IZOLÁCIA KVASNIČNEJ INVERTÁZY Z PEKÁRENSKÝCH KVASNÍC

IZOLÁCIA KVASNIČNEJ INVERTÁZY Z PEKÁRENSKÝCH KVASNÍC

Izolácia kvasničnej invertázy 1. TEORETICKÝ ÚVOD 1.1 Využitie bioseparačných procesov na prípravu enzýmov Enzýmy sú katalyzátory biochemických reakcií. Skoro vždy ide o katalyticky aktívne bielkoviny, ktoré urýchľujú reakcie tisíc až miliónnásobne. Všetky enzýmy sa syntetizujú v bunke, ale niektoré z nich sa v bunke uplatňujú (intracelulárne enzýmy), iné sa vylučujú do okolitého prostredia (extracelulárne enzýmy). Pri príprave enzýmov, či už v laboratóriu alebo priemyselne, sa kultivujú producentské bunky pri optimálnych podmienkach, pričom sa v nich syntetizujú želané enzýmy. Tieto sú v zmesi s bunkami, inými bielkovinami a látkami nebielkovinovej povahy, z ktorej je ich nutné odseparovať. Všeobecný postup separácie enzýmov je znázornený na obr. 1. Obr. 1 tiež prostredníctvom horizontálnych čiar naznačuje jeden z najbežnejších spôsobov klasifikácie bioseparačných postupov na [1]: izolačné koncentračné purifikačné. Cieľom izolácie je redukovať obrovský počet zlúčenín nachádzajúcich sa v bioreaktore na prítomnosť niekoľkých s výrazným zastúpením želaného produktu, v tomto prípade daného enzýmu. Prvým krokom separačného procesu je oddelenie buniek od kvapalného podielu kultivačnej pôdy. Najdôležitejšími postupmi sú filtrácia, mikrofilrácia a odstreďovanie, okrem nich sa využívajú aj flotácia a usadzovanie. Ako vyplýva z rozvetvenia prúdu extracelulárnych produktov za bioreaktorom (pravá vetva na obr. 1), v niektorých prípadoch sa môže proces oddelenia buniek vynechať a suspenzia buniek sa podrobuje typickým izolačným procesom (stredná vetva na obr. 1). Intracelulárne enzýmy treba najprv získať z buniek do kvapalnej fázy v procese dezintegrácie. Vo väčšine prípadov sa uvoľňujú do vodnej fázy, ktorá sa vedie na izoláciu buď po oddelení bunkových zlomkov alebo priamo v suspenzii (obr. 1). Dezintegrácia buniek sa najčastejšie uskutočňuje buď mechanicky, chemicky alebo enzýmovo. Výber vhodnej metódy závisí najmä od typu producentských buniek (živočíšne bunky, rastlinné bunky alebo mikroorganizmy). Medzi mechanické dezintegrátory, v ktorých sa generujú vysoké strihové napätia pôsobiace na bunky deštruktívne, zaraďujeme guľový mlyn, vysokotlakový dezintegrátor a ultrazvukový dezintegrátor. Pri chemickej dezintegrácii sa prídavkom organických rozpúšťadiel alebo povrchovo aktívnych látok oslabí alebo celkom rozpustí 2

Práca č. 1 Obr. 1. Všeobecná schéma sekvencie bioseparačných procesov [2]. bunková stena. Rozklad bunkovej steny sa dá dosiahnuť aj pôsobením lytických enzýmov. Každá z uvedených metód má výhody aj nevýhody, ktoré treba pri výbere zvážiť. Výťažok dezintegrácie je definovaný ako pomer rozbitých buniek ku začiatočnému počtu buniek: ( N0 N ) 100 Y (%) = (1) N0 Takto definovaný výťažok sa dá určiť priamym počítaním celých buniek pred a po dezintegrácii, čo je však pracné a nie veľmi presné, najmä v prípade, ak bunky majú tendenciu aglomerovať. Preto je výhodnejšie sledovať určité zložky (napríklad enzým, alebo rozpustné 3

Izolácia kvasničnej invertázy bielkoviny), ktoré sa uvoľnia do roztoku počas dezintegrácie. Potom sa výťažok dezintegrácie vypočíta z pomeru množstva uvoľneného materiálu, R, ku maximálnemu množstvu toho istého materiálu, R m, ktoré je teoreticky možné uvoľniť do roztoku. Množstvo tohto materiálu sa stanovuje v supernatante po odstránení tuhých podielov odstredením. Cieľom koncentrácie je odstránenie vedľajších produktov (najmä nebielkovinových) z kvapalného prostredia a často aj výrazné zníženie podielu rozpúšťadla. Medzi koncentračné techniky sa vo všeobecnosti zaraďujú ultrafiltrácia, odparovanie, extrakcia, obrátená osmóza, zrážanie, kryštalizácia adsorpcia a destilácia (obr. 1). Z uvedeného je zrejmé, že sa jedná o procesy odstraňovania rozpúšťadla alebo o prevod rozpusteného produktu do inej fázy. Následná purifikácia sa uplatňuje v prípade, kedy je požadovaná vysoká čistota pripraveného enzýmu. V procese purifikácie sa využívajú vysoko účinné postupy, ako sú chromatografia a elektroforéza. Nevýhodou týchto purifikačných postupov je ich vysoká ekonomická náročnosť, preto sa dajú použiť iba pri purifikácii drahých farmaceutických produktov a špeciálnych enzýmových preparátov používaných najmä na laboratórne a diagnostické účely. Obr. 2. Schéma Frenchovho lisu. Šípka znázorňuje smer pohybu piesta. 1.2 Dezintegrácia buniek vysokotlakovým dezintegrátorom Princíp dezintegrácie buniek vo vysokotlakovom dezintegrátore (Frenchovom lise) je znázornený na obr. 2. Kvapalná vzorka obsahujúca suspenziu buniek je umiestnená vo valci, na ktorý tlačí piest poháňaný hydraulickým lisom. Suspenzia potom pod vysokým tlakom 4

Práca č. 1 prechádza cez ihlový ventil, pričom v dôsledku vysokých šmykových napätí v kvapaline a náhleho poklesu tlaku praskne bunková stena. Šmykové sily pôsobiace na bunky sa dajú ovplyvniť presným nastavením tlaku pôsobiaceho na piest. 1.3 Kvasničná invertáza Kvasničná invertáza (E.C. 3.2.1.26, β-fruktofuranozidáza) je enzým patriaci do skupiny hydroláz. Základnou reakciou, ktorou možno charakterizovať jej katalytické vlastnosti je hydrolýza sacharózy: Invertáza sacharóza + H 2 O glukóza + fruktóza Invertáza sa vyskytuje v mikrobiálnych bunkách v intracelulárnej aj extracelulárnej forme. V bunkách kvasiniek Saccharomyces cerevisiae je extracelulárna invertáza situovaná v polysacharidovej vrstve bunkovej steny, kde tvorí manán-proteínový komplex. Oligosacharidová časť extracelulárnej invertázy zvyšuje jej rozpustnosť. Intracelulárna invertáza sa vyskytuje vo vnútri buniek a neobsahuje cukornú zložku. Množstvo invertázy, ako aj iných enzýmov, sa obvykle vyjadruje prostredníctvom enzýmovej aktivity. Je to preto, že aj relatívne malé množstvo enzýmu môže vykazovať vysokú enzýmovú aktivitu, ktorá sa dá špecificky stanoviť aj vo veľmi zriedených roztokoch a/alebo v komplexných zmesiach s inými bielkovinami. Jednotka aktivity invertázy (unit, U) je definovaná ako množstvo enzýmu potrebné na hydrolýzu 1 µmólu sacharózy na glukózu a fruktózu za 1 minútu pri ph 4,6 a teplote 30 C. Z definície vyplýva, že invertázová aktivita sa stanovuje pomocou začiatočnej rýchlosti enzýmovej reakcie, ktorá sa dá vyjadriť ako rýchlosť produkcie glukózy na začiatku reakcie. Táto rýchlosť sa určí experimentálne meraním množstva produkovanej glukózy za daný reakčný čas. Pritom je nevyhnutné, aby závislosť koncentrácie glukózy od reakčného času bola lineárna, t.j. rýchlosť reakcie bola konštantná. Toto sa zabezpečí vhodným nastavením reakčných podmienok tak, aby konverzia sacharózy bola menšia než 10%. Z uvedeného vyplýva, že aktivitu invertázy môžeme vypočítať nasledovne 1000 cgl VR Aktivita = (2) t VE kde c GL je koncentrácia glukózy (mmol dm -3 ), V R a V E sú objemy reakčnej zmesi a enzýmu pri enzýmovej reakcii (dm -3 ), t je reakčný čas (min). Aktivita je vyjadrená v U dm. Špecifická aktivita je vztiahnutá na množstvo bielkovín v roztoku enzýmu a má jednotku U g -1. Špecifická aktivita je mierou čistoty enzýmu a je konštantná pre čistý enzým. 5-3 E

Izolácia kvasničnej invertázy 2. CIEĽ PRÁCE 1. Izolovať kvasničnú invertázu z buniek Saccharomyces cerevisiae. 2. Vypočítať výťažok invertázy počas procesu dezintegrácie. 3. ZADANIE 1. Dezintegrovať bunky pomocou vysokotlakového Frenchovho lisu v troch za sebou nasledujúcich cykloch pri tlaku... psi (... MPa). 2. Stanoviť aktivitu a špecifickú aktivitu invertázy vo vzorkách. 3. Vypočítať a porovnať výťažky invertázy v jednotlivých dezintegračných cykloch. 4. EXPERIMENTÁLNA ČASŤ 4.1 Opis zariadenia Dezintegrátor pozostáva z dvoch hlavných súčastí Frenchovho lisu a pracovnej cely. V pracovnej cele je umiestnená suspenzia buniek určená na dezintegráciu, ktorá je uzatvorená piestom. Pracovná cela sa vkladá do Frenchovho lisu, ktorý vyvinie vysoký tlak vo vnútri cely. 4.1.1 Frenchov lis (obr. 3) 1. Prístup k zásobníku hydraulickej kvapaliny. 2. Prepínací ventil v polohe MED alebo HIGH sa spodná platforma (6) pohybuje smerom nahor, v polohe DOWN smerom nadol. 3. Hlavný vypínač. 4. Regulátor tlaku pôsobiaceho na spodnú platformu (6). Pootočením v smere hodinových ručičiek sa tlak zvyšuje, proti smeru hodinových ručičiek sa tlak znižuje. 5. Manometer, rozsah 0-3000 psi indikuje tlak na prepínacom ventile (2). Aktuálna hodnota tlaku závisí od polohy prepínacieho ventila (HIGH, MED alebo DOWN). 6

Práca č. 1 6. Spodná platforma pohybuje sa smerom nadol alebo nahor, čo umožňuje inštaláciu pracovnej cely a jej následné natlakovanie. Tri centrovacie kolíky (8) na spodnej platforme slúžia na presné umiestnenie pracovnej cely v lise. 7. Podporné tyče pre svorku pracovnej cely slúžia ako podpery pre svorku pracovnej cely. 8. Centrovacie kolíky pomáhajú vycentrovať pracovnú celu v lise. 9. Svorka pracovnej cely s maticami zaistí vrchnú časť pracovnej cely v správnej polohe v lise. 10. Vrchná platforma zabezpečuje mechanickú zarážku pre vrch piesta pracovnej cely. Obr. 3. Frenchov lis. 4.1.2 Pracovná cela Frenchovho lisu (obr. 4) A. Hlavné teleso cely. B. Spodné teleso cely s výpustným ventilom. C. Piest. D. Značka MAX FILL označuje maximálne vytiahnutie piesta pri plnení cely. E. Značka STOP označuje polohu piesta, pri ktorej sa musí ukončiť dezintegrácia. F. Rukoväť piesta. 7

Izolácia kvasničnej invertázy G. Výpustná rúrka slúži na odtok dezintegrovanej suspenzie. H. Výpustný ventil slúži na reguláciu prietoku suspenzie počas dezintegrácie. Obr. 4. Pracovná cela Frenchovho lisu. 4.2 Pracovný postup Upozornenie Pracovná cela je počas dezintegrácie vystavená pôsobeniu vysokého tlaku (až do 40 000 psi = 275 MPa). Preto sa so všetkými súčasťami pracovnej cely musí zaobchádzať starostlivo a jemne, najmä sa treba vyvarovať nárazom a pádom, ktoré by mohli spôsobiť vnútorné poškodenie materiálu cely. 4.2.1 Príprava suspenzie buniek 1. Pripravíme suspenziu buniek S. cerevisiae v acetátovom pufri (0,05 mol dm -3, ph 4,6) s koncentráciou 100 g dm -3 a objemom 25 ml. 2. Odoberieme 1,5 ml takto pripravenej suspenzie do s a odložíme do chladničky. Túto vzorku neskôr použijeme na stanovenie pôvodnej aktivity invertázy v bunkách. 8

Práca č. 1 4.2.2 Naplnenie pracovnej cely suspenziou buniek Upozornenie Je nevyhnutné udržiavať piest (C) vždy čistý. Akékoľvek tuhé nečistoty nevratne poškodia pracovnú celu. Výpustný ventil doťahovať len rukou! Príliš silné dotiahnutie ventila môže spôsobiť poškodenie tesnenia a zapríčiniť netesnosť ventilu. 1. Z princípu izolácie látok z buniek tlakom vyplýva, že počas procesu dôjde k zvyšovaniu teploty suspenzie buniek, preto je nevyhnutné, aby suspenzia ako aj pracovná cela Frenchovho lisu boli vopred vychladené. 2. K spodnému telesu cely (B) pripojíme výpustnú rúrku (G) a výpustný ventil (H). Ventil treba nechať otvorený, nedoťahovať! Pripravíme si plniaci stojan. 3. Na tesnenie piesta nanesieme jemnú vrstvu vazelíny. Točivým pohybom nasunieme piest do otvoru na vrchu pracovnej cely (A) tak, aby ryska MAX FILL (D) bola vo vnútri hlavného telesa cely. 4. Vložíme celu do plniaceho stojana piestom nadol. 5. Naplníme celu suspenziou buniek asi 2,5 cm pod horný okraj. 6. Pod výpustnú rúrku (G) podložíme kadičku. Na hlavné teleso cely zvrchu nasadíme spodné teleso (B) až na doraz, pričom výpustný ventil (H) je otvorený. Do kadičky vytečie nadbytok suspenzie a zároveň sa odstráni vzduch z pracovnej cely. 7. Uzatvoríme výpustný ventil. Týmto je pracovná cela pripravená na vloženie do lisu. 4.2.3 Dezintegrácia buniek na Frenchovom lise 1. Prepínací ventil nastavíme do polohy DOWN. 2. Zapneme hlavný vypínač. Keď spodná platforma (6) klesne úplne dolu, vypínač vypneme. 3. Spodné teleso cely pevne pridržímeť na hlavnom telese, spolu vyberieme zo stojana, otočíme a umiestnime na Frenchov lis medzi tri centrovacie kolíky (8) na spodnej platforme (6). 4. Vrchnú časť cely zaistíme svorkou (9) a obe matice dotiahneme. 9

Izolácia kvasničnej invertázy Upozornenie Rukoväť piestu (F) musí byť pootočená kolmo matice svorky! Inak by počas dezintegrácie narazila rukoväť piestu do matíc svorky, čo by spôsobilo ohnutie až zlomenie rukoväte a poškodenie skrutiek svorky. 5. Prepínací ventil (2) prepneme do polohy HIGH a zapneme hlavný vypínač lisu (3). Spodná platforma (6) sa začne pohybovať smerom nahor. Sledujeme tlak na manometri a otáčaním regulátora tlaku (4) v smere hodinových ručičiek nastavíme požadovaný tlak. Pod výpustnú rúrku (G) umiestnime kadičku na zachytenie dezintegrovanej biomasy. 6. Pomaly otvárame výpustný ventil (H) tak, aby sa dosiahol prietok približne 1 kvapka za 4-5 s. Prietok treba neustále kontrolovať. 7. Keď sa piest zasunie do cely po značku STOP, prepínací ventil ihneď prepneme do polohy DOWN. Upozornenie Ku koncu dezintegrácie je treba venovať na prístroju zvýšenú pozornosť. Značka STOP nesmie byť nikdy prekročená, inak dôjde k zničeniu pracovnej cely. 8. Keď spodná platforma dosiahne dolnú pozíciu, vypneme hlavný vypínač. 9. Pracovnú celu vyberieme z lisu a vložíme ju do stojana na plnenie piestom nadol. Otvoríme výpustný ventil, pričom ku výpustne rúrke priložíme kadičku. Vyberieme spodné teleso cely a zvyšok suspenzie buniek vylejeme. Piest vytiahneme do polohy MAX FILL. 10. Ak sa dezintegrácia uskutočňuje vo viacerých za sebou nasledujúcich cykloch, celý postup opakujeme. 4.2.4 Spracovanie dezintegrovaných vzoriek 1. Po skončení dezintegrácie odoberieme z homogenizátu buniek do skúmavky 2 ml suspenzie a odložíme do chladničky. 2. Zvyšok suspenzie vychladíme a znovu dezintegrujeme pri rovnakých podmienkach. Po dezintegrácii odoberieme 2 ml vzorky do skúmavky. 3. Po ukončení všetkých cyklov dezintegrácie, vzorky v skúmavkách odstredíme. Odstredivku zapneme asi 20 min pred samotným odstreďovaním, aby sa vychladila. Do 10

Práca č. 1 zvyšnej skúmavky napipetujeme 2 ml vody, aby bol rotor odstredivky vyvážený. Podmienky odstreďovania sú: frekvencia 3500 otáčok za minútu, čas 10 minút. 4. Po odstredení pipetou odoberieme číry supernatant do čistej ependorfky a vzorky odložíme do chladničky do času ďalšieho spracovania. 5. Vo všetkých vzorkách (vrátane vzorky suspenzie buniek) stanovíme aktivitu invertázy a vo vzorkách po dezintegrácii aj obsah bielkovín. Pozn: 1 psi = 6 894,75729 Pa 4.3 Stanovenie aktivity invertázy 4.3.1 Princíp Aktivita invertázy sa vypočíta pomocou začiatočnej rýchlosti enzýmovej reakcie, ktorú vyjadríme ako rýchlosť vzniku glukózy na začiatku reakcie. Túto rýchlosť experimentálne určíme tak, že zmeriame množstvo vzniknutej glukózy, ktoré vznikne hydrolýzou sacharózy za určitý reakčný čas. Aby bolo zabezpečené, že závislosť koncentrácie glukózy od reakčného času bude lineárna, a teda začiatočná rýchlosť reakcie bude konštantná, je treba pracovať pri takých podmienkach, aby konverzia sacharózy bola menšia než 10%. 4.3.2 Postup 1. Pripravíme 25 ml roztoku sacharózy v acetátovom pufri (0,1 mol dm -3, ph 4.8) s koncentráciou 100 mmol dm -3. 2. Do ependorfiek napipetujeme 750 µl roztoku sacharózy, počet ependorfiek je rovný počtu vzoriek enzýmu, v ktorých chceme stanoviť aktivitu invertázy. Ependorfky uzavrieme a dáme temperovať do termostatu na 30 C asi 15 min. 3. Po vytemperovaní naštartujeme enzýmovú reakciu tak, že pridáme do každej ependorfky po 50 µl vzorky enzýmu (suspenzia buniek alebo supernatant), zapneme stopky. Ihneď zamiešame a vrátime do termostatu. Na stopkách sledujeme čas reakcie. 4. Po 15 min reakcie do jednotlivých ependorfiek pridáme 80 µl NaOH (c = 2 mol dm -3 ), ihneď premiešame. Týmto sa enzýmová reakcia zastaví. 5. Obsah glukózy v jednotlivých vzorkách stanovíme glukózovým testom. 11

Izolácia kvasničnej invertázy 4.4 Stanovenie obsahu glukózy glukózovým testom 4.4.1 Princíp Glukózooxidáza katalyzuje oxidáciu glukózy na peroxid vodíka a glukonát. Vzniknutý peroxid vodíka sa stanovuje oxidačnou reakciou so substituovaným fenolom a 4- aminoantipyrínom katalyzovanou enzýmom peroxidázou, pričom vzniká červeno sfarbený produkt. 4.4.2 Postup 1. Od vedúceho cvičenia si vypýtame štandardné roztoky glukózy. 2. Roztok glukózového testu predhrejeme na 30 C. Do ependorfiek pipetujeme po 1 ml tohto roztoku. Počet ependorfiek je rovný počtu štandardov glukózy + 3 x počet vzoriek + 1. 3. Do prvej ependorfky pridáme 10 µl vody, do ďalších po10 µl štandardov glukózy alebo vzorky. Ihneď po pridaní zmes dôkladne premiešame. 4. Stojan s ependorfkami odložíme na tmavé miesto a necháme 30 min inkubovať. 5. Medzitým si zapneme UV/VIS spektrofotometer, aby sa ustálil signál. 6. Po ukončení inkubácie vzorky vyberieme a v každej zmeriame absorbanciu pri vlnovej dĺžke 500 nm. Ako referenčnú kvapalinu použijeme vodu. 4.5 Stanovenie obsahu bielkovín Lowryho metódou 4.5.1 Princíp Pri alkalických podmienkach tvorí Cu 2+ ión komplex s dusíkom peptidovej väzby, pričom sa redukuje na Cu + (Biuretova reakcia). Následne Cu + a aromatické aminokyselinové zvyšky (tyrozín, tryptofán a cysteín) reagujú s Folinou reagenciou, pričom vzniká nestabilný produkt, ktorý sa redukuje za vzniku produktu modrej farby. 12

Práca č. 1 4.5.2 Roztoky A. 2% Na 2 CO 3 v 0,1 mol dm -3 NaOH B. 0,5 % CuSO 4 C. 1% vínan sodno-draselný D. zmiešaním 48 dielov A + 1 diel B + 1 diel C E. 1 N Folinova reagencia 4.5.3 Postup 1. Od vedúceho cvičenia si vypýtame štandardné roztoky hovädzieho sérového albumínu (BSA). 2. Pripravíme si roztok D zmiešaním roztokov A, B a C. Objem pripravovaného roztoku vypočítame podľa množstva vzoriek a štandardov, pričom na jedno stanovenie treba 1 ml roztoku D. Roztok D pripravujeme tesne pred použitím. 3. Do ependorfiek napipetujeme po 1 ml roztoku D. Počet ependorfiek je počet štandardov + 3 x počet vzoriek + 1. 4. Vzorky, v ktorých budeme stanovovať obsah bielkovín nariedime acetátovým pufrom v objemovom pomere 1:2 (vzorka : pufor). 5. Do prvej ependorfky pridáme 200 µl vody, do ostatných po 200 µl štandardov alebo nariedených vzoriek. Každú vzorku pipetujeme do 3 ependorfiek, aby sme zvýšili presnosť stanovenia. Ihneď po pridaní zmes dôkladne premiešame. 6. Necháme inkubovať 10 min. 7. Potom do každej ependorfky pridáme 100 µl roztoku E, ihneď zamiešame. Necháme inkubovať 30 min. 8. Zmeriame absorbanciu vzoriek pri vlnovej dĺžke 720 nm. 13

Izolácia kvasničnej invertázy 5. VYHODNOTENIE NAMERANÝCH ÚDAJOV 1. Z meraní absorbancie štandardov glukózy zhotovíme kalibračnú závislosť f ( ) vypočítame parametre kalibračnej rovnice a regresný koeficient. 2. Vypočítame koncentráciu glukózy vo vzorkách. 3. Aktivitu invertázy vypočítame podľa vzťahu (2). Abs =, 4. Z meraní absorbancie štandardov BSA zhotovíme kalibračnú závislosť Abs = f, vypočítame parametre kalibračnej rovnice a regresný koeficient. 5. Vypočítame koncentráciu bielkovín vo vzorkách. 6. Vypočítame špecifickú aktivitu invertázy. 7. Vypočítame výťažky invertázy v jednotlivých cykloch. c GL ( ) c BSA 6. ZOZNAM LITERATÚRY 1. Báleš, V., Mészáros, A., Muntean, O., Polakovič, M., and Štefuca, V., Biochemické technológie. Bratislava, AB-ART, 2003 2. Harrison, R.G., Todd, P., Rudge, S.R., and Petrides, D., Bioseparations science and engineering. New York, Oxford University Press, 2003 14