EE - EP B1 KIRJELDUS

Transcript

1

2 EE - EP B1 KIRJELDUS [0001] Käesolev leiutis käsitleb ristseotud fibrinogeeni või selle derivaati sisaldava ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni valmistamise meetodit, nimetatud meetodiga saadud ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni ja nimetatud kompositsiooni kasutamist täispaksusega naha kaotusega haavade parandamisel, kudede taastamisel või koetehnoloogilise toesena. [0002] Haavad, millega kaasneb täispaksusega naha kaotus, tekivad paljudel erinevatel põhjustel, mis on seotud kolme peamise krooniliste haavade tüübiga: lamatistest, veenihaavanditest ja diabeediga kaasnevatest haavanditest kuni traumast põhjustatud haavade ja põletushaavadeni. Akuutsed ja kroonilised haavad, millega kaasneb täispaksusega naha kaotus, on eluohtlikud ja võivad lõppeda patsiendi surmaga. Sellised haavad põhjustavad füsioloogilist stressi, paljastavad alati olulisi struktuure ja nende ravimine on kulukas. Sellistel haavadel võivad olla rasked tagajärjed, kuna nad lõhuvad naha kaitsefunktsiooni, suurendavad infektsioonide tekke ohtu ja toovad kaasa vedelikukaotuse. Lisaks põhjustavad need patsiendile olulist füüsilist, emotsionaalset ja sotsiaalset ebamugavust, kuna need haavad ei parane kergesti. [0003] Kuna teadlaste põhiteadmised haavadest ja haavade paranemismehhanismidest on järjest täienenud, on välja töötatud hulk erinevaid haavade ravistrateegiaid. Vaatamata väikeste haavade ravis toimunud edasiminekule nagu mikrokirurgiline sulgur (microsurgical flap closure) ja paikse negatiivse rõhu kasutuselevõtt, on püüded parandada suurte haavade kontrolli all hoidmise meetodeid olnud edutumad. [0004] Selle põhjuseks on asjaolu, et sellised suured haavad vajavad katmiseks nahka, milleks on olemas hulk puudulikke lahendusi. STSG (split thickness skin grafts) siirikud, mille korral eemaldatakse vajalik kude patsiendilt ja põhjustatakse talle seeläbi edasisi kahjustusi, ei stimuleeri kaotatud pärisnaha (dermise) taastumist ja tekitavad seetõttu sageli tõsiseid arme. Pealegi võib kasvatatud keratinotsüütide valmistamiseks kuluda ligikaudu kuu ja haavale kandmisel ilma piisava pärisnahata võivad need tekitada pikaajalisi tõsiseid arme. [0005] Seetõttu on kliinilistes ringkondades võetud kasutusele ekstratsellulaarse maatriksi kompositsioonid nagu pärisnaha toese (dermal scaffold) kompositsioonid ja nende kasutamine on viimase kümne aasta jooksul järjest hoogustunud (vähemalt Ühendkuningriigis). On jõutud tõdemuseni, et nendel kompositsioonidel peavad olema konkreetsed omadused, et nendega saaks vähendada haavade kokkutõmbumist ja armistumist. See materjal peab olema

3 2 võimeline toetama rakkude adhesiooni, olema piisavalt jäik, et see ei vajuks sissekasvavate rakkude poolt avaldatava jõu survel kokku ja ka pidama vastu kiirele proteolüütilisele lagunemisele ja jääma haava keskkonnas toimuva fibroblastide proliferatsiooni korral funktsionaalseks. [0006] Praegu on naha toese kompositsioonide peamiseks koostisosaks kollageen. Kollageeni on peetud passiivseks ja paljulubavaks tugiaineks, mis võimaldab rakkude elektrijuhtivust. Kasvatatud fibroblastide ja endoteelirakkude sisenemine kollageensetesse materjalidesse on piiratud. Kliinilised kogemused näitavad, et raskete haavade korral võib selliste kollageenipõhiste lahenduste omaksvõtmine (take) (st siiriku edukas ühinemine patsiendi nahaga) võtta mitu nädalat. Selliste lahendustega kaasneb sageli infektsioon, seroomid ja hematoomid ning need osutuvad sageli ebafunktsionaalseteks ja toovad kaasa tõsiseid tagajärgi. [0007] Hiljutised andmed näitavad, et fibrinogeenil võivad olla kriitiliselt tähtsad omadused, mis on olulised angiogeneesis (Potter et al., (2006) Plast. Reconstr. Surg., 117 (6), ), mis on füsioloogiline protsess, mille käigus tekivad varem olemas olevatest veresoontest uued veresooned. Angiogenees on eriti oluline haavade paranemise protsessis, milles mõned rakud ei suuda ellu jääda, kui need paiknevad lähimast funktsionaalsest kapillaarist enam kui 100 µm kaugusel (Langer et al., Tissue Eng., 1995, 1, ). Patendidokumendis US 2004/ (Bowlin et al) kirjeldatakse elektriliselt töödeldud fibriinipõhiste maatriksite ja kudede seeriat. [0008] Fibrinogeen on identifitseeritud sünteesilise pärisnaha ühe potentsiaalse koostisosana (Baldwin et al., Development of a pro-angiogenic matrix for synthetic dermis using cultured endothelial cells. Institute Pasteur Euroconferences 40, 2005). [0009] Patendidokumendis WO 2004/ kirjeldatakse poorset fibriinimaatriksit rakkude kolmemõõtmelise kasvu toetamiseks. See maatriks on valmistatud plasmavalkudest, mis sisaldavad fibrinogeeni, trombiini ja lisaainet, mis on valitud glükoosaminoglükaanidest, kuid mis ei sisalda ristsiduv ainet ega vahustusainet. [0010] Käesoleva leiutise eesmärgiks on pakkuda stabiilset ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni, mis interakteerub rakkudega eeskätt selleks, et soodustada endoteelirakkude adhesiooni, suurendada omaksvõtmise tõenäosust ja seega sünteetilise maatriksi materjali funktsionaalsust.

4 3 [0011] Käesoleva leiutise esimese aspektina pakutakse seega ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni valmistamise meetodit, mis hõlmab: (a) fibrinogeeni vesilahuse segamist koagulandi ja mahuaine ning vahustava ainega, (b) etapis (a) saadud segu inkubeerimist ristsiduva ainega, mis on valitud järgmiste ainete seast: karbodiimiidi siduvad ained, nagu N-(3-dimetüülaminopropüül)-N'-etüülkarbodiimiid (EDC), N-hüdroksüsuktsiinimiid (NHS), asiidi siduvad ained, diisotsüanaati ristsiduvad ained nagu heksametüleendiisotsüanaat, epoksiidi ristsiduvad ained, nagu epikloorhüdriin, glütsidüüleetrid ja glütsidüülamiinid, ja aldehüüdi ristsiduvad ained, nagu formaldehüüd, glutaaraldehüüd ja glüoksaal, ning (c) etapis (b) saadud ristseotud kompositsiooni pesemit ristsiduva aine eemaldamiseks. [0012] Siin kasutatuna viitab mõiste ekstratsellulaarne maatriks struktuurile, toesele või plaadile, mis on valmistatud keemiliselt või biokeemiliselt defineeritud materjalist, mille külge suudavad kinnituda kõrgemate selgroogsete rakud (nt naha-, lihase-, närvi-, sidekoe-, sidekirme-, kõvakesta- või kõhukelmerakud) ja paljuneda, põhjustamata toksilisust või inhibeerimata rakkude replikatsiooni. [0013] Fibrinogeeni molekulmass on 340 kda (Doolittle, R. F., Annu. Rev. Biochem., 1984, 53, ) ja see koosneb polüpeptiidahelate kolmest paarist (AαBβγ) 2. Kõigi kolme paari ahelate aminoterminused on molekuli keskosas ühendatud disulfiidsidemetega. Bβ-ahelate karboksüterminused sisaldavad proksimaalseid otsapiirkondi ja γ-ahelate karboksüterminused sisaldavad distaalseid otsapiirkondi (Weisel, J. W., Stauffacher, C. V., Bullitt, E., Cohen, C., Science, 1985, 230, ). [0014] Fibrinogeeni võib lõhustada mitmesugustest erinevatest kohtadest, et saada fibriini fragmente. Fibrinogeeni võib plasmiini kasutades lõhustada näiteks fragmendiks A, B, C ja X. Fragmendi X võib seejärel lõhustada fragmendiks Y ja fragmendiks D. Fragmendi Y võib lõhustada veel üheks fragmendiks D ja fragmendiks E.

5 4 [0015] Viited fibrinogeenile või selle derivaadile hõlmavad seega ka viiteid plasmast puhastatud natiivsele fibrinogeenile, fibrinogeeni fragmentidele või fibrinogeeni analoogidele. Siinkohal tuleb mõista, et mis tahes fragment või selle analoog peab säilitama natiivse fibrinogeeni angiogeense funktsiooni ja me oleme käesolevas dokumendis näidanud, et eespool mainitud lagunemissaadused matkivad naiivse fibrinogeeni proangiogeenset toimet. [0016] Tuleb mõista, et viited puhastatud fibrinogeenile hõlmavad fibrinogeeni, mille puhtusaste on suurem kui kas 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% või 99%. [0017] Fibrinogeeni fragmentide näidete seas on fibrinogeeni kärbitud vormid, nagu fibriin A, fibriin B, fibriin C, fibriin D, fibriin X ja fibriin Y. Ühes täiendavas teostuses on fibrinogeeni kärbitud vorm fibriin E. [0018] Fibrinogeeni analoogide näidete seas on fibrinogeeni modifitseeritud derivaat, milles peptiidi üks või mitu aminohappejääki on asendatud teiste looduslikult esinevate või sünteetiliste aminohappejääkidega ja/või milles üks või mitu aminohappejääki on peptiidist deleteeritud ja/või milles peptiidi on lisatud üks või mitu aminohappejääki. Selline aminohappejääkide lisamine või deleteerimine võib toimuda peptiidi N-terminuses ja/või peptiidi C-terminuses. Veel üheks näiteks võib olla geneetiliselt rekombinantne fibrinogeenimolekul. [0019] Tuleb mõista, et viited fibrinogeenile või selle derivaadile ei laiene elektriliselt töödeldud fibrinogeenile või selle derivaadile nagu ühendid, mida kirjeldatakse patendidokumendis US 2004/ [0020] Fibrinogeeni või selle derivaadi olemasolul kompositsioonis on olemuslik ja tugev stimuleeriv toime endoteelirakkude migratsioonile, mis tagab parema omaksvõtmise ja teeb võimalikuks oluliselt kiirema paranemisprotsessi. Seetõttu arvatakse, et leiutisekohasel mee-

6 5 todil saadud poorne fibriinimaterjal võib olla haavade ravis efektiivsem kui eelnevalt kirjeldatud ekstratsellulaarse maatriksi kompositsioonid (nt pärisnaha toesed). [0021] Ühes teostuses sisaldub fibrinogeen kompositsioonis vesilahusena, mille ph on puhvri abil reguleeritud väärtusele 4 kuni 10. Ühes täiendavas teostuses on fibrinogeeni ph reguleeritud puhvri abil väärtusele 7 kuni 8 (nt 7,4). Ühes teostuses puhverdatakse fibrinogeeni fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) või HEPES-puhverdatud soolalahusega. [0022] Ühes teostuses sisaldab koagulant ensümaatilist või mitteensümaatilist koagulanti. Ühes täiendavas teostuses on ensümaatiline koagulant trombiin (IUBMB ensüümide nomenklatuuri kohaselt EC ) või trombiini mimeetik. Trombiini või trombiini mimeetiku olemasolu ekstratsellulaarses maatriksis aitab moodustada geeli kujul stabiilset kompositsiooni. [0023] Ühes teostuses on ensümaatiline koagulant trombiin, mis võib pärineda loomariigist või prokarüootsetest organismidest. Ühes täiendavas teostuses on ensümaatiline koagulant lõhe trombiin. Selle teostuse eeliseks on väiksem nakkushaiguse ülekandumise oht. Ühes alternatiivses teostuses on ensümaatiline koagulant inimese trombiin. [0024] Trombiin on kümotrüpsiinide perekonda kuuluv endopeptidaas, millel on trüpsiini tüüpi substraadispetsiifilisus. Trombiin muundab fibrinogeeni fibriiniks, lõhustades selleks fibrinogeenis valikuliselt Arg-Gly sidemed, et vabaneksid fibrinopeptiidid A ja B. [0025] Trombiini kirjeldatakse ka fibrinogenaasi, trombaasi, trombofordi, toopilise trombiin- C, tropostasiini, vere aktiveeritud hüübimisfaktori II, vere hüübimisfaktori IIa, faktori IIa, trombiini E, β-trombiini ja γ-trombiinina. Seetõttu hõlmavad viited trombiini mimeetikutele nendega mistahes struktuuri ja funktsiooni poolest sarnaseid aineid, analooge ja kõiki derivaate, millel on sellised omadused. Selliste trombiini mimeetikute näidete seas on: batroksobiin (sünonüümid: defibraas, reptilaas, IUBMB nomenklatuur S01.176), krotalaas (saadud Crotalus adamanteus mürgist, sünonüümid: defibrinsüüm, IUBMB nomenklatuur S01.177), botrombiin (saadud Bothrops jararaca mürgist, IUBMB nomenklatuur S01.179), atroksiin (saadud Bothrops atrox-st, IUBMB nomenklatuur U9G.05), Ancrod (saadud Agkistrodon controtix toksiinist, sünonüümid Arvin, Protac, C-valgu aktivaator, IUBMB nomenklatuur S01.178), ja gabonaas (saadud Bitis gabonica-st, IUBMB nomenklatuur S01.430). [0026] Ühes teostuses on mitteensümaatiline koagulant protamiin või hüaluronaan. [0027] Ühes teostuses hõlmab meetodi etapp (a) lisaks fibrinogeeni vesilahuse segamist vahustava ainega. Vahustavate ainete näidete seas on pindaktiivne aine, plokk-kopolümeeri

7 6 kujul pindaktiivne aine, nagu pindaktiivne aine Pluronic, detergent või muud sarnased. Vahustava aine olemasolu eeliseks on, et nii tekib efektiivne vahustruktuur, mida on näiteks pindaktiivse aine korral kompositsioonist kerge eemaldada etanoolis lahustamise teel või mikrohelme korral kaltsiumiioonide kontsentratsiooni vähendamise ja helmeste kaltsiumist sõltuva geeli väljalahustamise teel. Ühes täiendavas teostuses hõlmab vahustav aine pindaktiivset ainet nagu mitteioonne detergent, termotundlik geelistuv pindaktiivne aine (nt Pluronic 127), difosfatidüülglütserooli tüüpi fosfolipiid või segunematu faasi (nt isopentaani) ja fibrinogeeni vesilahuse faasi segu. [0028] Mahuaine olemasolu eeliseks etapis (a) on, et see initsieerib ekstratsellulaarse maatriksi moodustumist ja hoiab sünergistlikult kontrolli all saadud segu mikrostruktuuri. [0029] Mahuainete näidete seas on alginaadid, biopolümeerid, sealhulgas ksantaankummi ja skleroglükaan, karboksümetüültselluloos, karrageenid (nt galaktoossulfaat), galaktomannaanid, st jaanileivapuujahu ja guarkummi, hetatärklis, diferentsiaalselt lahustuv inertne mikrohelmes, glükoosaminoglükaanid (GAG, nt kondroitiin-6-sulfaat, kondroitiin-4-sulfaat, hepariin, hepariinsulfaat, kerataansulfaat, dermataansulfaat, kitiin, kitosaan, dekstraansulfaat või hüaluronaan) ja jaanileivapuujahu rafineeritud ekstraktid, nagu letsitiinid ja pektiinid. [0030] Ühes teostuses on mahuaine alginaat või derivaaditud alginaat. Ühes täiendavas teostuses on mahuaine naatriumalginaat või naatriumpropüülglükoalginaat. Alginaadi olemasolu ekstratsellulaarse maatriksi kompositsioonis kutsub esile kaltsiumist sõltumatu kaasasadestumise reaktsiooni, mille eeliseks on, et see soodustab geeli vormis stabiilse kompositsiooni moodustumist. [0031] Alginaadid on algiinhappe soolad, kusjuures see on polüuroniid, mis on moodustunud kahe heksuroonhappejäägi: β-d-mannuroonhappe (ehk M-jäägi) ja α-l-guluroonhappe (ehk G-jäägi) järjestusest. α-l-guluroonhape moodustub β-d-mannuroonhappe ensümaatilise epimerisatsiooni teel. Sellised monomeerid võivad olla järjestikuste G-jääkide (G-plokkide), järjestikuste M-jääkide (M-plokkide), vaheldumisi paiknevate M- ja G-jääkide (MG-plokkide) homopolümeersed plokid või suvalise asetusega plokid. Iga plokitüübi suhteline kogus sõltub mõlemal juhul alginaadi päritolust. Vaheldumisi paiknevad plokid moodustavad kõige elastsemaid ahelaid ja need lahustuvad väikese ph juures paremini kui teised plokid. G-plokid on sobivamad, kuna need moodustavad tugevamaid geele kui M-rikkad ahelad kahevalentsete katioonide, nt Ca 2+, Ba 2+, Sr 2+, Cu 2+ jne lisamisel. Selle põhjuseks on asjaolu, et kaks G-plokki, milles on enam kui 6 jääki, suudavad moodustada stabiilsemaid ristseotud

8 7 ühendusi kahevalentsete katioonidega, mille tulemusel tekib kolmemõõtmeline geeljas võrgustik (Simpson N. E. et al., Biomaterials, (2004) 25, ). [0032] Ühes alternatiivses teostuses on mahuaine glükoosaminoglükaan (GAG, nt kondroitiin-6-sulfaat, kondroitiin-4-sulfaat, hepariin, hepariinsulfaat, kerataansulfaat, dermataansulfaat, kitiin, kitosaan, dekstraansulfaat või hüaluronaan). GAG-i olemasolu kompositsioonis tagab eelisena suurema stabiilsuse, mis tuleneb selles sisalduvatest aminohappejääkidest, mille saab fibrinogeeni ristsidumisel kovalentselt ristsiduda fibrinogeeniga. [0033] Tuleb mõista, et protsessis (a) valmistatava fibrinogeenipõhise segu moodustamiseks võib kasutada erinevaid meetodeid, millest igaühega saadakse poorsed matriitsid koetoeste moodustamiseks. Seega võib ühes teostuses etapp (a) alternatiivselt või täiendavalt hõlmata valamise, faaside eraldamisega valamise (phase separation casting), vahustamise, lüofiliseerimise, ekstrudeerimise, kangaks muutmise, viltimise, pihustuskatmise või kiire valmistamise etappi. [0034] Etapis (b) kasutatav ristsiduv aine võib olla mis tahes ristsiduv aine paljudest ristsiduvatest ainetest või ristsidumistehnikatest, mis on eriala asjatundjatele tuntud, nagu keemilised, kiiritamisega seotud ja dehüdrotermaalsed meetodid. Ristseotud fibrinogeeni sisaldavate ekstratsellulaarse maatriksi kompositsioonide veel üheks eeliseks on bakterikogumite eemaldamine materjalidest. Leiutisekohaseid kompositsioone seega steriliseeritakse samal ajal ristsidumisega. Lisaks oleme näidanud, et ristsidumise olemasolu võimaldab kompositsiooni füüsikalistel ja terapeutilistel omadustel tekitada sünergia, millel on olulised eelised võrreldes ristsidumata fibrinogeeni või selle derivaadi või teiste pärisnaha toestega. [0035] Sobivate keemiliste ristsiduvate ainete näidete seas on karbodiimiid-sidumisreagendid, nagu N-(3-dimetüülaminopropüül)-N'-etüülkarbodiimiid (EDC), N-hüdroksüsuktsiinimiid (NHS), asiidi tüüpi sidujad, diisotsüanaadi tüüpi sidujad nagu heksametüleendiisotsüanaat, epoksiidi tüüpi sidujad, nagu epikloorhüdriin, glütsidüüleetrid ja glütsidüülamiinid, ja aldehüüdi tüüpi sidujad, nagu formaldehüüd, glutaaraldehüüd ja glüoksaal. [0036] Ühes täiendavas teostuses hõlmab keemiline ristsiduv aine N-(3-dimetüülaminopropüül)-N'-etüülkarbodiimiidi (EDC) ja/või N-hüdroksüsuktsiinimiidi (NHS). [0037] Ühes alternatiivses teostuses hõlmab keemiline ristsiduv aine aldehüüdi tüüpi ristsiduvaid aineid, nagu formaldehüüd, glutaaralaldehüüd ja glüoksaal. Aldehüüdi tüüpi ristsiduvate ainete eeliseks on, et nende abil saadakse parema bioloogilise ühilduvusega ekstratsellulaarse maatriksi kompositsioonid. Näiteks oleme me käesolevas dokumendis näidanud,

9 8 et aldehüüdi tüüpi ristsiduva aine olemasolu parandab in vitro laotamist (nt inimese endoteelirakkude või fibroblastide külvamist maatriksile). Ühes täiendavas teostuses on aldehüüdi tüüpi ristsiduvaks aineks glutaaraldehüüd. Glutaaraldehüüdi kasutamisel ristsiduva ainena on üllatuslikuks eeliseks, et optimaalne ristsidemete tihedus saavutatakse kiiremini kui teiste aldehüüdide korral, ja ta võimaldab saavutada ka suhteliselt suure tihedusega ristsidumise. [0038] Kui ristsiduv aine hõlmab glutaaraldehüüdi või N-(3-dimetüülaminopropüül)- N'-etüülkarbodiimiidi (EDC) ja/või N-hüdroksüsuktsiinimiidi (NHS), võib etapp (b) lisaks hõlmata ka toksilisust vähendava aine (nt lüsiini) lisamist. [0039] Ühes teostuses, mille korral mahuaine hõlmab alginaati, võib leiutisekohane meetod hõlmata täiendavat ristsidumise etappi, milles alginaat ristseotakse fibrinogeeniga. Ühes täiendavas teostuses hõlmab ristsiduv aine perjoodhapet. Selline täiendav ristsidumise etapp tõenäoliselt suurendab saadava kompositsiooni stabiilsust. [0040] Inkubatsioonietapi (b) võib tüüpiliselt läbi viia ajavahemikus 1 minut kuni 24 tundi (nt 4 tundi) sobival temperatuuril (nt toatemperatuuril). [0041] Kui ristsiduv aine hõlmab aldehüüdi tüüpi ristsiduvat ainet, võib meetod hõlmata lisaks redutseeriva aine lisamist pärast etappi (b) ja enne etappi (c). [0042] Arvatakse, et redutseeriva aine olemasolu stabiliseerib ristsidumisprotsessi ja tagab üllatuslikult ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni, millel on suurem bioloogiline tõhusus. Lisaks vähendab redutseeriva aine olemasolu tõenäoliselt tsütotoksilisi toimeid, mida põhjustab redutseerimata ristsiduva aine leostumine kompositsioonist. [0043] Sobiva redutseeriva aine näidete seas on naatriumborohüdriid või ained, millel on viimasega sarnane reaktsioonivõime reaktsioonil karbonüülrühmaga. [0044] Redutseerivat ainet võib tüüpiliselt lisada koguses 0,1% mass/mass ja 10% mass/mass (nt 1% mass/mass). [0045] Glutaaraldehüüd esineb paljudes erinevates konformatsioonides. Näiteks happelise ph juures on glutaaraldehüüd tasakaalus oma tsüklilise poolatsetaaliga, ph tõstmisel neutraalsesse või kergelt aluselisse piirkonda toimub dialdehüüdi aldoolkondensatsioon iseendaga, millele järgneb dehüdraatumine, mille tulemusel tekib α,β-küllastumata aldehüüdpolümeer. Kuigi mõlema struktuuri korral esinevad mehhanismid ja tekivad erinevad saadused, arvatakse üldiselt, et glutaaraldehüüdi peamiseks reaktsioonikohaks on valgu külgahelate lüsiini- või hüdroksülüsiinijäägid. Kui ristsidumine toimub ph väärtusel 3, moodustuvad

10 9 Schiffi aluse tüüpi sidemed ühe glutaaraldehüüdimolekuli ja kahe lüsiinijäägi vahel, mis stabiliseerib saadust happe mõjul toimuva hüdrolüüsi suhtes. [0046] Neutraalse ph korral on aldehüüdiga moodustuv Schiffi alus konjugeeritud kaksiksidemega. Selle korral on tegemist Schiffi aluse resonantsinteraktsiooniga etüleeni tüüpi kaksiksidemega, mille tulemuseks on happe hüdrolüüs (nagu on näidatud skeemil 1). Skeem 1 [0047] Konjugeeritud Schiffi alusega võib siiski toimuda Michaeli liitumine, kui amiini paikne kontsentratsioon on eriti suur. Alternatiivselt, nii hape kui ka alus katalüüsivad aldehüüdrühma nukleofiilset aktiivsust ja ristsidumisreaktsioon valguga sõltub ka vaba ε-nh 2 olemasolust, mille määrab lüsiinijäägi pk a või valgu isoelektriline punkt (pi) kombinatsioonis keskkonna ph-ga. Praktikas viiakse see reaktsioon tavaliselt läbi peaaegu neutraalsetes tingimustes nagu ph 7,4, et saavutada optimaalne reaktsiooniaste ja kiirus. Lõpptulemusena saadava struktuuri stabiilsus sõltub kasutatavast glutaaraldehüüdi kogusest ja reaktsioonikohtade kättesaadavusest. Isegi sellisel juhul tekib suvaliselt mitmesuguste režiimide

11 10 korral konkureerivaid reaktsioone: monopunkti fikseerimine, bifunktsionaalne või multifunktsionaalne ristsidumine, molekulidevaheline või -sisene reaktsioon jne. Glutaaraldehüüd on seega piiritlematult ristsiduv reagent. Sidumata end teooriaga, võib kasutamise edukuse taga olla reagendilahuses korraga olemas olevate molekulaarsete vormide mitmekesisus, mis võimaldab valgu tertsiaarses struktuuris siduda erineval kaugusel reaktsioonikohti nii molekulidevaheliste kui ka -siseste ristsidemetega. [0048] Ühes teostuses võib meetod lisaks hõlmata kahevalentse või mitmevalentse metalliiooni nagu kaltsiumi (nt kaltsiumkloriidi) lisamist. Kaltsiumi olemasolu tagab ühe või enama järgmistest kasulikest omadustest: (i) trombiini aktiveerimise etapi, (ii) mahuainete nagu alginaat geelistamise etapi, (iii) fibrinogeeni koagulatsioonireaktsiooni kontrolli all hoidmise, (iv) ristseotud fibrinogeeni, fibriini või derivaaditud fragmendi stabiilsuse proteolüütilise lõhustumise suhtes. Tuleb mõista, et kaltsiumi kontsentratsioon valitakse selline, et see oleks piisavalt suur alginaadi geelistamiseks ja/või trombiini aktiveerimiseks, kuid samas ei ületaks kogust, mis tõenäolisest leostub kompositsioonist ja on tsütotoksilise toimega. Ühes teostuses lisatakse kaltsiumit lõppkontsentratsioonini 1 kuni 50 mm. Ühes täiendavas teostuses lisatakse kaltsiumit lõppkontsentratsioonini ligikaudu 50 mm. [0049] Pesemisetapp (c) on oluline protsess, mis võimaldab eemaldada allesjäänud keemilist ristsiduv ainet (ja selle kasutamisel redutseerivat ainet), mis võib sellest leostuda veel mitme tunni või päeva jooksul. Pesemisetapi tulemusena suureneb ka valmistatavate ekstratsellulaarse maatriksi kompositsioonide bioloogiline ühilduvus pärast ristsidumist. [0050] Ühes teostuses viiakse etapp (c) läbi sobiva pesemisrežiimi kohaselt (nt pestes 5 x 5 minutit) sobivas puhvris nagu PBS või lahustis, nagu vesi, etanool, metanool, propanool, isopropanool või nende segu. Ühes täiendavas teostuses kaasneb pesemisetapiga (c) sonikeerimine. Ultraheliga sonikeerimine (nt 5 x 30 s sonikeerimist) parandab veelgi ristsiduva aine (ja selle olemasolul redutseeriva aine) eemaldamist. Veel ühes täiendavas teostuses hõlmab pesemisetapp (c) 5 x 5 minutit pesemist etanooli ja vee segus (nt 95 mahuprotsenti etanooli ja 5 mahuprotsenti vett). [0051] Ühes teostuses võib segamisetapi (a) viia läbi vahustamise teel, nt segamise ja aereerimisega. Ühes täiendavas teostuses kasutatakse vahustamiseks aeraatorit (nt 30 s). [0052] Ühes teostuses valatakse, külmutatakse ja vajadusel lüofiliseeritakse etapis (a) saadud segu enne inkubeerimisetappi (b).

12 11 [0053] Tuleb mõista, et valamisetapp hõlmab tüüpiliselt protseduure, mis on ekstratsellulaarse maatriksi kompositsioonide valmistamise valdkonna asjatundjatele tuntud. Valamisetapp hõlmab tüüpiliselt etapis (a) saadud segu 15-minutist inkubeerimist temperatuuril 37 C. [0054] Külmutamisetapp hõlmab tüüpiliselt etapis (a) saadud valamissegu mitmetunnist kuni üle öö hoidmist temperatuuril alla 0 C (nt temperatuuril -20 C kuni -70 C. Ühes teostuses külmutatakse etapis (a) saadud valamissegu 1 tund temperatuuril -20 C ja seejärel üle öö temperatuuril -70 C. [0055] Tuleb mõista, et lüofiliseerimisetapp hõlmab tüüpiliselt lüofiliseerimise valdkonna asjatundjatele tuntud protseduure. Näiteks etapis (a) saadud valatud ja külmutatud segu lüofiliseerimine hõlmab tüüpiliselt üle öö kuni mitmepäevast (nt 24 h) lüofiliseerimist sobival rõhul (nt 10-2 mbar) ja sobival temperatuuril (nt-60 C). [0056] Ühes teostuses külmutatakse ja vajadusel lüofiliseeritakse etapis (c) saadud pestud ristseotud kompositsioon enne kasutamist. [0057] Tuleb mõista, et külmutus- ja lüofiliseerimisetappe võib läbi viia viisil, mida kirjeldatakse käesolevas dokumendis eespool. [0058] Käesoleva leiutise teise aspektina pakutakse ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni, mis sisaldab ristseotud fibrinogeeni või selle derivaati. [0059] Leiutise kolmanda aspektina pakutakse ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni, mida on võimalik valmistada käesolevas dokumendis eespool kirjeldatud meetodil. [0060] Lisaks siin defineeritud maatriksi kompositsiooni in vivo kasutusviisidele nähakse ette ka seda, et see kompositsioon võib olla kasulik in vitro ja ex vivo kasutmisel, nagu koetehnoloogia abil valmistatud nahamudelite sõeluuringutes. Selliseid mudeleid võiks valmistada fibroblastide ja endoteelirakkude külvamise teel ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni ja keratinotsüütide kasvatamise teel selle pinnal. [0061] Leiutise veel ühe aspektina pakutakse siin eespool määratletud ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni kasutamist in vitro, ex vivo või in vivo haavade parandamisel, kudede taastamisel või koetehnoloogilise toesena. [0062] Leiutise veel ühe täiendava aspektina pakutakse haavade parandamise või kudede taastamise meetodit, mis hõlmab siin eespool määratletud maatriksi kompositsiooni kandmist haavale.

13 12 [0063] Leiutise veel ühe täiendava aspektina pakutakse siin eespool määratletud ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni kasutamist haavade parandamisel, kudede taastamisel või koetehnoloogia toesena in vitro, ex vivo või in vivo. [0064] Leiutist kirjeldatakse nüüd ainult näidete abil, viidates seejuures kaasasolevatele joonistele. Joonisel 1 on näidatud analüüsitulemused, mis kajastavad ristsidumise toimet vastupidavusele proteolüüsi suhtes. Joonistel 2 4 on näidatud ristseotud toestega tehtud bioloogilise ühilduvuse analüüsi tulemused. Joonisel 5 on näidatud analüüsitulemused, mis kajastavad ristsidumise toimet rakkude adhesioonile. Joonistel 6 8 on näidatud ristsiduvate ainetega seotud toksilisuse analüüsi tulemused. Joonistel 9 13 on näidatud fibrinogeeni flokulatsiooni/koagulatsiooni analüüsi tulemused. Joonistel on näidatud ristsidumise optimeerimise uuringute tulemused. Joonisel 29 on näidatud fibriini/alginaadi toese SEM-analüüsi tulemused. Joonistel on näidatud toeste koostisosade tsütotoksilise analüüsi tulemused. Joonistel on näidatud toeste koostisosade põletikuga seotud analüüsi tulemused. Joonisel 42 on näidatud leiutisekohase vahttoese in vivo hindamise tulemused. NÄITED Näide 1: Glutaaraldehüüdiga ristseotud fibrinogeeni sisaldava ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni valmistamine (a) Kasutatud materjalid [0065] 2% veise fibrinogeen (veise plasma 1. tüüpi IV fraktsioon) (F4753, Sigma, St Louis, US) segus PBS + CaCl 2 /MgCl 2 (Gibco, Paisley, UK), 2% algiinhape (pruunvetikas, Macrocystitis pyrifera segatud mannuroonhappe/guluroonhappe polümeeriga, Sigma) in Dulbecco PBS-s, ph 7,4, lahustatud 1 M NaOH lisamise teel,

14 13 Inimese trombiin (EC inimese plasmast T6884 Sigma) 10 NIH-ühikut/ml 0,1% BSA / M199-s (Gibco, Paisley, UK), 25% glutaaraldehüüdi lahus (puhtusaste II G62517 Sigma), 1-(3-dimetüülaminopropüül)-3-etüülkarbodiimiid-HCl (EDC) 98% (Acros Organics, New Jersey, USA), Naatriumborohüdriid (Sigma), 95% etanool (Hayman Ltd, Witham, UK) / 5% dih 2 O, Dulbecco PBS kaltsiumi- ja magneesiumisooladeta (PBS), Dulbecco PBS kaltsiumi- ja magneesiumisooladega. (b) Kasutatud vahendid [0066] Christ lüofilisaator ja vaakumpump (Vacuubrand RZ2.5, tugevaim vaakum 4 x 10-4 mbar). Polüstüreenist Petri tassid või mitmesüvendilised plaadid Stripette pipetid (stripetid) Autoklaavitud pipetiotsikud Polüpropüleentuubid, 50 ml (c) Maatriksi ettevalmistamine [0067] 2 ml fibrinogeenilahust segati 50 ml polüpropüleentuubis toatemperatuuril 2 ml algiinhappe lahusega. Sellele segule lisati 50 µl trombiinilahust ja saadud segu vahustati 30 sekundit aeraatoriga. Vahustatud segu valati seejärel kaalukaussi suurusega 2,5 x 2,5 cm ja seda inkubeeriti 15 minutit temperatuuril 37 C. Seejärel külmutati valatud segu 1 tund temperatuuril -20 C ja külmutati veel öö läbi temperatuuril -80 C. Külmutatud saadust lüofiliseeriti siis 24 tundi Christ 1-2alpha-lüofilisaatoris rõhul ligikaudu 10-2 mbar ja temperatuuril ligikaudu -60 C. Tekkinud saadust hoiti seejärel kasutamiseni 6 süvendiga plaadil (Greiner-Bio, Saksamaa) temperatuuril 4 C. Substraadile lisati 10 ml glutaaraldehüüdi (kontsentratsiooniga vahemikus 0,05 0,4%) 95% etanoolis / 5% H 2 O-s ja seda inkubeeriti 4 tundi toatemperatuuril. Pärast ristsidumist pesti substraati viis korda 10 ml 95% etanooli /

15 14 5% H 2 O-ga, külmutati ja lüofiliseeriti nagu enne ja hoiti täiendava iseloomustamiseni temperatuuril 4 C. Näide 2: EDC-ga ristseotud fibrinogeeni sisaldava ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni valmistamine [0068] See kompositsioon valmistati analoogselt näites 1 valmistatud kompositsiooniga, kuid erinevuseks oli see, et ristsiduva ainena kasutati 10 ml EDC-d (kontsentratsioonivahemikus mm). Näide 3: Ristsidumata fibrinogeeni sisaldava ekstratsellulaarse maatriksi valmistamine [0069] See kompositsioon valmistati analoogselt näidetes 1 ja 2 valmistatud kompositsioonidega, kuid erinevuseks oli see, et ristsidumise ja pesemise etapp jäeti ära. Näide 4: Glutaaraldehüüdiga ristseotud ja redutseeritud fibrinogeeni sisaldava ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooni valmistamine [0070] See kompositsioon valmistati analoogselt näites 1 valmistatud kompositsiooniga, kuid erinevuseks oli see, et kompositsiooni hüdrogeeniti pärast lüofiliseerimist 5 minutit toatemperatuuril 1% naatriumborohüdriidiga. Seejärel kompositsioon nõrutati ja reagent asendati värske reagendiga, inkubeeriti veel viis minutit ja seejärel korrati töötlemist (kokku tehti 3 töötlust). Saadud redutseeritud kompositsiooni pesti seejärel viis korda PBS-ga ja iga pesemiskorra vahel leotati seda viis minutit. Näide 5: Ristsidumise mõju vastupidavusele proteolüüsi suhtes (a) Kasutatud materjalid [0071] Vivaspin molekulkaalu piiriga (cut off) 10 kda ultrafiltrimise tuubis (0,5 ml), ELISA plaadid,

16 15 Dulbecco PBS, 2,5% trüpsiin PBS-is või Versene is, Pierce BCA reagendid A ja B, 1 mg/ml BSA/PBS. (b) Makroskoopilise stabiliseerimise meetod [0072] Näites 1, 2 ja 3 (ristsidumata või ristseotud 4 tundi 50 või 100 mm EDC või 0,05%, 0,2% või 0,4% glutaaraldehüüdiga 95% etanoolis) valmistatud katsetoese tükid paksusega ligikaudu 1 cm 2 x 2 mm asetati polüpropüleentuubi. Tuubi lisati 10 ml 0,25% trüpsiini PBS-is või ainult PBS-i (kontrollina), tuub suleti korgiga ja seda inkubeeriti 1 nädal temperatuuril 37 C. [0073] Toest uuriti seejärel makroskoopilise terviklikkuse suhtes ning täheldatud tulemused on esitatud järgnevas tabelis 1. Tabel 1 Ristsiduv aine Töötlemine PBS-ga Töötlemine 0,25% trüpsiiniga Kontroll (ristsiduva aineta) fragmenteerunud 50 mm EDC terviklik ühe nädala jooksul, jäid terviklikuks 3 nädalaks 100 mm EDC terviklik ühe nädala jooksul, jäid terviklikuks 3 nädalaks 0,2% glutaaraldehüüd terviklik ühe nädala jooksul, jäid terviklikuks 3 nädalaks 0,4% glutaaraldehüüd terviklik ühe nädala jooksul, jäid terviklikuks 3 nädalaks lagunes 4 tunni jooksul lagunes 24 tunni jooksul lagunes 96 tunni jooksul terviklik ühe nädala jooksul, jäid terviklikuks 3 nädalaks terviklik ühe nädala jooksul, jäid terviklikuks 3 nädalaks [0074] Tabelis 1 esitatud andmed näitavad, et fibrinogeeni sisaldavad toesed olid stabiilsed ainult PBS-is, kuid ristsidumise puudumisel toimus mõne tunni pärast osaline lahustumine. Tulemused näitavad samuti, et trüpsiin tõi kaasa ristsidumata kontrollmaterjali täieliku lagunemise, kuid EDC ja glutaaraldehüüdiga ristseotud materjal ei lagunenud. Täheldati, et glutaaraldehüüd oli stabiliseerimise seisukohalt kõige efektiivsem ristsiduv aine.

17 16 (c) Proteolüütilise lagunemise kvantitatiivne standardiseeritud kiirus [0075] Näidetes 1, 2 ja 3 valmistatud (ristseotud 50 või 100 mm EDC-ga või 0,05%, 0,2% või 5% glutaaraldehüüdiga) katsetoese lõigud paksusega ligikaudu 1 cm 2 x 2 mm asetati koos kaubanduslikult saadava ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooniga (Integra ) polüpropüleentuubi. Tuubi lisati 10 ml 0,25% trüpsiini Versene is või ainult Versene i (kontrollina), tuub suleti korgiga ja seda inkubeeriti kuni 48 tundi temperatuuril 37 C. [0076] Kindlate ajavahemike järel (nt 0, 2, 4, 24 ja 48 tunni pärast) eemaldati 100 µl proove ja need pandi Vivaspin tuubi ning tsentrifuugiti 10 minutit kiirendusel 8000 g. Siis koguti ultrafiltraat ja igast proovist kanti alikvoodid suurusega 10 µl pipetiga kolme paralleelproovina 96 süvendiga mikrotiiterplaadile. [0077] Valmistati 1 mg/ml BSA lahus PBS standardses kaliibrimislahuses ja sellest valmistati 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 µg/ml standardsed lahjendusseeriad PBS-is. Igast kaliibrimislahusest kanti 10 µl pipetiga kolme paralleelproovina plaadile. [0078] Valmistati BCA töölahus (50 osa A + 1 osa B) ja igasse süvendisse lisati 200 µl seda lahust ning inkubeeriti seejärel 1 tund temperatuuril 37 C. Plaat jahutati seejärel toatemperatuurile ja näit loeti lainepikkusel 540 nm. Seejärel arvutati standardi järgi Spreadsheet programmi kasutades valgu kontsentratsioon proovis ja tulemused on näidatud joonisel 1. [0079] Joonisel 1 esitatud kvantitatiivne proteolüütilise lõhustumise analüüs kinnitab tulemusi, mis saadi eespool tabelis 1 näidatud makroskoopilise stabiilsuse hindamise analüüsis. Näiteks EDC-ga ristseotud matriitside korral täheldati suurte peptiidikoguste kiiret vabanemist. Keskmisel ristsidumisel glutaaraldehüüdiga (0,05% ja 0,2%) täheldati suuremat stabiilsust ja matriitsidest, mis sisaldasid 5% glutaaraldehüüdi, vabanes ainult minimaalne hulk lagunenud peptiide, mis oli võrreldav kaubanduslikult saadava ekstratsellulaarse maatriksi kompositsiooniga (Integra ). Näide 6: Ristsidumise toime bioloogilisele ühilduvusele (a) Kasutatud materjalid [0080] Dulbecco PBS kaltsiumi ja magneesiumita ja kaltsiumi ja magneesiumiga, ph 7,4,

18 17 minimaalne sööde M ,5% BSA, trüpsiin (0,25% lahus Versene is/pbs-is), 5% agaroosi PBS-is (Ca/Mg-ta), 4% paraformaldehüüdi PBS-is (PFA/PBS). (b) Kasutatud vahendid [0081] 24 süvendiga plaadid, steriilsed koonusekujulise põhja ja korkidega 50 ml polüpropüleentuubid, steriilne 25 ml polüstüreenist universaalne tuub, stripetid, autoklaavitud pipetiotsad, roostevabast terasest kasvatussilindrid: siseläbimõõt = 9 mm, välisläbimõõt = 1,2 mm, kõrgus = 10 mm. (c) Toeste kinnitumine [0082] Näidetes 1, 2 ja 3 valmistatud katsetoesed ja kaubanduslikult saadav ekstratsellulaarse maatriksi kompositsioon (Integra ) lõigati ketasteks suurusega ligikaudu 1,2 (diameeter) x 2 mm. Iga toes asetati 24 süvendiga kasvuplaadi eraldi süvendisse. Agaroosilahus sulatati temperatuuril ligikaudu 80 C ja tilgad suurusega ligikaudu 20 µl kanti pipetiga toese servadele, et kleepida toes süvendi pinnale. [0083] Katsegeeli hüdrogeeniti kasvusöötmega ja kasvatussilinder asetati toese materjalile keskele, et tekitada sisemist süvendit. (d) Rakutüübid [0084] Materjalid: Kasvusööde Veise loote seerum (Gibco-Invitrogen) inaktiveeriti soojusega, inkubeerides seda 30 minutit temperatuuril 56 C (HIFBS).

19 18 Vereliistakutest puhastatud veise loote seerum saadi ettevõttelt First Link (Birmingham, UK). Earles i sooladega söödet 199 ja 25 mm HEPES rikastati 200 µm glutaminüülalaniini ühikut/ml penitsilliini / 100 µg/ml streptomütsiini / 100 µg/ml tseftasidiiniga (M199). Standardne HPMEC kasvusööde oli M % PDPDS + 2% HIFBS ja HPMEC High kasvusööde oli M % HIFBS. Dulbecco modifitseeritud Eagles Medium, mis sisaldas 1% glükoosi, rikastati 100 ühikut/ml penitsilliini / 100 µg/ml streptomütsiini / 100 µg/ml tseftasidiiniga (DMEM). HDF kasvusööde oli DMEM + 10% HIFBS. Inimese platsenta mikrovaskulaarsed endoteelirakud (HPMEC) [0085] HPMEC isoleeriti inimeste platsentadest, mis olid saadud vastava nõusolekuga, ja neid kasvatati varem avaldatud meetoditel (Leach et al., (1994) Placenta 15 (4), , Dye et al., (2001) Microvasc. Res., 62 (2), , Dye et al., (2004) Faseb J., 18 (1), 125-7). Saadud kultuurid on fenotüübilt stabiilsed tüüpiliselt 25 passaažini jaotussuhtega 1 : 3. Rakukultuure hoitakse standardses kasvusöötmes (M % PDPDS + 2% HIFBS). Rakukultuure hoiti niisutatud, 5% CO 2 sisaldavas keskkonnas ja temperatuuril 37 C. Toeste bioloogilise ühilduvuse hindamiseks suspendeeriti kogutud rakud uuesti kasvusöötmes (high growth medium) (M % HIBFS). Rakkude adhesiooni analüüsimiseks suspendeeriti kogutud rakud uuesti söötmes M ,5% BSA-d. Inimese naha fibroblastid (HDF) [0086] Inimese naha fibroblastid isoleeriti täiskasvanud inimese normaalsest nahast, mis oli saadud patsiendi nõusolekul rutiinsete operatsioonide käigus. Näidiseid hoiti steriilsetes tingimustes ja nahaalune rasv eemaldati lahtilõikamise teel ning nahk lõigati ligikaudu 1-2 mm 3 suurusega tükkideks. Saadud tükid asetati naha pool allapoole steriilsete näpitsate abil T25 kasvukolbidesse (igasse kolbi 6 tükki) ja sinna lisati 3 ml kasvusöödet. HDF kasvusööde koosneb DMEM-ist + 10% HIFBS-i. Koekultuure hoiti ligikaudu 2 kuni 3 nädalat niisutatud, 5% CO 2 sisaldavas keskkonnas ja temperatuuril 37 C, et fibroblastid saaksid väljuda. Seejärel eemaldati naha eksplantaadid ja kasvukultuure hoiti enne passaaži veel 1 kuni 2 nädalat. Seejärel hoiti kultuure passeerimise teel jaotussuhtega ligikaudu 1 : 4 ja neid

20 19 kasutati ligikaudu 9. või 10. passaažini. Toeste bioloogilise ühilduvuse hindamiseks suspendeeriti rakud uuesti kasvusöötmes (DMEM + 10% HIBFS). Rakkude elujõulisuse ja tsütotoksilisuse analüüsimiseks suspendeeriti rakud uuesti söötmes koostisega DMEM + 2% HIBFS-i, nagu on kirjeldatud. (e) Rakkude (ette)valmistamine [0087] 0,25% trüpsiini/versene i valmistati lähtekoekultuuridest, ja soe sööde ning Ca/Mg-ta PBS soojendati temperatuurini 37 C. [0088] Kasvusööde eemaldati aspireerimise teel konfluentsetest rakkudest. Rakukultuur loputati PBS-iga ja aspireeriti. Lisati trüpsiini/versene i (1 ml 25 cm 3 kohta) ja rakukultuuri inkubeeriti temperatuuril 37 C rakkude eraldumiseni. Rakususpensioonile lisati võrdses mahus kasvusöödet ja see pandi universaalsesse tuubi. Kasvukolb loputati PBS-iga ja selle sisu pandi universaalsesse tuubi. Seejärel tsentrifuugiti seda 7 minutit kiirendusel 200 x g, supernatant eemaldati aspireerimise teel, rakud suspendeeriti vajadusel uuesti 1 2 ml kasvukultuuris, titureeriti ja loendati rakkude tihedus (1 : 10 4% trüpaansinises/pbs-is), soovides saada tulemuseks 2 x 10 6 /ml. [0089] Analüüsiks vajalike rakkude arv arvutati rakkude tihedusest 0,5 1 x 10 5 rakku süvendi kohta. Arvutatud rakkude kogus lahjendati analüüsi üldmahuni, arvestusega 500 µl süvendi kohta M199/BSA-s. (f) Bioloogilise ühilduvuse hindamise analüüs [0090] Igast süvendist eemaldati hüdrogeenimise teel toeste hüdrogeenimissööde ja see asendati 1 ml värske kasvusöötmega. [0091] Rakususpensiooni titureeriti (5 korda) ühtlase suspensiooni saamiseks ja kanti alikvoodina 500 µl/süvend tilkhaaval sisemises süvendis olevale toesele. Plaadid kaeti ja inkubeeriti kuni 4 päeva niisutatud, 5% CO 2 sisaldavas keskkonnas temperatuuril 37 C. [0092] Kasvusööde eemaldati aspireerimise teel, rakke fikseeriti 15 minutit 4% PFA/PBS-is, pesti kaks korda PBS-ga ja tilkhaaval lisati 5% LMP-agaroosi ning lasti seista. Igast süvendist eemaldati ettevaatlikult agaroosis olev toes, kasvurõnga piirkond eraldati, liigne

21 20 agaroos eemaldati ja asetati kudede töötlemise korvi kahe käsna vahele automaatseks vahasse sisestamiseks (Bright). [0093] Vahasse sisestatud näidis lõigati kaheks ja pandi küljeli mikrotoomi plokile. Plokid lõigati 8 µm kaupa ja värviti hematoksülliini ja eosiiniga. [0094] Teised lõigud hoiti immuunvärvimiseks Ki67 proliferatsiooniantigeeniga ja neid vaadati ereda väljaga mikroskoobiga. Tulemused salvestati ja representatiivsed mikrofotod tehti Leica DC200 digitaalkaamera ja frame-grabbing tarkvaraga, mida on kujutatud joonistel 2 4. [0095] Joonisel 2 esitatud tulemused näitavad, et endoteelirakkude korral täheldati võrreldes ristsidumata fibriini/alginaadi matriitsidega erineval määral kinnitumist glutaaraldehüüdi või EDC-ga ristseotud fibriini/alginaadi matriitsidele, mida oli uhutud viis korda 95% etanooliga. Täheldati, et endoteelirakud kleepuvad glutaaraldehüüdiga ristseotud matriitsidele, kuid olid inhibeeritud ja EDS matriitsidele need isegi ei kinnitunud. Need tulemused näitavad, et ristsiduvate ainete stabiliseerivatel kontsentratsioonidel on püsiv negatiivne toime. Paralleelse võrdlusmaterjali (Integra materjal) korral moodustasid rakud tüüpilise endoteelirakkude monokihi, kuid see ei sisenenud maatriksisse. [0096] Joonisel 3 esitatud tulemused näitavad, et endoteelirakud kinnitusid ja levisid 0,2% ja 0,5% glutaaraldehüüdiga ristseotud fibriini/alginaadi matriitsidele, mida pesti pärast teist lüofiliseerimist veel PBS-iga. Asjaolu, et nii endoteeli kui ka dermise fibroblastid ei levinud 0,2% ja 0,5% glutaaraldehüüdiga ristseotud matriitsidel täiendava PBS-iga pesemise etapita, andis tunnistust sellest, et levimine ei ole endoteelirakkudele spetsiifiline. [0097] Joonisel 4 esitatud tulemused näitasid, et endoteelirakud kinnitusid ja levisid borohüdriidiga redutseeritud ristseotud fibriini/alginaadi matriitsidele nii glutaaraldehüüdi kui ka EDC-i korral. Lisaks, endoteelirakud sisenesid kiiresti borohüdriidiga redutseeritud 0,2% glutaaraldehüüdiga ristseotud fibriinalginaatmaatriksisse. Selline käitumine erineb selgelt samade rakkude käitumisest võrdlusena kasutatud kollageenipõhisel Integra materjalil ja usutatakse, et see tagab in vivo kiire angiogeneesi.

22 21 Näide 7: Ristsidumise mõju rakkude adhesioonile (a) Kasutatud materjalid [0098] 0,1 M NaHCO 3 ph 9,5, ka 0,1% BSA NaHCO 3 -s, Versene i lahus kudede kasvatamiseks, Dulbecco PBS kaltsiumi ja magneesiumita ja kaltsiumi ja magneesiumiga, ph 7,4, Miinimumsööde M ,5% BSA-d (M199/BSA), Accutase (1-kordne lahus, mida hoitakse alikvootidena temperatuuril -20 C, Innovative Technologies Inc), Fibrinogeen (veise, Sigma), Fibriini E fraktsioon (ligikaudu 1 mg/ml PBS-is, 100 ühikut/ml trasüloolis), Fibronektiin (veise, Sigma), I tüüpi kollageen, mg/ml, 0,6% äädikhappes (First Link, Birmingham), Kristallviolett-värvimislahus (0,5% kristallvioletti, 1,85% formaldehüüdi, 0,85% NaCl, 50% EtOH), Kaltsiumi ja magneesiumita PBS pesemiseks (valmistatud 10-kordsest lähtelahusest), Äädikhape, 33%, 25% glutaaraldehüüdi vesilahus (Sigma), EDC (Acros). (b) Kasutatud vahendid [0099] CovaLINK 96 süvendiga plaadid Steriilsed koonusekujulise põhja ja korgiga 50 ml polüpropüleentuubid Steriilne 25 ml polüstüreenist universaalne tuub Strippette pipetid Autoklaavitud pipetiotsikud ELISA spektrofotomeetriline plaadilugeja

23 22 (c) Maatriksi katmine ja ristsidumine [0100] Fibrinogeen lahustati 1 mg/ml PBS-is, mida oli vaja soojendada temperatuuril C. Analüüsitavad maatriksivalgud lahjendati külmas (0 4 C) 0,1 M NaHCO 3 -s, ph 9,5, ning pipetiga kanti 50 µl materjali Nunc covalink 96 süvendiga ELISA plaatide igasse süvendisse ja inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 C. Igaks rakkude töötluseks või positiivseks kontrolliks jäi neli paralleelsüvendit ja null -adhesiooniga süvenditesse kanti vaid BSA kate. Kõiki proove inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 C. [0101] Valmistati ristsiduva aine töölahus ja lahjenduste seeria (0,05, 0,1, 0,5, 1, 5% glutaaraldehüüdi, 0,3, 1,5, 6,25100 mm EDC-s). Valgulahus eemaldati aspireerimise teel süvendist ja pipetti võeti 100 µl ristsiduva aine lahust süvendi kohta ning inkubeeriti seejärel 1 tund temperatuuril 20 C. [0102] Süvendit pesti piisav arv kordi, et langetada jääkkontsentratsioon alla tsütotoksilise piirväärtuse (5 x 100 µl süvendi kohta), PBS-iga, mis asendati BSA/NaHCO 3 -ga (kovalentse reagendi blokeerimise etapiks) koguses 50 µl süvendi kohta ja inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 C. Plaati pesti kaks korda steriilse PBS-iga ja seda hoiti PBS-is (100 µl süvendi kohta), kuni rakud olid kasutusvalmis. (d) Rakkude ettevalmistamine [0103] Accutase sulatati ja valmistati M199/BSA. Kasvusööde eraldati aspireerimise teel konfluentsetest rakkudest, kasvukultuur loputati Versene iga ja aspireeriti. Lisati Accutase i (1 ml 25 cm 3 kohta) ja kasvukultuuri inkubeeriti temperatuuril 37 C rakkude eraldumiseni. Rakususpensioonile lisati võrdse mahuga M199/BSA söödet ja materjal paigutati universaalsesse tuubi. Kasvukolbi pesti PBS-iga, materjal paigutati universaalsesse kolbi ja tsentrifuugiti 7 minutit kiirendusel 200 x g. Supernatant eemaldati aspireerimise teel ja rakud suspendeeriti uuesti vastavalt vajadusele 1 2 ml M199/BSA-s, titureeriti ja määrati rakkude tihedus (1: 104% trüpaansinine/pbs), eesmärgiga saavutada tihedus ligikaudu 2 x 10 6 /ml. [0104] Selleks analüüsiks vajalike rakkude arvu arvutamiseks kasutati 1 2 x 10 4 rakku süvendi kohta. Arvutatud kogus rakke lahjendati analüüsitava üldkoguseni 100 µl/süvend M199/BSA-s.

24 23 (e) Rakkude adhesiooni analüüs [0105] Rakususpensiooni titureeriti (5 korda), et tagada ühtlane suspensioon, ja kanti koguses 100 µl/süvend alikvootidena eelnevalt kaetud süvenditesse. Plaat kaeti plaadi katmiseks mõeldud kleepuva kilega ja inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 C niiskes keskkonnas, mis sisaldas 5% CO 2. [0106] Kasvusööde eemaldati aspireerimise teel, süvendeid pesti kergelt kaks korda 100 µl PBS-iga, kasutades aspireerimiseks/pesemiseks peene nõelaga vaakumtorustikku. Kinnitunud rakud fikseeriti/värviti 50 µl kristallvioleti lahusega ja inkubeeriti 10 minutit. [0107] Kristallviolett eemaldati peenikese nõela ja spetsiaalse kristallvioleti imikolviga. Süvendeid pesti kaks korda 400 µl PBS-ga, kasutades lahuse tilgutamiseks külgseinale peene nõelaga torustikku, hoides plaati samal ajal 45-kraadise nurga all ja liigutades seda süvendite tühjendamiseks ja nõrutades paberrätikule kummuli pööramise teel. Iga süvendi kaelalt tuleb kindlasti vatitupsuga eemaldada kõik kristallvioleti jäägid, mis võisid sinna jääda pärast esimest pesemist. [0108] Seondunud kristallviolettvärv lahustati 33% äädikhappega, plaadile koputati, kuni kogu kristallviolett oli kõikides süvendites ühtlaselt lahustunud ja seda kontrolliti hoolikalt enne tulemuste mõõtmist. Optiline tihedus (OD) mõõdeti mikroplaadilugejaga lainepikkusel 595 nm. Rakkude adhesioon (st allesjäänud rakkude arv) on võrdeline (A 595 [katsesubstraat] - A 595 [BSA]). Adhesiooni väljendati analüüsitingimustes adhesioonifraktsioonina vastava kontrollsubstraadi suhtes ja tulemused on näidatud joonisel 5. [0109] Joonisel 5 näidatud tulemused näitavad üllatuslikult, et ristsidumine suurendab pidevalt adhesiooni fibrinogeeniga, kuid selle toime kollageenile on kahefaasiline. Näide 8: Toksilisuse analüüs (a) Kasutatud materjalid [0110] Kasvusööde: Dulbecco modifitseeritud Eagles sööde (DMEM) 10% HIFBS-iga (soojusega inaktiveeritud veise loote seerum), Dulbecco PBS,

25 24 2,5% trüpsiini PBS-is, mida hoiti alikvootidena temperatuuril -20 C, Versene (NaEDTA/PBS). MTS (3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-5-(3-karboksümetoksüfenüül)-2-(4-sulfofenüül)-2H-tetrasoolium, sisesool, Promega) 2,14 mg/ml PBS-is, 20 ml alikvoodid, mida hoitakse temperatuuril -20 C, PMS (fenasiinmetosulfaat, Sigma) 0,9 mg/ml PBS-is, 2 ml alikvoodid, mida hoiti temperatuuril -20 C. (b) Kasutatud vahendid [0111] 24 süvendiga kasvukultuuriplaadid. ELISA spektrofotomeetriline plaadilugeja. (c) Rakkude ettevalmistamine [0112] Kasvusööde eemaldati aspireerimise teel konfluentsest kasvukultuurist ja pesti Versene iga. Lisati 1 ml 0,25% trüpsiini/versene i 25 cm 2 kohta ja inkubeeriti temperatuuril 37 C eraldumiseni. Trüpsiin neutraliseeriti võrdse mahu kasvusöötmega, rakususpensioon pandi universaalsesse tuubi. Kasvukolb pesti PBS-iga ja pesuvesi pandi universaalsesse tuubi. Seda tsentrifuugiti 7 minutit kiirendusel 200 x g. Rakud suspendeeriti uuesti 1 2 ml kasvusöötmes. [0113] Rakud külvati (10 5 süvendi kohta) 24 süvendiga plaatidele 0,5 ml/süvend DMEM kasvusöötmesse ja inkubeeriti tüüpiliselt üle öö temperatuuril 37 C niisutatud inkubaatoris, mis sisaldas 5% CO 2, kuni rakud kinnitusid ja levisid. Reagendi kontrolliks jäeti üks tühi süvend plaadi kohta. (d) Toksilisuse analüüs [0114] Kasvusööde eemaldati aspireerimise teel kasvukultuuridest ja asendati toese kaalutud prooviga (20 mg/süvend) värskes seerumivabas DMEM-is, seerumivaba DMEM-iga, mis

26 25 sisaldas ristsiduvate ainetena glutaaraldehüüdi või EDC lahjendusi. Rakke inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 C niiskes keskkonnas, mis sisaldas 5% CO 2. [0115] Sööde ja toese materjal eraldati rakkudest ja asendati värske säilitussöötmega (DMEM ja 2% HIFBS) ja pandi 2 kuni 22 tunniks tagasi inkubaatorisse. Otsest toksilisust mõõdeti 2, 14 ja 20 tunni möödudes. Sama söödet lisati tühja reagendita kontrollsüvendisse. (e) Rakkude elujõulisuse MTS/PMS analüüs [0116] MTS & PMS lähtelahuste alikvoodid sulatati ja valmistati MTS/PMS tööreagent (2 ml MTS µl PMS). MTS/PMS reagenti lisati kõikidesse süvenditesse (50 µl/süvend) ja plaat asetati 2 4 tunniks tagasi inkubaatorisse, kuni sööde värvus võrreldes kontrollkultuuridega, mille korral ei toimunud toksilist provotseerimist. [0117] 100 µl söötme alikvoodid kanti spektrofotomeetriliseks mõõtmiseks lainepikkusel 495 nm 96 süvendiga ELISA plaadile. [0118] Kõikidest mõõtetulemustest lahutati tühi -neelduvus ja tulemused esitati (test kontroll) muutusena protsentides võrreldes positiivse kontrolliga. [0119] Toksilisuse analüüsi tulemused on näidatud joonistel 6 7, kus on üldjoontes näha, et inimese naha fibroblastide kasvukultuuride ägedal kokkupuutel glutaaraldehüüdi või EDC-ga tekib äge kontsentratsioonist sõltuv toksilisus. Rakkude kuni 24-tunnisel inkubeerimisel pärast kokkupuuteperioodi ilmneb, et elujõulisuse langus on 2 tunni või 20 tunni pärast sarnane ja see ei näita, et sellel juhul esineks olulise protsessina mistahes hilinenud surma, mis oleks põhjustatud näiteks apoptoosi indutseerimisest. [0120] Rakkude korral on LD korda väiksem kui glutaaraldehüüdi väikseim kontsentratsioon ristsidumisel, kuid korda väiksem kui väikseim kasutatud EDC kontsentratsioon. (f) Pesemise mõju toksilisusele [0121] Vahustatud ja lüofiliseeritud 1% fibriini / 1% alginaadi matriitsid ristseoti EDC või glutaaraldehüüdiga ja neid pesti 5 korda glütsiinis või PBS-is enne teist lüofiliseerimist või mitte, nagu on näidatud. Maatriksi 20 µg suuruseid tükke inkubeeriti süvendites seerumi-