Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2012 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza (30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Merjenje nivojev glukoze v solzah Mentor: Dr. Boris Pihlar Izdelala: Lidija Gorenc Ljubljana, 2012
Izjavljam, da sem seminarsko nalogo samostojno pripravila brez tuje pomoči. Lidija Gorenc
KAZALO UVOD... 1 MERJENJE NIVOJEV GLUKOZE V SOLZAH S POMOČJO AMPEROMETRIČNIH GLUKOZNIH BIOSENZORJEV S KAPILARNO KONFIGURACIJO... 2 AMPEROMETRIČNI IGLIČNI GLUKOZNI SENZOR... 2 EKSPERIMENT... 3 Reagenti in aparatura... 3 Proizvodnja senzorja na glukozo v solzah... 3 Umerjanje senzorja... 4 Postopek za določanje zveze med koncentracijami glukoze v solzah in krvi pri zajcih... 5 REZULTATI... 5 Učinkovitost biosenzorja na glukozo v solzah... 5 Zveza med solzno in krvno glukozo pri zajcih... 6 KONTAKTNE LEČE Z VGRAJENIM SENZORJEM ZA SPREMLJANJE RAVNI GLUKOZE V SOLZAH... 8 ZAKLJUČEK... 12 LITERATURA... 13 KAZALO SLIK Slika 1: Amperometrični iglični glukozni senzor... 3 Slika 2: Umerjanje glukoznega senzorja solz z uporabo 5 µl raztopine v kapilari... 5 Slika 3: Zveza med glukozo v solzah in v krvi pri zajcih...7, 8 Slika 4: Senzor, ki ga namestijo na kontaktno lečo... 10 Slika 5: Končna kontaktna leča z vgrajenim senzorjem in ožičen tester na kontaktni leči... 10 Slika 6: Merjenje amperometričnega odziva in umeritvena krivulja... 11
UVOD Različne tehnike nadzorovanja glukoznih nivojev so v zadnjih desetletjih pritegnile veliko pozornosti, saj so tovrstne meritve ključnega pomena pri nadzorovanju sladkorne bolezni, ki prizadene približno 5% svetovnega prebivalstva [1]. V ZDA ima 20,8 milijonov ljudi (7 % prebivalstva) sladkorno bolezen. Več kot 200 000 Američanov umre za to kronično boleznijo; tako je sladkorna bolezen šesti vodilni razlog smrti v ZDA. Ljudje s sladkorno boleznijo so bolj izpostavjeni tveganju bolezni srca, kapi, visokega krvnega tlaka, slepote, odpovedi ledvic, nevroloških motnj in drugih težav. Vsemu temu se lahko izognejo, oziroma omilijo bolezen, če si redno spremljajo koncentracijo glukoze v krvi. Zato priporočajo, da nivo glukoze v krvi merimo večkrat na dan, kar pa zna predstavljati težavo, saj je za to vedno potreben neprijeten odvzem krvi, to pa je tudi razlog, da se bolniki ne držijo vedno teh priporočil [3]. Na tem področju je zato poteklo že mnogo raziskav, zajemajoč tudi infrardečo spektroskopijo. Ena izmed teh metod je metoda»glucowatch«, ki temelji na elektro-osmotskem pritoku podkožne tekočine na površino kože, kjer pa nato glukozo izmerimo s sistemom encimske elektrode. Žal pa se nobena izmed teh metod ni izkazala za zadovoljivo alternativo proti klasični krvni analizi. Razne druge raziskave so že davnega leta 1950 namigovale na solze kot nadomestilo za kri. Takšen pristop ponuja unikatne možnosti razvoja; dokaj preproste in neboleče metode za določanje glukoze. Dokazati treba le to, da bi meritve v solzah dobro korelirale z meritvami v krvi. V kolikor bi se to dokazalo, bi se lahko dobilo zelo dobro in zanimivo indirektno metodo za določanje slednjega, tako pri normalnih, kot tudi pri hiperglikemičnih in hipoglikemičnih posameznikih. Da pa bi bila takšna metoda učinkovita, moramo solzno tekočino vzorčiti z nestimulativno metodo, saj bi lahko stimulacija solzenja povzročila razredčenje dejanskih koncentracij glukoze. Istočasno moramo paziti, da z ozkimi kapilarami ne poškodujemo kapilarnih žilic v očesu, saj bi to lahko povzročilo močno višje koncentracije glukoze. Z nekaj vaje, slednje ne bi smelo biti problem. Pacienti s sladkorno boleznijo tipa 1, ki si morajo odvzeti vzorec krvi večkrat na dan, bi prav gotovo bili močno motivirani, da se naučijo uporabljati mnogo blažjo in lažjo metodo za določevanje sladkorja. 1
MERJENJE NIVOJEV GLUKOZE V SOLZAH S POMOČJO AMPEROMETRIČNIH GLUKOZNIH BIOSENZORJEV S KAPILARNO KONFIGURACIJO Raziskave so potekale pri več raziskovalnih skupinah, ki so si prizadevale razviti detekcijske metode za določevanje glukoze v solzah. Zahtevana je torej nizka meja detekcije reda mikromola, velika selektivnost preko drugih možnih interferenc, kot sta na primer askorbinska in sečna kislina, in pa tudi možnost določanja v zelo majhnih količinah vzorcev, saj lahko zajamemo le vzorce reda velikosti nekaj mikrolitrov. Do sedaj je bilo objavljenih že nekaj različnih metod, na primer kapilarna elektroforeza v kombinaciji z lasersko fluorescenco, fluorescenčni senzorji, tekočinska kromatografija v kombinaciji z ESI-MS, holografski senzorji na glukozo in pa tudi možnost uporabe kontaktnih leč in nato oftalmna detekcija. Takšen pristop bi lahko bil zelo lepa alternativa zdravljenju sladkorne bolezni, saj dosti ljudi s sladkorno boleznijo potrebuje pripomočke za korekcijo vida in že nosijo kontaktne leče. Leta 1980 so s pomočjo encimske metode ugotovili, da so koncentracije glukoze v solzah pri sladkornih bolnikih s povečano koncentracijo glukoze v krvi višje, kot pri zdravih ljudeh. Ugotovili so tudi, da so nivoji glukoze v solzah od 30-50 krat nižji, kot v krvi. Študije so nedavno razkrile povezavo med nivoji v solzah in krvi, vendar bi za natančnejše določitve in dokaze potrebovali še dosti raziskav na ljudeh in živalih. V nedavno izdani reviji so odkrili, da je korelacija med solzno in krvno količino glukoze izrazitejša pri pacientih, ki ne nosijo kontaktnih leč. Zato je bistveno, da se razišče, ali so meritve v solzah sploh smiselne. AMPEROMETRIČNI IGLIČNI GLUKOZNI SENZOR Amperometrični iglični glukozni senzor, uporabljamo v kombinaciji s kapilaro premera 0,84 mm, v katero zbiramo solze v količinah reda velikosti mikrolitra. Princip delovanja temelji na zajetju encima glukoza-oksidaza na 0,25 mm debelo žičko iz platine in iridija in na anodni detekciji sproščenega vodikovega peroksida iz encimske reakcije. Notranje plasti Nafiona in elektropolimeriziranega filma iz 1,3-diaminobenzena in resorcinola (dihidroksi benzen) občutno povečajo občutljivost na glukozo v mešanici možnih interferenčnih spojin, v katero sodi tudi askorbinska kislina in sečna kislina. 2
Senzor je prilagojen tudi tako, da lahko zaznamo že zelo nizke koncentracije glukoze reda 1,5 0,4 µm (S/N=3), ki jih potrebujemo, da lahko spremljamo nivo glukoze v solzah pri občutljivosti 0,032 0,02 na/µm (n=6). Tako za meritev potrebujemo le 4-6 µl vzorca. Meritev je potekala tako, da so merili količino glukoze v solzah pri zajcih (pod narkozo) v časovnem intervalu 8 ur. Istočasno so tudi merili količino glukoze v krvi. Izkazalo se je, da rezultati meritev zelo sovpadajo, s čimer bi se lahko izognili meritvi glukoze zgolj v krvi in tako začeli z meritvami tudi v solzah. Slika 1: Amperometrični iglični glukozni senzor [1] EKSPERIMENT Reagenti in aparatura Glukoza oksidaza (tip VII, iz Aspergillus niger), d-(+)-glukoza, glutaraldehid, goveji serumski albumin (BSA), natrijev klorid, kalijev klorid, natrijev hidrogen fosfat, kalijev dihidrogen fosfat, železov (III) klorid, 37% HCl, L-askorbinska kislina, sečna kislina, Nafion (5% raztopina v nižjem alifatskem alkoholu in vodi), 1,3-diaminobenzen, resorcinol. Vse to je bilo kupljeno pri Sigma-Aldrich. Platinska in srebrna elektroda pa pripadata A-M Systems. Proizvodnja senzorja na glukozo v solzah Oblika glukoznega biosenzorja temelji na predhodnjih načrtih, ki so se uporabljali za pripravo elektrokemičnih senzorjev, primernih za podkožno meritev glukoze. Odrezali so 10 cm dolgo in 0,2 mm debelo platinsko žičko, prevlečeno s teflonom. Vanjo so 4 mm od konca izvrtali luknjo globine 1 mm, 1,5 mm nad luknjo so ovili 15 cm, 0,1 mm debelo Ag/AgCl elektrodo, ki je prekrila 4 mm žičke. Ag/AgCl elektrodo so pripravili, tako da so Ag žičko potopili v 1M FeCl 3 v 0,1M raztopino HCl. 3
Notranje polimerne plasti na Pt elektrodi so bile nameščene zato, da so odpravili interference askorbinske in sečne kisline. Najprej so prekrili luknjo s tanko plastjo Nafiona (debeline približno 5 µm). Nato s pomočjo voltamografskega potenciostata pri krožeči napetosti 0-830 mv sprožili elektropolimerizacijo raztopine, ki je vsebovala 1,5 mm 1,3-diaminobenzena in približno enako koncentracijo resorcinola v PBS pufru (0.1M, ph 7.4). Encimsko plast so naredili tako, da so najprej nakapali 1 µl 3% glukoze oksidaze s 3% BSA v prej izvrtano luknjo. Zadevo so nato sušili 30 minut in nato dodali še 1 µl 2% glutaraldehida in prav tako sušili na zraku eno uro. Senzor so sprali z deionizirano vodo in namočili v 0.1 M PBS (ph 7.4) za nadaljnjo uporabo. Umerjanje senzorja Senzor so umerili s pomočjo štiri-kanalnega BioStat potenciostata. Senzor so postavili v vialo z 10 ml PBS in ga polarizirali pri potencialu +600 mv proti Ag/AgCl referenčni elektrodi. Senzor so nato umerjali z raztopinami standardov glukoze. To je potekalo tako, da so najprej v kapilaro zajeli 5 µl standarda (5-800 µm) pripravljenih v PBS in nato v kapilaro vstavili senzor, ki so ga poprej vzeli iz PBS in osušili s krpico (Kimwipes). Tok skozi člen so merili 2 minuti, nato so senzor zopet sprali z vodo in PBS, ter ga dali nazaj v pufer. Senzor je bilo potrebno testirati tudi za razne možne interference, zato so izmerili še tok skozi člen v prisotnosti sečne kisline (100 µm), askorbinske kisline (100 µm) in acetaminofena (10 µm). Na podlagi rezultatov slednjih meritev so izračunali % napake, ki nastopi ob prisotnosti teh interferenčnih spojin. Potrebno je bilo določiti tudi ponovljivost meritev, zato so zaporedoma izmerili tok v petih kapilarah, ki so vsebovale vsaka po 5 µl 100 µm raztopino glukoze, nato pa še 5 meritev, kjer je vsaka kapilara vsebovala 5 µl 20 µm raztopine glukoze. Med vsako meritvijo je bilo seveda senzor potrebno sprati s PBS pufrom in nastaviti ničlo. Povprečno koncentracijo glukoze so določili s poprej opisano kalibracijo s standardi (5-800 µm). Preiskovano raztopino so v kapilaro dobili s pomočjo kapilarnih sil. Kapilaro so nato zatesnili z voskom (Critoseal). Na ta način so lahko vstavili elektrokemični senzor v kapilaro, ne da bi pri tem na drugem koncu izgubljali vzorec, čeprav volumen vzorca pri merjenju električnega toka tu ne igra nobene vloge. 4
Postopek za določanje zveze med koncentracijami glukoze v solzah in krvi pri zajcih V eksperimentu, ki je zajemal določanje glukoze v solzah s kapilarnim senzorjem in s komercialno dostopnim krvnim analizatorjem, je bilo vključeno vsega skupaj 12 zajcev. Zajci so bili tekom eksperimenta pod anestezijo (intramuskularna injekcija 5 mg/kg ksalizina in 30 mg/kg ketamin hidroklorida). Ohranjali so jo tako, da so s pretokom 1,53 mg/kg/h zajcem dovajali razredčen (2 mg/ml) ketamin hidroklorid. Pod vplivom anestezije so bili 8 ur. Senzor je bil ves čas polariziran pri +600 mv v PBS pufru skozi cel eksperiment. Kalibrirali so ga s 100 µm glukozo. Vsake pol ure so odvzeli tudi 0,6 ml krvi, kjer so izmerili koncentracijo glukoze v krvi. Istočasno so seveda zbirali tudi po 5 µl zajčjih solz, v katerih so s pomočjo prej opisanega senzorja merili glukozo. Podatke obeh meritev so nato procesirali in obdelali, ter določili zvezo med koncentracijami v obeh vzorcih. Slika 2: Umerjanje glukoznega senzorja solz z uporabo 5 μl raztopine v kapilari [1] (a) raztopine v zaporedju: 100 μm sečna kislina, 100 μm askorbinska kislina, 10 μm acetaminofen in 5 μm, 10 μm, 30 μm, 50 μm, 150 μm, 300 μm, 500 μm in 800 μm glukoza. Interference in manjši glukozni odziv (5-50 μm). (b) Rezultat umeritvene krivulje glukoznega senzorja solz. Nižji glukozni odziv (5-50 μm). Intervali napak predstavljajo standardno odstopanje (SD) n=3, merjeno v kapilarnih cevkah. REZULTATI Učinkovitost biosenzorja na glukozo v solzah Na sliki 2 je prikazana tipična umeritvena krivulja za senzor z uporabo kapilar. Meja zaznave je 1,5 0,4 µm glukoze (S/N=3). Upoštevati je potrebno, da je nizka meja zaznave posledica odsotnosti kakršnekoli membrane, ki bi preprečevala difuzijo glukoze do encimske plasti. Takšen dodatek je potreben pri krvni analizi, da omogočimo prisotnost kisika v presežku, v primerjavi z glukozo. Pri analizi solz to ni potrebno, saj je koncentracija glukoze mnogo nižja in koncentracija kisika bistveno višja. 5
Kot že omenjeno, nam to omogoča zelo nizko mejo zaznave. Občutljivost senzorja je v povprečju 0,032 0,02 na/µm glukoze (n=6). Potrebno je upoštevati dejstvo, da če uporabimo 5 % glukozo oksidazo namesto 3 %, lahko dosežemo še večjo občutljivost in še nižjo mejo zaznave kot prej. Linearni doseg seže do več kot 800 µm, kar je približno 7x več kot povprečna koncentracija glukoze pri človeku, ki po navadi znaša 138 µm. Po petih meritvah so senzorji pokazali dobro ponovljivost in sicer 102,5 3,2 µm glukoze v vzorcih volumna 5 µl in koncentracije 100 µm. Prav tako je bila ponovljivost dobra pri nižjih koncentracijah standardov, in sicer 19,10 0,23 µm za 20 µl standarda. Vsak biološki senzor za merjenje fizioloških raztopin mora biti selektiven na sprejemljivo število možnih interferenc. Pri potencialu +600 mv proti Ag/AgCl se lahko te interference tudi oksidirajo na delovni elektrodi, ki zaznava sproščeni vodikov peroksid. To lahko povzroči bistvene napake v meritvah izhodnih tokov. Povprečne koncentracije askorbinske in sečne kisline v solzah, ki jih navaja literatura, so 20 oziroma 70 µm, zato so tudi pri določanju interferenc uporabili 100 µm obeh spojin. Da bi preprečili interference majhnih molekul, so dodali 10 µm acetaminofena ob predpostavki, da je spojina prisotna v solzah v enakih količinah kot v krvi. Seveda ob upoštevanju primernega razredčenja. Odstotek napake so izračunali tako, da so delili tok neke interferenčne spojine s tokom pri meritvi 100 µm standarda glukoze. Prisotnost Nafiona in elektropolimeriziranega 1,3- diaminobenzena/resorcinola v notranji plasti je senzorju omogočila odlično selektivnost preko interferenc. Pri tem je prišlo do napak v višini 7,56 % za askorbinsko kislino, 11,16 % za sečno kislino in 4,85 % za acetaminofen. Ti rezultati kažejo na dobro selektivnost senzorja preko interferenc, tako da lahko vse meritve jemljemo kot relevantne. Zveza med solzno in krvno glukozo pri zajcih Sliki 3a in 3b kažeta Pearsonovo zvezo med koncentracijami glukoze v krvi in solzah pri dveh posameznih eksperimentih na zajcih. Določeni vrednosti r 2 sta 0,9126 in 0,8894, kar kaže na zelo dobro ujemanje. Oba primera kažeta odlično ujemanje na modelu linearne regresije. Na sliki 3c vidimo vse vrednosti koncentracij glukoze v krvi in solzah iz eksperimenta z 12 zajci. Če kombiniramo podatke vseh testiranih živali, pa je ujemanje pri Pearsonovi korelaciji zelo slabo (r 2 =0,4867, p<<0,05). Prav tako je težko določiti neko matematično funkcijo, kot na primer linearna funkcija, ki bi dobro popisala zvezo med koncentracijami glukoze pri vseh vzorcih. Do tega pride zato, ker prihaja do razlik pri določanju korelacij med posameznimi zajci. 6
To nam nakazuje, da čeprav pri posameznih primerkih vidimo odlično zvezo med koncentracijami glukoze v krvi in solzah, je nihanje med temi posameznimi primerki preveliko, da bi lahko z meritvami bili zadovoljni. Upoštevati je potrebno, da pri začetku 8 urnega eksperimenta pričakujemo višjo koncentracijo glukoze, saj anestezija pospeši izločanje glukoze v kri in solze. Pri eksperimentu žal ni bilo dovoljeno uporabiti inzulina, s katerim bi lahko kontrolirali izločanje glukoze. Prav tako je meritve oteževal mrtvi čas med meritvijo, saj je v tem času koncentracija glukoze že lahko bistveno padla. Posledica konstantnega padanja koncentracije glukoze pri zajcih pod anestezijo je bila ta, da so kot rezultat vzeli povprečne vrednosti obeh koncentracij vsakih 30 minut. Iz teh rezultatov so zaključili, da je padanje koncentracij pri obeh vzorcih (kri in solze) približno enako. Na sliki 3d vidimo povprečje koncentracij v krvi in solzah vsakih 30 minut. Pearsonova korelacijska analiza prikaže dobro zvezo med obema (r 2 =0,9475, p<<0,05). Z uporabo polinomske korelacije drugega reda je ujemanje še boljše (r 2 =0,9835) (slika 3e). Čeprav takšno ujemanje kaže na malo višji r 2, pa zadevo bistveno zakomplicira, prednosti metode pa tega ne opravičujejo. Priporočljiva je torej uporaba linearnega modela, ki zadovolji naše potrebe po točnosti. V kolikor bi torej želeli to metodo uporabljati v vsakdanjem življenju pri diabetikih, bi bilo najprej potrebno določiti zvezo med koncentracijo glukoze v krvi in solzah, saj eksperiment namiguje na to, da se zveza razlikuje od posameznika do posameznika. Ko to dosežemo, imamo enostavno in nebolečo metodo za merjenje koncentracije krvne glukoze tudi do večkrat na dan. Za zelo natančne meritve pa lahko še vedno uporabljamo standardno metodo odvzema krvi [1]. Slika 3: Zveza med glukozo v solzah in v krvi pri zajcih [1] (a,b) Rezultati dveh posamečnih poskusov na zajcih. 7
Slika 4: Zveza med glukozo v solzah in v krvi pri zajcih [1] (c) Imamo podatke za vrednost glukoze v solzah in v krvi pri dvanajstih zajcih. (d) Povprečne vrednosti ravni glukoze za vse živali v študiji na vsake pol ure, ki je opremljeno z linearno regresijo najmanjših kvadratov. (e) Drugi red polinomske korelacije med povprečno glukozo v solzah in v krvi za podatke v točki d. KONTAKTNE LEČE Z VGRAJENIM SENZORJEM ZA SPREMLJANJE RAVNI GLUKOZE V SOLZAH Glukozni senzorji so že desetletja predmet poglobljenih raziskav. Obstaja mnogo različnih in praktičnih senzorjev.v zadnjih letih so bistvene glukozne raziskave pokazale pomembne dosežke pri razvoju elektrodnih materialov, ki omogočajo direktno detekcijo glukoze, brez vključenih encimov. Veliko nedavnih prizadevanj na področju medicine, poskuša razviti majhne in zanesljive senzorje, ki bi omogočili neprekinjeno merjenje glukoze pri diabetikih. Pomembeno je neinvazivno oziroma minimalno invazivno zaznavanje, ter mnogo inovativne 8
tehnologije, ki so bile razvite pri uresničevanju tega cilja. Neinvazivno detekcijo se običajno doseže z nameščanjem občutljivega elementa na kožo, ki preko detektorja zazna glukozo, brez da bi prebadali kožo. Alternativne poti za zmanjšanje invazivnosti pri merjenju glukoze so na primer merjenje glukoze iz urina, sline, solz... Glavni problem tega pristopa so prekinitve, kajti vse tekočine je potrebno najprej zbrati, da sploh lahko izvedemo meritve. Stalno zaznavanje tu ni možno. Vendar zadnje raziskave so pokazale, da bi lahko stalno spremljali glukozo v solzah. Glukozno občutljive kontaktne leče so bile pripravljene z imobilizacijo dveh tipov fluorescentnih indikatorjev v lečah, ki so bile polimerizirane. Indikatorji so povezani eden z drugim, in v odsotnosti glukoze se je emisija fluorescence izklopila. V prisotnosti glukoze se loči in zazna fluorescenco. Signal se bere s pomočjo osvetlitvene/snemalne enote, ki je pred očmi. Delovanje takega senzorja je bilo dokazano s klinično določitvijo. Še en podoben sistem temelji na vgrajevanju fotonskih kristalov na hidrogel obliž, gre za ustvarjanje holografskega hidrogela. Ko je hidrogel osvetljen se valovna dolžina z lomno svotlobo spreminja v odvisnosti od koncentarcije glukoze. Predlagali so, da se tak hidrogelni material vgradi v kontaktne leče in tudi nosi, s tem pa bi lahko merili raven glukoze z ujemanjem barve na obližu merilne skale. Ti senzorji so zelo prilagodljivi, saj se lahko pritrdijo neposredno na oko ali pa se zvijejo in se vstavijo v solzni kanal. Obe možnosti sta pokazali, da imajo zadostno občutljivost za detekcijo glukoze v solzah. Obstajajo različni pogledi na veljavnost uporabe merjenja glukoze v solzah, kajti še vedno smo bolj nagnjeni k določanju glukoze v krvi. Kontaktne leče bi bile idealne za neprekinjeno merjenje glukoze. Pri tem bi morali dokazati, da bi bilo draženje oči minimalno, ter zagotoviti enostavno vstavljanje in odstranjevanje. Študije, kjer uporabljajo kontaktne leče vezane s fluorescentnim indikatorjem so pokazale, primerno povezavo med solzami in krvjo pri merjenju glukoze. Kontaktne leče, ki prenašajo zaznavo glukoze, se kažejo za zelo obetavne, vendar se to zelo počasi razvija oziroma uresničuje. Do sedaj so fluorescentni indikator namestili v ali na kontaktno lečo. Povečanje občutljivosti in zavrnitev motenj so pomembni dejavniki za merjenje glukoze v solzah. Ena solza vsebuje 0,1-0,6 mm glukoze. Zahteve za merjenje glukoze v solzah so veliko bolj strožje od senzorja glukoze v krvi. 9
Izdelali so mikro amperometrične glukozne senzorje, ki so vgrajeni na kontaktne leče. Postopek izdelave je praktičen, saj so vse elektrode pripravljene iz enakih kovinskih konstrukcij (Ti/Pd/Pt). Struktura senzorja je robustna, vendar je še vedno funkcionalna po toplotni obdelavi postopka, za prilagoditev na kontaktne leče. Z imobilizacijo glukozne oksidaze v plasti titanovega sol-gela, lahko bistveno povečamo občutljivost in s tem izpolnjujemo zahteve za nizko stopnjo določanja glukoze v solzah. Uporaba Nafion plasti poveča občutljivost. Slika 5: Senzor, ki ga namestijo na kontaktno lečo [2] Slika 6: Končna kontaktna leča z vgrajenim senzorjem in ožičen tester na kontaktni leči [2] Slika 7a kaže tipičen izmerjen amperometrični odziv, pridobljen med zaporednim dodajanjem 0,1 mm glukoze vsakih 60 s, kar je približno najmanjša koncentracija na površini oči v solzah. Odziv je zelo hiter, saj doseže 90 % maksimalne vrednosti v manj kot 20 s, kar pomeni možnost praktične uporabe na kontaktnih lečah. Slika 7b prikazuje krivuljo kontrole meritv, pridobljene z zaporednim dodajanjem enake količine pufra (ne vsebuje glukoze), ki preverja specifičnost odziva senzorja. Kalibracijska krivulja na sliki 7c je bila ustvarjena s povprečjem trenutnih vrednosti 30-50 s po vsakem dodajanju. Linearno razmerje med trenutno in koncentracijo glukoze je bilo opaženo med 0.1 mm in 0.6 mm (R = 0.9988). 10
Slika 7: Merjenje amperometričnega odziva in umeritvena krivulja [2] Neinvaziven kontinuiran senzor glukoze, ki je vgrajen na kontaktne leče, bi lahko omogočil cenejšo, preprostejšo in bolj zanesljivo uporabo. Uspešno so izdelali polimerne kontaktne leče z vgrajenim mikro senzorjem glukoze, ki so ga predhodno obdelali s titanovim sol-gel filmom in Nafion plastjo. Senzor je pokazal hiter odziv, visoko občutljivost ter dobro ponovljivost v območju nizkih koncentracij glukoze v solzah. Potrebno bi bilo še izboljšati večjo stabilnost in povečati učinkovit zavračanja motenj. Razvili so čip za kontaktne leče, ki nosijo elektronsko vezje. Senzor bo povezan s tem čipom, kar se pa bo prenašalo brezžično [2]. 11
ZAKLJUČEK V eksperimentu so uporabili preprost elektrokemični senzor na glukozo v solzah, ki so ga združili s kapilaro za zbiranje solz, s katero so neboleče in enostavno določevali koncentracijo glukoze pri zajcih. Igličasti amperometrični senzor je pokazal odlično selektivnost preko znanih interferenc, nizko mejo detekcije, zelo velik obseg in odlično ponovljivost pri volumnih od 4-5 µl. Pri nadaljnjih izboljšavah bi lahko ta volumen zmanjšali na 1-2 µl, kar bi naredilo meritve pri ljudeh še enostavnejše in tako predstavljalo odlično alternativo klasičnemu merjenju pri vzorcih krvi. Ugotovili so tudi, da zveza med koncentracijo glukoze v krvi in solzah obstaja, vendar se od osebka do osebka preveč razlikuje, da bi lahko uporabili neko splošno matematično formulo. V primeru aplikacije takšne metode pri ljudeh, bi seveda bilo potrebno najprej določiti to zvezo z ustrezno meritvijo. V prihodnosti lahko pričakujemo študije, ki bodo ugotovile, ali podobne zveze obstajajo tudi pri zajcih z bolj normalnimi in tudi hipoglikemičnimi nivoji glukoze v krvi, pri čemer si bodo pomagali z uporabo inzulina. Pričakovati je tudi nadaljnje raziskave v smeri kulometričnih meritev z različico senzorja pri volumnih reda 1 µl. Takšen kulometričen pristop morda ne bi več potreboval predhodne umeritve senzorja, kar bi pomenilo, da lahko merimo konstanten in obnovljiv volumen solz [1]. 12
LITERATURA [1] Qinyi Yan, Bo Peng, Gang Su, Bruce E. Cohan, Terry C. Major, and Mark E. Meyerhoff, Measurement of Tear Glucose Levels with Amperometric Glucose Biosensor/Capillary Tube Configuration, Analitical Chemistry 83 (2011) 8341-8346 [2] Huanfen Yao, Angela J. Shum, Melissa Cowan, Ilkka Lähdesmäki, Babak A. Parviz, A contact lens with embedded sensor for monitoring tear glucose level, Biosensors and Bioelectronics 26, (2011) 3290 3296 [3] Heidi E. Koschwanez, William M. Reichert, In vitro, in vivo and post explantation testing of glucose-detecting biosensors: Current methods and recommendations, Biomaterials 28 (2007) 3687 3703 13