava povećani elektrodonorski kapacitet uz deprotonaciju. SET mehanizam je dominantan ako se u sistemu nalazi spoj sa ΔIP>-45 kcal/mol. Reakcije koje se odvijaju po SET mehanizmu su obično spore i treba im dosta vremena do uspostavljanja ravnoteže, dok se antioksidativna aktivnost obično izražava kao postotak smanjenja reaktivne vrste, a ne kinetičkim parametrima. Kada AH +. ima dovoljno dug vijek trajanja, sekundarne reakcije postaju značajna smetnja u testovima baziranim na SET mehanizmu. Fericijanidna metoda i metoda redukcije Mo(VI) teku po čistom SET mehanizmu. Razlika ovih metoda jeste u indukciji kraja reakcije. U nastavku su date osnove ovih metoda. Fericijanidna metoda Ova metoda je prvi put opisana godine od strane Oyaizu. Zasnovana je na redukciji [Fe(CN) 6 ] 3- antioksidansom. Pri tome, prema SET mehanizmu antioksidans donira elektron centralnom metalnom jonu redukujući ga prema reakciji: ( ) ( ) Nastali produkt (redukovana forma) se stabilizira dodatkom Fe 3+ jona, dajući kompleks koji apsorbira u vidljivom dijelu spektra. Upravo pračenje promjene apsorpcije na 700 nm daje podatke o sposobnosti antioksidansa da redukuje Fe(III) jon do dvovalentnog jona koji obrazuje obojeni kompleks stabilizacijom sa Fe(III) jonima. Metoda redukcije Mo(VI) Redukcija Mo(VI) kao metoda evaluacije antioksidativne aktivnosti prvi put je upotrebljena godine. Mehanizam reakcije antioksidansa i Mo(VI) jona zasniva se na transferu elektrona, pri čemu se formira Mo(V) jon koji apsorbuje u vidljivom dijelu spektra. Analogno kao i kod fericijanidne metode upravo intenzitet apsorpcije dobivenog rastvora Mo(V) je pokazatelj antioksidativne aktivnosti ispitivanog uzorka (spoja). ( ) ( )

3 Za razliku od fericijandine metode, nastali produkt Mo(V) jona, je već sam po sebi obojen te nije potrebno dodavati reagens koji će sa istim nagraditi kompleks koji apsorbuje u vidljivom dijelu spektra. Evaluacija i obrada rezultata Fericijanidna metoda Literaturni izvori navode na dva osnovna načina izražavnja rezultata dobivenih ovom metodom, a to su: Moć redukcije, RP (reduction power) i Moć redukcije u odnosu na neki standard. Prvi način izražavanja rezultata se preporučuje kada su na raspolaganju različiti uzorci, jer se time postiže postavljanje komparacije među uzorcima u odnosu na rezultate. Princip izražavanja ovom metodom se sastoji u sljedećem. Paralelno sa analizom uzorka koji se ispituje na moć redukcije trovalentnog jona Fe(III) vodi se analiza kontrolne probe koja umjesto K 3 [Fe(CN) 6 ] sadrži ekvivalentnu količinu K 4 [Fe(CN) 6 ]. Iz dobivenih rezultata se moć redukcije računa prema formuli: ( ) Iz ovako dobivenih rezultata moguće je izračunati IC 50 vrijednosti, crtajući grafik RP=f(c antioksidans ). Izražavanje dobivenih rezultata ovom metodom preko ekvivalenata nekog standarda je znatno češći način. Standardi koji se najčešće koriste kod ove metode su L(+)-askorbinska kiselina i BHT. Ovaj način izražavanja rezultata dobivenih ovom metodom podrazumjeva analizu askorbinske kiseline u različitim koncentracijama. Nakon toga se konstruira kalibraciona kriva te se računskim putem dolazi do količine L(+)-askorbinske kiseline koja je izvršila jednaku redukciju kao i odgovarajuća količina analiziranog uzorka.

4 Metoda redukcije Mo(VI) Kada je u pitanju izražavanje rezultata dobivenih ovom metodom, literatura je vrlo usaglašena i nalaže izražavanje rezultata u odnosu na neki od standarda, najčešće L(+)-askorbinska kiselina ili α- tokoferol. Ovaj način podrazumjeva paralelnu analizu uzorka i standarda različitih koncentracija. Na osnovu rezultata standarda (različitih koncentracija) konstruiše se kalibraciona kriva. Iz konstruisane kalibracione krive se potom računskim putem dolazi do podatka koji govori o količini standarda koji je izvršio jednaku redukciju kao i ispitivani uzorak. Prednosti i nedostaci Primjena jona prelaznih metala u određivanju antioksidativne aktivnosti uzoraka imaju veliki broj prednosti, ali i nedostataka. Radi se o metodama koje su relativno jednostavne za izvedbu i ne zahtjevaju skup instrumentarij. Od ostalih prednosti koje se navode u literaturi, sljedeće su najbitnije: Reproducibilnost i ponovljivost metode, Jako dobro slaganje rezultata u odnosu na ukupni sadržaj fenola, Prisustvo jona prelaznih metala u živim sistemima, čime se postiže veća vjerodostojnost in vitro studija. Primjena jona metala prelaznih elemenata ima i svoje nedostatke. Osnovni nedostatak koji se navodi u literatuti jeste velika ph ovisnost rastvorljivosti njihovih soli. Tako se npr. određivanje redukcijske moći antioksidansa ferocijanidnom metodom mora provoditi u relativno kiselom mediju kako bi se održala zadovoljavajuća rastvorljivost Fe(III) soli. Pored toga ovim metodama nije moguće mjeriti antioksidacijsku moć koja potiče od prisustva tiola. Još veliki broj molekula interferiraju metodama određivanja antioksidativne aktivnosti jonima prelaznih metala. Takve su organske molekule: adenin, aminobenzojeva kiselina, bezaldehid, kreatinin, citozin, N,N-dimetilanilin, glicin, EDTA, tiourea, i mnoge druge anorganske molekule kao što su hidrazin, FeSO 4, MgSO 4, NaCN, SnCl 2 i druge.

5 EKSPERIMENTALNI DIO Materijal i metode Metanol BHT 1% K 3 [Fe(CN) 6 ] 1% K 4 [Fe(CN) 6 ] 0,1 % FeCl3 10% TCA Procedura: Pripremiti smjese u ependorficama slijedećeg sastava: (NAPOMENA: Za uzorak koristiti najmanje 5 rastvora BHT-a koncentracija mg/ml) Slijepa proba Kontrola Uzorak 0,1 ml MeOH 0,1 ml MeOH 0,1 ml uzorka u MeOH 0,25 ml MeOH 0,25 ml MeOH 0,25 ml MeOH 0,25 ml 1% K 3 [Fe(CN) 6 ] 0,25 ml 1% K 4 [Fe(CN) 6 ] 1% K 3 [Fe(CN) 6 ] Dobivene smjese termostatirati na 50 C 20 minuta. Nakon toga, dodati 0,25 ml 10% trihlorsirćetne kiseline i smjese promješati. U kivete direktno iz dobivene smjese pipetirati 0,15 ml, razblažiti sa 0,8 ml MeOH i dodati 0,05 ml 0,1% FeCl 3. Snimiti apsorpcioni spektar, a zatim sve rastvore snimiti na maksimumu apsorpcije. Grafički odrediti IC 50 vrijednost za BHT i ekvivalente BHT za neki biološki uzorak.

6 REZULTATI Abs kontrolne probe: Abs kontrolne probe (srednja vrijedost): Koncentracija BHT-a Abs 1 Abs 2 Abs s Abs biološkog uzorka: RAČUN: Napomena: Priložiti grafik! OVJERA:

Σχετικά έγγραφα

SEMINAR IZ KOLEGIJA ANALITIČKA KEMIJA I. Studij Primijenjena kemija

SEMINAR IZ KOLEGIJA ANALITIČKA KEMIJA I. Studij Primijenjena kemija SEMINAR IZ OLEGIJA ANALITIČA EMIJA I Studij Primijenjena kemija 1. 0,1 mola NaOH je dodano 1 litri čiste vode. Izračunajte ph tako nastale otopine. NaOH 0,1 M NaOH Na OH Jak elektrolit!!! Disoira potpuno!!!