4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiini soolade vedelad koostised

4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiini soolade vedelad koostised TEHNIKAVALDKOND Selles leiutises käsitletakse vedelat ravimkoostist. TEHNIKA TASE Rahvusvahelises patenditaotluses (WO 03/029232) käsitletakse 4-[2-(4- metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiini ühendit (ühendit I) vaba alusena ja selle HCl liitumissoola. See ühend on väidetavalt serotoniini transporteri ja serotoniini retseptori 2C (-HT 2C ) inhibiitor ning kasulik, et ravida afektiivseid häireid, näiteks depressiooni ja ärevust. On leitud, et ühend I on samuti serotoniini retseptori 3 (-HT 3 ) ja serotoniini retseptori 2A (-HT 2A ) potentne antagonist, mistõttu võidakse ühendit I kasutada, et ravida mitmesuguseid seisundeid, kaasa arvatud valu ja kognitiivset puudulikkust. Selle farmakoloogilist profiili on käsitletud patendidokumendis WO 07/144006. Mitmete raviühendite puhul on tableti, kapsli, pilli vms neelamiseks mõeldud vormi suukaudne manustamine eelistatud manustamisviisiks. Kuid teatud patsientidel, eriti eakatel patsientidel, võib esineda raskusi neelamisel ning vedelikud võivad olla sobivaks alternatiiviks, kui soovitakse vältida tablettide, kapslite, pillide vms neelamist. Vedelik (lahus) võimaldab ka paindliku doseerimisrežiimi. Vedeliku mahu piiramiseks on tarvis toimeaine kõrget kontsentratsiooni lahuses, mis eeldab omakorda toimeaine kõrget lahustuvust. Leiutises käsitletakse ühendi I vedelaid koostisi. LEIUTISE KOKKUVÕTE Leiutajad on üllatuslikult avastanud, et 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)- fenüül]piperidiini DL-piimhappe liitumissool (DL-laktaat), glutaarhappe liitumissool (gluteraat), L-asparagiinhappe liitumissool (L-aspartaat) ja glutaamhappe liitumissool (glutamaat) on iseäranis lahustuvad. Seega käsitletakse leiutises vedelat koostist, mis sisaldab 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiini DL-

2 piimhappe liitumissoola, glutaarhappe liitumissoola, L-asparagiinhappe liitumissoola või glutaamhappe liitumissoola. Ühes teostusnäites käsitletakse leiutise soolade kasutust vedela koostiste tootmisel, mis on mõeldud teatud haiguste ravimiseks. Ühes leiutise teostusnäites käsitletakse leiutise soolade kasutamist teatud haiguste ravis, kusjuures nimetatud soolad on vedelas koostises. Ühes leiutise teostusnäites käsitletakse mahutit, mis sisaldab leiutise vedelat koostist ja on varustatud tilgutusseadmega. JOONISTE LOETELU Joonis fig 1: atsetüülkoliini tasemed prefrontaalses ajukoores ja ventraalses hipokampuses ühendi I manustamisel. Joonis fig 2: dopamiini tasemed prefrontaalses ajukoores ühendi I manustamisel. LEIUTISE DETAILNE KIRJELDUS Leiutises käsitletav valmistis on ravimkoostis. Näidete sektsiooni tabelis 2 on toodud 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)- fenüül]piperidiini erinevate soolade lahustuvus. Nagu andmete põhjal selgub, on DL-piimhappe, L-asparagiinhappe, glutaamhappe ja glutaarhappe liitumissooladel on iseäranis kõrge lahustuvus. Lihtsuse huvides nimetatakse neid sooli leiutise sooladeks. DL piimhapet teatakse ka DL-2-hüdroksüpropioonhappena ning see moodustab 1:1 happe liitumissoola 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiiniga, mida leiutises kasutatakse. Glutaarhapet teatakse ka kui 1,-pentaandioonhapet ja see moodustab 1:1 happe liitumissoola 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiiniga, mida leiutises kasutatakse.

3 L-asparagiinhape moodustab 1:1 happe liitumissoola 4-[-(4-metüülfenüülsulfanüül) fenüül]piperidiiniga, mida leiutises kasutatakse. Glutaamhape moodustab 1:1 happe liitumissoola 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül) fenüül]piperidiiniga, mida antud leiutises kasutatakse. 30 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiin võidakse valmistada, nagu käsitletud patendidokumendis WO 03/029232. Samuti võidakse 4-[2-(4- metüülfenüül-sulfanüül)fenüül]piperidiin valmistada, nagu kirjeldatud näidetes. Leiutise soolad võidakse valmistada sobiva happe lisamisega, millele järgneb sadestamine, mis tingitakse nt jahutamise, lahusti eemaldamise, teiste lahusti või vastava mikstuuri lisamise teel. Leiutise näited käsitlevad konkreetseid viise nende soolade saamiseks. Vedelad koostised võivad olla mõeldud suukaudseks või parenteraalseks manustamiseks. Parenteraalseks manustamiseks mõeldud vedelad koostised, milleks on näiteks infusioonilahused, on mitmes mõttes sarnased teiste vedelate koostistega, olles aga lisaks steriilsed ja isotoonilised. Leiutise suukaudseks manustamiseks mõeldud vedelad koostised võivad olla siirupi, eliksiiri, lahuse, suspensiooni või kontsentreeritud koostise kujul. Nende manustamisvormide üheks eeliseks on asjaolu, et patsient ei pea tahket vormi alla neelama, mis võib osutuda raskeks, eriti eakate või suu- või kurgutraumadega patsientide puhul. Siirupid ja eliksiirid on tavaliselt magustatud, maitsestatud vedelikud, mis sisaldavad toimeainet. Siirupite suhkrusisaldus on reeglina kõrge ja eliksiirid sisaldavad sageli ka alkoholi. Suukaudne lahus on toimeaine lahus. Suspensioon on kahefaasiline süsteem, mis sisaldab tahkeid osakesi, mis on lahuses dispergeeritud. Siirupite, eliksiiride, suukaudsete lahuste või suspensioonide manustamine hõlmab tavaliselt suhteliselt suurtes kogustes, s.o -0 ml vedeliku sisse võtmist. Seevastu mõõdetakse leiutise kontsentreeritud suukaudsete koostiste manustamiseks patsiendile välja eelnevalt määratud doos, kasutades mahuti sobivat etteandurit (jaoturit), lisades saadud doosi vedelikuga (nt veega, mahlaga

30 4 vms) klaasi, millest patsient selle sisse joob. Mugavuse huvides on väljamõõdetav kogus väike, nt väiksem kui 2 ml, väiksem kui 1 ml, väiksem kui 0, ml. Konkreetses teostusnäites manustatakse leiutise kontsentreeritud suukaudseid koostisi patsiendile, mõõtes välja eelnevalt määratud arvul nimetatud koostise tilku vastavast etteandurist, nt tilgutusseadmega varustatud anumast, viies tilgad vedelikuga (nt veega, mahlaga vms) klaasi, milles patsient vedeliku sisse joob. Antud kontekstis on tilgutusseade anumaga kaasas, et saada vedelik sellest eraldiseisvate tilkadena kätte. Leiutise soolade kontsentratsioon kontsentreeritud suukaudsetes koostistes on määratud tilkade arvuga (või mahuga), mida soovitakse koguda, ja soolade kogusena, mida soovitakse manustada. Üldiselt mõistetakse, et ca - tilga välja mõõtmine on optimaalne kompromiss nii ravi ohutuse/efektiivsuse kui ka mugavuse seisukohast. Kui leiutise soolade kontsentratsioon on liiga kõrge, s.o kui välja mõõdetakse vaid väike arv tilkasid, võib see pärssida ravi ohutust või efektiivsust. Väikese arvu tilkade korral suurendavad üks või mitu tilka soovitust rohkem või vähem oluliselt manustatava doosi ebakindlust. Teisalt kui leiutise soolade kontsentratsioon on liiga madal, on väljamõõdetavate tilkade arv kõrge, mis on aga patsiendile või hooldajale ebamugav. Kui leiutise soolade päevadoos on mg, valmistatakse sobivalt kontsentreeritud suukaudne koostis, mis sisaldab mg toimeainet ml kohta. Kontsentratsioon mg ml kohta ja tilkade arv tilka ml kohta võimaldab mg doosi korral manustada tilka. Kui leiutise soolade päevadoos on mg, võib valmistada kontsentreeritud suukaudse koostise, mis sisaldab mg toimeainet ml kohta. Kontsentratsioon mh ml kohta ja tilkade arv tilka ml kohta võimaldab mg doosi korral manustada tilka. Kui leiutise soolade päevadoos on mg, võidakse valmistada kontsentreeritud suukaudne koostis, mis sisaldab mg toimeainet ml kohta. Kontsentratsioon mg ml kohta ja tilkade arv tilka ml kohta võimaldab mg doosi korral manustada tilka.

Kui leiutise ühendite päevadoos on mg, võidakse valmistada kontsentreeritud suukaudne koostis, mis sisaldab 40 mg toimeainet ml kohta. Kontsentratsioon 40 mg ml kohta ja tilkade arv tilka ml kohta võimaldab mg doosi korral manustada tilka. Kui leiutise ühendite päevadoos on 30 mg, võidakse valmistada kontsentreeritud suukaudne koostis, mis sisaldab 60 mg toimeainet ml kohta. Kontsentratsioon 60 mg ml kohta ja tilkade arv tilka ml kohta võimaldab 30mg doosi korral manustada tilka. Kui leiutise ühendite päevadoos on 40 mg, võidakse valmistada kontsentreeritud suukaudne koostis, mis sisaldab 80 mg toimeainet ml kohta. Kontsentratsioon 80 mg ml kohta ja tilkade arv tilka ml kohta võimaldab 40mg doosi korral manustada tilka. Kui leiutise ühendite päevadoos on 0 mg, võidakse valmistada kontsentreeritud suukaudne koostis, mis sisaldab 0 mg toimetainet ml kohta. Kontsentratsioon 0 mg ml kohta ja tilkade arv tilka ml kohta võimaldab 0mg doosi korral manustada tilka. Ühes leiutise teostusnäites manustatakse leiutise kontsentreeritud suukaudset tilkade valmistist vastavast mahutist süstlalaadse doseerimisseadmega. Selliseid manustamisvahendeid on käsitletud muuhulgas patendidokumentides WO 03/0608, US 04/0186431 ja US 03-089743. Need seadmed sisaldavad leiutise kontsentreeritud suukaudset koostist suletud kambris, nt padrunis, ja on varustatud vahenditega, et saada mahutist kätte kontsentreeritud suukaudse lahuse mõõdetud kogus. Et piirata seadme suurust, on kontsentreeritud suukaudse lahuse maht väike (0,01-1 ml), mis omakorda eeldab, et soolad oleksid kõrgelt lahustuvad. Need sule- või süstlalaadsed doseerimisseadmed on patsiendile mugavad, sest neid on võimalik kanda nt rinnataskus, ja sobiva kujuga, mis aitab varjata, et tegemist on ravimi jaoturiga. Kui leiutise soolade päevadoosid jäävad vahemikku kuni mg, võidakse valmistada kontsentreeritud suukaudne koostis, mis sisaldab 0 mg toimeainet

6 ml kohta. See tähendab, et 0,0 ml manustatakse mg doosi korral ja 0,1 ml manustatakse mg doosi korral. 30 Kui leiutise ühendite päevadoosid jäävad vahemikku kuni 0 mg, võidakse valmistada kontsentreeritud suukaudne koostis, mis sisaldab 0 mg toimeainet ml kohta. See tähendab, et mg doosi korral manustatakse 0,1 ml ja 0mg doosi korral 0, ml. Seega sisaldavad leiutise kontsentreeritud suukaudsed koostised leiutise sooli ligikaudu -0 mg/ml. Konkreetseteks näideteks on ligikaudu -0 mg/ml, ligikaudu -0 mg/ml, ligikaudu 0-0 mg/ml, ligikaudu -80 mg/ml, ligikaudu 30-70 mg/ml ja ligikaudu,, 30, 40, 0, 60, 70, 80, 90 või 0 mg/ml. Ühes leiutise teostusnäites sisaldab leiutise suukaudselt manustatav tilkade koostis vähemalt mg/ml leiutise sooli. Ühes teostusnäites sisaldab leiutise suukaudne tilkade koostis vähemalt mg/ml leiutise sooli. Ühes teostusnäites sisaldab leiutise suukaudne tilkade koostis vähemalt mg/ml leiutise soola. Ühes teostusnäites sisaldab leiutise suukaudne tilkade koostis vähemalt 30 mg/ml leiutise soola. Ühes teostusnäites sisaldab leiutise suukaudne tilkade koostis vähemalt 0 mg/ml leiutise soola. Ühes teostusnäites sisaldab leiutise suukaudne tilkade koostis vähemalt 80 mg/ml leiutise soola. Lisaks leiutise sooladele võivad leiutise suukaudsed lahused, eriti kontsentreeritud suukaudsed koostised sisaldada ka lahusteid, puhvreid, pindaktiivseid aineid, pindpinevuse regulaatoreid, viskoossuse regulaatoreid, säilitusaineid, antioksüdante, värvaineid, maitse maskeerijaid, maitse- ja lõhnaaineid jne. Lahustiteks on muuhulgas vesi ja teised lahustid, mis segunevad veega või solubiliseerivate ainetega ja sobivad suukaudseks manustamiseks. Sobivateks lahustiteks on muuhulgas etanool, propüleenglükool, glütserool, polüetüleenglükoolid, poloksameerid, sorbitool, bensüülalkohol. Toimeaine veeslahustuvuse parandamiseks võidakse lahusele lisada farmatseutiliselt vastuvõetav kaaslahusti, tsüklodekstriin või selle derivaat. Puhversüsteemi võidakse kasutada koostise ph hoidmiseks optimaalses vahemikus. Puhversüsteem on sobivates kogustes nõrkade hapete, nt äädik-,

7 fosfor-, merevaik-, viin-, piim- või sidrunhapete ja nende konjugaadi aluse mikstuur. Ideaaljuhul on puhversüsteemil piisav võime jääda soovitud ph vahemikku, kui seda lahjendatakse neutraalse, mõneti happelise või mõneti aluselise joogiga. Pindaktiivsed ained on ained, mis lahjendavad toimeühendeid, mis ei ole vesikeskkonnas piisavalt lahustuvad, moodustades tavaliselt mitselle. Eelistatavalt on kasutatud pindaktiivsed ained väiksema toksilisuse tõttu mitte-ioonsed. Pindaktiivsete ainete kõrged kontsentratsioonid võimaldavad lahjendamist manustamisel sadestamata. Pindaktiivsete ainete näideteks on muuhulgas nn Tween ja Span ühendid, mono- ja diglütseriidid. Pindpinevuse regulaatoreid kasutatakse, kui soovitakse kohandada suukaudsete tilkade koostiste tilkade arvu. Pindpinevuse regulaatoriks on näiteks etanool, mis vähendab pindpinevust ja suurendab tilkade arvu. Viskoossuse regulaatorid kaasatakse, et reguleerida kontsentreeritud suukaudse koostise tilgutamise kiirust. Kui koostist mõõdetakse tilkadena välja tilgutamisseadmega varustatud anumast, on tilgutamise kiirus mitte kõrgem kui 2 tilka sekundi kohta. Viskoossuse regulaatorite näideteks on muuhulgas etanool, hüdroksüetüültselluloos, karboksümetüültselluloos naatrium, metüültselluloos, polüvinüülalkohol, polüvinüülpürrolidoon, polüetüleenglükool ja glütseriin. Säilitusaineid võidakse lisada, et takistada mikroorganismide, nt bakterite, pärmide ja seente kasvu vedelates koostistes, mida tõenäoliselt korduvalt kasutatakse. Sobivad säilitusained on farmatseutiliselt vastuvõetavad, füüsikalis-keemiliselt stabiilsed ja efektiivsed soovitud ph vahemikus. Säilitusaineteks on muuhulgas etanool, bensoehape, sorbhape, metüülparabeen, propüülparabeen ja bensüülalkohol. Et raviaine on keemilise lagunemise suhtes lahustunult tundlikum kui tahkel kujul, võidakse vedelasse koostisesse kaasata ka antioksüdant. Antioksüdantide näideteks on muuhulgas propüülgallaat, askorbüülpalmitaat, askorbiinhape, naatriumsulfit, sidrunhape ja EDTA.

30 8 Teatud koostistes võidakse kasutada värvaineid, et anda saadustele ühtlane välimus. Teatud toimeained võivad valguse suhtes olla väga tundlikud, mistõttu võib olla vajalik lisada tilkade koostistele värvained, et kaitsta neid stabiliseerimise eesmärgil valguse eest. Sobivateks värvaineteks on muuhulgas tartrasiin ja päikeseloojangukollane. Magusained võivad maskeerida teatud koostiste ebameeldivat maitset või andma koostisele soovitud maitse. Magusaineteks on muuhulgas sahhariin, sahhariini naatriumsool, glükoos, sorbitool, glütserool, atsesulfaamkaalium ja dihüdrokalkoon-neohesperidiin. Maitset võidakse veelgi optimeerida, lisades ühe või mitu maitse- või lõhnaainet. Sobivateks maitse- või lõhnaaineteks on puuvilja maitseained, nt kirsi, vaarika, mustsõstra, sidruni või maasika lõhna- ja maitseained või muud lõhna- ja maitseained, nt lagrits, aniis, piparmünt, karamell jne. Kontsentreeritud suukaudse koostise näideteks, mida manustatakse tilgutusseadme abil, on (4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)-fenüül]piperidiin = ühend I) 0,73% ühend I glutaraat, mis vastab 0,% ühendi I vabale alusele vett, et saada koostiseks 0% 1,8% ühend I glutamaat, mis vastab 1% ühendi I vabale alusele 0,08% metüülparahüdroksübensoaat 0,02% propüülparahüdroksübensoaat vett, et saada kokku 0% 2,94% ühendi I L-aspartaat, mis vastab 2% ühendi I vabale alusele 0,08% metüülparahüdroksübensoaat 0,02% propüülparahüdroksübensoaat 7% etanool vett, et saada kokku 0%,4 ühendi I DL-laktaat, mis vastab 8% ühendi I vabale alusele 0,08% metüülparahüdroksübensoaat 0,02% propüülparahüdroksübensoaat vett, et saada kokku 0%

9 Kontsentreeritud suukaudse koostise näiteks, mida võidakse manustada süstlalaadse seadmega, järgmine: 26,36% ühendi I DL-laktaat, mis vastab % ühendi I vabale alusele 0,08% metüülparahüdroksübensoaat 0,02% propüülparahüdroksübensoaat vett, et saada kokku 0%. Leiutise soolade farmatseutiliselt profiili on käsitletud näidetes. Üldjoontes on leiutise soolad serotoniini transporteri ja serotoniini retseptori 2C (-HT 2C ) 30 inhibiitorid ja serotoniini retseptori 3 (-HT 3 ), serotoniini retseptori 2A (-HT 2A ) ja α 1 adrenergilise retseptori antagonistid ning need tingivad atsetüülkoliini rakuvälise taseme kasvu prefrontaalses ajukoores ja ventraalses hipokampuses ning dopamiini taseme kasvu prefrontaalses ajukoores. Lisaks on leiutise soolad efektiivsed valu ravimises, nagu näidetes kirjeldatud. Leiutise soolade kliinilise kasulikkus kajastub selle farmakoloogilises profiilis ja eelkliinilistes andmetes. Niisiis on leiutise soolad arvatavalt kasulikud, et ravida haigusi, kaasa arvatud meeleoluhäireid, tõsist depressiivset häiret, üldist ärevushäiret, atüüpilist depressiooni, bipolaarset depressiooni, sotsiaalset ärevushäiret, obsessiivkompulsiivset häiret, paanikahäiret, traumajärgse stressi häiret, ainete kuritarvitamist, toitumishäiret, unehäiret, Alzheimeri tõbe, dementsust, kroonilist valu, kognitiivse puudulikkusega seotud depressiooni, psühhoosiga seostatud depressiooni, skisofreeniaga kaasnevat kognitiivset puudulikkust, valuga seotud depressiooni või ärevust, käitumuslikke häireid eakatel, ADHDi, raviresistentset melanhoolset depressiooni ja jääksümptomitega depressiooni. -HT 2C retseptorid paiknevad nt dopamiinergilistel neuronitel, kus nende aktiveerimine avaldab toonilist inhibeerivat toimet dopamiini vabastusele, kusjuures -HT 2C antagonistid tingivad dopamiini taseme tõusu. Näidetes esitatud andmed näitavad, et ühend I tingib tõepoolest rakuvälise dopamiini taseme tõusu ajus. Selle põhjal võib püstitada hüpoteesi, et -HT 2C antagonistid sobivad eriti hästi depressiooni raviks, mis on selektiivsete serotoniini taasseondamise inhibiitorite teraapia suhtes refraktoorne. Seda hüpoteesi toetavad mitmed kliinilised uuringud, milles demonstreeritakse mirtasipiini ja SSRI kombinatsiooni paremust üksi kasutatavast SSRIst, et ravida ebaadekvaatse kliinilise vastusega

depressioonis patsiente (raviresistentne depressioon, lühendina TRD treatment resistant depression, või refraktoorne depressioon) [Psychother. Psychosom., 7, 139-3, 06]. Mirtasapiin on ka -HT 2 ja -HT 3 antagonist, mis näitab, et ühendid, mis inhibeerivad serotoniini taasseondamist, kombineerituna -HT2 ja - HT3 antagonismiga, nt ühendiga I, on kasulikud, et ravida raviresistentset depressiooni, s.o tõsta TRD patsientide remissiooni kiirust. Näidetes esitatud andmed näitavad, et ühend I tõstab atsetüülkoliini rakuvälist taset ajus. Kliinilised katsed on järjepidevalt näidanud, et atsetüülkoliini tasemete tõstmine ajus on moodus Alzheimeri tõve ja kognitiivse puudulikkuse ravimiseks üldiselt, kasutades atsetüülkoliini esteraasi inhibiitoreid Alzheimeri tõve ravis. Selle taustal arvatakse, et ühend I on kasulik Alzheimeri tõve, kognitiivse puudulikkuse ja meeleoluhäirete, nt Alzheimeri ja kognitiivse puudulikkusega seotud depressiooni ravis. Teatud osa depressioonis patsientidest vastab nt SSRI ravile selles osas, et parandatakse kliiniliselt olulisi depressiooni punkte, nt MADRD ja HAMDi, kuid teised sümptomid, nt unehäired ja kognitiivne puudulikkus ei kao. Leiutise kontekstis nimetatakse neid patsienti osalisteks reageerijateks, kes kannatavad jääksümptomitega depressiooni all. Tänu eespool käsitletud toimetele atsetüülkoliini tasemetele eeldatakse, et ühend I on lisaks depressioonile kasulik kognitiivse puudulikkuse ravis. Kliinilised uuringud on näidanud, et ühend prasosiin, mis on α-1 adrenergilise retseptori antagonist, vähendab unehäireid [Raskind, Biol. Psychiatry, 06, ajakirjanduses]. Enamgi veel, arvatakse, et leiutise ühendite -HT 2A ja -HT 2C antagonismil on uinutav, und parandav toime [Neuropharmacol, 33, 467-471, 1994], mistõttu on leiutise ühendid kasulikud osaliste reageerijate ravis (jääksümptomitega depressioon), s.o depressioonis patsientide ravi ühendiga I vähendab osaliste reageerijate hulka. Leiutise ühendit võidakse manustada ligikaudses koguses 0,001 kuni 0 mg kehakaalu kg kohta päevas. 30 Tüüpiline suukaudselt manustatav doos jääb ligikaudsesse vahemikku 0,001 kuni 0 mg kehakaalu kg kohta päevas, eelistatavalt 0,01 kuni 0 mg kehakaalu kg kohta päevas, mida manustatakse ühe või mitme annusena, nt 1 kuni 3 annusena.

11 Täpne doos sõltub manustamise sagedusest ja viisist, ravitava patsiendi soost, vanusest, kaalust ja üldisest tervislikust seisundist, ravitava seisundi olemusest ja tõsidusest, kaasnevatest ravitavatest haigustest ning teisteks teguritest, mis on valdkonna spetsialistide pädevuses. 30 Täiskasvanute tüüpiline suukaudne doos jääb vahemikku 1 kuni 0 mg leiutise ühendit päevas, nt 1-30 mg päevas või - mg päevas. Doseerimiseks manustatakse 0,1 kuni 0 mg, nt 1- mg, nt 1,,,,,, 30, 40, 0 või 60 mg leiutise ühendit üks või kaks korda päevas. Käesolevas kasutatud termin ühendi terapeutiliselt efektiivne kogus tähendab kogust, mis on piisav, et ravida, leevendada või osaliselt pidurdada teatud haiguse ja selle komplikatsioonide kliinilisi ilminguid terapeutilises sekkumises, mis hõlmab nimetatud ühendi manustamist. Selle saavutamiseks adekvaatne kogus ongi terapeutiliselt efektiivne kogus. See termin hõlmab ka koguseid, mis on piisavad, et ravida, leevendada või osaliselt pidurdada teatud haiguse ja selle komplikatsioonide kliinilisi ilminguid ravis, mis hõlmab nimetatud ühendi manustamist. Efektiivsed kogused konkreetseks rakenduseks sõltuvad haigusi või vigastuse tõsidusest, samuti subjekti massist ja üldisest tervislikust seisundist. Mõistetakse, et sobiva koguse määramiseks kasutatakse rutiinseid katseid, konstrueerides väärtuste maatriksi ja testides erinevaid punkte selles maatriksis, mis on raviarsti pädevuses. Käesolevas kasutatud terminid ravi ja ravimine tähendavad patsiendi hooldust ja tema seisundi ohjamist, et vastava haiguse või häirega võidelda. See termin hõlmab teatud seisundi, mille all patsient kannatab, igasugust ravi, nt toimeaine manustamist sümptomite või komplikatsioonide leevendamist, et pidurdada haiguse, häire või seisundi progressiooni, leevendada või kergendada sümptomeid ja komplikatsioone ja/või ravida või kõrvaldada haigus, häire või seisund, et ennetada seisundit, millise ennetuse all mõeldakse patsiendi hooldust haiguse, seisundi või häirega võitlemiseks, ja mis hõlmab toimeühendite manustamist, et ennetada sümptomite või komplikatsioonide välja kujunemist.

12 Sellest hoolimata on profülaktiline (ennetav) ja terapeutiline (raviv) ravi leiutise kaks eri aspekti. Ravitavaks patsiendiks on eelistatavalt imetaja, eriti inimene. 30 Ühes leiutise teostusnäites käsitletakse leiutise soola kasutust, et toota vedelat koostist ravimaks haigust, mis valitakse rühmast, milles sisalduvad meeleoluhäired, tõsine depressiivne häire, üldine ärevushäire, atüüpiline depressioon, bipolaarne depressioon, sotsiaalne ärevushäire, obsessiivkompulsiivne häire, paanikahäire, traumajärgse stressi häire, ainete kuritarvitamine, toitumishäire, unehäire, Alzheimeri tõbi, dementsus, krooniline valu, kognitiivse puudulikkusega seotud depressioon, psühhoosiga seotud depressioon, skisofreenia kognitiivne puudulikkus, valuga seotud depressioon ja ärevus, käitumuslikud häired eakatel, ADHD, melanhoolia, raviresistentne depressioon või jääksümptomitega depressioon. Ühes teostusnäites on nimetatud vedelaks koostiseks kontsentreeritud suukaudne koostis. Ühes teostusnäites käsitletakse leiutise sooli, mida kasutatakse, et ravida haigust, mis valitakse rühmast, milles sisalduvad meeleoluhäired, tõsine depressiivne häire, üldine ärevushäire, atüüpiline depressioon, bipolaarne depressioon, sotsiaalne ärevushäire, obsessiiv-kompulsiivne häire, paanikahäire, traumajärgse stressi häire, ainete kuritarvitamine, toitumishäire, unehäire, Alzheimeri tõbi, dementsus, krooniline valu, kognitiivse puudulikkusega seotud depressioon, psühhoosiga seotud depressioon, skisofreenia kognitiivne puudulikkus, valuga seotud depressioon ja ärevus, käitumuslikud häired eakatel, ADHD, melanhoolia, raviresistentne depressioon või jääksümptomitega depressioon, kusjuures nimetatud sool sisaldub vedelas koostises. Ühes teostusnäites on nimetatud vedel koostis kontsentreeritud suukaudne tilkade koostis. Leiutise sooli võidakse manustada üksi või kombineerituna teiste terapeutiliselt aktiivse ühendiga, kusjuures neid kaht ühendit võidakse manustada nii samaaegselt kui ka järjestikuliselt. Leiutises kasulikud terapeutiliselt aktiivseteks ühenditeks, mis võidakse kombineerida ühendiga I, on muuhulgas rahustid ja hüpnootilised ained, nt bensodiasepiinid, antikonvulsandid, nt lamotrigiin, valproiinhape, topiramaat, gabapentiin, karbamasepiin; meeleolu stabilisaatorid, nt liitium; dopaminergilised ravimid, nt dopamiini agonistid ja L-Dopa, ravimid ADHD ravimiseks, nt atomoksetiin, psühhostimulandid, nt modafiniil, ketamiin,

13 metüülfenidaat ja amfetamiin; teised antidepressandid, nt mirtasapiin, mianseriin ja buproprioon, hormoonid, nt T3, östrogeen, DHEA ja testosteroon; atüüpilised antipsühhootikumid, nt olansapiin ja aripiprasool; tüüpilised antipsühhootikumid, nt haloperidool; ravimid Alzheimeri tõve ravimiseks, nt kolinesteraasi inhibiitorid ja memantiin, folaat; S-adenosüül-metioniin; immuunmodulaatorid, nt interferoonid; opiaadid, nt buprenorfiinid; angiotensiin II retseptori I antagonistid (AT1 antagonistid); ACE inhibiitorid; statiinid; ja alfa 1 adrenergiline antagonist, nt prasosiin. Leiutise kontekstis hõlmavad viited ainsusele ka mitmust ja vastupidi, kui pole selgelt märgitud teisi või kui kontekstist ei tulene teisiti. Näiteks mõistetakse ühendi all erinevaid leiutise ühendeid või konkreetset kirjeldatud aspekti, kui pole teisiti märgitud. Kui pole teisiti märgitud, tähistavad konkreetsed käesolevas toodud väärtused vastavaid ligikaudseid väärtusi (nt mõistetakse, et kõik täpsed näidisväärtused teatud faktori või mõõtmise kohta hõlmavad ka vastavaid ligikaudseid mõõtmisi, millele on viidatud sobivalt kui ligikaudsetele ). Kui leiutise mis tahes teostusnäites kasutatakse teatud elemendi või elementidega seoses verbe hõlmama, omama, kaasa arvama või sisaldama, toetavad nad leiutise sarnast aspekti või aspekte, mis koosneb, koosneb sisuliselt või hõlmab sisuliselt, kui konkreetne element või elemendid, kui pole märgitud või kui kontekstist ei tulene selgelt teisiti (nt mõistetakse, et koostis, mis sisaldab konkreetset elementi, on samaväärne kui koostis, mis koosneb sellest elemendist, kui pole märgitud või kui kontekstist ei tulene teisiti). NÄITED Näide 1. Farmakoloogiline profiil Näide 1A. Serotoniini (-HT) ja norepinefriini (NE) taasseondamise inhibiitor Testühendi alikvoote ja roti kortikaalse sünaptosoomi koostist eelinkubeeritakse minutit temperatuuril 37 C, misjärel lisatakse [ 3 H]NE või [ 3 H]-HT (lõplik kontsentratsioon nm). Mittespetsiifiline seondamine määratakse µm

14 talsupraami või tsitalopraami kohalolekul ning koguseondamine määratakse puhvri juuresolekul. Alikvoote inkubeeritakse minutit temperatuuril 37 C. Pärast inkubeerimist sünaptosoomide üles võetud [ 3 H]NE või [ 3 H]-HT eraldatakse filtreerides läbi Unifilter GF/C, mida on eelnevalt immutatud 0,1% PEI-ga 30 minutit, kasutades Tomtec Cell Harvester programmi. Filtreid pestakse ja loetakse Wallac MicroBeta lugejas. NET programmis on ühendi I IC 0 väärtus 23 nm. SERT korral on ühendi I IC 0 väärtus 8 nm. Näide 1B. -HT 2A antagonism 30 Ühendit I testitakse serotoniini retseptorite afiinsuste suhtes ja leiti, et sel on antagonistlik profiil afiinsusega -HT 2A retseptorite suhtes (K i 4 nm). Afiinsus arvutatakse valemist Y = 0/1 + (X-logIC 0 ) ), kus Y on sidumise % ja X on ühendi kontsentratsioon. IC 0 väärtuse arvutamiseks kasutatakse viit ühendi kontsentratsiooni (1,, 30, 0, 00 nm). Afiinsus määratakse MDL Pharmaservices kataloogi numbriga 27160. Inimese -HT 2A retseptoreid ekspresseerivates imetajarakkudes on ühendil I konkureerivad antagonistlikud omadused. Ühend seondub -HT 2A retseptoritega Ki väärtusel < 0 nm ja funktsionaalses testis antagoniseerivad ühendid -HT tekitatud Ca 2+ vabastust rakusisestest ladudest Kb 67 nm. Schild analüüs näitab konkureerivat antagonismi KB väärtusel 0 nm. See katse viiakse läbi järgmiselt. 2 või 3 päeva enne katset viiakse CHO rakud, mis ekspresseerivad 0 fmol/mg inimese -HT 2A retseptoreid, plaatidele tihedusel, mis on piisav, et saada katsepäevaks monokonfluentne kiht. Rakke töödeldakse värviga (Ca 2+ komplekt, Molecular Devices) 60 minutit temperatuuril 37 C % CO 2 inkubaatoris niiskusel 9%. Põhilist fluorestsentsi jälgitakse fluoromeetrilise pilditehnika plaadi lugejaga või FLIPR384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) kiirguslainepikkusel 488 nm ja emissioonivahemikus 00 kuni 60 nm. Laseri intensiivsus seatakse sobivalt tasemele, et saada põhiväärtused ca 8000-000 fluorestsentsi ühikut. Põhilise fluorestsentsi varieerumine peaks olema väiksem kui %. EC 0 väärtuste saamiseks kasutatakse kasvavates

kontsentratsioonides testühendit, kattes vähemalt 30 kümnendit. pa2 väärtuste saamiseks testitakse -HT täisdoosi vastuse kõveraid neljas eri kontsentratsioonis ühendiga (0, 400, 00 ja 4000 nm). Kb väärtused saadakse, testitakse testühendite 2 dekaadi kontsentratsioone -HT väärtuse EC 8 suhtes. Testühendid lisatakse rakkudele minutit enne -HT. K i väärtuste arvutamiseks kasutatakse Cheng-Prusoff võrrandit. Näide 1C: -HT 3A retseptori antagonism 30 Ootsüütides, mis ekspresseerivad inimese homomeerset -HT 3A retseptoreid, aktiveerib -HT vood EC 0 väärtusega 2600 nm. Seda voogu saab antagoniseerida klassikaliste -HT 3 antagonistidega, nt ondansetrooniga. Ondansetrooni K i väärtus on selles süsteemis allpool 1 nm. Ühend I avaldab potentset antagonismi madalates kontsentratsioonides (0,1 nm 0 nm) (IC 0 ~ nm/kb ~ 2 nm) ja agonistlikke omadusi, kui seda rakendatakse kõrgemates kontsentratsioonides (0 0 000 nm) (EC 0 ~ 2600 nm), saavutades maksimaalse voo ca 70-80% maksimaalsest voost, mida tekitab -HT ise. Ootsüütides, mis ekspresseerivad -HT 3A retseptoreid, aktiveerib -HT vooge EC 0 väärtusega 3,3 µm. Katsed viiakse läbi järgmiselt. Ootsüüdid eemaldatakse kirurgiliselt täiskasvanud emastest Xenepus laevis est, keda on tuimestatud 0,4% MS-222 kuni minutit. Ootsüüte seeditakse seejärel toatemperatuuril 2-3 tundi 0, mg/ml kollagenaasiga (tüüp IA Sigma-Aldrich) OR2 puhvris (82, mn NaCl, 2,0 mm KCI, 1,0 mm MgCl 2 ja,0 mm HEPES, ph 7,6). Ootsüüdid, mis folliikuli kihti ei sisalda, eraldatakse ja neid inkubeeritakse 24 tundi modifitseeritud Barthi saliinipuhvris [88 mm NaCl, 1 mm KCl, mm HEPES, 2,4 mm NaCHO 3, 0,41 mm CaCl 2, 0,82 mm MgSO 4, 0,3 mm Ca(NO 3 ) 2 ], millele on lisatud 2 mm naatriumpüruvaati, 0,1 U/I penitsilliini ja 0,1 µg/l streptomütsiini. IV-IV faasi ootsüüdid identifitseeritakse ja süstitakse 12-48 nl nukleaasivaba veega, mis sisaldab 14-0 pg crnad, mis kodeerib inimese -HT3A retseptoreid, ja neid inkubeeritakse temperatuuril 18 C, kuni neid kasutatakse elektrofüsioloogilisteks salvestusteks (1-7 päeva pärast süstimist). Ootsüüdid, mis ekspresseerivad inimese -HT3 retseptoreid, viiakse 1ml vanni ja perfuseeritakse Ringeri puhverlahusega (1 mm NaCl, 2, mm KCl, mm HEPES, 1,8 mm CaCl 2, 0,1 mm MgCl 2, ph 7,). Rakud aetakse agariga kaetud 0,-1 MΩ elektroodidele, mis

16 sisaldavad 3M KCl, ja haaratakse pinge abil -90 mv juures GeneClamp 00B võimendisse. Ootsüüte perfuseeritakse pidevalt Ringeri lahusega ja ravimeid rakendatakse perfusaadis. -HT agonisti lahuseid rakendatakse -30 sekundit. - HT3 retseptori antagonistide potentsi uurimiseks mõõdetakse kontsentratsiooni vastus µm -HT stimuleerimisele. Näide 1D. α 1A retseptori antagonism Ühendit I testiti afiinsuste suhtes α 1A retseptori suhtes ja leiti, et sel on antagonistlik profiil keskmise afiinsusega α 1A retseptorite suhtes (K i = 34 nm). Katsete päeval membraanid (membraani koostisi on kirjeldatud allpool) sulatatakse ja homogeniseeritakse puhvris, kasutades Ultra-Turrax seadet, ja lahjendatakse soovitud kontsentratsioonile ( µg/auk ~ µg/900 µl, hoitakse jääl kasutuseni). Katsete käivitamiseks segatakse 0 µl testühendit, 0 µl [ 3 H]-prasosiini ja 900 µl membraanidega ning saadud segu inkubeeritakse minutit temperatuuril C. Mitte-spetsiifiline sidumine määratakse µm WB-41 juuresolekul ning kogu seostumine määratakse puhvri kohalolekul. Pärast inkubeerimist eraldatakse seotud ligand sidumata ligandist, filtreerides läbi Unifilter Gf/B, mida on eelnevalt immutatud 0,1% PEI 30 minutit, kasutades Tomtec Cell Harvester programmi (D4.2.4) 96 augus. Filtreid pestakse 3 korda 1 ml jääkülma puhvriga, kuivatatakse temperatuuril 0 C ja filtritele lisatakse 3 µl stsintsillatsiooni vedelikku. Seotud radioaktiivsus loetakse Wallac OY 140 MicroBeta seadmes. Afiinsus arvutatakse võrrandist Y = 0/(1 + ( X-logIC 0 ) ), kus Y tähistab protsentuaalset sidumist ja X ühendi kontsentratsiooni. Kaht dekaadi katvaid ühendi kontsentratsioone kasutatakse IC 0 väärtuse arvutamiseks. Ki arvutatakse Cheng Prusoff võrrandist: Ki = (IC 0 /(1 + ([L]/Kd)). Funktsionaalses testis antagoniseerivad leiutise ühendid adrenaliini tekitatud Ca 2+ vabastust rakusisestest varudest ja see test näitab, et need ühendid on antagonistid. Katsed viidi sisuliselt läbi, nagu kirjeldatud allpool.

17 Kõiki rakke kasvatatakse DMEM söötmes, millele on lisatud % BCs, 4 mm L- glutamiini (või 2 mm COS-7) ja 0 ühikut ml kohta penitsilliini ja 0 µg/ml streptomütsiini, temperatuuril 37 C % CO 2 all. 24 tundi enne teste külvatakse CHO rakud, mis ekspresseerivad inimese alfa 1A-7 retseptoreid, 384-augulistele mustade seintega mikrotiitri plaatidele, mis on kaetud polü-d-lüsiiniga. Söödet aspireeritakse ja rakud laetakse värvi ja 1, µm Fluo-4-ga testpuhvris, mis koosneb Hanki tasakaalustatud soolalahust (138 mm NaCl, mm KCl, 1,3 mm CaCl 2, 0, mm MgCl 2, 0,4 mm MgSO 4, 0,3 mm KH 2 PO 4, 0,3 mm Na 2 HPO 4,,6 mm glükoosi) ja mm HEPES ph 7,4, 0,0% BSA ja 2, mm probenitsiidi (0 µl/auk) 1 tund % CO 2 temperatuuril 37 C. Kui ülemäärane värv eemaldatakse, pestakse rakke testpuhvriga ja kihitatakse lõppmahule, mis on võrdne 4 µl/auk (või 30 µl/auk antagonisti testiks). Antagonisti hingamisel lisatakse siinkohal antagonist või tugiaine µl alikvoodina puhvrit sisaldavad 4% DMSO söötmes 4-kordsele lõppkontsentratsioonile (lõplik DMSO = 1%), millele järgneb minutit inkubeerimist. Põhilist fluorestsentsi jälgitakse fluoromeetrilise pilditehnika plaadilugejas või FLIPR TM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) kiiruslainepikkusel 488 nm ja emissioonivahemikus 00 kuni 60 nm. Laseri intensiivsust reguleeritakse nii, et põhilise fluorestsentsi näidud olid ca 8000 fluorestsentsühikute (RFU) suhtes. Rakke stimuleeriti seejärel toatemperatuuril agonistidega, mida on lahjendatud testpuhvris ( µl), ja RFU mõõdeti 1,- sekundiliste intervallidega 2,-minutilise perioodi vältel. Maksimaalne fluorestsentsi muutus arvutati iga raku kohta. Kontsentratsiooni-vastuse kõveraid, mis tuletati fluorestsentsi maksimaalsest muutusest, analüüsiti mittelineaarses regressioonis (Hilli võrrand). Antagonismi määramisel lisati minutit pärast ühendi inkubeerimist (nagu kirjeldatud eespool) kindlas kontsentratsioonis standardset agonisti serotoniini. Näide 2A: 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiin, HBr sool 2-(4-tolüülsulfanüül)-fenüülbromiid 30 Segatud, lämmastikuga kaetud reaktoris loputatakse N-metüül-pürrolidooni, NMP (4, L) lämmastikuga minutit. Seejärel lisatakse 4-metüülbenseentiool (900 g, 7, mol) ja 1,2-dibromobenseen (1709 g, 7, mol). Viimase reagendina

18 lisatakse kaalium tert-butoksiid (813 g, 7, mol). Reaktsioon oli eksotermiline, reaktsiooni temperatuur tõusen 70 kraadini (Celsius). Seejärel kuumutatakse reaktsioonisegu temperatuurini 1 C 2-3 tundi. Reaktsioonisegu jahutatakse toatemperatuurile. Lisatakse etüülatsetaat (4 L) ja naatriumkloriidi vesilahus (%, 2,L). Saadud mikstuuri segatakse minutit. Vesifaas eraldatakse ja ekstraheeritakse teise osa etüülatsetaadiga (2L). Vesifaas eraldatakse ja orgaanilised faasid kombineeritakse ja pestakse naatriumkloriidi lahusega (%, 2,L). Orgaaniline faas eraldatakse, kuivatatakse naatriumsulfaadiga ja aurustatakse vähendatud rõhul, et saada punane õli, mis sisaldab -30% NMP. Seda õli lahjendatakse kahekordsele mahule metanooliga ja saadud segu kuumutatakse püstjahutil. Lisatakse täiendav kogus metanooli, kuni saadakse selge punane lahus. Külvamisel jahutatakse saadud lahus aeglaselt toatemperatuurile. Saadus kristalliseerub valgete kristallidena, mis isoleeritakse filtreerides, pestakse metanooliga ja kuivatatakse temperatuuril 40 C vaakumahjus, kuni saadakse konstantne mass. Etüül 4-hüdroksü-4-(2-(4-tolüülsulfanüül)fenüül)-piperidiin-1-karboksülaat 30 Segatud reaktoris suspendeeritakse lämmastiku all 2-(4- tolüülsulfanüül)fenüülbromiid (600 g, 2, mol) heptaanis (4, L). Toatemperatuuril lisatakse M BuLi heksaanis (23 ml, 2,36 mol) minutiga. Täheldatakse üksnes vähest eksotermi. Suspensiooni segatakse 1 tund ümbrustemperatuuril ja jahutatakse seejärel temperatuurile -40 C. 1-karbetoksü-4-piperidoon (368 g, 2, mol) lahustatakse THF-is (1,L) ja lisatakse määral, mis pole kiirem kui reaktsiooni temperatuur, mida hoitakse allpool -40 C. Kui reaktsioon lõpeb, soojendatakse see temperatuurile 0 C ja lisatakse 1M HCl (1L), hoides temperatuuril allpool C. Happe vesifaas eraldatakse ja ekstraheeritakse etüülatsetaadiga (1L). Orgaanilised faasid kombineeritakse ja ekstraheeritakse etüülatsetaadiga (1L). Orgaanilised faasid kombineeritakse ja ekstraheeritakse naatriumkloriidi lahusega (%, 1L). Orgaanilist faasi kuivatatakse naatriumsulfaadiga ja aurustatakse poolkristalseks massiks. Seda suspendeeritakse etüüleetriga (0 ml) ja filtreeritakse välja. Kuivatatakse vaakumahjus temperatuuril 40 C, kuni saadakse konstantne mass.

19 Etüül 4-(2-(4-tolüülsulfanüül)fenüül)-piperidiin-1-karboksülaat Trifluoroäädikhape (2,8 kg, 24,9 mol) ja trietüülsilaan (362 g, 3,1 mol) viiakse tõhusa segistiga reaktorisse. Etüül 4-hüdroksü-4-(2-(4-tolüülsulfanüül)fenüül)- piperidiin-1-karboksülaat (462 g, 1,24 mol) lisatakse osade kaupa lehtri abil. Reaktsioon on kergelt eksotermiline. Temperatuur tõusen 0 kraadini (Celsius). Pärast lisamise lõppu soojendatakse reaktsioonisegu temperatuuril 60 C 18 tundi. Reaktsioonisegu jahutatakse toatemperatuurile. Lisatakse tolueen (70 ml) ja vesi (70 ml). Orgaaniline faas isoleeritakse ja vesifaasi ekstraheeritakse teise osa tolueeniga (70 ml). Orgaanilised faasid kombineeritakse ja pestakse naatriumkloriidi lahusega (%, 00 ml) ning kuivatatakse naatriumsulfaadiga. Naatriumsulfaat filtreeritakse välja, filtraat aurustatakse vähendatud rõhul punaseks õliks, mida töödeldakse järgmises etapis. 4-(2-(4-tolüülsulfanüül)fenüül)-piperidiin vesinikbromiid Toores etüül 4-(2-(4-tolüülsulfanüül)fenüül)-piperidiin-1-karboksülaat, mis saadakse näites 3 punase õlina, kombineeritakse segistiga reaktoris vesinikbromiidhappega äädikhappes (40%, 4 ml, 3,11 mol). Saadud segu kuumutatakse temperatuuril 80 C 18 tundi. Reaktsioonisegu jahutatakse toatemperatuurile. Jahutamisel saadus kristalliseerub. Pärast üht tundi toatemperatuuril lisatakse reaktsioonisegule etüüleeter (800 ml) ja saadud mikstuuri segatakse veel tund. Saadus filtreeritakse välja, pestakse etüüleetriga ja kuivatatakse vaakumisahjus temperatuuril 0 C, kuni saadakse konstantne mass. Näide 2B: 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiin, HBr sool 30 442 g segatud ja kergelt kuumutatud (ca 4 C) 4-(2-p-tolüülsulfanüül-fenüül)- piperidiin-1-karboksüülhappe etüülestrile (õli) lisatakse 4 ml 33 massi% HBr lahust AcOH-s (,7 M, 2, ekv). Saadud segamine annab C eksotermi. Pärast viimast lisamist kuumutatakse reaktsioonisegu temperatuuril 80 C ja jäetakse 18 tunniks seisma. Proov eemaldatakse ja seda analüüsitakse HPLC abil, ning kui tuvastatakse, et reaktsioon ei ole lõppenud, lisatakse veel 33 massi% HBr AcOHs. Vastasel juhul jahutatakse segu temperatuurile C, et saadus 4-(2-ptolüülsulfanüül-fenüül)-piperidiin vesinikbromiid sadestada. Ühe tunni pärast

temperatuuril C lisatakse saadud paksule suspensioonile 800 ml dietüüleetrit. Segamist jätkatakse veel 1 tund, misjärel saadus isoleeritakse filtreerides, pestakse 400 ml dietüüleetriga ja kuivatatakse vaakumis temperatuuril 40 C üle öö. Ühendi I vesinikbromiid isoleeritakse valge kuivainena. Näide 2C: 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiini, HBr soola rekristalliseerimine,0 g HBr soola segu (valmistatud nagu kirjeldatud eespool) kuumutatakse püstjahutil 0 ml vees. Segu muutub selgeks ja lahustub täielikult temperatuuril 80-90 C. Selgele lahusele lisatakse 1 g sütt ja püstjahutil kuumutamist jätkatakse minutit, misjärel see filtreeritakse ja jäetakse spontaanselt toatemperatuurile jahtuma. Jahtumisel sadestub valge kuivaine ja suspensiooni segatakse 1 tund toatemperatuuril. Filtreerimine ja kuivatamine vaakumis temperatuuril 40 C annab 6,9 g (69%) 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]-piperidiini HBr happe liitumissoola. Näide 3: 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)fenüül]piperidiin, täiendavad soolad Vaba aluse põhilahuste valmistamine 00 ml etüülatsetaadi ja 0 ml vee segule lisatakse 0 g HBr soola, saades kahefaasilise suspensiooni. Sellele heljumile lisatakse ligikaudu ml kontsentreeritud NAOH, mille tulemusel moodustub selge kahefaasiline lahus (ph tasemeks mõõdetakse 13-14). Saadud lahust segatakse korralikult minutit ja orgaaniline faas eraldatakse. Orgaanilist faasi pestakse 0 ml veega, kuivatatakse Na 2 SO 4 -ga, filtreeritakse ja aurustatakse vaakumis temperatuuril 60 C, saades vaba aluse 38g saagisega (99%) ja praktiliselt värvitu õlina. g õli lahustatakse ja etüülatsetaadiga reguleeritakse mahuks 0 ml, mille tulemusel saadakse 0,23 M etüülatsetaadi põhilahust, millest kasutatakse 1,ml alikvoote (0 mg vaba alust). g õli lahustatakse ja 96 mahu% EtOH abil reguleeritakse mahuks 0 ml, saades 0,33 M põhilahust EtOH-s, millest kasutatakse 1,0ml alikvoote (0 mg vaba alus).

Vaba aluse põhilahuste abil soolade moodustamine 21 Saadud alikvoodid viiakse katseklaasidesse ja samal ajal segades lisatakse sobivas koguses hapet, nagu näidatud tabelis 1. Kui hape oli vedel, lisatakse see puhtal kujul, vastasel juhul lahustatakse hape enne lisamist vastavas lahustis. Pärast segamist ja sadestamist jätkatakse segamist üle öö ja sade kogutakse filtreerides. Tabelis 2 on näidatud 4-[2-(4-metüülfenüülsulfanüül)-fenüül]piperidiini soolade lahustuvust. Tabel 1 Hape (alus:hape) MM Happe Lahusti CHN (g/mol) kogus (mg (eksp.) või µl) Palmitiinhape, 6,42 90, EtOAc 7,36 9,77 heksadekaanhape 2,46 1:1 DL-piimhape, DL- 90,1 31,8 EtOAc 66,88 7,26 2-hüdroksüpropioonhape 3,2 1:1 Adipiinhape, 1,6-146,14 1,6 EtOAc 66,08 7,23 heksaandihape 2,98 1:1 Adipiinhape, 1,6-146,14,8 EtOAc 70,66 7,32 heksaandihape 3,82 2:1 Fumaarhape 1:1 116,01 40,9 EtOH 6,71 6,41 3,3 Glutaarhape, 1,- 132,12 46,6 EtOAc 66,09 6,97 pentaandihape 3,2 1:1 Maloonhape 1:1 4,1 36,7 EtOAc 6,04 6,3 3,4 Oksaalhape 1:1 90,1 31,8 EtOAc 64,28 6,41 3,61 CHN (teooria) 7,64 9,9 2,6 67,3 7,29 3,7 67,1 7,27 3,26 70,7 7,3 3,93 66,14 6,31 3,1 66,48 7,03 3,37 6,09 6, 3,62 64,32 6,21 3,7

22 Hape (alus:hape) MM Happe Lahusti CHN (g/mol) kogus (mg (eksp.) või µl) Sebakoiniinhape, 2,02 3,6 EtOAc 71,79 7,86 1,8-oktaandihape 3,8 2:1 Merevaikhape, 118,1,8 EtOAc 6,6 6,86 1,4-butaandihape 3,4 L-õunhape, L-2-134,1 47,3 EtOAc 62,87, 6, hüdroksü 3,22 butaandihape 1:1, α L-õunhape, L-2-134,1 47,3 EtOH 62,99 6,66 hüdroksü 3,13 butaandihape 1:1, β D-viinhape, D-2,3-0,1 3,0 EtOH 60,67 6,4 dihüdrokü 3,07 butaandihape 1:1 L-asparagiinhape 133,1 47,0 EtOH 9,31 6,7 1:1 7,1 (sisaldab happe liiga) Glutaamhape 1:1 16, 8,3 EtOH 6,38 6,88 7,3 (sisaldab happe liiga) CHN (teooria) 71,83 7,86 3,64 6,80 6,78 3,49 (moodustub 1:1 sool) 63,29 6,2 3,36 63,29 6,2 3,36 60,9 6,28 3,23 63,43 6,78 6,73 6,46 6,94 7,06 (1:1- soola kohta ja hapemonohüdraat 1:1)

23 Hape (alus:hape) MM Happe Lahusti CHN (g/mol) kogus (mg (eksp.) või µl) Sidrunhape 2:1 192,13 33,9 EtOAc 6,93 6,72 3,44 HCl/Et 2 O 1:1 2M 176,4 EtOH Fosforhape 1:1 14,7 M 24,0 EtOAc,79 6,47 3,43 CHN (teooria) 66,46 6,64 3,69 6,68 6,34 3,67 Tabel 2 Hape (alus:hape) Lahustuvus (mg/ml) Palmitiinhape, heksadekaanhape 1:1 0,4 DL-piimhape, DL-2-hüdroksüpropioon-hape 1:1 > 0 Adipiinhape, 1,6-heksaandihape 1:1 2, Adipiinhape, 1,6-heksaandihape 2:1 1,0 Fumaarhape 1:1 0,2 Glutaarhape, 1,-petaandihape 1:1 13 Maloonhape 1:1 (α),2 Oksaalhape 1:1 1,1 Sebakoiniinhape, 1,8-oktaandihape 2:1 0,7 Merevaikhape, 1,4-butaandihape, 2:1 2,0 L-õunhape, L-2-hüdroksü butaandihape 1:1, β 2,8 D-viinhape, D-2,3-dihüdroksü butaandihape 1:1 1,8 L-asparagiinhape 1:1 39 Glutaamhape 1:1 >3 Sidrunhape 1:1 0, Fosforhape 1:1 6,0 HCl 4, HBr 2,4

24 Näide 4. Toime atsetüülkoliini tasemetele Antud katse eesmärgiks oli hinnata ühendi I toimet atsetüülkoliini rakuvälistele tasemetele vabalt liikuvate rottide prefrontaalses ajukoores ja ventraalses hipokampuses. Katses kasutatakse isaseid Sprague-Dawley rotte, kes kaaluvad katse alguses 27-300 g. Loomi hoitakse 12-tunnistes valgetes/pimedates tsüklites kontrollitud tingimustes regulaarsel sisetemperatuuril (21 ± 2 C) ja -niiskusel ( ± %), toidu ja vabalt kättesaadava kraanivee juuresolekul. Kirurgia ja mikrodialüüsi katsed Rotid tuimestatakse hüpnorm/dormikumiga (2 ml/kg) ja intratserebraalsed juhtkanüülid (CMA/12) siirdatakse stereotaksikaalselt hipokampusesse eesmärgiga asetada dialüüsi sondi otsa ventraalsesse hipokampusesse (koordinaadid:,6 mm bregma taga, külgmine,0 mm, 7,0 mm ventraalne kõrvakestaga või frontaalses ajukoores) (koordinaadid: 3,2 mm bregma ees; külgmine 0,8 mm; 4,0 mm ventraalne kõrvakestaga). Juhtkanüülide kinnitamiseks kasutada ankurkruvisid ja akrüültsementi. Loomade kehatemperatuuri jälgitakse rektaalse sondiga ja temperatuuri hoitakse tasemel 37 C. Rottidel lastakse operatsioonist 2 päeva toibuda ja pannakse eraldi puuridesse. Katsepäeval sisestatakse mikrodialüüsi sond (CMA/12, 0, mm diameeter, 3 mm pikkus) juhtkanüüli kaudu. Sondid ühendatakse kahekanalise käändtelje kaudu mikrosüstimise pumpa. Mikrodialüüsi sondi perfusiooni filtreeritud Ringeri lahusega (14 mm NaCl, 3 mm KCl, 1 mm MgCl 2, 1,2 mm CaCl 2, mis sisaldab 0, µm neostigmiini) alustatakse vahetult pärast sondi sisestamist ajju ning jätkatakse kogu katse vältel konstantsel voolukiirusel 1 µl/min. Pärast 180 minutit stabiliseerimist käivitatakse katsed. Dialüsaadid kogutakse iga minuti pärast. Pärast katseid loomad ohverdatakse, nende ajud eemaldatakse, külmutatakse ja viilutatakse sondi asetuse kinnitamiseks.

Dialüsaat atsetüülkoliini analüüs Dialüsaatides analüüsitakse atsetüülkoliini (ACh) kontsentratsiooni HPLC elektrokeemilises tuvastamises, kasutades mobiilset faasi, mis sisaldab 0 mm dinaatriumvesinikfosfaati, 2,0 mm oktaansulfoonhapet, 0, mm tetrametüülammooniumkloriidi ja 0,00% MB (ESA), ph 8,0. Eel-kolonni ensüümi reaktor (ESA), mis sisaldas immobiliseeritud koliini oksidaasi, eemaldas koliini süstitud proovist ( µl) enne ACh eraldamist analüütilises kolonnis (ESA ACH- 0); voolukiirus 0,3 ml/min, temperatuur: 3 C. Pärast analüütilist kolonni viiakse proov kolonnijärgse tahke faasi reaktorist (ESA) läbi, mis sisaldab immobiliseeritud atsetüül-koliinesteraasi ja koliinoksüdaasi. See reaktor muundab ACh koliiniks ja koliini omakorda betaiiniks ja H 2 O 2 -ks. Viimane tuvastatakse elektrokeemiliselt, kasutades plaatina elektroodi (Analüütiline rakk: ESA, mudel 040). Andmete esitus Eraldi süstimistes kasutati 3 järjestikuse ACh proovi (eelnesid vahetult ühendi manustamisele) keskmist väärtust iga katse põhitasemena ja saadud andmed muundatakse põhitaseme protsendiks (keskmised süstimiseelsed põhiväärtused normaliseeriti 0%). Need andmed on toodud joonistel fig 1a ja 1b. Joonistel fig 1a ja 1b toodud andmed näitavad doosist sõltuvat rakuvälise atsetüülkoliini taseme kasvu ajus. Seda eelkliinilist avastust on võimalik rakendada kognitsiooni parendamiseks kliinilistes tingimustes, mis on kasulikud muuhulgas selleks, et ravida kognitiivset puudulikkust ja kognitiivse puudulikkuse poolest eristatavaid haigusi. Näide. Toime dopamiini tasemetele Ühendi I üks süstimine tõstis doosist sõltuvalt rakuväliseid dopamiini (DA) tasemeid roti frontaalses ajukoores. Leiutise ühendi manustamine nahaaluselt 8,9 mg/kg ja 18 mg/kg DA tasemeid ligikaudu vastavalt 0% ja 0% nulltasemetega võrreldes, nagu kujutatud joonisel fig 2. Kogused on arvutatid vaba alusena.

Meetod 26 Katseks kasutati isaseid Sprague-Dawley rotte, kes kaalusid katse alguses 27-300 g. Loomi hoiti 12-tunnistes valgetes/pimedates tsüklites kontrollitud tingimustes ja regulaarsel sisetemperatuuril (21 ± 2 C) ja -niiskuses ( ± %) toidu ja vabalt kättesaadava kraanivee juuresolekul. Kolmepäevasteks katseteks kasutati osmootseid minipumpasid (Alzet, 2ML1). Pumbad täidetakse aseptilistes tingimustes ja siirdatakse nahaaluselt sevofluraani anesteesias. Katsed viiakse läbi minipumpadega. Et mõõta testühendi plasma kontsentratsiooni 3 päeva pärast ravi, võetakse katsete lõpus vereproovid. Kirurgia ja mikrodialüüsi katsed Loomad tuimestatakse hüpnorm/dormikumiga (2 ml/kg) ja intratserebraalsed juhtkanüülid (CMA/12) siirdatakse stereotaksikaalselt hipokampusesse, asetades dialüüsi sondi otsa ventraalsesse hipokampusesse (koordinaadid:,6 mm bregma eest, külgmine,0 mm, 7,0 mm ventraalne kõrvakestaga või eesmises ajukoores; koordinaadid: 3,2 bregma ees; külgmine 3,0 mm; 4,0 mm ventraalne kõrvakestaga). Juhtkanüülide kinnitamiseks kasutatakse ankurkruvisid ja akrüültsementi. Loomade kehatemperatuuri jälgiti rektaalse sondiga ja seda hoiti 37 C juures. Rottidel lasti operatsioonist 2 päeva toibuda, viies nad eraldi puuridesse. Katsepäeval sisestatakse mikrodialüüsi sond (CMA/12, 0, mm diameeter, 3 mm pikkus) juhtkanüüli kaudu. Sondid ühendatakse kahekanalise käändtelje kaudu mikrosüstimise pumbaga. Mikrodialüüsi sondi perfusioon filtreeritud Ringeri lahusega (14 mm NaCl, 3 mm KCl, 1 mm MgCl 2, 1,2 mm CaCl 2 ) alustati vahetult enne sondi ajju sisestamist ja jätkati kogu katse vältel konstantsel voolukiirusel 1 (1,3) µl/min. Pärast 180 minutit stabiliseerimist käivitati katsed. Dialüsaadid koguti iga (30) minuti järel. Pärast katseid loomad ohverdatakse dekapitatsioonis, nende ajud eemaldatakse, külmutatakse ja viilutatakse sondi asetuse kinnitamiseks. Dialüsaatide analüüs 30 Dopamiini kontsentratsiooni dialüsaatides analüüsitakse HPLC abil elektrokeemilises tuvastuses. Monoamiinid eraldatakse pöördfaasilises

27 vedelikkromatograafias (ODS 0 x 3 mm, 3 µm). Dopamiin: mobiilne faas, mis koosneb 90 mm NaH 2 PO 4, 0 nm naatriumtsitraadist, 367 mg/l naatrium 1- oktaansulfoonhappest, 0 µm EDTA-st ja 8% atsetonitriilist (ph 4,0), voolukiirusel 0, ml/min. Elektrokeemiliseks tuvastuseks kasutatakse kolorimeetrilist detektorit; potentsiaaliga 0 mv (kaitserakk 30 mv) (Coulochem II, ESA). Näide 6. Toime neuropaatilisele valule Et demonstreerida ühendi I efektiivsust neuropaatilise valu vastu, testitakse seda neuropaatilise valu formaliini mudelis [Neuropharm., 48, 2-263, 0; Pain, 1, -17, 1992]. Selles mudelis süstitakse hiirtele formaliini (4,%, µl) vasaku tagakäpa plantaarpinda ja asetatakse seejärel eraldi klaasist katseklaasidesse (2- liitrised). Formaliini süstimisest tingitud ärritus tekitab iseloomuliku kahefaasiline käitumusliku vastuse, mida kvantifitseeritakse ajaga, mis kulub vigastatud käpa lakkumisele. Esimene faas (~0- minutit) tähistab otsest keemilist ärritust ja notsitseptsiooni, kusjuures teine (~-30 minutit) tähistab neuropaatilise päritoluga valu. Kaks faasi eraldatakse liikumatul periood, mil käitumine muutub normaalseks. Mõõtes aega, mis kulub vigastatud käpa lakkumisele kahes faasis, hinnatakse testühendite efektiivsust valulike stiimulite vähendamisel. Kaheksa C7/b6 hiirt (ca g) testiti rühma kohta. Tabelis 3 allpool on kujutatud aega, mis kulus vigastatud käpa lakkumisele kahes faasis, s.o 0- minutit ja -30 minutit pärast formaliini süstimist. Manustatud ühendi kogus arvutatakse vaba alusena. Tabel 3 Tugiaine 1,0 mg/kg 2, mg/kg mg/kg 0- minutit (sek) 42 37 30 37-30 minutit (sek) 41 43 26 6 Tabelis 3 esitatud andmed näitavad, et ühend I avaldab esimeses faasis vähe mõju, osutades otsesele keemilisele ärritusele ja notsitseptsioonile. Enamgi veel, andmed näitavad, et käppade lakkumisele kulutatud aeg väheneb selget ja doosist sõltuvat teises faasis, osutades ühendi I toimele neuropaatilise valu ravis.