Sylabus prednášok z Biochémie nukleových kyselín II

Transcript

1 Sylabus prednášok z Biochémie nukleových kyselín II 1. Úvod do problematiky génového inžinierstva: základná stratégia, charakteristika dielčích postupov používaných pri manipulácii s genetickým materiálom (2) 2. Izolácia nukleových kyselín: princípy izolácie DNA, RNA (2) 3. Enzýmy v génovom inžinierstve: polymerázy, restrikčné endonukleázy, nukleázy, ligázy, fosfatázy, transferázy, kinázy, topoizomerázy (2x2) 4. Príprava rekombinantných DNA: základné požiadavky na vektory, klasifikácia vektorov podľa mechanizmu replikácie, expresné vektory, fragmentácia, úprava a značenie fragmentov, adaptorové molekuly, ligácia fragmentov DNA, príprava kompetentných buniek, transformácia rekombinantnej DNA, selekcia rekombinantov, stabilita transformovaných buniek, genómové knižnice (3x2) 5. Amplifikačné metódy: PCR, stratégia a celkové požiadavky... (2) 6. Analýza nukleových kyselín: elektroforetická analýza, Southern, Northern, West blotting, dot blot... (2) 7. Sekvenčná analýza: primerová syntéza, +/- metóda, sekvenovanie krátkych oligonukleotidov, Sangerova terminačná metóda, použitie fágovej DNA M13, Maxam-Gilbertova chemická metóda, syntéza oligonukleotidov, cielená mutagenéza 8. Základy bioinformatiky: Analýza sekvencií a získavanie dát (7-8, 2) 9. Praktické aplikácie: diagnostika dedičných a nádorových ochorení, génová terapia, molekulárna genetika priemyselne dôležitých mikroorganizmov, génové manipulácie bachorových baktérií... (2x2) Doporučená literatúra: Turňa, J. a kol.: Rekombinantné DNA a biotechnológie, Alfa, Bratislava, Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

2

3 V prírode mnohokrát dochádza k spontánnemu prijímaniu génov s vonkajšieho prostredia alebo k ich prenosu medzi príbuznými mikroorganizmami v procesoch ako sú: konjugácia, transpozícia, prípadne transdukcia. Na úrovni príbuznych baktérií je napr. konjugácia vcelku úspešná, v prípade nepríbuzných baktérií alebo úplne cudzorodej DNA (napr, cicavčej alebo rastlinnej DNA) je tento prirodzený transformačný proces viac-menej neúspešný. Čo s tým súvisí: Cudzorodú DNA, môže sice nepríbuzná bunka prijať, ale nemusí ju prepisovať-transkribovať. Ak sa však cudzorodá DNA transkribuje, vzniknutá mrna sa nemusí ďalej verne preložiť do funkčnej bielkoviny. Zložitejším problémom je, či bunky prijatú DNA udržia, či táto DNA bude v bunke stabilne replikovaná. Ak sa totiž určitá DNA nemôže integrovať do hostiteľského chromozómu, nebude sa replikovať a pri delení buniek sa z bunkovej populácie postupne vyriedi. Aj v prípade, ak cudzorodá DNA obsahuje všetky potrebné regulačné prvky na vlastnú replikáciu, nemusí tieto signály hostiteľská bunka rozoznávať. Tieto isté problémy nás však čakajú aj pri snahe o prenos cudzorodej DNA do hostiteľských buniek in vitro, čiže v procese génových manipulácií v skúmavke. Ak predpokladáme, že najčastejším a najbežnejším dôvodom eliminácie cudzorodej DNA z bunky je jej neschopnosť replikácie, najjednoduchším spôsobom na prekonanie tejto prekážky je pripojenie fragmentu cudzorodej DNA k vhodnému nosiču, ktorý by mal vlastnosti samostatného replikónu nezávislého na replikácii chromozómu, čo sa viac-menej úspešne využíva v procese tvorby a prenosu rekombinantnej DNA in vitro.

4 Génové manipulácie, génové inžinierstvo, klonovanie génov, techniky rekombinantnej DNA, technológia rekombinantných DNA génová manipulácia je činnosť, ktorou sa vytvárajú nové kombinácie genetického materiálu tým, že molekuly nukleových kyselín sa integrujú mimo bunky do plazmidu, vírusu alebo iného vektorového systému tak, že sa môžu inkorporovať do hostiteľského organizmu, v ktorom sa pôvodne nevyskytovali, ale môžu sa v ňom rozmnožovať (klonovať)

5 Základné etapy prípravy rekombinantných DNA 1. Izolácia DNA: vektorová (plazmidová - fágová) a donorová (chromozómová, mrna fi cdna) DNA 2. Príprava rekombinantnej DNA: spojenie vektorovej a donorovej DNA (príprava špecifických fragmentov donorovej DNA a jej integrácia do vektorovej molekuly pomocou DNA ligázy in vitro, konštrukcia vhodného klonovacieho systému pre daný cieľový organizmus) 3. Prenos rekombinantnej DNA do cieľového organizmu: (klonovací systém zahrňuje vhodný vektor a metódu prenosu), štúdium regulácie bunkovej expresie, získavanie nových vlastností pre biotechnologické účely 4. Selekcia, analýza a úprava rekombinantov: odlíšenie rekombinantov od nerekombinantov, výber hľadaného rekombinanta z celkového množstva pozitívnych rekombinantov a ich analýza (určenie restrikčnej mapy, primárnej štruktúry, upresnenie polohy hľadaného génu a jeho regulačných úsekov, reklonovanie do iného vektora)

6 Základné vlastnosti vektorov: vektor musí byť dostatočne malý, aby sa ľahko transformoval do bunky, prípadne ľahko izoloval a purifikoval, mal by sa replikovať nezávisle na chromozóme, mal by obsahovať unikátne restrikčné miesta najlepšie v úseku, ktorý kóduje vlastnosti selekčného markeru, do ktorého sa cudzorodá DNA vkladá, pričom sa tento gén vlastne inaktivuje. Plazmidy: predstavujú extrachromozómové bakteriálne častice dvojvláknovej-kruhovej-uzavretej DNA so schopnosťou nezávislej replikácie s veľkosťou kb, úsek 1kb = 1000 bázových párov je dlhý 0,34 mm s molekulovou hmotnosťou cca 660 kd, často kódujú pre bunku životne dôležité enzýmy alebo iné proteínové substancie potrebné pre vitálne funkcie bunky ako sú antibiotická rezistencia, rezistencia na ťažké kovy, produkcia antibiotík, bakteriocínov, restrikčných enzýmov, degradácia organických látok alebo môžu mať kryptický charakter. Pre potreby tvorby rekombinantnej DNA boli skonštruované rôzne plazmidové vektory, medzi najpoužívanejšie patria plazmid pbr322 a plazmidy série puc. Plazmid pbr322 má veľkosť 4,3 kb a nesie gény pre rezistenciu na tetracyklín a ampicilín. Plazmidy série puc sú menšie (2,7 kb), obsahujú polylinker v oblasti lacz génu a gén zodpovedný za rezistenciu na ampicilín.

7 Restrikčná mapa plazmidu puc18 Amp Ssp I (2504) puc bp LacZ-alfa Hind III (400) Sph I (410) Pst I (416) Sal I (418) BamH I (430) Sma I (437) Kpn I (443) Eco R I (451) Lac promotor ORI Replikón: pmb1 Veľkosť : 2,7 kb Promótor: lac Gén rezistencie: Amp (ampicilín) Klonovacie miesta: polylinker obsahujúci 13 unikátnych restrikčných miest Hostiteľský organizmus: Escherichia coli s delta lac mutáciou (len pre modro/bielu selekciu, napr. JM109), prípadne ľubovoľný iný

8 Restrikčná mapa plazmidu pbr322 Eco R I (4360) Ssp I (4171) Amp Pst I (3612) Cla I (25) Hind III (30) BamH I (376) Sph I (567) Sal I (652) Tet pbr bp ORI ROP Replikón: pmb1 Veľkosť : 4,3 kb Promótor: žiadny Gén rezistencie: Amp (ampicilín), Tet (tetracyklín) Klonovacie miesta: EcoRV, BamHI, SphI, SalI pre inzerčnú inaktiváciu génu rezistencie na tetracyklín, PstI pre inzerčnú inaktiváciu génu rezistencie na ampicilín plus unikátne EcoRI miesto bez možnosti selekcie Hostiteľský organizmus: ľubovoľný kmeň Escherichia coli (napríklad HB101)

9 Bakteriofágy: sú vlastne parazity bakteriálnych buniek a ich reprodukčný cyklus je úzko spojený s reprodukčným cyklom hostiteľskej bunky. Po infekcii bunky (transdukcia) je jej substrátový a energetický potenciál využívaný na syntézu vírových DNA a proteínov, potrebných pre vznik nových fágových častíc, čo infikovanú bunku prakticky zničí (lytická funkcia), za určitých okolností sa môže fágová DNA inkorporovať do chromozómu bunky (lyzogénna funkcia, inkorporovaná DNA sa prenáša do nových jedincov pri delení spolu s chromozómom) a vplyvom environmentálnych faktorov sa môže neskôr z neho uvoľniť a prejsť do lytickej formy. Napr. bakteriofág l, ktorý je najčastejšie využívaný ako vektor pre konštukciu rekombinantnej DNA, predstavuje asi 50 kb veľkú, dvojvláknovú lineárnu DNA s prečnievajúcimi-komplementárnymi-12 nukleotidov dlhými koncami. Po vniknutí do bunky sa však kruhovo uzavrie a hneď v počiatočnej fáze infekcie sa replikuje

10 Životný cyklus fágových častíc l-dna predstavuje asi 50 kb veľkú, dvojvláknovú lineárnu DNA s prečnievajúcimi-komplementárnymi-12 nukleotidov dlhými koncami. Po vniknutí do bunky sa však kruhovo uzavrie a hneď v počiatočnej fáze infekcie sa replikuje

11 Základný princíp klonovania cudzorodej DNA v plazmidovom vektore Chimerická molekula DNA» rekombinantná DNA: v gréckej mytológii chiméra predstavuje stvorenie s hlavou leva, telom kozy a chvostom hada

12 Inzerčná inaktivácia

13 Priame klonovanie

14 Životný cyklus fágových častíc a využitie fágovej DNA na klonovanie cudzorodej DNA L P DNA molekula l bakteriofága > 105% < 78%

15 Klonovanie do l fágových vektorov: do žiadneho fágového vektora nemôžeme klonovať ľubovoľne veľké DNA fragmenty. Z celkového fágového genómu je len 60% nevyhnutne potrebné na propagáciu jeho lytickej funkcie (ľavé, asi 20 kb dlhé rameno, kóduje syntézu proteínov hlavičky a chvosta; pravé, približne rovnako veľké, rameno kóduje syntézu jeho DNA a lytickú funkciu), preto jeho stredná časť, ktorá nie je dôležitá pre jeho lytickú funkciu, môže byť nahradená cudzorodou DNA (asi jedna tretina). Pri celkovej stratégii klonovania do fágových vektorov musíme brať na zreteľ, že viabilita rekombinantných fágových častíc výrazne klesá, keď ich DNA je dlhšia ako 105% a menšia ako 78%, než DNA divokého typu, preto musíme dôsledne dodržovať dĺžku klonovaných fragmentov. Táto zdanlivá nevýhoda je vcelku prospešná pri selekcii rekombinantov, lebo zligované ramená a fragmenty DNA, ktoré nie sú v danom limite veľkosti DNA sa po zbalení in vitro nebudú propagovať a my získame len pozitívne rekombinanty. Ďalšou výhodou použitia fágových vektorov je ich schopnosť autotransformácia do bakteriálnej hostiteľskej bunky.

16 V prírode možno pozorovať medzi bakteriálnou populáciou spontánny príjem voľnej DNA, efektívnosť tohoto prirodzeného procesu je však veľmi nízka, len 1 z 10 6 molekúl DNA sa môže takýmto spôsobom dostať do bakteriálnej bunky. Prirodzený prenos (konjugácia, transdukcia, transpozícia: transpozómy-pohyblivé gény sa v prírode väčšinou vyskytujú ako súčasť konjugatívnych plazmidov prokaryontov, ktoré sú po prenose do recipientnej bunky schopné integrácie do chromozómu hostiteľa, pričom môžu spôsobiť zmeny v štruktúre a expresii genómu, mutáciu. Transpozómy sú väčšinou nositeľmi génov rezistencie na antibiotiká, môžu sa navzájom spájať a integrovať do seba cudzorodé gény), umelý prenos (chemická transformácia, transformácia protoplastov a sféroplastov, fúzia protoplastov, elektroporácia) je bezprostredne spojený s existenciou vhodných vektorov, ktoré sú schopné replikovať sa v príslušnom organizme (E. coli, B. subtilis, kvasinky, )

17 Konjugácia bakteriálnych buniek E. coli Elektrónoptické snímky konjugujúcich buniek E. coli

18 Fágová infekcia bakteriálnych buniek

19 Elektroporačná aparatúra Schéma prepojenia elektroporačnej aparatúry. Údaje sú uvedené v angličtine, tak ako sú vyznačené na jednotlivých častiach aparatúry (Gene Pulser, Pulse Controller a Sample chamber).

20 Selekcia, analýza a úprava rekombinantov Selekcia zahrňuje oddelenie rekombinantných molekúl DNA od nerekombinantných (dá sa zabezpečiť celkom úspešne voľbou vhodných vektorov, napr. antibiotickej selekcie pri pbr322). Analýza je výber hľadaného rekombinantu z množstva celkových rekombinantov, obyčajne najzložitejší krok. Pri úprave sa môžu oddeliť funkčné častí génu od nefunkčných, upresní sa jeho restrikčná mapa, určí sa primárna štruktúra, upresní sa jeho poloha a okolie. Na základe týchto informácií môžeme pristúpiť k jeho úprave a reklonovaniu do iného vektora a pod. Analýza rekombinantných génov ja často posledným štádiom práce s rekombinantmi, prenos rekombinantného génu do iného organizmu nie je vždy jediným cieľom génových manipulácií.

21 Selekcia pozitívnych transformantov

22 Schéma postupu prác pri príprave rekombinantných DNA Turňa a kol.: Rekombinantné DNA a biotechnológie (1990)