Molekulaargeneetilised uuringud sisekliinikus Tiina Kahre, ühendlabori geneetikakeskus
Ülevaade α1-antitrüpsiini puudulikkuse hemokromatoosi Wilsoni tõve laktoositalumatuse Kliinilisest pildist, diagnostikast ravist ja meie osakonnas tehtavatest DNA analüüsidest 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 2
α1-antitrüpsiini (AAT) puudulikkuse kliiniline pilt ja diagnostika Kliiniliselt on täiskasvanutel juhtivaks sümptoomiks krooniline obstruktiivne kopsuhaigus või emfüseem Kujuneb suitsetajatel 40 50 a., mittesuitsetajatel u.60a. Maksakahjustus võib alata nii lapse- kui täiskasvanueas (fibroos, tsirroos, lapseeas obstruktiivne ikterus, harva HCC) Diagnostika vastava kopsu- või maksakahjustuse korral Madal plasma α1-antitrüpsiini tase ja AAT variantide määramine isoelektrilise fokuseerimisega või AAT alleelsete variantide tuvastamine DNA uuringuga 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 3
α1-antitrüpsiini (AAT) puudulikkuse kliiniline pilt ja diagnostika (2) Plasma AAT tase Referentsväärtused Lapsed < 1 k. 1.24-3.48 g/l > 2 a. 1.1-2.8 g/l 1-6 k. 1.11-2.97 g/l Täiskasvanud 0.9-2.00 g/l 7 k.-2 a. 0.95-2.51 g/l PI*S/S genotüübi korral tase tavaliselt kuni 40% normist PI*Z/Z genotüübi korral kuni 12-24% normist Teised madala AAT taseme põhjused Vastsündinute respiratoorse distressi sündroom Raske valgukaoga sündroomid Raske maksakahjustus muudest põhjustest Tsüstiline fibroos jt 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 4
AAT puudulikkuse geneetiline taust AAT puudulikkuse põhjuseks on SERPINA1 (anti-elastaasi, antitrüpsiini) geeni mutatsioonid; üle 95% haigetest homosügootsed nn Z alleeli (PI*Z ehk p.e366k) suhtes SERPINA1 asub 14q32.13, suurus 14kb, koosneb 7 eksonist AAT teised alleelid PI*M normaalne, alatüübid M1, M2, M3 PI*S (p.e288v) kliiniliselt oluline vaid olulise AAT languse korral; sageli koos M alleeliga PI*M/S (valgetel 8%) Teada veel ca 20 varianti, mis moodustavad 5% AAT puudulikkuse alleelidest - p.f53del, p.s53f, nullalleelid jt Samuti teada hulk kliiniliselt ebaolulisi variante Osades allikates S ja Z alleelide positsioonid erinevad: E366K=E342K; E288V=E264V 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 5
AAT puudulikkuse geneetiline taust (2) PI*M/M terved, normaalse plasma AAT tasemega PI*M/S genotüübiga (AAT tase ~90%); kopsuhaiguse (sh. astma) või maksakahjustuse risk ei ole suurenenud PI*M/Z heterosügootidel (2 5%) võib olla kerge kopsufunktsiooni langus, kuid kliinilisi sümpt. tekib harva. Suitsetajatel kahjustus tõsisem. Kergelt tõusnud maksakahjustuse risk täiskasvanueas, pakutud RR=2 PI*S/Z kõrge risk kroonilise obstruktiivse kopsuhaiguse tekkeks suitsetajatel; maksakahjustuse risk ei ole kõrge PI*Z/Z kõrge risk kopsu- ja maksakahjustuse tekkeks. U. 18%-l maksakahjustus ning u.2,4% maksatsirroos lapseeas. Täiskasvanutel maksatsirrosi risk: 20-40a. u. 2%, 41-50 a. 4% ja üle 50 a. 15 19% (meestel>naistel) 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 6
AAT PI*Z/Z genotüübi sagedus Euroopas Blanco I et al. Eur Respir J 2006; 27:77-84 1:1500-1:3000 Skandinaavias 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 7
Oletatav AAT PI*Z/Z genotüübiga isikute hulk Euroopas Blanco I et al. Eur Respir J 2006; 27:77-84 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 8
Oletatav AAT PI*S/Z genotüübiga isikute hulk Euroopas Blanco I et al. Eur Respir J 2006; 27:77-84 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 9
AAT puudulikkuse ravi Kui FEV1 on 35-50% eeldatavast ning see langeb hoolimata suitsetamisest loobumisele, soovitatakse puhastatud AAT regulaarset infusiooni, ehkki puuduvad kontrollitud kliinilised uuringud Suitsetamisest hoidumine Hoidumine mineraalsest tolmust, gaasidest ja aurudest Vajadusel maksa transplantatsioon. NB! Doonori maks toodab AAT, seega võib haigus paraneda E-vitamiiniga ravi toetab lastel maksa- ja kopsufunktsiooni Rinnaga toitmine pidurdab PI*Z/Z genotüübiga lastel maksakahjustuse arengut 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 10
AAT puudulikkuse DNA uuringud AAT PI*Z ehk p.e366k ja PI*S (p.e288v) alleelide määramine SA TÜK geneetikakeskuses juurutatud 2008.a alguses, meil põhineb PCR ja restriktsioonanalüüsil Uuringu HK kood 66616 Vajadusel geeni sekveneerimine teistes Euroopa laborites, kui suunatud mutatsioonianalüüsiga leiti üks haigusalleel ja anamnees viitab liitheterosügootsuse võimalusele. Sünnieelne diagnostika on võimalik, aga eeldab eelnevalt vanematel AAT alleelide määramist. Näidustuseks peres raske maksakahjustusega laps 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 11
AAT puudulikkuse PI*Z alleeli määramine RFLP-ga 7734 PI*Z/M 7925 PI*Z/Z 6740 PI*M/M 7447 PI*Z/Z 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 12
AAT puudulikkuse geneetiline konsultatsioon Pärandumine autosoom-retsessiivselt: seega kui vanemad on kandjad on pooltel lastel risk olla kandja ja 25% on risk olla AAT puudulikkusega, kuid haiguse avaldumine sõltub avaldumine sõltub genotüübist Kui üks vanematest homosügoot ja teine kandja, on lastel 50% risk olla AAT puudulikkusega ja 50% risk olla kandja Algust, sümptoome ja kulgu ei saa hästi ennustada. Kui ühel lapsel peres on raske maksakahjustus, on teisel lapsel kuni 10% risk sarnase kahjustuse tekkeks (PI*Z/Z genotüübiga kuni 40% risk). Kui peres esmaselt diagnoositud lapsel puudus raske maksakahjustus, on selle tekke risk teistel lastel kuni 3.3% (PI*Z/Z genotüübi korral 13%)(Cox et al. 2004) Kui peres on haige, soovitatakse testida kõiki lapsi 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 13
HFE-hemokromatoosi (HFE-HK)e. tüüp I kliiniline pilt ja diagnostika HFE-seoseline hemokromatoos on seotud raua ebanormaalselt kõrge absorptsiooniga ja raua ladestumisega maksas, nahas, pankreases, südames, liigestes ja testistes Algab mittespetsiifiiliste sümptomitega kõhuvalu, nõrkus, letargia kaalu kaotus Sümptoomideks võivad olla hepatomegaalia, maksafibroos ja tsirroos, hepatotsellulaarne kartsinoom, nahapigmentatsioon, diabetes mellitus, südamepuudulikkus, kardiomüopaatia, arütmiad, artriit, hüpogonadism Ravita avaldub meestel 40-60 a. ja naistel peale menopausi Diagnostika transferriini saturatsiooni ( 45%), ferritiini taseme tõusu ja kinnitavate HFE DNA analüüside alusel; lisaks maksa biopsial ja/või MRI-ga raua ladestuse määramine HFE-HK on sagedasem Põhja-Euroopas 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 14
Hemokromatoosi jälgimine ja ravi Kui S-ferritiin >1000 µg/l, soovitatakse tsirroosi kontrolliks maksabiopsiat Regulaarne (iga nädalane) flebotoomia on vajalik, kui esinevad kliinilised nähud. S-ferritiini taset tuleks hoida sellega 50 µg/l Haiguse hilise avaldumise ja aeglase progresseerumise tõttu puudub konsensus flebotoomia kasutamiseks ainult biokeemiliste muutuste alusel Mida varem alustatakse raviga, seda tõenäosemalt suudetakse vältida komplikatsioone Kui suudetakse vältida tsirroosi, on haiguse mõju elueale vähene Guidelines for testing BMC Medical genetics 2006 King, Barton 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 15
HFE-hemokromatoosi geneetiline taust HFE-HK on põhjustatud muutustest HFE (MHC I sarnane hemokromatoosi valk) geenis. Valk seostub β2-mikroglobuliiniga ja mõjutab transferriini seostumist transferriini retseptoriga HFE geen asub 6p21.3, suurus 8kb, koosneb 6 eksonist Teada kaks HFE-HK-ga seotud mutatsiooni: p.c282y ja p.h63d HFE-HK haigete genotüübid 60-90% p.c282y/p.c282y 3-8% p.c282y/p.h63d 1% p.h63d /p.h63d Eristada juveniilsest hemokromatoosist (põhjustatud HJV ja HAMP geenide mutatsioonidest) (tüüp 2a ja 2b) HFE-seoselisest varasema algusega TFR2 geeni mutatsioonidest tingitud hemokromatoosist (tüüp 3) Tüüp 4 AD, feroportiini geeni muutustest tingitud HK 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 16
Hemokromatoosi DNA uuringud (2) p.c282y ja p.h63d mutatsioonide määramine HFE geenis Uuringu võib jagada diagnostiliseks, ennetavaks, kandluse määramiseks ja prenataalseks. Prenataalse testimise ennustusväärtus on väike, kuna kliinilised nähud arenevad vähestel SA TÜK geneetikakeskuses alates 2008.a p.c282y mutatsiooni määramine, varem tehti sama analüüsi ÜMPI-s ning 2009a. p.h63d mutatsiooni määramine Hetkel põhinevad mõlemad PCR ja restriktsioonanalüüsil Analüüsi HK kood 66616 Mujalt võimalik tellida ka HFE geeni sekveneerimist, aga selle informatiivsus on ebaselge 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 17
Hemokromatoosi geneetiline konsultatsioon HFE-HK pärandub autosoom-retsessiivselt. Kandjate vanemate lastel esineb 25% homosügootsust või liitheterosügootsust; 50% kandluse risk Valgetel on p.c282y heterosügootseid kandjaid kuni 1/11 p.c282y/p.c282y homosügoote 1:200 400 (Adams et al. 2005) p.h63d heterosügootsust on valgetel kuni 25% p.c282y/p.c282y homosügootidel on biokeemilised nihked sagedased, aga penetrantsus ei ole 100%. Kliinilised nähud arenevad väga harva, u 2%-l ja seda ei saa ette ennustada (Beutler et al. 2002) p.h63d/p.c282y liitheterosügootidel ja p.h63d/p.h63d homosügootidel on kliinilisi probleeme harva, madal penetrantsus Teised geneetilised modifikaatorid Keskkonnafaktorid 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 18
Wilsoni tõve kliiniline pilt ja diagnostika Wilsoni tõbi e. Hepatolentikulaarne degeneratsioon Vase seostumise häirest tseruloplasmiiniga tekkiv metabolismi häire, mis võib avalduda maksakahjustuse (korduv ikterus, erinevat tüüpi ägedad hepatiidid, krooniline hepatiit) neuroloogiliste nähtude (treemor, koordinatsiooni ja peenmotoorika häire, koorea, rigiidne düstoonia) psühhiaatriliste nähtude (depressioon, neurootiline käitumine, isiksusehäire, intellektihäire) või nende kombinatsioonina Avaldumisaeg 3.50-a Sagedaseks haigusnähuks on Kayser-Fleyschneri rõngad vase deponeerumisest kornea perifeersetes osades; see peegeldab kõrget vase taset ka mujal organismis. Esinevad 50-60% maksakahjustuse ja 90% neuroloogiliste või psühhiaatriliste leidude korral. Samuti võib esineda kolestaatiliste maksahaiguste ja autoimmuunse hepatiidi korral 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 19
Wilsoni tõve diagnostika (2) Diagnostiliselt on olulised madal seerumi vase ja tseruloplasmiini tase ning kõrge vase tase uriinis. Seostumata vase tase sõltub tseruloplasmiinist ja vase üldisest tasemest Tseruloplasmiini tase on vase tasemest vähem usaldusväärne, kuna see on normis 5% neuroloogiliste ja 40% maksanähtudega haigetel du-cu tase on kelaate manustamata pea alati tõusnud >0.6µmol/24h Maksas on Wilsoni tõvega tavaliselt vase tase >250µg/g (normis <55 µg/g), aga see võib esineda ka muude krooniliste maksahaiguste korral Referentsväärtused S-Cu 0-6 kuud 3.1-11.0 µmol/l 6-12 aastat 12.6-29.9 µmol/l du-cu 0.047-0.55 µmol/24h Mehed Naised 11-22 µmol/l 12-24 µmol/l S-Cer Lapsed < 5 p. 0.05-0.4 Lapsed > 1 a. ja g/l täiskasvanud 0.2-0.6 g/l 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 20
Wilsoni tõve jälgimine ja ravi Ravis kasutatakse vaske kelateerivaid preparaate (penitsillamiin, trientiin, tetrabiomolübtaat) või tsinkatsetaat, see omab efekti kliiniliste nähtude ennetamisel ja ravis Vasevaene dieet (ei sobi maks, aju, šokolaad, seened, karbid, pähklid) Toetav ravi vitamiin E-ga antioksüdatiivse toime tõttu Suukaudsed tsingipreparaadid takistavad vase imendumist soolestikus; need toimivad sünergeetiliselt koos kelateerivate preparaatidega Vajadusel kasutatakse maksasiirdamist, eriti kui patsient ei allu medikamentoossele ravile või ei talu seda 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 21
Wilsoni tõve geneetiline taust Wilsoni tõbi on põhjustatud mutatsioonidest vaske transportivat P-tüüpi ATPaasi kodeerivas ATP7B geenis. Haiguse sagedus globaalselt u 1:30000, kandjate sagedus u 1:90 ATP7B asub 13q14.3, suurus 79kb, koosneb 21 eksonist Euroopas on sagedasim p.h1069q mutatsioon, mis moodustab segapopulatsioonides 35 45% haigusalleelidest ning on kõrgema sagedusega Ida- Euroopas Teada ligi 400 haigusalleeli, enamus neist on harvaesinevad Fenotüüp genotüüp korrelats: kel muutus geenis raskem, sel ka varasem algus ja raskem kulg 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 22
Wilsoni tõve DNA uuringud ATP7B geeni p.h1069q mutatsiooni määramine Põhineb PCR ja restriktsioonanalüüsil Analüüsi HK kood 66616 Geenikiibiga kompleksanalüüs 73 mutatsiooni+13 SNP määramiseks (kiibianalüüsi pakub AS Asper Biotech ka otse). Geenikiip on välja töötatud koostöös Tšehhi laboriga ja katab suures osas eeskätt seal sagedasi alleele (Gojova L et al. 2008) Analüüsi HK koodid 66617+66617 Mõlemat analüüsi võimalik geneetikakeskusest tellida alates 2008.a Kuna Eestis pole Wilsoni tõve haigusalleele süstemaatiliselt uuritud, ei ole võimalik täpselt ennustada, kui palju üks või teine test neist katab Mujalt võimalik tellida ka ATP7B geeni kodeeriva ala sekveneerimist, mis annaks kuni 98% tundlikkuse (Cox DW, publitseerimata). Kohapeal väikese nõudluse tõttu hetkel ei ole plaanis juurutada 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 23
Wilsoni tõve geneetiline konsultatsioon Wilsoni tõbi pärandub autosoom-retsessiivselt. Kandjate vanemate lastel esineb 25% homosügootsust või liitheterosügootsust; 50% kandluse risk Geneetiline testimine on soovitav ka asümptomaatilistele sugulastele, et eristada haigusalleelide kandlust tervetest riskigenotüübiga isikutest Prenataalne testimine aeglaselt progresseeruva ja ravitava haiguse suhtes on eetiliselt küsitav 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 24
Laktoositalumatuse tüübid Alaktaasia ehk suhkru lagundamiseks vajaliku ensüümi puudus juba sündides Täiskasvanutüüpi laktoositalumatus ehk hüpolaktaasia Sekundaarne laktoositalumatus, nt tsöliaakiast tingitud Laktoosi (suhkru) talumatus piima (valgu) talumatus 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 25
Hüpolaktaasia Väljendub kõhupuhituse, gaaside halva enesetunde, kõhulahtisuse ja kõhuvaludena Dif diagnostika Ärritatud soole sündroomist Crohni tõvest Haavandilisest koliidist 57% protsenti patsientidest, kel tekivad piimatarbimisel vaevused tegelikult hüpolaktaasia Vaevuste teke sõltub kui palju tarbib inimene piima Missugune on tema peensoole seisund Missugusne on individuaalne tolerants 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 26
Hüpolaktaasiaga seotud piiratud laktoositaluvuse patogenees Laktaas on enterotsüütide membraanis olev ensüüm UCLA Center for Human Nutrition järgi 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 27
Hüpolaktaasia geneetiline taust Põhjuseks on on inimese laktaasi-florisiinhüdrolaasi geeni (LCT, lactasephlorizine hydrolase gene) aktiivsust mõjutavad variandid sellele eelnevas naabergeenis MCM6, eriti LCT 1390C>T, (rs4988235). C alleeli allaregulatsioon algab peale 5.eluaastat Pärandumine autosoom-retsessiivselt LCT aikneb 2q21, suurus 55kb ja sisaldab 17 eksonit Tegemist β-galaktosidaasiga - kaks aktiivsust: Laktoosi hüdrolaas (laktaas): laktoos galaktoos+ glükoos Florisiinhüdrolaas: florisiin floretiin + glükoos 28.8.09 Phlorizin ELMÜ 2009, Marguse Phloretin 28
Täiskasvanu hüpolaktaasia geneetiline taust Hüpolaktaasiaga korreleeruvad SNP-d Tishkoff et al. 2007 Enim on hüpolaktaasiaga seotud LCT 1390C>T, (rs4988235) C/C homosügootne genotüüp Kaasasündinud laktoositalumatust võivad põhjustada LCT geeni kodeeriva ala variandid 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 29
Diagnostika Vajalik neis riikdes, kus on ajalooliselt kasutatud rohkem piimatooteid Laktoosi toleantsuse test ( 50 g laktoosi= 1 l piim) Vajadusel biopsia peensoolest, mõõdetakse laktaasi ja sukraasi ning maltaasi aktiivsust ja laktaasi ja sukraasi suhet Laktoosi absorptsiooni määramine väljahingatavas õhus 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 30
Hüpolaktaasia geneetilised uuringud Eestis Lember M jt 2006. valim Lääne-Virumaalt Väike- Maarjast, 365 isikut Hüpolaktaasiaga seotud LCT 1390C>T, (rs4988235), C/ C genotüübi sagedus 24,8 ± 4,4% Esko T jt 2007, Eesti Geenivaramu valimi alusel (1090 isikut erinevatest maakondadest) LCT 1390C>T, (rs4988235) genotüüpide sagedused Eestis: C/C (hüpolaktaasiaga seotud) 28,3%, C/T (osalise hüpolaktaasiaga seotud) 50,2% ja T/T (laktoosi taluv) 21,5% 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 31
Hüpolaktaasia DNA uuringud LCT 1390C>T, (rs4988235) variandi määramine, meie laboris juurutatud 2007.a Põhineb PCR ja restriktsioonanalüüsil Analüüsi HK kood 66616 T/T 195 bp 167bp C/C 352 bp C/T Teistes laborites võimalik ka muude LCT geeni variantide määramine 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 32
Tänan tähelepanu eest! 28.8.09 ELMÜ 2009, Marguse 33