VALIDACIJA ANALITIČKIH METODA KAO ZAHTJEV PRAVILNIKA O POSEBNIM UVJETIMA (NN 74/13) Sonja Tolić, Gordana Bach, Sandra Šikić, Adela Krivohlavek 13. Stručni sastanak laboratorija ovlaštenih za ispitivanje voda, Vodice 2014.
Prema Pravilniku o posebnim uvjetima za obavljanje djelatnosti uzimanja uzoraka i ispitivanja voda (NN 74/13), članak 10. Uvjeti posebne osposobljenosti stranka mora ispunjavati i sljedeće uvjete posebne osposobljenosti: da je prethodno akreditirana kod Hrvatske akreditacijske agencije sukladno normi HRN EN ISO/IEC 17025 za najmanje jednu metodu za jedan pokazatelj ili skupinu pokazatelja te ako primjenjuje druge metode osim onih akreditiranih iste moraju biti dokumentirane i validirane u skladu s normom HRN EN ISO/IEC 17025 ili drugim jednakovrijednim međunarodno priznatim normama. Osnovna zadaća svakog analitičkog laboratorija - postizanje brzih, točnih i vjerodostojnih rezultata analize. Analitičke metode opisati u onom obliku i opsegu kako bi se njihovom primjenom dobili točni i pouzdani rezultati validacija analitičkih metoda
Validacija se provodi: prije primjene nove (interne) metode nenormirane metode normirane metode koja se upotrebljava izvan mjernog područja kod proširenja i preinake metode Prije provedbe validacije definiraju se parametri validacije i kriteriji njihove prihvatljivosti. Odabir parametara validacije radi se prema vrsti i namjeni metode.
Validaciju analitičkih metoda možemo definirati kao postupak kojim se osiguravaju točni, precizni i reproducibilni rezultati tijekom dugoročnoga korištenja metode. Validacijom se postiže veliki stupanj pouzdanosti i pogodnosti metode. Osnovna načela validacije analitičari su primjenjivali i davno prije kod razvoja metode. Međutim, tada se taj postupak nije nazivao validacijom analitičkih metoda i nije bio popraćen danas potrebnom, temeljitom i opsežnom dokumentacijom. Validacije metoda postale rutina u laboratorijima.
Osnovna načela validacije analitičkih metoda VALIDACIJA = postupak kojim dokazujemo da naša metoda služi svrsi koju smo joj namijenili. Validacijom se utvrđuju postupci, tj. planiraju i provode eksperimenti čije rezultate treba prikupiti i prikazati kao dokaze o validaciji metode. Validacija kvalitativnih i kvantitativnih metoda; razlikuju se postupci validacije metode kojom se određuje analit prisutan u većoj koncentraciji i one kojom se određuju tragovi u kompleksnoj matrici. Svakoj se metodi pristupa individualno. Osam osnovnih parametara, tj. izvedbenih značajki validacije: specifičnost /selektivnost linearnost radno područje preciznost ponovljivost, eng. repeatability međupreciznost (eng. intermediate precision) obnovljivost (eng. reproducibility) istinitost (eng. trueness) granica kvantifikacije granica detekcije postojanost /robusnost
Specifičnost /selektivnost svojstvo je metode da točno i specifično odredi željeni analit u prisutnosti ostalih komponenata u matrici uzorka pod utvrđenim uvjetima ispitivanja. Specifična metoda - može se odrediti samo jedan specifični analit. Selektivna metoda - može se određivati više komponenata istodobno, ali pod uvjetom da te komponente pri određivanju ne smetaju jedna drugoj. Dokazuje se usporedbom odziva metode na referencijski materijal i analit u uzorku. Linearnost je određena kao mogućnost metode da unutar određenog područja daje ispitne rezultate proporcionalne koncentraciji analita u uzorku. Određuje se mjerenjem odziva metode na različite poznate koncentracije referencijskog materijala. Procjenjuje se matematički i grafički. y = ax + b k 0,99 Radno područje je raspon između gornje i donje koncentracijske granice analita u uzorku koje se mogu kvantificirati uz odgovarajuću preciznost, istinitost i linearnost. Određuje se iz linearnosti. Sužavanjem područja na koncentracijski raspon uzoraka postižu se bolja točnost i preciznost metode. Kad se očekuju uzorci sa širokim rasponom koncentracija, bolje je definirati maksimalno područje metode.
Preciznost metode definiramo kao izraz slaganja između niza mjerenja provedenih iz istog homogenog uzorka prema propisanom analitičkom postupku. Ovisno o uvjetima u kojima se određuje razlikujemo: 1. ponovljivost jedan laboratorij, isti analitičar, isti instrument, kratko razdoblje. 2. međupreciznost isti laboratorija kroz dulje razdoblje uz očekivane promjene nekih uvjeta (različiti analitičari, instrumenti, reagensi iz različitih boca i različitih dobavljača). 3. obnovljivost različiti laboratoriji; taj se parametar određuje u svrhu normiranja metode i rijetko ga provodi sam laboratorij. Eksperimentima preciznosti kvantificiraju se slučajne pogreške metode, a numerički je pokazatelj standardna devijacija, koeficijent varijacije ili varijanca. Iznimno je važno mjerenja koja se ponavljaju provoditi u uvjetima koji su što sličniji onima pri rutinskoj uporabi metode. Eksperimenti preciznosti se rade na homogenom stvarnom uzorku, odnosno pripremljenom uzorku.
Istinitost metode definira se kao stupanj podudaranja između stvarne, tj. prihvaćene referencijske vrijednosti i srednje vrijednosti dobivene primijenjenim postupkom određeni broj puta. Brojčani pokazatelj istinitosti eksperimentalno je utvrđeno sustavno odstupanje (eng. bias) metode, a dobiven je kao razlika aritmetičke sredine rezultata i referencijske vrijednosti. Eksperimenti se provode nakon određivanja selektivnosti, linearnosti i preciznosti, najmanje tri puta za najmanje tri koncentracijske razine unutar radnog područja metode. Raspon koncentracija treba odgovarati stvarnom uzorku, ali treba uključiti i koncentraciju na granici kvantifikacije (GK) kada je ona bitna. Istinitost metode moguće je procijeniti na nekoliko načina: usporedbom rezultata ispitivane metode s rezultatima dobivenim referencijskom metodom analizom uzorka poznate koncentracije, npr. certificiranoga referencijskog materijala i usporedbom izmjerenih rezultata i certificiranih vrijednosti nacijepljivanjem matrice ili uzorka poznatom koncentracijom referencijskog materijala.
Nekoliko praktičnih napomena povezanih s istinitošću: matrica ili uzorak nacijepe se dodavanjem referencijskog materijala na samom početku postupka tako da nacijepljeni uzorak bude podvrgnut cjelokupnom postupku od pripreme uzorka do mjerenja iskorištenje ovisi o matrici uzorka, postupku uzorkovanja i koncentraciji analita kod kromatografskog određivanja više komponenta treba odrediti čimbenike odziva za svaku komponentu ako se sve određuju preko istoga referencijskog materijala
Granica detekcije/kvantifikacije najmanja je količina analita u uzorku koja se može detektirati/kvantificirati uz odgovarajuću preciznost i točnost. Određuje se razrjeđivanjem osnovne otopine. Procjena može biti vizualna (omjer signal/šum) ili statistička. Vizualna se procjena može primijeniti i kod neinstrumentalnih i instrumentalnih metoda, uglavnom samo za granicu detekcije, a procjenjuje se najmanji signal koji se nedvojbeno može prepoznati. Omjer signal/šum može se primijeniti samo na analitičke postupke s baznom linijom, a prihvatljivi su omjeri 3 : 1 za granicu detekcije i 10 : 1 za granicu kvantifikacije. Statistički se granice detekcije i kvantifikacije mogu odrediti na bazi standardne devijacije signala i nagiba prema jednadžbama: GD = 3,3 σ/a GK = 10 s/a pri čemu je a nagib, a s standardna devijacija regresijskog pravca.
Zahtijev da metoda ima zadanu preciznost na granici kvantifikacije - pripremi se više uzoraka poznate koncentracije u području oko moguće GK, svaki se izmjeri 5 6 puta i izračunaju se RSD za svaku koncentraciju. Grafički se prikaže odnos RSD-a prema koncentraciji i iz grafa odredi koncentracija na GK s točno određenom preciznošću. Parametar GK važan kod metoda kojima se određuju analiti u tragovima koji i u vrlo niskim koncentracijama mogu štetno djelovati na zdravlje ljudi i okoliš. Robusnost (grubost) je otpornost na promjene rezultata kada se dogode mala, namjerna odstupanja radnih uvjeta metode. Provodi se kako bi se odredilo kako male promjene radnih uvjeta i provedbe metode utječu na rezultat analize. Tijekom eksperimenta mijenjaju se radni uvjeti unutar stvarnih granica i prati kvantitativna promjena rezultata. Ako promjena nekog radnog uvjeta ne utječe bitno na rezultat, kaže se da je on u području robusnosti metode.
Pri provedbi validacije nije potrebno za svaku metodu odrediti sve parametre. Odabir parametara ovisi o namjeni metode. Razumijevanje značenja pojedinih parametara i načina na koji se izvode u laboratoriju, poznavanje značajka metode i regulatornih zahtjeva osnova su za postavljanje kriterija prihvatljivosti za svaki parametar, što je također neizostavni dio validacije. Postavljeni kriteriji uspoređuju se s dobivenim rezultatima eksperimenata, a zadnji je korak validacije pisanje izvješća s jasno naznačenom izjavom da metoda odgovara namijenjenoj svrsi.
Zaključak: Validacija analitičke metode = značajan angažman analitičara Validacijom analitičke metode dobit će se obavijesti o: 1. točnosti i preciznosti, 2. odnosu između koncentracije uzorka i odziva metode, 3. mogućim interferencijama iz matrice uzorka, 4. najmanjim koncentracijama koje će se moći utvrditi ili kvantificirati tom metodom i doznat će se njezine najslabije, ali i najjače strane. Validacija analitičkih metoda je regulatorni zahtjev kao i profesionalna odgovornost analitičara jer korištenje validiranih metoda pruža sigurnost analitičarima i vjerodostojnost njihovim rezultatima.
Hvala na pažnji