Izolácia a purifikácia nukleových kyselín Pri konštrukcii rekombinantnej DNA spájame vektorovú a darcovskú-donorovú DNA

Transcript

1 Izolácia a purifikácia nukleových kyselín Pri konštrukcii rekombinantnej DNA spájame vektorovú a darcovskú-donorovú DNA

2 Základné princípy izolácie nukleových kyselín (DNA, RNA) 1. Rozrušenie - homogenizácia buniek, tkanív, pletív a ich súčastí 2. Extrakcia nukleových kyselín 3. Zrážanie nukleových kyselín 4. Prečistenie -purifikácia izolovaných nukleových kyselín východiskové DNA musia byť z chemického hľadiska dostatočne čisté, aby prípadne prímesy neinhibovali ďalšie reakcie, ktorými donorovú a vektorovú DNA spájame pri získavaní vektorovej a donorovej DNA musíme dodržiavať také podmienky, ktoré zachovavájú ich štruktúru a zabraňujú ich degradácii Všetky uvedené základné princípy izolácie nukleových kyselín platia pre izoláciu vektorovej DNA (plazmidovej, fágovej) a donorovej (chromozómovej bakteriálnej a eukaryotickej DNA a RNA) Každej izolácii nukleových kyselín predchádza príprava príslušných buniek kultiváciou (baktérie, fágové častice)alebo priamo spracovaním príslušných tkanív

3 Rozrušenie buniek baktérií, tkanív, pletív a ich súčastí fyzikálno-chemické: mechanické drvenie a trenie, zmrazovanie a rozmrazovanie, zmrazenie v tekutom dusíku, ultrazvuk, chemické detergenty ako sú SDS, Tritón X-100, fenol. enzymatické: baktérie (lyzozým), rastlinné bunky (celulázy), kvasinky (extrakt z hepatopankreasu slimáka záhradného ) Za určitých podmienok je možné bunkový obsah uvoľniť pôsobením SDS, či fenolu. Tento spôsob je dostačujúci hlavne u buniek, ktorým chýba polysacharidová zložka bunkovej steny napr. pri gramnegatívnych baktériách (po narušení bunkovej steny vzniknuté protoplasty samovoľne praskajú pokiaľ nie sú osmoticky stabilizované).

4 Extrakcia nukleových kyselín Nukleové kyseliny sa v živých organizmoch nevyskytujú voľné (výnimku tvoria čiastočne trna), ale vo forme komplexov s bielkovinami (nukleoproteínmi), ktoré sú často veľmi stabilné. Odstránenie proteínov (ale aj polysacharidov a ďalších kontaminujúcich častí buniek, tiež rôznych činidiel používaných pri celkom postupe purifikácie) je jedným zo základných problémov pri izolácii a purifikácii jednotlivých typov nukleových kyselín. Nukleové kyseliny extrahujeme pomocou médií (tlmivých roztokov) obsahujúcich detergenty, deproteinizačné činidlá a inhibítory nukleáz detergenty: sodná soľ dodecylsulfátu-sds, deoxycholát sodný, laurylsarkozinát sodný a iné... deproteinizačné činidlá: fenol, chloroform, guanidínchlorid Fenol patrí medzi najefektívnejšie denaturačné činidlá, pritom súčasne inhibuje aj aktivitu nukleáz. Fenolovú extrakciu možno použiť aj na súčasné oddelenie DNA a RNA, a to tým, že sa využije závislosť uvoľnenia DNA od ph fenolového extračného roztoku. Zistilo sa, že ak ph fenolového roztoku je 6,0 (kyslý fenol), do vodnej fázy prechádza len RNA, kým DNA zostáva nerozpustná. Pri zvyšovaní ph prostredia prechádza do roztoku i DNA a pri ph 7,4 možno DNA kompletne extrahovať do vodnej fázy extrakčného média. Použitie fenolu ako extračného a deproteinizačného prostriedku má nevýhodu v tom, že absorbuje svetlo s veľmi malou vlnovou dĺžkou, čo prekáža pri spektrofotometrickom stanovení čistoty, prípadne pri stanovení koncentrácie nukleových kyselín. Fenol možno odstrániť z preparátov nukleových kyselín pomocou opakovanej extrakcie s etyléterom alebo

5 gélovou filtráciou. Jeho odtránenie je dôležité aj pre prípravu rekombinantnej DNA, kde jeho zvyšky môžu inhibovať enzýmy potrebné pri konštrukcii hybridných molekúl DNA. Chloroform v zmesi s izoamylalkoholom (24:1) je účinným denaturačným prostriedkom bielkovín. Izoamylalkohol pomáha pri oddelovaní vrstiev pri centrifugácii a udržuje ich stabilitu. Guanidínchlorid rýchlo denaturuje a inaktivuje bielkoviny, je vhodný aj na izoláciu DNA a RNA. Pri izolačných technikách musíme dbať aj na možnosť mechanického poškodenia vysokomolekulárnych NK. Vzniku krátkych fragmentov NK je možné zabrániť obmedzením prudkého pretrepávania a miešania roztokov NK pri rozrušovaní buniek a pri extrakcii. Hlavnou prekážkou pri izolácii nukleových kyselín je pomerne vysoká aktivita nukleáz v bunkách. V neporušenej bunke je väčšina nukleáz lokalizovaná v lyzozómoch a len pri homogenizácii, keď sa poruší štruktúra bunky, nukleázy prechádzajú do roztoku. V priebehu celeho izolačného postupu je preto potrebné udržiavať také podmienky, aby nedošlo k degradácii DNA prítomnými DN-ázami, prípadne RNA prítomnými RN-ázami, ktoré patria medzi termostabilné enzýmy a majú široké optimum ph. inhibítory nukleáz: EDTA, bentonit, dietylpyrokarbonát, heparín, polyamidy, aniónové detergenty.

6 Inhibítory nukleáz a) Bentonit: účinný inhibítor ribonukleáz z rôznych zdrojov. Najčastejšie sa používa v koncentrácii asi 10 mg/ml (Al 2 O 3.4SiO 2.H 2 O, obsahuje v svojej molekule viaceré miesta schopné viazať kovové ióny a zásadité bielkoviny, medzi ktoré patrí aj ribonukleáza). b) Dietylpyrokarbonát: (DEPC, C 2 H 5 O CO O CO-C 2 H 5 ) je účinným inhibítorom ribonukleáz. Jeho účinok sa zakladá na modifikácii aktívneho centra enzýmu. V niektorých prípadoch ho však nemožno použiť, lebo modifikuje aj samotné nukleové kyseliny. Pri práci s DEPC sa musia dodržať bezpečnostné predpisy, pretože látka je silne toxická a karcinogénna. c) Heparín: v koncentrácii 50 mg/ml pri teplote 37 C znižuje aktivitu ribonukleáz o viac ako 95%. Používa sa zriedkavo, vzhľadom na svoju vysokú cenu. Jeho odstránenie z roztoku nukleových kyselín je problematické, a preto takto izolované nukleové kyseliny nemožno použiť napr. pri restrikčnej analýze. d) Prirodzené inhibítory nukleáz: patria medzi glykoproteíny a inhibujú nešpecificky. Vzhľadom na vysokú cenu je však ich použitie obmedzené. e) Polyamidy: spermidín a putrescín inhibujú ribonukleázovú a deoxyribonukleázovú aktivitu. f) Aniónové detergenty: napr. SDS, inhibujú ribonukleázovú a deoxyribonukleázovú aktivitu a súčasne zapríčiňujú disociáciu nukleoproteínového komplexu. Vzhľadom na nízku cenu a silný účinok sa používajú veľmi často. g) Komplexotvorné činidlá: napr. citrát sodný, EDTA (etylén-diaminotetraoctová kyselina), 8-hydroxychinolín. Väčšina deoxyribonukleáz si na svoje katalytické pôsobenie vyžaduje prítomnosť dvojmocných katiónov (Mg 2+, Mn 2+ ), preto ich aktivitu je možné inhibovať prídavkom komplexotvorných činidiel, EDTA je súčasťou väčšiny detergenčných a extrakčných činidiel používaných pri izolácii DNA. h) Rýchla denaturácia bielkovín pomocou hore spomínaných činidiel tiež účinne napomáha k odstráneniu nežiadúcich nukleázových enzýmových aktivít.

7 Zrážanie nukleových kyselín Nukleové kyseliny získame z roztoku zrážaním s etanolom alebo izopropylalkoholom a následnou centrifugáciou (pridaný etanol pôsobí ako dehydratačné činidlo, mení dielektrické vlastnosti vody ako rozpúšťadla, odstraňuje vodný solvatačný obal NK, čo spôsobuje zníženie ich rozpustnosti až vyzrážanie). Pre zrážanie používame vychladený etanol v pomere (2:1), do roztoku môžeme pridať aj malé množstvo monovalentných iónov (octan amonný: 2,0-2,5 M; chlorid lítný: 0,8 M; chlorid sodný: 0,2 M; octan sodný: 0,3 M (ph 5,2), ktoré podporujú zrážanie NK. Po centrifugácii odstránime zbytky solí premytím v 70% etanole. Pri zrážaní s izopropylalkoholom nám postačuje laboratórna teplota a pomer (1:1), čím zachováme menší objem, ale izopropanol sa ťažšie odstraňuje z precipitátu NK. Prečistenie izolovaných nukleových kyselín prečistenie od prímesí polysacharidov, kontaminujúcich nukleových kyselín navzájom, fenolu, EtBr.. Prečistenie DNA od prímesí RNA: preparáty DNA možno dobre očistiť od prímesí RNA pomocou špecifických ribonukleáz, ktoré degradujú RNA na oligonukleotidy. Deproteinovaný bunkový extrakt sa nechá inkubovať 30 minút pri 37 C v prítomnosti pankreatickej ribonukleázy, z ktorej však treba pred samotným použitímm odtrániť stopy DN-ázy. Precipitácia DNA pomocou izopropylalkoholu namiesto etanolu ma tiež znak selektívnosti, lebo RNA sa izopropylakoholom nezráža.

8 NK môžeme prečistiť aj pomocou gélovej filtrácie a iných chromatografických metód (hydroxiapatit, afinitná chromatografia), frakcionáciou v gradiente sacharózy alebo chloridu cézneho, účinné je aj delenie na agarózom alebo polyakrylamidovom géli spojené s následnou elúciou požadovaných frakcií. Prečistenie nukleových kyselín pomocou chromatografických metód Gélová filtrácia: prečistenie od prímesí interferujúcich látok (G-25, G-50: odstránenie fenolu, farebné látky pri izolácii rastlinnej DNA, G-100, G-200: oddelenie DNA od RNA, rrna od trna, Sepharóza 4B: DNA od prímesí RNA). Adsorbčná chromatografia: izolácia natívnych preparátov nukleových kyselín od denaturovaných NK (hydroxiapatit, Bio-Gel HT: prečistenie natívnej DNA od denaturovanej, oddelenie mitochondriálnej DNA od jadrovej, metylovaný albumín absorbovaný na kremeline MAK: oddelenie RNA od DNA, delenie jednotlivých druhov RNA, oddelenie natívnych NK od denaturovaných).

9 Afinitná chromatografia: využíva špecifické fyzikálno-chemické vlastnosti a štrukturálne charakteristiky NK na ich delenie (oligo dt celulóza: je schopná špecificky a reverzibilne viazať poly(a) reťazec charakteristický pre mrna).

10 Izolácia vektorovej DNA Izolácia plazmidovej DNA: jednotlivé formy plazmidovej DNA majú rôzne fyzikálno-chemické vlastnosti (boiling metóda, alkalická lýza, centrifugácia v chloride céznom) Denaturácia a renaturácia lineárnych a kruhových molekúl DNA Metódy izolácie plazmidovej DNA vychádzajú z vlastností kruhovej uzavretej DNA (cccdna - covalent closed circular DNA). Tieto molekuly DNA neobsahujú prerušenia, tzv. zlomy (nicks) a v roztoku sa často nachádzajú v superšpiralizovanej (superhelical) forme, ktorá dáva takýmto molekulám vlastnosti, ktorými sa odlišujú od lineárnych alebo nickovaných molekúl cccdna (ccc DNA nemajú voľné 3 OH a sú preto odolné voči exonukleázam, rozdielne sa chovajú aj pri tepelnej a alkalickej denaturácii). UV svetlo Ultracentrifugácia kruhovej a lineárnej DNA v hustotnom gradiente CsCl po vmedzernení interlalačného činidla etídium bromidu (EtBr) Superhelikálna štruktúra má odlišné sedimentačné vlastnosti a viaže menej interkalačných molekúl než relaxované molekuly iných typov (táto vlastnosť sa využíva aj pri čistení plazmidovej DNA pomocou centrifugácie v hustotnom gradiente nasýteného roztoku chloridu cézneho (s EtBr), ktorý má vyššiu vznášaciu hustotu ako samotné molekuly DNA). Pri tejto metóde sa využíva skutočnosť, že interkalačné farbivo (EtBr) sa vo väčšom množstve interkaluje do lineárnej alebo kruhovej DNA, ako do kruhovej kovalentne uzavretej formy DNA, čo úzko súvisí s tzv. vznášaciou hustotou jednotlivých foriem lazmidovej DNA. I napriek tomu, že uvedenou metódou získame v podstate najčistejšiu DNA, jej nevýhodou je zdĺhavosť (centrifugovanie trvá až 48 hodín) a tiež, že chlorid cézny je pomerne drahý.

11 Podmienky lýzy buniek pri izolácii plazmidovej DNA sú obyčajne miernejšie, aby sa zabránilo úniku chromozómovej DNA z bunky, ktorá spôsobuje kontamináciu plazmidovej DNA pri jej ďalšom použití. Celkove tieto podmienky priamo súvisia so zložením bunkovej steny gramnegatívnych a grampozitívnych baktérií (bunková stena grampozitívnych baktérií obsahuje % peptidoglykanov, ktoré sú kovalentne viazané s polysacharidmi a teichovými kyselinami čo spôsobuje ich väčšiu odolnosť proti chemickému a fyzikálnemu poškodeniu. Naproti tomu bunková stena gramnegatívnych baktérií obsahuje len 1-10 % peptidoglykanov). Amplifikácia plazmidovej DNA v bunke Pri kultivácii buniek E. coli na izoláciu rekombinantných plazmidov pridávame do kultivačného média odpovedajúce antibiotiká, ktoré nám prostredníctvom selekčného tlaku zvyšujú výťažky plazmidovej DNA (napr. pri príprave pbr322 pridávame do tekutého LB média ampicilín alebo tetracyklín, prípadne zmes obidvoch, klony E. coli obsahujúce rekombinantné plazmidy na báze puc vektorov môžeme kultivovať v prítomnosti ampicilínu ale aj bez neho). Zvýšenie výťažku plazmidovej DNA, ktorá sa replikuje nezávisle na chromozóme, môžeme dosiahnuť aj tzv. amplifikáciou. Pridaním chloramfenikolu do kultivačného média dosiahneme zastavenie replikácie chromozómovej DNA prostredníctvom inhibície proteosyntetického aparátu bunky. Chloramfenikol inhibuje aktivitu peptidyl transferázy, ktorá je dôležitá pri elongácii proteínového reťazca na ribozóme a tým zablokuje syntézu dôležitých proteínov nevyhnutných k replikácii chromozómovej DNA. Replikácia plazmidovej DNA na druhej strane nevyžaduje kontinuálnu prítomnosť týchto proteínov.

12 Izolácia plazmidovej DNA pomocou alkalickej lýzy: v bakteriálne bunky z 1-1,5 ml nočnej kultúry (E. coli HB101 obsahujúcej plazmid pbr322 alebo puc19) centrifugujeme 1 min. pri g (stolová centrifúga, pri laboratórnej teplote alebo pri 4 o C) v supernatant odsajeme a bakteriálne bunky rozsuspendujeme pomocou cyklomixéra (Vortex) v 0,1 ml vychladeného roztoku GTE (50 mm glukóza, 25 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA ph 8,0) tesne pred použitím môžeme do roztoku GTE pridať aj 1 mg lyzozýmu na 1 ml výsledného roztoku v bakteriálnu suspenziu inkubujeme 5 min. v ľadovom kúpeli v pridáme 200 ml čerstvo pripraveného alkalického roztoku SDS (0,2 M NaOH, 1% SDS) a premiešame obracaním ependorfovej skúmavky (3-6 x, fl) v inkubujeme 5 min. v ľadovom kúpeli v pridáme 150 ml acetátu draselného (zloženie roztoku: 5M octan draselný 60 ml, ľadová kyselina octová 11,5 ml, destilovaná voda 28,5 ml) a premiešame obracaním ependorfovej skúmavky ( fl) v inkubujeme 15 min. v ľadovom kúpeli v centrifugujeme 5 minút pri g pri 4 o C a supernatant prenesieme do novej skúmavky v k supernantantu pridáme rovnaký objem množstvo roztoku fenol/chloroform (1:1) a skúmavku dôkladne premiešame viacnásobným intenzívnym pretrepaním (roztok by mal byť celý rovnomerne zakalený) v centrifugujme 2 min. pri g pri 4 o C, extrakciu a centrifugáciu opakujeme ešte dvakrát v dvojvláknovú DNA vyzrážame s dvoma objemami vychladeného etanolu v mrazničke (-20 o C) asi minút (keď je DNA menšia ako 1 kb alebo koncentrácia nižšia ako 0,1 mg/ml odporúča sa predĺžiť čas zrážania alebo znížiť teplotu zrážania až na -70 o C) v centrifugujeme pri g, 5 minút pri 4 o C (ak je koncentrácia DNA nízka môžeme čas centrifugácie predĺžiť až na 30 min.) v supernatant odsajeme, skúmavku postavíme hore dnom na filtračný papier a odstránime všetky kvapky etanolu zo stien skúmavky v zrazeninu DNA opatrne premyjeme vychladeným 70% etanolom (týmto krokom odstránime zvyšky solí, ktoré sa vyzrážali spolu s DNA. Neodstránenie prítomných solí môže zmeniť optimálne podmienky pre restrikčnú analýzu DNA po pridaní odpovedajúceho tlmivého roztoku pre príslušnú restrikčnú endonukleázu, RE), vysušíme vo vákuu a rozpustíme v 50 ml roztoku TE, ktorý obsahuje pankreatickú RN-ázu bez DNázovej aktivity (20 mg/ ml) v kontaminujúcu RNA odstránime inkubáciou 15 min pri 37 o C (po tomto kroku môže nasledovať jedna extrakcia s chloroformom na odstránenie RN-ázy) v získanú plazmidovú DNA môžeme po ochladení použiť priamo na opracovanie s restrikčnými endonukleázami alebo ju uchováme pri -20 o C.

13 Izolácia plazmidovej DNA lýzou varom (boiling procedure): v bakteriálny pelet získaný z 1,5 ml nočnej bakteriálnej kultúry E. coli obsahujúcej plazmidovú DNA rozsuspendujme v 350 ml roztoku STET (0,1 M NaCl, 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0, 5% Triton X-100) v pridáme 25 ml čerstvo pripraveného roztoku lyzozýmu (10 mg/ml v 10mM Tris-HCl, ph 8,0) a premiešame na cyklomixéry (aktivita lyzozýmu je inhibovaná v roztokoch, ktorých hodnota ph je menšia ako 8,0) v ependorfovú skúmavku premiestnime do vriaceho vodného kúpeľa na 40 sekúnd v bakteriálny lyzát centrifugujme pri g, 10 minút pri izbovej teplote v zbytky baktérií odtránime z centrifugačnej skúmavky pomocou sterilného špáradla v k supernatantu pridáme 40 ml 2,5 M octanu sodného (ph 5,2) a 420 ml izopropanolu, premiešame na cyklomixéry a necháme stáť 5 minút pri laboratórnej teplote (izopropanol pridávame v pomere 1:1; používame ho vtedy, keď chceme zachovať nízky objem vzorky pre ďalšie spracovanie; jeho nevýhodou je nižšia prchavosť a ťažšie odstraňovanie jeho zbytkov; roztoky DNA, ktoré obsahujú sacharózu alebo NaCl sa s izopropanolom zrážajú ľahšie; DNA vyzrážaná s izopropanolom sa však horšie rozpúšťa v TE tlmivom roztoku) v zrazeninu nukleových kyselín oddelíme centrifugáciou pri g, 5 minút pri 4 o C v supernatant odsajeme, skúmavku postavíme do inverznej polohy na filtračný papier a odstránime všetky kvapky izopropanolu zo stien skúmavky v zrazeninu DNA premyjeme s vychladeným 70% etanolom (tento krok pomôže odstrániť zvyšky izopropanolu a zvýši rozpustnosť vzorky DNA v TE), vysušíme vo vákuu a rozpustíme v 50 ml roztoku TE, ktorý obsahuje pankreatickú RN-ázu bez DN-ázovej aktivity (20 mg/ ml) v kontaminujúcu RNA odstránime inkubáciou 15 min pri 37 o C (po tomto kroku môže nasledovať extrakcia s chloroformom na odstránenie zvyškov RN-ázy) v opracovanú plazmidovú DNA môžeme po ochladení použiť priamo na štiepenie restrikčnými endonukleázami alebo ju uchováme pri -20 o C.

14 Izolácia fágovej DNA: fágové vektory (deriváty l-bakteriofága a fága M13) sú zložené len z DNA a proteínov, ich DNA izolujeme z purifikovaných fágových častíc obyčajne extrakciou fenolom, fágové častice koncentrujeme z bakteriálnej kultúry lyzovanej príslušným fágom ultracentrifugáciou (malé objemy pri analýze rekombinantov) alebo zrážaním polyetylénglygolom (PEG 6000, pri väčších objemoch) a následnou purifikáciou v gradiente CsCl. Izolácia donorovej DNA Izolácia bakteriálnej chromozómovej DNA: relatívne veľká chromozómová DNA sa musí dostať do roztoku neporušená (chromozómová DNA bakteriálnych buniek nie je pevne viazaná na žiadne bunkové štruktúry). Izolácia tkanivovej a rastlinnej chromozómovej DNA: eukaryotická chromozómová DNA tvorí pevné komplexy s histónovými a ďalšími proteínmi, väzbu DNA-proteín musíme rozrušíť pomocou proteáz v prítomnosti detergentov po izolácii bunkových jadier, rastlinná chromozómová DNA sa uvoľní až po dôkladnom rozrušení bunkových stien (mechanickým alebo enzymatickým spôsobom). Princípy izolácie RNA: mrna predstavuje len 1 až 5% z celkového obsahu RNA bunky a predstavuje relatívne heterogénnu zmes, všetky mrna cicavčích buniek majú na 3 konci poly(a) zakončenie, ktoré dovoľuje ich izoláciu afinitnou chromatografiou na oligo(dt) celulóze; mrna je možné izolovať aj imunoprecipitáciou polyzómov, ktorá je založená na poznatku, že bielkoviny vznikajúce na ribozómoch môžu reagovať so špecifickými protilátkami proti kompletnej bielkovine (citlivosť metódy sa môže zvýšiť použitím afinitnej chromatografie s monoklonálnou protilátkou zakotvenej na nosiči); pri izolácii špecifických mrna sa protilátkou proti bielkovine kódovanou príslušnou mrna yzrážajú polyzómy, ktoré ju práve syntetizujú a z polyzómov sa izoluje RNA, ktorá teoreticky obsahuje len rrna a špecifickú mrna.

15 Izolácia donorovej - chromozómovej bakteriálnej DNA Na izoláciu bakteriálnych DNA sa najčastejšie používa metóda, ktorú vypracoval Marmur. Bakteriálne bunky sa opracujú lyzozýmom pri teplote 37 C v prítomnosti EDTA a 25% roztoku sacharózy, pričom vznikajú sféroplasty, ktoré majú čiastočne zachovanú bunkovú stenu. Na uvoľnenie cytoplazmatického obsahu je výhodné použiť neiónové detergenty (Triton X- 100, Tween), ktoré nespôsobujú chromozómové zlomy. Lýza buniek sa prejaví vzrastom viskozity lyzačného roztoku, pretože do roztoku sa uvoľnia dlhé vláknité molekuly, vrátane nukleových kyselín. Chromozómovú DNA môžeme izolovať priamo z primárneho lyzátu, pričom opakovanou extrakciou odstránime kontaminujúce bielkoviny. K lyzátu pridáme rovnaký objem zmesi chloroform-izoamylalkohol (24:1), miešame asi 20 minút a vodnú fázu oddelíme centrifugáciou. vrchná vodná fáza obsahuje prevažne nukleové kyseliny, potom nasleduje biela medzifáza, ktorá obsahuje bielkoviny a na spodku je zmes organických rozpúšťadiel (pokiaľ sme pridali 8-hydroxychinolín spodná fáza je žltá). Extrakcia s organickými rozpúšťadlami sa opakuje dovtedy, kým sa na rozhraní prestane vytvárať zrazenina proteínov (medzifáza prakticky vymizne). Nukleové kyseliny získame zo spojených vodných frakcií zrážaním etanolom (chromozómová DNA má vláknitú štruktúru a možno ju natočiť na špáradlo). Kontaminujúcu RNA možno z vodnej fázy odstrániť inkubáciou s ribonukleázou (ribonukleáza však musí byť bez DNázy!). druhou metódou, ktorá sa často používa, je Kirbyho metóda, pri ktorej sa na deproteinizáciu používa fenol. Fenol je silnejšie deproteinizačné činidlo ako chloroform a denaturované proteíny sú čiastočne rozpustné vo fenolovej fáze (zároveň inhibuje aj potenciálne nukleázy). K fenolu sa najčastejšie pridáva 0,1% 8-hydroxychinolín, ktorý zabraňuje oxidácii fenolu a súčasne je aj komplexotvorným činidlom (jeho žlté sfarbenie pomáha ľahšie rozoznať fenolovú frakciu od bezfarebnej vodnej frakcie). Extrakciu s fenolom môžeme kombinovať aj s extrakciou so zmesou fenol:chloroform (1:1).

16 z vodnej fázy sa nukleové kyseliny obyčajne vyzrážajú dvoma objemami vychladeného etanolu. Fenol, ktorý sa neodstránil pri poslednej chloroformovej extrakcii sa odstráni po rozpustení nukleovej kyseliny vo vode alebo TE (TRIS-EDTA) tlmivom roztoku extrakciou éterom alebo dialýzou. Izolácia tkanivovej a rastlinnej chromozómovej DNA: v eukaryotických chromozómoch, kde DNA tvorí pevné komplexy s histónovými a ďalšími proteínmi, je túto väzbu ťažko rozbiť len pomocou detergentov, ktoré sa používajú pri izolácii chromozómovej DNA z bakteriálnych buniek, preto sa používajú proteázy (pronáza a proteináza K), ktoré sú aktívne aj v prítomnosti detergentov (SDS) a dajú sa pripraviť bez prítomnosti kontaminujúcich nukleáz. pri izolácii sa väčšinou vychádza z bunkových jadier, kde je chromozómová DNA lokalizovaná a ktoré tvoria relatívne malý podiel z celkovej hmotnosti bunky, ich izoláciou odstránime potenciálne rušivé zložky obsiahnuté v cytoplazme. Aktivitu potenciálnych nukleáz inhibujeme komplexotvornými činidlami (5-50 mmol/l EDTA), ich aktivitu potlačíme aj vplyvom proteáz, ktoré pôsobia obyčajne aj pri teplote 60 C v prítomnosti účinných detergentov. izolácia DNA z rastlín je obyčajne obtiažnejšia lebo musíme v prvom rade zvládnuť rozbitie bunkovej steny, ktorá sa realizuje rôznymi mechanickými postupmi alebo často aj pomocou špeciálnych enzýmov (bakteriálne celulázy). pri izolácii organelovej DNA sú postupy v podstate podobné ale predchádza im izolácia samotných bunkových organel obyčajne pomocou centrifugácie v koncentračných gradientoch rôznych látok napr. sacharózy alebo Ficollu.

17 Princípy izolácie RNA Pri génových manipuláciach (tiež pri RT-PCR) sa často vychádza z RNA, podľa ktorej sa v ďalšom kroku syntetizuje DNA. V bežnej cicavčej bunke je asi 10-5 mg RNA. 80 až 85% predstavuje ribozomálna RNA, 10 až 15% transferová RNA a rôzne malé jadrové RNA. Z celkového obsahu RNA 1 až 5% predstavuje mrna (rôznej veľkosti- heterogénna). Prakticky všetky mrna cicavčích buniek majú na 3 konci poly(a) zakončenie, ktoré dovoľuje ich izoláciu afinitnou chromatografiou na oligo(dt) celulóze. Izolácia mrna má význam len pri získavaní eukaryotických génov, ktoré majú mozaikovú štruktúru, kde sa striedajú kódujúce úseky, exóny, s nekódujúcimi úsekmi, intrónmi. Takto organizované gény by po prenose do baktérií boli nefunkčné. Zrelá mrna je komplementárna len k exónovým sekvenciám. Proces, ktorým sa intróny vyštepujú a jednotlivé exóny spojujú, prebieha na RNA z primárneho transkriptu a nazýva sa zostrih RNA alebo splicing.

18 Práca s natívnymi RNA je omnoho obtiažnejšia ako s DNA, najmä pre všadeprítomnosť RN-áz. RN-ázy sú prítomné na väčšine laboratórneho skla, veľké množstvo je ich na prstoch experimentátorov a nachádzajú sa prakticky vo všetkých biologických materiáloch. RN-ázy sú navyše vysoko termostabilné a ich kompletná inhibícia je náročnejšia ako inhibícia DN-áz, ktorým stačí odstrániť dvojmocné katióny. Laboratórne sklo sa pred prácou s RNA odporúča vypaľovať 4 hodiny pri 250 o C. Z roztokov a materiálu z plastických hmôt sa RN-ázy odstránia dietylpyrokarbonátom (DEPC). Syntéza proinzulínu, prekurzoru inzulínu, v transformovanom klone E. coli

19 Syntéza cdna