UNIVERZITETNI ŠTUDIJ KMETIJSTVO - AGRONOMIJA

Biotehniška fakulteta Oddelek za agronomijo Dominik VODNIK FIZIOLOGIJA RASTLIN PRAKTIČNE VAJE UNIVERZITETNI ŠTUDIJ KMETIJSTVO - AGRONOMIJA Ljubljana, 2001 1

KAZALO 1. MINERALNA PREHRANA RASTLIN... 4 Vaja 1.1.: Mineralna prehrana rastlin hidroponski poskus... 4 2. VODNI POTENCIAL... 10 Merjenje vodnega potenciala teoretične osnove... 10 Sprememba volumna in mase tkiva... 11 Sprememba koncentracije raztopine, v kateri je tkivo... 11 Psihrometrija... 11 Merjenje vodnega potenciala s tlačno (Scholander-jevo) komoro... 12 Merjenje osmotskega potenciala (krioskopski osmometer)... 13 Merjenje vodnega potenciala s tlačno sondo... 13 Vaja 2.1.: Merjenje vodnega potenciala s spremembo mase... 13 Vaja 2.2.: Merjenje vodnega potenciala z mejno plazmolizo... 15 Vaja 2.3.: Merjenje vodnega potenciala s tlačno komoro... 15 3. TRANSPIRACIJA... 18 Vaja 3.1. Merjenje transpiracije s potometrom... 18 Vaja 3.2. Merjenje transpiracije s porometrom... 19 4. ASIMILACIJSKI PIGMENTI... 22 Vaja 4.1. Absorpcijske lastnosti asimilacijskih pigmentov... 23 Vaja 4.2. Kvantitativno določevanje asimilacijskih pigmentov v rastlinskem tkivu... 25 5. FOTOSINTEZA - merjenje fotosinteze... 29 Vaja 5.1. Svetlobna odvisnost fotosinteze... 32 Vaja 5.2. Odvisnost fotosinteze od koncentracije CO 2... 33 6. Fluorescenca klorofila... 37 Vaja 6.1. Merjenje potencialne in dejanske učinkovitosti fotositema II pri različnih rastlinah... 40 7. DIHANJE SEMEN... 42 Vaja 7.1. Dihanje semen Merjenje s Pettenkoferjevo metodo... 43 Vaja 7.2.. Dihanje semen Merjenje z merilnim sistemom za merjenje CO 2 44 8. ZALOŽNE SNOVI V SEMENU MERJENJE AKTIVNOSTI LIPAZE... 46 Vaja 8.1. Merjenje aktivnosti lipaze v semenih navadnega kloščevca... 47 9. RASTLINSKI RASTNI HORMONI... 49 Vaja 9.1. Tvorba adventivnih korenin... 49 Vaja 9.2. Apikalna prevlada ( = apikalna dominantnost)... 50 Vaja 9.3. Tvorba adventivnih korenin vpliv eksogenega avksina... 50 9.4. Hormoni in odpadanje listov, plodov (abscizija)... 50 2

9.5. Hormoni in staranje (senescenca)... 51 10. RASTLINSKA GIBANJA... 54 Vaja 10.1: Tigmonastija... 54 Vaja 10.2: Seizmonastija... 55 Vaja 10.3: Fotonastija... 55 Vaja 10.4: Termonastija... 55 3

1. MINERALNA PREHRANA RASTLIN Nujno potrebna mineralna hranila so tista, brez katerih rastlina ne more zaključiti svojega življenjskega cikla, vse do tvorbe kalivih semen. Nek kemijski element je nujno potreben - esenicialen, če je sestavni del molekul oz. sestavin rastlinske celice, ki so same po sebi nujne za obstoj rastline (npr. dušik v proteinih, magnezij v klorofilu). Takšnega elementa ne moremo nadomestiti z drugim kemijskim elementom. Na podlagi trenutnega znanja na področju mineralne prehrane rastlin domnevamo, da je za rast in razvoj rastline nujno potrebnih 17 elementov. Ti so N, K, Ca, Mg, P, S, Cl, Fe, B, Mn, Zn, Cu, Ni, in Mo, ki jih prištevamo med mineralna hranila. Ogljika, vodika in kisika, ki jih rastlina pridobi iz vode in ogljikovega dioksida, ne prištevamo med mineralna hranila. Glede na potrebe rastline po teh mineralnih hranilih ločimo makro-elemente, rastlina jih potrebuje v koncentraciji ca 1000 mg kg -1 suhe snovi ter mikroelemente, rastlina jih potrebuje v koncentraciji 100 mg kg -1 suhe snovi ali manj. Kadar nekega sicer nujno potrebnega mineralnega hranila rastlini primanjkuje, se razvijejo znaki pomanjkanja. Rast je zavrta, na posameznih organih se pojavljajo kloroze (razgradnja klorofila in razpad kloroplastov) in nekroze (razkroj tkiva). Znaki pomanjkanja so lahko za posamezen element značilni. Odvisni so od fiziološke vloge elementa in od njegove mobilnosti v rastlini, t.j. sposobnosti transporta iz starejših delov rastline v mlajše. Ta je v največji meri odvisna od mobilnosti elementa v floemu. Če je element v rastlini dobro mobilen, se ob pomanjkanju prerazporeja iz starejših listov v mlajše. Znaki pomanjkanja se zato izrazijo na starejših listih. Če pa je mobilnost elementa slaba, razporejanje ni možno in znaki pomanjkanja se najprej pokažejo na mladih delih rastline. Značilne znake pomanjkanja nekega mineralnega hranila lahko opazujemo, če rastline gojimo v hidroponskem sistemu, v hranilni raztopini, ki vsebuje vsa potrebna mineralna hranila razen proučevanega elementa. Na polju, v naravi, pomanjkanje določenega mineralnega hranila z opazovanjem znakov velikokrat težko opredelimo. Pogosto se namreč pojavlja hkratno pomanjkanje večjega števila mineralnih hranil. Tudi znaki nekaterih bolezni, ki jih povzročajo rastlinski virusi, so lahko podobni znakom pomanjkanja esencialnih elementov. V primeru, da na podlagi znakov ne moremo sklepati o prehranjenosti rastline, je potrebna kemijska analiza vsebnosti elementov. Vaja 1.1.: Mineralna prehrana rastlin hidroponski poskus Material: kalice navadne sončnice (Helianthus annuus L.) in navadne koruze (Zea mays L.) ali drugih rastlin, hidroponski lonci in ploščice-pokrovi, zračna črpalka, razdelilna cev, cevke za povezavo, pena, vata

Kemikalije: glej Tabeli 1.1 in 1.2.! Tabela 1.1 Volumen založne raztopine, ki jo dodamo (ml) Založna raztopina Polna Ca S Mg K N P Fe Mikro H 2 O 0.5 M Ca(NO 3 ) 2 4 0 4 4 4 0 4 4 4 0 0.5 M KNO 3 4 4 4 4 0 0 4 4 4 0 0.5 M MgSO 4 1.6 1.6 0 0 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 0 0.5 M KH 2 PO 4 0.8 0.8 0.8 0.8 0 0.8 0 0.8 0.8 0 FeNaEDTA 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0 0.8 0 Mikroelementi 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0 0 0.5 M NaNO 3 0 4 0 0 4 0 0 0 0 0 0.5 M MgCl 2 0 0 1.6 0 0 0 0 0 0 0 0.5 M Na 2 SO 4 0 0 0 1.6 0 0 0 0 0 0 0.5 M NaH 2 PO 4 0 0 0 0 0.8 0 0 0 0 0 0.5 M CaCl 4 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0.5 M KCl 0 0 0 0 0 4 0.8 0 0 0 Tabela 1.2 Mikroelementi molekulska masa založna r. (mm) založna r. (g L-1) KCl 74.55 25 1.864 H 3 BO 3 61.83 12.5 0.773 MnSO 4 x H 2 O 169.01 1 0.169 ZnSO 4 x 7H 2 O 287.54 1 0.288 CuSO 4 x 5H 2 O 249.68 0.25 0.062 Na 2 MoO 4 241.95 0.25 0.060 Izvedba: V vaji bomo spremljali znake pomanjkanja različnih mineralnih hranil pri sončnici in koruzi. Uporabili bomo 2 tedna stare rastline, ki smo jih predhodno nakalili na z vodo omočenem filtrirnem papirju v petrijevkah. Rastline gojimo v 5

hidroponski kulturi, v loncih s po 800 ml hranilne raztopine, v katero smo zamešali ustrezne volumne osnovnih raztopin hranil kot opisuje Tabela 1.1. Poleg enega lonca s polno hranilno raztopino (Tabela 1.1, prvi stolpec) pripravimo 7 loncev s hranilnimi raztopinami, katerim bo manjkal po en makroelement, v enem loncu bo hranilna raztopina brez dodanih mikroelementov, v enem pa destilirana voda brez vsakršnih dodatkov. V vsakem loncu gojimo 3 rastline sončnice in 3 rastline koruze, ki jih v perforirane ploščice-pokrove previdno pritrdimo s peno. Uredimo prezračevalni sistem hidroponike. S PVC cevko povežemo zračno črpalko z razdelilno cevjo, narežemo dovodne cevke za lonce. Na razdelilec jih pritrdimo preko plastične cevke, katero napolnimo z vato. Hidroponiko namestimo v rastlinjak. Posamezne prezračevalne cevke namestimo v lonce, tako da so približno enako globoko potopljene v hranilno raztopino. Priklopimo zračno črpalko ter preverimo njeno delovanje. Prezračevanje v vseh loncih naj bo čimbolj enako. Tedensko spremljamo rast in razvoj rastlin in si beležimo opažanja. Posebej smo pozorni na pojavljanje znakov pomanjkanja, značilnih za posamezen element (Tabela 1.3). V vaji lahko posamezna skupina študentov vsa obravnavanja označi tudi s šiframi. Za hidroponsko vzgojene rastline, ki jih gojijo druge skupine, skušamo na podlagi znakov ugotoviti, katero mineralno hranilo manjka v hranilni raztopini. Preverimo uspešnost svojih ocen. Tabela 1.3: Znaki pomanjkanja nekaterih mineralnih hranil. Gre za posplošene znake, ki lahko variirajo glede na rastlinsko vrsto in razmere rasti: mineralno hranilo Ca N P K Fe znaki pomanjkanja Prvi znak pomanjkanja Ca je deformacija mlajših listov, prizadete so terminalne listne cone, pride do nekroz rastnih vršičkov. Znaki se pojavijo zelo zgodaj, rast je zelo omejena. Klični listi in spodnji zeleni listi zelo hitro porumenijo, nato porjavijo in odmrejo. Rast je zelo omejena. Pri nekaterih vrstah, kot je npr. koruza, je značilen pojav rdeče oz. škrlatne barve med žilami. Rast je omejena, steblo je nizko in vitko. Listi so majhni in temno zeleni. Na listih, listnih pecljih in tudi plodovih se razvijajo nekroze. Za več rastlin, npr. koruzo, je zaradi tvorbe antocianov značilen pojav rdeče oz. škrlatne barve. Rastline so zakrnele v rasti. Na listih se pojavljajo kloroze v obliki lis. Klorotično tkivo se zvija in kodra. Za pomajkanje K so značilne nekroze na listnih robovih in na konici lista. Mladi, predvsem zgornji listi postanejo svetlo zeleni ali skoraj beli. Starejši listi so zeleni in ohranijo normalen izgled, ker se železo iz njih ne more transportirati v starejše dele. Kloroze mladih listov so najmočnejše med žilami, pojavijo se zgodaj. 6

Mg S Znaki se najprej pojavijo na starejših listih v obliki kloroze, ki se širi od listne konice. Značilno je, da se kloroza tkiv nad žilami pojavi kasneje kot kloroza medžilnega tkiva. Listi odpadajo. V zgodnjih fazah se lahko pojavi rumenenje mlajših listov, značilna je bledo zelena barva preko celotne površine lista (žile, medžilno tkivo). Rast je normalna. Apikalni listi lahko postanejo zelo rumeni do obledeli. mikroelementi Če posplošimo, se pri večini mikroelementov simptomi pomanjkanja pojavijo z zakasnitvijo in največkrat na mladih listih. Mn: značilne so točkaste nekroze, najmanjše žile ostanejo zelene, list dobi mrežast izgled in odpade Cu: venenje konic mlajših listov, venenje cele rastline, tudi če je dobro preskrbljena z vodo Zn: rumenenje spodnjih listov na konicah in robovih, deformacije listov, internodiji skrajšani Mo: je potreben pri metabolizmu dušika, zato so simptomi podobni kot pri pomanjkanju tega elementa Opomba: vaja Mineralna prehrana rastlin se navezuje na vaji 4. Asimilacijski pigmenti in 6. Fluorescenca klorofila, v katerih bomo ovrednotili vpliv pomanjkanja posameznih mineralnih hranil na vsebnost fotosinteznih pigmentov in učinkovitost fotosistema II. Vprašanja: 1. Ali lahko na podlagi simptomov pomanjkanja sklepaš na mobilnost elementa v rastlini? Za kateri element si v svojem poskusu dokazal, da je slabo mobilen v rastlini? 2. Zakaj smo pri hidroponskem gojenju hranilno raztopino prezračevali? 3. Problemi pri izvedbi poskusa in predlogi za izboljšave. 7

Vaja 1.1: Mineralna prehrana rastlin Znaki pomanjkanja REZULTATI - opažanja Rastlina: datum 8

Vaja 1.1: Mineralna prehrana rastlin Znaki pomanjkanja REZULTATI - opažanja Rastlina: datum 9

2. VODNI POTENCIAL Vodni potencial je merilo za razpoložljivost vode v nekem sistemu. Koncept vodnega potencial izhaja iz koncepta kemijskega potenciala, ki opisuje prosto energijo 1 v nekem sistemu. Dejansko je vodni potencial kemijski potencial vode, deljen z njenim parcialnim molalnim volumnom (volumnom enega mola vode, ki je 18 x 10-6 m 3 mol -1 ). Ima torej enoto proste energije na volumen (J m -3 = Nm m -3 ) oz. enoto tlaka (Pa = N m -2 ). Vodni potencial označujemo z grško črko Ψ (psi). K vodnemu potencialu prispevajo trije dejavniki: koncentracija raztopine, tlak in gravitacija. Zato vodni potencial opišemo z enačbo: Ψw = Ψs + Ψp + Ψm + Ψg pri čemer je: Ψw skupen vodni potencial Ψs potencial raztopine ali osmotski potencial (< 0) Ψp potencial tlaka (turgor) (> 0) Ψm matrični potencial (< 0) Ψg gravitacijski potencial (> 0) (Oznake so povzete po viru Taiz in Zeiger, 1998. V literaturi lahko zasledite različne simbole!) Glavni prispevek k vodnemu potencialu žive rastlinske celice imata osmotski potencial in potencial tlaka (turgor), zato lahko zgornjo enačbo poenostavimo: Ψw = Ψs + Ψp Čista voda ima v standardnih razmerah (25 C in 1013 mbar) Ψw = 0. Biološki sistemi imajo manjše, negativne vodne potenciale. Sistem z večjim vodnim potencialom bo oddajal vodo sistemu z manjšim vodnim potencialom, dokler se vodna potenciala obeh ne bosta izenačila. Merjenje vodnega potenciala teoretične osnove Merjenje vodnega potenciala temelji na dejstvu, da je v ravnotežju ΔΨ = 0. Če zapremo rastlino v nek zaprt prostor in počakamo, da se vzpostavi ravnotežje 1 Prosta energija je pojem iz termodinamike, s katerim opišemo razpoložljivo energijo, ki ima potencial opravljanja dela 10

vodnih potencialov rastline in prostora, lahko določimo Ψ rastline. Tega principa se poslužujemo pri različnih merilnih metodah, ki jih opisujemo v nadaljevanju. Sprememba volumna in mase tkiva Vzorec tkiva, ki mu hočemo določiti Ψ, damo v raztopine z različno osmolarnostjo. Uporabimo lahko raztopine saharoze, sorbitola, manitola ali polietilenglikola. Najboljši osmotik (osmotsko aktivna raztopina) je tisti, ki ne more na lahek način prehajati plazmaleme in ne poškoduje tkiva. Iz koncentracije raztopine, v kateri se volumen tkiva ne spremeni (ni sprejemanja ali oddajanja vode) lahko izračunamo osmotski potencial Ψs. Ker je sistem pri atmosferskem tlaku Ψ p =0 in je Ψ w = Ψ s. Volumen lahko določamo preko sprememb dolžine cilndričnih kosov tkiva (izvrtamo jih s plutovrtom). Druga možnost je določanje mase tkiva. Osmotski potencial raztopine, v kateri se volumen (masa) vzorca tkiva ne spremeni, ustreza vodnemu potencialu tega tkiva. Vodni potencial lahko izračunamo iz enačbe: Ψ w = Ψ s = - RTc s pri tem je R = plinska konstanta (8.31 J mol -1 K -1 ) T = absolutna temperatura v K c s = koncentracija raztopine, podana kot molalnost (mol kg -1 ) 2 Sprememba koncentracije raztopine v kateri je tkivo Glede na to, ali tkivo sprejema ali pa oddaja vodo, postane raztopina znane koncentracije bolj ali pa manj koncentrirana. Ta princip uporabljamo pri metodi, ki jo je razvil Chardakov (1948). V epruvete nalijemo raztopine različnih koncentracij in jih obarvamo tako, da v vsaki raztopimo kristal barvila npr. metilenskega modrila. Paralelno damo v raztopine istih koncentracij brez barvila tkivo, ki mu želimo določiti Ψ. Po določenem času (5-15 min) tkivo odstranimo in dodamo kapljico obarvane raztopine iz paralelne epruvete. Če kapljica tone, pomeni, da je raztopina manj gosta, ker je prevzela vodo iz tkiva. Če je voda prehajala iz raztopine v tkivo, je raztopina bolj gosta in zaradi tega kapljica dodanega barvila plava. Če se kapljica enakomerno porazdeli po raztopini, pomeni, da ni bilo sprememb v koncentraciji raztopine in da je bil v tem primeru osmotski potencial raztopine enak vodnemu potencialu tkiva (pri atmosferskem tlaku). Psihrometrija (gr. psychein = hladiti) Manjši vodni potencial dejansko pomeni manjši tlak vodne pare. Psihrometer je aparat, s katerim merimo tlak vodne pare. Glavni del psihrometra sta dva 2 Molalnost = molov topljenca na kg vode, simbol za molalnost je m. 11

termometra, suh in vlažen. Osnova merjenja je dejstvo, da se površina telesa, ki vodo oddaja, ohlaja. S primerjavo temperature suhega in mokrega termometra lahko izračunamo relativno vlažnost zraka. Tkivo, ki mu želimo določiti vodni potencial, damo v manjšo zaprto posodo. Vodni potencial zraka v tem prostoru se po določenem času uravnoteži z vodnim potencialom tkiva. S psihrometrom izmerimo spremembo vodnega potenciala atmosfere oz. njegovo relativno vlažnost. Vodni potencial izračunamo po enačbi: Ψ = -RT/V 1 ln (p 0 /p) p 0 = gostota vodne pare ali njen tlak pri nasičenju p = izmerjena gostota vodne pare ali izmerjen tlak vodne pare V 1 = molarni volumen vode (18.03 x 10-6 m 3 mol -1 ) ker je 100 p/p 0 relativna vlažnost (RH), lahko zapišemo: Ψ = -RT/V 1 ln (RH/100) Psihrometer kalibriramo z raztopinami znane koncentracije, za katere lahko izračunamo Ψ. Merjenje vodnega potenciala s tlačno (Scholander-jevo) komoro Vodni potencial (Ψ) lista je enak v vsem listu, čeprav so prispevki različnih komponent vodnega potenciala (osmotski potencial, potencial tlaka) v različnih celicah različni. V ksilemu je najpomembnejša komponenta Ψ negativni potencial tlaka, t.j. podtlak oz. tenzija. Ker lahko poenostavimo, da je ksilemska tekočina čista voda, je osmotski potencial enak nič, vodni potencial sistema pa enak potencialu tlaka oz. tenziji (Ψs = 0, Ψw = Ψp). Ko list odrežemo z rastline, tenzija v ksilemu preneha. Ψp (Ψw) naraste do nič. Voda iz ksilema prehaja v sosednje celice, kjer je vodni potencial bolj negativen. Zaradi tega voda izgine iz odrezane površine listnega peclja. List zapremo v tlačno komoro in povečamo tlak do te mere, da se ksilemski sok spet pokaže na odrezani površini. Tlak, ki je za to potreben, po absolutni vrednosti ustreza tenziji oz. potencialu tlaka, ki je bil v ksilemu pred tem, ko smo list odrezali. S tlačno komoro torej merimo ksilemski potencial. Predvidevamo, da je vrednost ksilemskega vodnega potenciala blizu vrednosti vodnega potenciala za cel organ. Ta predpostavka je verjetna zaradi 1) zanemarljivo majhnega prispevka osmotske komponente h ksilemskemu potencialu in 2) neposrednega stika ksilema z večino celic v listu. 12

Slika 2.1: Shema Scholandrove bombe in princip meritve (glej tekst!) (prirejeno iz Taiz in Zeiger, 1998). Merjenje osmotskega potenciala (krioskopski osmometer) Z naraščanjem koncentracije raztopine pada temperatura ledišča (koligativna lastnost). Če raztopina vsebuje 1 mol topljenca na 1 kg vode bo njeno ledišče pri -1.86 C (0 C pri čisti vodi). S krioskopom lahko merimo koncentracije raztopin zelo majhnih vzorcev (10-9 L volumen celice!). Vzorec hitro zamrznemo in ob višanju temperature opazujemo njegovo tajanje pod mikroskopom. Ko izgine še zadnji kristal odčitamo temperaturo. Iz temperature izračunamo koncentracijo, iz te pa Ψs. Merjenje vodnega potenciala s tlačno sondo Gre za merjenje vodnega potenciala v sami celici. Možno je samo pri velikih celicah, kot npr. pri algah Nittela in Chara. Glavni del aparata je nekakšna siringa, ki jo zapičimo v proučevano celico. Siringa je napolnjeno z relativno nestisljivim silikonskim oljem. Ko prodremo v celico celični sok zaradi Ψ potisne iz celice. Z batom izenačimo tlak in odčitamo vrednost tlaka, ki je bila za to potrebna. Vaja 2.1: Merjenje vodnega potenciala s spremembo mase Material: gomolji krompirja in koren repe, epruvete, milimeterski papir, britvica, skalpel, pinceta, filtrirni papir, plutovrt 0.5 cm, meter, tehtnica 13

Kemikalije: destilirana voda (dh 2 O) 1 molalna raztopina KNO 3 0.8 m KNO 3 0.6 m KNO 3 0.5 m KNO 3 0.4 m KNO 3 0.3 m KNO 3 0.2 m KNO 3 0.1 m KNO 3 0.05 m KNO 3 Izvedba: 1 molalna razt. saharoze 0.6 m saharoza 0.5 m saharoza 0.45 m saharoza 0.4 m saharoza 0.35 m saharoza 0.3 m saharoza 0.25 m saharoza 0.2 m saharoza 0.15 m saharoza 0.1 m saharoza 0.05 m saharoza Za posamezne željene koncentracije odpipetiramo v epruvete ustrezen volumen osnovne 1 m raztopine KNO 3 oz. saharoze ter dodamo destilirano vodo (npr. za 0.8 m 8 ml + 2 ml dh 2 0). S plutovrtom izvrtamo iz krompirjevega gomolja ali korena repe valje premera 0.5 cm in dolžine 3 cm. Položimo jih na vlažen filter papir in jih natančno stehtamo. Takoj zatem valje razrežemo na 2 mm debele koščke in vse koščke enega valja potopimo v testno raztopino. Po 1.5 2 urah inkubacije odstranimo raztopino, odcedimo koščke na filtrirnem papirju in jih ponovno stehtamo. Za posamezno koncentracijo izračunamo, kakšna je sprememba v masi: sprememba mase [%] = ((končna masa začetna masa) / začetna masa) x 100 Za vsako raztopino izračunamo Ψs po enačbi: Ψs = - RTc s R = plinska konstanta 8.31 J mol -1 K -1 T = absolutna temperatura K, c s = molalnost (mol kg -1 ), molalnost pomnožimo še s faktorjem, ki označuje ionizacijo molekule topljenca, t.i. disociacijsko konstanto. Za molekule, ki ne ionizirajo, je ta enaka 1, za druge variira s koncentracijo; saharoza =1 KNO 3 =1.69. 14

Izračun poenostavimo, tako da osmotski potencial izračunamo po zgornji enačbi (1.1) za eno koncentracijo, za ostale pa uporabimo zvezo: c 1 / Ψ s1 = c 2 / Ψ s2 Poiščemo koncentracijo saharoze oz. KNO 3, pri kateri ni prišlo do spremembe v masi. Osmotski potencial te raztopine ustreza vodnemu potencialu tkiva. Vaja 2.2: Merjenje vodnega potenciala z mejno plazmolizo Material: luskolisti čebule Kemikalije: glej 2.1! Izvedba: V petrijevke nalijemo raztopine saharoze oz KNO 3 enakih koncentracij kot pri vaji 2.1. V vsako damo košček povrhnjice čebulnega luskolista. Po eni uri opazujemo pod mikroskopom, pri kateri koncentraciji je nastopila v celicah mejna plazmoliza. Vodni potencial izračunamo tako kot v vaji 2.1. Pri izračunu uporabimo koncentracijo osmotika, ki je po velikosti med koncentracijo, pri kateri smo opazili mejno plazmolizo in tisto, pri kateri plazmolize še ni bilo opaziti. Vaja 2.3: Merjenje vodnega potenciala s tlačno komoro Material: različno zalivane rastline navadnega bodiča (Xanthium strumarium L.), Scholandrova bomba, skalpel, povečevalno steklo Izvedba: Sestavimo merilni aparat. Jeklenko z N 2 priklopimo na merilno komoro, preverimo čistočo komore, posebej stika komore in pokrova. Po potrebi stik namažemo s silikonsko mastjo. V pokrov vstavimo tesnilo brez luknjice, merilno komoro zapremo in opravimo tlačni preizkus, t.j. preverimo delovanje varnostnega ventila, ki se mora odpreti pri povečanju tlak v komori. Sproti vzorčimo posamezne poganjke bodiča in jih merimo. Odrezano rastlino oz. poganjek s pomočjo cevke vstavimo v luknjico gumijastega tesnila in vse skupaj namestimo v pokrov. Rastlino zapremo v komoro in dobro zapremo pokrov. Skozi pokrov na zgornjem koncu gleda odrezano steblo rastline, poganjka ali odrezan listni pecelj. S povečevalnim steklom opazujemo odrezano površino in hkrati s počasnim odpiranjem ventila povečujemo tlak v komori z rastlino. Ko se na odrezani površini pojavi ksilemska tekočina, ventil zapremo in odčitamo tlak. Ta po velikosti ustreza ksilemskemu negativnemu tlaku, ki je bil v tkivu pred tem, da smo rastlino, poganjek ali list odrezali. Ker privzamemo, da je osmotska komponenta vodnega potenciala ksilemske tekočine zanemarljiva in da je ksilem v dobrem stiku z večino celic v tkivu, izmerjeni ksilemski potencial ustreza vodnemu potencialu merjene rastline oz. poganjka, lista. 15

tlak (+) = - Ψp ksilem - Ψw rastlina, poganjek, list Po končani meritvi izenačimo tlak v komori z atmosferskim in nadaljujemo z merjenjem naslednjega vzorca. Za vsako obravnavanje (različni režim zalivanja) izmerimo Ψw na večjem številu rastlin. Primerjamo povprečne vrednosti vodnega potenciala za različna obravnavanja. POZOR: Pri delu s tlačno komoro upoštevamo navodila za varstvo pri delu! REZULTATI: VAJA 2.1.: Merjenje vodnega potenciala s spremembo mase Objekt: koncentracija osmotika vodni potencial raztopine začetna sveža masa končna sveža masa sprememba mase sprememba mase v % Vodni potencial tkiva: 16

VAJA 2.2: Merjenje vodnega potenciala z mejno plazmolizo Mejno plazmolizo smo opazili pri koncentraciji. Vodni potencial tkiva znaša. VAJA 2.3: Merjenje vodnega potenciala s tlačno komoro obravnavanje vodni potencial (MPa) Vprašanja: 1. Katere so pomanjkljivosti metode merjenja vodnega potenciala z merjenjem spremembe mase? 2. Vodni potencial tkiva meriš z mejno plazmolizo. Preko koncentracije raztopine, pri kateri je prišlo do mejne plazmolize izračunaš Ψ. Ali je to res točna vrednost vodnega potenciala celice? 3. Zakaj rastlini, poganjku oz. listu pri merjenju s tlačno komoro ne smemo ponovno prirezati stebla, oz. peclja? 4. Zakaj je pomembno, da meritev s tlačno bombo opravimo v čim krajšem času po tem, ko smo poganjek oz. rastlino odrezali? 17

3. TRANSPIRACIJA Transpiracija je oddajanje vode iz nadzemnih delov kopenskih rastlin. Razlika v vodnem potencialu tal in vodnem potencialu zraka je gonilna sila za transpiracijski tok, t.j. gibanje vode iz tal, skozi korenine v rastlino in po rastlini skozi liste v atmosfero. Koliko vode rastlina odda s transpiracijo je odvisno od omenjene razlike v vodnem potencialu in pa od upora vodnemu toku, ki ga imajo vse tri komponente, tla, rastlina in mejna plast zraka. Transpiracijo, ki je enaka hitrosti oddajanja vode, lahko opišemo z enačbo: C wv (list) C wv (zrak) E = ------------------------------- (mol m -2 s -1 ) r s + r b C wv (list) in C wv (zrak) sta koncentraciji vodne pare v listu in zraku, izraženi v mol m -3. Namesto koncentracije lahko v enačbi uporabimo tlak vodne pare (P list, P zrak ), ki ga izražamo v kpa. Razliko v števcu formule imenujemo tudi deficit tlaka vodne pare (vapor pressure deficit). r s označuje upornost listnih rež, r b pa upornost mejne plasti zraka toku vode. Upornost lahko nadomestimo z recipročnim parametrom, ki ga imenujemo prevodnost g H20 (µmol m -2 s -1 ). Spremenjena enačba za transpiracijo se glasi: E = g H20 x (P zrak - P list ) Vaja 3.1: Merjenje transpiracije s potometrom Potometer je aparatura, s katero merimo sesalno silo, ki nastaja s transpiracijo. V našem primeru je to elektronski senzor, ki meri spremembo tlaka (pozitivno ali negativno) in jo pretvarja v napetost. Material: rastline ostrice (Cyperus sp.), sobne koprive (Coleus sp.), potometer z napajalnikom (Qubit Instruments, Kanada), voltmeter, PVC in silikonske cevke, laboratorijsko stojalo, prižeme, 1 L čaša, injekcijska brizgalka. Kemikalije: voda, silikonska mast Izvedba: Senzor za tlak priključimo na napajalnik in ga obesimo na laboratorijsko stojalo. Na en konec PVC cevke namestimo krajšo silikonsko cevko. Silikonska cevka naj bo ustreznega premera, tako da trdno objame steblo rastline. 18

Cevko napolnimo z vodo in zapremo stišček. Z britvico odrežemo poganjek rastline in odrezani konec poganjka takoj potopimo v vodo. 1 cm nad prvim rezom poganjek pod vodo še enkrat odrežemo. Tako preprečimo morebitne embolije. Poganjek pod vodo namestimo v silikonsko cevko. Preverimo, ali je stik s steblom zadosti dober in da v cevki ni zračnih mehurčkov. Pri tesnenju si lahko pomagamo s silikonsko mastjo. Rastlino dvignemo iz vode in jo vpnemo v laboratorijsko stojalo. Pri tem naj bo nivo odrezanega stebla pod nivojem senzorja za tlak (priključek za cevko). S siringo iz prostega dela cevke odvzamemo manjši volumen vode. Med tem mora biti rastlina, vpeta v drugem koncu cevke, vseskozi v stiku z vodo. Prosti del cevke priključimo na senzor za tlak. Pazimo, da voda ne pride v senzor! Vključimo voltmeter in spremljamo spremembo napetosti v odvisnosti od časa. Zveza med napetostjo in tlakom je naslednja: tlak (kpa) = napetost (V) x 20-4.44 Spremljamo spremembo tlaka v določenem času. Spremembo tlaka oz sesalno silo preračunamo na listno površino merjenega poganjka, oz. na površino lista. Primerjamo sesalno silo pri različnih rastlinah. Spreminjamo zunanje dejavnike, npr. upornost mejne plasti zraka (r b ), tako da na rastline pihamo s hladnim fenom. Vaja 3.2: Merjenje transpiracije s porometrom Porometer je merilni instrument, s katerim merimo transpiracijo in stomatalno prevodnost (prevodnost listnih rež) rastline. Osnova meritve je meritev vsebnosti vodne pare v zraku. Ker rastlina s transpiracijo vodo oddaja, lahko v nekem omejenem prostoru to izmerimo kot povečanje koncentracije vodne pare. Navadno je ta prostor merilna kiveta, v katero vpnemo list. Poleg senzorja za vlago je kiveta opremljena z dvema senzorjema za temperaturo, eden meri temperaturo lista, drugi temperaturo zraka v kiveti. Ventilator omogoča mešanje zraka v kiveti in zagotavlja enakomerno upornost mejne plasti zraka. Aparat (glej sliko 3.1) ima dva glavna sestavna dela: merilno kiveto in del, v katerem so nameščeni črpalka za zrak, merilec protoka zraka, mehanski ter elektronski deli, ki omogočajo fino regulacijo pretoka zraka, ter baterije in zaslon. Zrak, ki vstopa v aparat, je sušen (kolona s silikagelom), dodatno sušenje zagotavlja kolona s silikagelom, ki je nameščena na kiveti. Princip meritve je naslednji: pri merjenju rastline, ki transpirira, relativna vlaga v kiveti zaradi oddajanja vode naraste, ta porast pa izničimo z dovajanjem potrebne količine suhega zraka. Seveda je za to potrebno natančno merjenje vlage v kiveti in izredno natančna regulacija in kontrola pretoka suhega zraka. Preko pretoka suhega zraka lahko ovrednotimo intenziteto transpiracije. Upornost (prevodnost) listnih rež je računan parameter. Ker je upornost mejne plasti zraka konstantna in poznana in ker poznamo temperaturo lista ter razlike 19

v koncentraciji vodne pare, lahko z upoštevanjem difuzijskih zakonitosti (Fick-ov zakon) izračunamo r s oz. g H2O. Slika 3.1: Shema porometra (iz Pearcy in sod., 1992) Material: različne rastline, Na-visokotlačna luč Kemikalije: silikagel Izvedba: Po navodilih pripravimo aparat za merjenje. Zaporedoma merimo transpiracijo različnih rastlin. Primerjamo različne rastlinske vrste, vrste z različno anatomijo listov, in različno razvite liste na eni rastlini. Na različno osvetljenih rastlinah ugotavljamo, kako na odprtost rež vpliva svetloba. REZULTATI: 3.1. Potometer Rastlina: 20

sesalna sila na površino ( kpa m -2 ) čas (min) 3.2. Porometer: Rastlina obravnavanje trasnpiracija (mol m -2 s -1 ) prevodnost rež (μmol m -2 s -1 ) Vprašanja: 1. Zakaj moramo pri meritvi s potometrom, po tem, ko smo poganjek odrezali, steblo poganjka še enkrat odrezati pod vodo? 2. Ali s potometrom izmerimo dejansko vrednost transpiracije (primerjava z rastlino, ki raste v tleh)? 3. Naštej okoljske dejavnike, ki vplivajo na hitrost transpiracije! 21

4. ASIMILACIJSKI PIGMENTI Asimilacijski pigmenti so vsi tisti pigmenti, ki sodelujejo pri absorpciji, prenosu in pretvorbi energije fotosintetsko aktivnega sevanja za potrebe asimilacije CO 2, to je njegove fotosintetske redukcije. Kemijska narava skupin asimilacijskih pigmentov je različna. Klorofili so porfirini, za katere je značilna struktura štirih pirolovih obročev s centralnim Mg ionom, na osnovni skelet je zaestren fitol. Najpomembnejša klorofila sta klorofil a in klorofil b, poznamo še klorofila c in d. Če centralni Mg 2+ ion nadomestimo z dvema H + ionoma dobimo feofitin. Karotenoidi so tetraterpeni, med oranžno rdečimi karoteni je najpomembnejši β-karoten, oksidacijski produkti karotenov so ksantofili, ki so rumeni do rdeči. Pri višjih rastlinah in algah se v kloroplastih nahajajo naslednji ksantofili: lutein, violaksantin, kriptoksantin in zeaksantin: Pri nižjih rastlinah srečamo še druge skupine asimilacijskih pigmentov npr. fikobiliproteide (fikocian in fikoeritrin) pri modrozelenih cepljivkah in rdečih algah, hkrati pa se tu pojavljajo posebne oblike klorofilov in karotenoidov. V celici se pigmentne molekule nahajajo v tilakoidnih membranah kloroplastov, kjer so skupaj s proteinskimi molekulami povezane v fotosistemu I (PSI) in v fotosistemu II (PSII). Sestavni del vsakega fotosistema sta antenski kompleks, ki služi lovljenju svetlobe in pa reakcijski center, v katerem se vrši fotokemično delo, t.j. klorofil reakcijskega centra elektron odda. V antenskem kompleksu PSII sodeluje ca. 250 molekul klorofila a in klorofila b in več molekul ksantofilov. Vsi ti pigmenti delujejo kot pomožni (akcesorni) pigmenti. Po absorpciji svetlobe prenašajo energijo do reakcijskega centra, ki ga predstavlja glavni asimilacijski pigment, povezan s proteini. Pri rastlinah je to klorofil a. Skupna značilnost vseh asimilacijskih pigmentov je prisotnost konjugiranih dvojnih vezi v molekuli (Π-orbitale). Elektroni teh orbital lahko ob absorpciji fotona preidejo v višjo energetsko stanje. Pomožni asimilacijski pigmenti lahko po ekscitaciji prenesejo energijo na druge pigmentne molekule z resonanco. Vzbujena molekula inducira vzbujeno stanje v sosednji molekuli. V končni fazi se energija prenese na klorofil a - reakcijski center, ki odda energijo v obliki fotokemičnega dela, t.j. odda elektron, ki se v tilakoidi prenaša na druge prejemnike elektrona. Gre za transport elektronov proti redoks gradientu, to pa omogoča nastajanje NADPH + H + ter ATP v kasnejših fazah svetlobnih fotosintetskih reakcij. Funkcija pomožnih pigmentov ni samo prenos energije do glavnega asimilacijskega pigmenta, ampak tudi večja absorpcijska izkoriščenost svetlobnega spektra in tudi zaščita fotosintetskega aparata pri previsokih jakostih sevanja. Posledica različne kemijske strukture pri različnih asimilacijskih pigmentih so tudi razlike v absorpciji svetlobe. Absorpcijo fotosintetskih pigmentov lahko izmerimo na intaktnem listu in vivo (slika 4.1), pri čemer dobimo spekter, v katerem se prekrivajo absorpcijski spektri posameznih barvil, hkrati pa na absorpcijo vpliva tudi vezava pigmentnih molekul na druge molekule. Pigmentne molekule se nahajajo v tilakoidnih membranah kloroplasta vezane na proteine. Za ekstrakcijo pigmentov iz rastlinskega materiala lahko uporabimo različna organska topila npr. aceton, etanol, itd.. Iz izmerjenega absorpcijskega spektra ekstrakta je razvidno seštevanje spektrov posameznih pigmentov. 22

Vrhovi v absorpcijskem spektru predstavljajo absorpcijske maksimume posameznih barvil in so za njih karakteristični, čeprav so odvisni tudi od vrste uporabljenega topila. Če izmerimo absorpcijo ekstrakta pri točno določenih valovnih dolžinah, lahko z uporabo različnih računskih postopkov izračunamo vsebnost določenega pigmenta v ekstraktu. Pri tem gre v bistvu za odštevanje absorpcijskih spektrov. Če pa hočemo točno določiti absorpcijski spekter posameznega pigmenta, moramo pigmente najprej ločiti. V ta namen lahko uporabimo različne kromatografske tehnike od najbolj preprostih (papirna in tankoplastna kromatografija), do bolj kompliciranih, npr. tekočinske kromatografije velike ločljivosti (HPLC). Ločene pigmente določimo z izračunom retenzijskih faktorjev, nekatere lahko zaznamo z UV svetlobo. Izmerimo absorpcijo posameznega pigmenta v spektralnem območju od 300 do 800 nm in določimo absorpcijske vrhove. Če je bila separacija s kromatografijo uspešna in imamo čist ekstrakt enega pigmenta, dobimo absorpcijske vrhove pri točno določenih valovnih dolžinah. Ločbo in absorpcijo večkrat motijo tudi razgradni produkti asimilacijskih pigmentov, saj pigmenti ob vzorčenju in ekstrakciji zelo hitro razpadajo. Občutljivi so predvsem na svetlobo in pa visoke temperature, na kar moramo posebej paziti kadar opravljamo kvantitativno analizo pigmentov. Vaja 4.1 Absorpcijske lastnosti asimilacijskih pigmentov V vaji bomo opravili kvalitativno analizo asimilacijskih pigmentov v listih peteršilja. Po acetonski ekstrakciji bomo posamezne pigmente ločili s tankoplastno kromatografijo in izmerili njihove absorpcijske spektre, ter določili absorpcijske maksimume. Material: listi peteršilja, terilnica, erlenmajerica 250 ml, presesalna erlenmajerica z Büchnerjevim lijem, filtrirni papir, 4 pipete 5 ml, menzure 10 in 100 ml, plošče za tankoplastno kromatografijo, komora za razvijanje, sušilnik za plošče, priprava za nanašanje gela, eksikator, sušilec, rotavapor, centrifuga, centrifugirke, stojalo za centrifugirke, spatula, UV svetilka, spektrofotometer Kemikalije: Silikagel G po Stahlu, aceton, kloroform, heksan, dietileter, Na 2 SO 4, destilirana voda. Izvedba: Priprava plošč za kromatografijo: 30 g silikagela zmešamo s 60 ml destilirane vode v 250 ml erlenmajerici in ga nanesemo na plošče 250 µm na debelo. Aktiviramo jih v sušilniku 30 minut in jih do uporabe shranimo v eksikatorju. Ekstrakcija 20 g listov peteršilja stremo v terilnici z dodatkom kremenčevega peska in ekstrahiramo s 100 ml hladnega acetona. Dodamo malo Na 2 SO 4 za vezavo 23

vode. Filtriramo skozi Buechnerjev lij. Filtrat evaporiramo na rotavaporju in sušino raztopimo v 10 ml kloroforma. Slika 4.1: Spektroskopske karakteristike fotosintetskih pigmentov. Eksperimentalni material listi Sparmannia africana. a) Absorpcijski spekter intaktnega lista (in vivo) in surovega ekstrakta pigmentov. b) Absorpcijski spekter kromatografsko očiščenih klorofilov a in b c) Absorpcijski spekter luteina in β-karotena. V vseh primerih je bil kot topilo uporabljen dietileter (Mohr in Schopfer, 1995). 24

Kromatografija in spektrometrija: Na kromatografski plošči označimo start 3 cm od roba, 10 cm od starta začrtamo fronto. Na levi in desni strani odstranimo silikagel 1.5 cm od roba. Z 0.1 ml pipeto nanesemo v črti 0.5 ml ekstrakta, nanose sproti sušimo s sušilcem (hladen zrak). Ploščo razvijemo v mešanici heksan - dietileter - aceton 6:3:2 v/v. Izračunamo retenzijske faktorje posameznih pigmentov in pogledamo fluorescenco pod UV svetlobo. S plošče s spatulo odstranimo gel na mestih, kjer se nahaja posamezen pigment. Vsakemu vzorcu dolijemo po 5 ml acetona. Centrifugiramo 3 minute pri 1000 obratih, odpipetiramo supernatant in s spektrofotometrom izmerimo absorpcijske spektre v spektralnem območju od 400 do 700 nm. Vaja 4.2 Kvantitativno določevanje asimilacijskih pigmentov v rastlinskem tkivu Razlike v absorpcijskih značilnostih posameznih asimilacijskih pigmentov lahko izkoristimo tudi za določenje njihove količine v rastlinskem tkivu. Metoda je spektrofotometrična. Pigmente ekstrahiramo z organskim topilom (npr. aceton, dimetil sulfoksid ipd.) in s spektrometrom izmerimo absorpcijo pri različnih valovnih dolžinah. S pomočjo različnih enačb, ki se razlikujejo glede na vrsto uporabljenega topila, lahko izračunamo količino klorofila a in b ter vsebnost skupnih karotenoidov. V vaji bomo analizirali količino klorofilov in karotenoidov v različnih rastlinah. V analize bomo vključili tudi rastline iz Vaje 1 Mineralna prehrana rastlin. Poskušali bomo ugotoviti, kako se pomanjkanje posameznih kemijskih elementov odraža v vsebnosti fotosintetskih pigmentov. Material: listi oz. rastline z različno vsebnostjo pigmentov, oz. rastline sončnice in koruze, ki smo jih gojili v hidroponski raztopini brez posameznih mineralnih hranil (Vaja 1, tabela 1.1), terilnica, pestilo, merilni valj, lij, filtrirni papir, epruvete, centrifugirke, tehtnica, centrifuga, spektrofotometer Kemikalije: aceton, kremenčev pesek, Mg(HCO 3 ) 2, Na 2 SO 4 Izvedba: Vzorec rastlinskega materiala stehtamo. Za določevanje suhe mase vzorca lahko iz homogenega vzorca odvzamemo podvzorec, ki mu določimo svežo maso in po sušenju do konstantne mase še suho maso. Svež, stehtan material prenesemo v terilnico, dodamo kremečev pesek in Mg(HCO 3 ) 2.ter stremo. Dodajamo v zamrzovalniku ohlajen aceton. Filtriramo ali nučiramo (vakuumsko filtriramo). Vsebino v terilnici speremo s čistim acetonom, tako da povzamemo ves obarvan ekstrakt. S čistim acetonom na koncu oplaknemo tudi filtrirni papir. Izmerimo volumen ekstrakta, t.j. volumen porabljenega acetona. Del ekstrakta prenesemo v centrifugirko, dodamo ščepec Na 2 SO 4 za vezavo vode in centrifugiramo 5 min pri 3000 obratih min -1. Po centrifugiranju izmerimo absorpcijo supernatanta pri 470, 645 in 662 nm. Vsebnost posameznih barvil izračunamo po enačbah: 25

klorofil a: C a = 11.24 x A 662-2.04 x A 645 klorofil b: C b = 20.13 x A 645-4.19 x A 662 karotenoidi: C x+c = (1000 x A 470-1.9 x C a - 63.14 x C b ) / 214 Dokončne vsebnosti pigmentov v mg g -1 dobimo po upoštevanju sveže mase tkiva (ali še bolje suhe mase, če smo jo določili), iz katerega smo naredili ekstrakt = G (g) in ob upoštevanju volumna ekstrakta, t.j. volumna porabljenega acetona = V (ml). C y x V končna koncentracija: C y = ---------------- G x 1000 y = a, b, x+c REZULTATI 4.1 Absorpcijske lastnosti asimilacijskih pigmentov Skica kromatograma: 26

Pigment Retenzijski faktor (Rf) Absorpcijski vrhovi (nm) klorofil a klorofil b β karoten karotenoidi ksantofili feofitin a 4.2. Kvantitativno določevanje asimilacijskih pigmentov rastlina / vzorec Ca mg g -1 Cb mg g -1 razmerje Ca / Cb Cx+c mg g -1 Rastline iz vaje 1* polna - Ca - S - Mg - K - N - P - Fe - mikroelementi Rastline iz drugih obravnavanj * Vaja 1.1: Mineralna preharana rastlin, s kemijskimi simboli je označeno pomanjkanje posameznega elementa (glej tudi tabelo 1.1). 27

Vprašanja: 1. Zakaj se različna barvila razlikujejo glede svojih absorpcijskih lastnosti? Kakšen je fiziološki pomen teh razlik za rastlino? 2. Kakšno afiniteto imajo do stacionarne faze (silikagel) pigmenti, ki pri tankoplastni kromatografiji potujejo s fronto in kakšno tisti, ki ostanejo na startu? 3. Zakaj je pri kvantitativnem določanju pigmentov pomembno, da jih analiziramo hitro, pri tem uporabljamo hladna ekstrakcijska sredstva in delamo v zatemnjenem prostoru? 4. Pomanjkanje katerega mineralnega hranila se najmočneje odraža v zmanjšanju vsebnosti klorofila? 5. Kakšen je pomen železa in kakšen pomen magnezija za količino klorofila v tkivu? 28

5. FOTOSINTEZA - merjenje fotosinteze V rastlinskem svetu predstavlja fotosinteza enega najbolj značilnih fizioloških procesov. Izkoriščanje svetlobne energije za redukcijo CO 2 ima izreden pomen za večino metabolnih dogajanj v rastlini, hkrati pa tudi za biološko kroženje snovi v ekosistemu. Kompleksna dogajanja v procesu asimilacije ogljikovega dioksida nam predstavlja poenostavljena enačba: 6CO 2 + 6H 2 O + h υ C 6 H 12 O 6 + 6O 2 V splošnem lahko hitrost neke kemijske reakcije merimo bodisi s spremljanjem spremembe koncentracije reaktantov, bodisi z merjenjem koncentracije produktov reakcije. Tako lahko tudi fotosintezo merimo s spremljanjem spreminjanja koncentracij CO 2 ali O 2 v neki omejeni atmosferi, kot je npr. komora, v kateri imamo zaprto rastlino. Pri tem moramo upoštevati tudi druge fiziološke procese, pri katerih prihaja do izmenjave teh dveh plinov med rastlino in okoljem. To sta dihanje (respiracija) in svetlobno dihanje (fotorespiracija), pri katerih se O 2 porablja, CO 2 pa tvori. Meritve fotosinteze na svetlobi so torej spremljanje neto-fotosinteze (asimilacija + disimilacija). Merjenje fotosinteze: - merjenje tvorbe O 2 - oksimetri, kisikova sonda - kemijske metode (titracija po Winklerju) - merjenje porabe CO 2 - izotopske tehnike C-14 - infrardeči CO 2 analizator (infrared gas analyzer = IRGA) - kemijske metode (npr. preko sprememb ph v raztopini, ki veže CO 2 ) Sodobne izvedbe sistemov za merjenje fotosinteze omogočajo tudi uporabo na terenu, pri čemer so nabolj razširjeni sistemi z IRGA detektorjem, v primeru CAM rastlin se uporabljajo tudi sistemi z O 2 elektrodo, ki pa so manj priročni. Uporaba naziva "sistem" pri označbi aparata za merjenje, je posledica dejstva, da je fotosinteza v bistvu posredno merjen parameter, ter dejstva, da hkrati s koncentracijo CO 2 (O 2 ) spremljamo tudi različne druge parametre, ki vplivajo na proces fotosinteze. Njihovo spremljanje nam omogoča boljšo razlago rezultatov meritev. Nujno je spremljanje nekaterih abiotskih dejavnikov (svetloba, temperatura, relativna vlažnost) in drugih parametrov, pri katerih opravljamo meritev (npr. Pretok zraka v sistemu). Po drugi strani nam simultano spremljanje fotosinteze, transpiracije in stomatalne prevodnosti, ki je možno zaradi hkratnega merjenja sprememb koncentracij CO 2 in deleža izločene vodne pare v komori, omogoča kompleksnejšo sliko o dejanskem fiziološkem 29

stanju rastline. Povezanost fotosinteze in transpiracije temelji na istih difuzijskih poteh za CO 2 in H 2 O, velikost fotosinteze in transpiracije pa predstavljata nekakšen kompromis med obema procesoma v danih razmerah okolja. Oba procesa sta uravnavana s spremembami prevodnosti difuzijskih poti, pri čemer imajo najpomembnejšo vlogo listne reže. Prevodnost za vodo je ključna tudi za izračun nekaterih dodatnih parametrov pri meritvah fotosinteze kot je na primer koncentracija CO 2 v intercelularjih lista (Ci). Princip delovanja sistema za merjenje fotosinteze (sistem z infrardečim CO 2 analizatorjem - IRGA) Molekula CO 2 močno absorbira infrardečo svetlobo. Če kiveto z vzorcem zraka presvetlimo z IR virom (Ni-Cr žarnica, 600-800 C) in izmerimo energijo IR sevanja po prehodu skozi vzorec, lahko iz razlike izračunamo absorpcijo in ob primerni kalibraciji tudi koncentracijo CO 2 v vzorcu (Slika 5.1). Slika 5.1: Princip delovanja infrardečega CO 2 analizatorja IRGA. zrak IR vir kiveta z vzorcem IR detektor Analizator se lahko uporablja v različnih izvedbah sistemov za merjenje (laboratorijski sistemi, prenosni sistemi,...). Poleg analizatorja je bistveni sestavni del vsakega sistema merilna komora, kamor zapremo list, poganjek ali celo rastlino. Komora je opremljena s senzorjem za svetlobo in z ventilatorjem, ki preprečuje nastajanje zastojne plasti zraka na listni površini. Različne izvedbe komor nam omogočajo meritve fotosinteze tako na široko listnatih rastlinah, travah, kot tudi na iglavcih (cilindrična kiveta). Sisteme za merjenje fotosinteze lahko razdelimo na zaprte in odprte (Slika 5.2). Zaprti sistemi: Gre za merjenje sprememb kocentracije CO 2 v določenem časovnem intervalu. Če je asimilacija CO 2 večja od disimilacije, s časom koncetracija CO 2 v komori upada, zaradi transpiracije pa se veča delež vodne pare v zraku. 30

Slika 5.2: Shematski prikaz treh osnovnih tipov sistemov za merjenje fotosinteze. Sistemi za merjenje fotosinteze Zaprti Odprti Diferencialni Kompenzacijski zrak zrak CO2 črpalka merilnik pretoka merilnik pretoka kiveta kiveta kiveta IRGA Vzorčna celica Referenčna celica IRGA Vzorčna celica Referenčna celica IRGA Vzorčna celica Odprti sistemi: V listno komoro dovajamo zrak z določeno koncentracijo CO 2. Koncentracija CO 2, ki zapušča komoro, je zaradi fotosinteze rastline manjša, delež vodne pare pa zaradi transpiracije večji. Ob ustaljeni fotosintezi in transpiraciji, ter ob ustaljenem pretoku zraka skozi sistem, se v listni komori vzpostavi ravnotežno stanje. Sistem ima dva analizatorja, eden meri CO 2 v zraku iz listne komore, drugi meri referenčno vrednost CO 2 v zraku, ki ga vodimo mimo listne komore. S primerjavo obeh vrednosti lahko izračunamo velikost neto-fotosinteze rastline. Takšno izvedbo odprtega sistema imenujemo diferencialni odprti sistem. Poznamo še kompenzacijski odprti sistem, ki prav tako meri CO 2 v referenčnem in analiziranem zraku. Aktivnost rastline kompenziramo z dodajanjem CO 2 v sistem, tako da so vrednosti na obeh analizatorjih enake. Preko porabe CO 2 izračunamo fotosintetsko aktivnost. 31

Pri obeh izvedbah odprtih sistemov je nujna kontrola pretoka zraka skozi sistem. Vsi sistemi so opremljeni tudi s pomnilnikom, ki omogoča shranjevanje podatkov in njihov prenos na računalnik. Rezultate meritev fotosinteze pri listavcih izrazimo v μm CO 2 na časovno enoto (s, h), ter na listno površino (m 2 ). Pri meritvah iglavcev lahko zaradi težavne določitve površine iglic izrazimo časovno spremembo koncentracije CO 2 na projekcijsko površino poganjka, na množino klorofilov v merjenem poganjku ali na maso iglic. Vaja 5.1 Svetlobna odvisnost fotosinteze Anatomska zgradba lista, velikost, oblika in položaj listov ter razporeditev listov omogočajo rastlini učikovito sprejemanje svetlobe. Kljub temu je svetloba pogosto omejujoč dejavnik fotosinteze (npr. zaradi vremenskih razmer ali senčenja). Slika 5.3: Svetlobna odvisnost fotosinteze pri sončnih, senčnih in C 4 rastlinah. neto-fotosinteza ( µmol CO 2 m -2 s -1 ) 30 25 20 saturacija 15 10 sončne rastline 5 senčne rastline 0 kompenzacijska točka -5 0 250 500 750 1000 1250 1500 jakost svetlobnega sevanja ( µmol m -2 s -1 ) Če merimo fotosintezo (porabo CO 2 ) pri različnih jakostih svetlobe, ugotovimo, da pri majhnih jakostih svetlobe dihanje (sproščanje CO 2 ) prevladuje nad fotosintezo (vezava CO 2 ) in zaradi tega dobimo negativne vrednosti netofotosinteze. Svetlobna kompenzacijska točka je tista jakost sevanja, pri kateri 32

sta fotosintetska vezava in respiracijsko sproščanje CO 2 uravnotežena. Neto fotosinteza je enaka nič. Če jakost svetlobe povečujemo, se nekaj časa veča tudi fotosinteza. Svetlobna saturacijska točka oz. saturacijsko območje je tista jakost sevanja, pri kateri se fotosintetska vezava CO 2 ustali in tudi s povečevanjem osvetlitve ne moremo doseči večje fotosinteze, ali pa je njen porast neznaten. Na ta način izmerjeno svetlobno odvisnost fotosinteze lahko prikažemo s krivuljo (Slika 5.3). Svetlobna odvisnost fotosinteze je odvisna od vrste rastline in od rastnih razmer (senčne rastline, sončne rastline). Veljavna SI mera za jakost fotosintetsko aktivnega sevanja je gostota toka fotonov v fotosintetskem delu svetlobnega spektra (PPFD) z enoto µmol m -2 s -1. V praksi se pogosto uporablja mikro Einstein (1 µe = 1µmol m -2 s -1 ). V vaji bomo s prenosnim diferencialnim sistemom za merjenje fotosinteze prikazali svetlobno odvisnost fotosinteze pri fižolu. Material: senčne in sončne rastline navadnega fižola (Phaseolus vulgaris L.), navadne sončnice (Helianthus annuus L.) in navadne koruze (Zea mays L.), prenosni sistem za merjenje fotosinteze LiCor-6400 (Licor, Lincoln, U.S.), LCA- 3 in LCA-4 (ADC Instruments, VB), umeten vir svetlobe (visokotlačna Na-luč, 400W, Philips). Izvedba: Po navodilih pripravimo aparat za merjenje fotosinteze. Prižgemo Na visokotlačno luč. Rastline fižola pred meritvijo za 15 do 30 minut postavimo pred svetlobni vir, da se fotosintetski aparat prilagodi na večjo jakost svetlobe. Pripravimo sistem za merjenje. Prvo meritev opravimo pri večji jakosti svetlobe (npr.1000 μe), nato pri vsaki meritvi lonček z rastlino nekoliko odmaknemo od luči, ter ponavljamo meritve pri manjših osvetlitvah (700, 500, 300, 100 μe). Opravimo približno pet meritev, najmanj eno takšno, da izmerimo povečanje koncentracije CO 2 (dihanje > fotosinteza). Pri vsaki meritvi preverjamo pretok zraka skozi sistem, pri meritvah pri velikih osvetlitvah smo zaradi možnosti pregrevanja posebej pozorni na temperaturo v listni komori. Rezultate meritev (neto fotosinteza, PPFD) si sproti zapisujemo, da lahko takoj skiciramo grobo krivuljo svetlobne odvisnosti fotosinteze pri fižolu. Poskušamo oceniti svetlobno kompenzacijsko točko ter svetlobno saturacijsko točko. Isto vajo opravimo tudi z merilnim aparatom LiCor-6400, ki nam omogoča avtomatsko snemanje svetlobnih krivulj fotosinteze. Vaja 5.2 Odvisnost fotosinteze od koncentracije CO 2 Odvisnost fotosinteze od parcialnega tlaka CO 2 ali koncentracije CO 2 v listu (Ci) je precej podobna svetlobni odvisnosti. Pri zelo majhnih koncentracijah CO 2, je razmerje med v fotosintezi vezanim CO 2 in pri dihanju sproščenim CO 2 v prid slednjemu. Govorimo o negativni neto fotosintezi. Koncentracijo CO 2, kjer sta 33

oba procesa uravnotežena, označujemo kot CO 2 kompenzacijsko točko (neto iztok CO 2 = 0). Pri C 3 rastlinah se z nadaljnjim povečevanjem koncentracije CO 2 fotosinteza povečuje v širokem koncentracijsekm območju, preden pride do zasičenja. Pri manjših do zmernih koncentracijah CO 2 je fotosinteza omejena s karboksilacijsko kapaciteto encima ribuloza-bifosfat karboksilaza (RUBISCO). Pri večjih koncentracijah CO 2 je glavni omejujoč dejavnik encimska regeneracija ribuloze-1,5-bifosfata v Calvinovem ciklu. V listih se koncentracija CO 2 (Ci) uravnava na vrednost, ki je med obema omenjenima omejitvama. Za razliko od C 3 rastlin imajo C 4 rastline razvit mehanizem za koncentriranje CO 2. To se odraža tudi na krivulji CO 2 odvisnosti fotosinteze. Manjše povečanje atmosferskega CO 2, oz. CO 2 v listu vodi v močno povečanje fotosintetske aktivnosti, hitro pa pride do nasičenja, ko nadaljnje povečevanje koncentracije CO 2 ne vpliva več na fotosintezo. Majhna stopnja svetlobnega dihanja (fotorespiracije) C 4 rastlin se odraža v zelo nizki kompenzacijski točki, blizu nič. Material: senčne in sončne rastline nevednega fižola (Phaseolus vulgaris L.), navadne sončnice (Helianthus annuus L.) in navadne koruze (Zea mays L.), prenosni sitem za merjenje fotosinteze LiCor-6400 (Licor, Lincoln, U.S) Izvedba: Po navodilih pripravimo aparat za merjenje fotosinteze. Uporabimo svetlobo jakosti 1500 µmol m -2 s -1. Fotosintezo merimo pri 50, 100, 200, 300, 400, 600, 1000, 1500 in 2000 ppm CO 2. Primerjamo krivulje CO 2 odvisnosti posameznih rastlin (C 3 in C 4 ). REZULTATI: Vaja 5.1 Svetlobna odvisnost fotosinteze Opis razmer, pri katerih so bile gojene posamezne rastline: Rastlina Razmere gojenja Oznaka na grafu 34