MOLECULAR DIAGNOSTICS

Transcript

1 MOLECULAR DIAGNOSTICS (Μοριακή Διαγνωστική) Αγγελική Μαγκλάρα, PhD Eργαστήριο Κλινικής Χημείας Iατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

2 Μοριακή Διαγνωστική Ορισμός... Eφαρμογή τεχνικών Μοριακής Βιολογίας στην ανάλυση βιολογικών δεικτών στο ανθρώπινο γονιδίωμα (genome) και πρωτέωμα (proteome).

3 Μοριακή Διαγνωστική Στόχοι: προσδιορισμός κινδύνου εμφάνισης της νόσου (risk detection) διάγνωση και παρακολούθηση της νόσου καθορισμός πιο κατάλληλης θεραπείας (εξατομικευμένη ιατρική)

4 Personalized Medicine (εξατομικευμένη Ιατρική) Χρησιμοποιεί το γενετικό προφίλ ενός ατόμου για τη λήψη αποφάσεων όσον αφορά την πρόληψη, διάγνωση και θεραπεία της νόσου. Προωθείται μέσω των δεδομένων από το Human Genome Project (Πρόγραμμα του Ανθρώπινου Γονιδιώματος).

5 Human Genome Project 90% of genome was sequenced by July human genes complete sequence in April 2003 Till 1990 there were only 53 known genes that carried disease -causing mutations Today: >2900 genes with mutations in disease

6 Σημασία για τις ανθρώπινες νόσους... Ανακάλυψη και ταυτοποίηση νέων μοριακών δεικτών και χρησιμοποίησή τους για την ανάπτυξη νέων μοριακών δοκιμασιών για την ανίχνευση, διάγνωση, και την πρόβλεψη της πορείας της νόσου. Επιτρέπουν: την παρακολούθηση ασθενειών με μεγαλύτερη ακρίβεια την έγκαιρη θεραπευτική αγωγή και την καλύτερη φροντίδα των ασθενών με τον καθορισμό της πλέον κατάλληλης θεραπείας Μειώνει ή εξαλείφει περιττή θεραπεία. Μειώνει ή εξαλείφει ανεπαρκή θεραπεία. Μειώνει το κόστος, αυξάνει την αποτελεσματικότητα. τη μείωση της νοσηρότητας και της θνησιμότητας των ασθενών

7 Τεχνολογία... Amplification Techniques PCR (polymerase chain reaction) LCR (ligase chain reaction) NASBA (nucleic-acid sequence-based amplification) DNA Sequencing Sanger sequencing Next generation sequencing Biochip Technology DNA microarrays Protein microarrays

8 Electrophoretic Methods SSCP (single-strand conformation polymorphism) detection of DNA polymorphisms largely replaced by DNA sequencing DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) RFLP (restriction fragment length polymorphism) Genome mapping Genetic disease analysis Genetic fingerprinting Paternity test Hybridization Techniques (largely replaced by PCR) Southern hybridization Blot Detection of DNA Northern hybridization Blot Detection of RNA

9 Polymerase Chain Reaction

10 Performing PCR Reaction mix for DNA synthesis: Primers dntps DNA polymerase Buffer (KCL, MgCl2, Tris) DNA template Thermocycling Denaturation temperature Reduce double stranded molecules to single stranded molecules o C, 20 seconds Annealing temperature Controls specificity of hybridization o C, 20 seconds Extension temperature Optimized for individual polymerases o C, 30 seconds Amplification (30-40 cycles)

11 Preparation of PCR reactions PCR in thermocycler Preparation of agarose gel Loading PCR samples on gel Agarose gel electrophoresis Gel after electrophoresis

12 Preparation of PCR reactions PCR in thermocycler Preparation of agarose gel Loading PCR samples on gel Agarose gel electrophoresis Gel stained with EtBr under UV

13 Diagnostic PCR Amplification from Patient Samples

14 Είδη τεχνικών PCR RT-PCR (Reverse Transcription) Μεταγραφή του RNA σε cdna PCR. Χρησιμοποιείται για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και την ποσοτικοποίηση επιπέδων mrna

15

16 Είδη τεχνικών PCR RT-PCR (Reverse Transcription) Μεταγραφή του RNA σε cdna PCR. Χρησιμοποιείται για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και την ποσοτικοποίηση επιπέδων mrna Quantitative Real Time PCR Yπερευαίσθητη τεχνική που μετρά την συγκέντρωση των προϊόντων PCR στην εκθετική φάση Τεχνική Taqman Xρήση φθοριζουσών χρωστικών που ενσωματώνονται στο DNA (π.χ. Sybr Green)

17 3 phases of PCR EtBR staining Exponential: exact doubling of product is accumulating at every cycle (100% efficiency). Reaction is very specific and precise Linear: reaction components are consumed, reaction is slowing Plateau: Reaction has stopped, no more products are being made

18 Real-Time PCR threshold threshold 22 A=26.5 B=31.5 C=41.5 DNA: A>B>C

19 Several PCR kits are FDA-approved ( ) Abbott RealTime HCV Genotype II (Reverse Transcription PCR) Genotype Detection 1a, 1b, 1, 2, 3, 4, 5, 6 BRACAnalysis CDx (Myriad genetics- ovarian cancer) The presence of mutations resulting in defective BRCA gene products indicates that a patient may be selected for treatment with Lynparza (olaparib) THxID -BRAF Kit for use on the ABI 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument therascreen EGFR RGQ PCR Kit (Qiagen) cobas EGFR, ΚRAS Mutation Test (Roche)

20 DNA Sequencing Sanger sequencing (chaintermination method) Developed in 1977 by Fred Sanger (Nobel in 1980) Based on selective incorporation of terminating dideoxynucleotides (radioactively or fluorescently labeled) Used in the Human Genome Project

21 DNA Sequencing Next-generation (or high-throughput) sequencing Illumina (Solexa) sequencing Sequencing by synthesis (detection of fluorescent nucleotides) Roche 454 sequencing Pyrosequencing (detection of pyrophosphate released) Ion torrent: Proton / PGM sequencing Detection of H+ released during DNA polymerization SOLiD sequencing

22 NGS Sequencing in the Clinic MiSeqDX Illumina system for diagnostic purposes FDA clearance (In Vitro Diagnostic): MiSeqDX instrument Kit for Cystic Fibrosis Universal kit

23 NGS Sequencing in the Clinic PyroMark24 (96) Qiagen pyrosequencing system Used in Europe (marked as therascreen, IVD) KRAS NRAS EGFR BRAF

24 DNA Microarrays (μικροσυστοιχίες) Normal cell Isolate mrnas Make fluorescent cdnas Add to DNA microarray Red matches No matches Scanned microarray Red matches

25 Εφαρμογές της Μοριακής Διαγνωστικής - Διάγνωση μολυσματικών ασθενειών HPV Chlamydia Hepatitis HIV Toxoplasmosis -Γενετική ταυτοποίηση (genetic profiling) Parental testing Forensics - Διάγνωση γενετικών ασθενειών -Φαρμακογονιδιωματική (Pharmacogenomics)

26 Διάγνωση γενετικών ασθενειών Μεταλλάξεις σε μονογονιδιακές νόσους (monogenic diseases) Κληρονομική προδιάθεση (genetic risk factors) σε πολυπαραγοντικές νόσους

27 Συχνές μονογονιδιακές νόσοι Μεσογειακή αναιμία (thalassaemia) Δρεπανοκυτταρική αναιμία (sickle cell anemia) Aιμορροφιλία (Haemophilia) Κυστική Ίνωση (Cystic Fibrosis) Σύνδρομο εύθραυστου Χ (Fragile X syndrome) Νόσος του Huntington

28 Φαρμακογονιδιωματική είναι η μελέτη του πώς τα γονίδια επηρεάζουν την ανταπόκριση ενός ατόμου σε συγκεκριμένα φάρμακα.

29 Η φαρμακογονιδιωματική στο μεταβολισμό φαρμάκων Κυτόχρωμα P450 γονίδια μεταβολίζουν 80% φαρμάκων Έχουν πολλαπλά αλληλόμορφα (SNPs) Poor Intermediate Normal Ultra-rapid CYP2C9 reduced clearance of warfarin (αντιπηκτικό) CYP2C19 activation of clopidogrel (αντιπηκτικό) CYP2D6 activation of tamoxifen (αντιοιστρογόνο)

30 Molecular Diagnostics in cancer management

31 1. Risk assessment (εκτίμηση του κινδύνου-γενετική προδιάθεση)

32 Ποιος θα πρέπει να υποβληθεί σε γενετικές εξετάσεις για τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου; Το προσωπικό ή οικογενειακό ιστορικό υποδεικνύει τον κίνδυνο εμφάνισης κληρονομικού καρκίνου. Επαρκής ερμηνεία των αποτελεσμάτων (δηλαδή, μπορούν να πουν με σαφήνεια αν μια συγκεκριμένη γενετική αλλαγή είναι παρούσα ή όχι). Τα αποτελέσματα παρέχουν πληροφορίες που θα βοηθήσουν στην καθοδήγηση της μελλοντικής ιατρικής φροντίδας του ατόμου. Source: NCI

33 Kληρονομικές μορφές καρκίνου Hereditary breast cancer and ovarian cancer syndrome Genes: BRCA1, ΒRCA2 Related cancer types: Female breast, ovarian, and other cancers, including prostate, pancreatic, and male breast cancer Li-Fraumeni syndrome Gene: TP53 Related cancer types: Breast cancer, soft tissue sarcoma, osteosarcoma (bone cancer), leukemia, brain tumors, adrenocortical carcinoma and other cancers Cowden syndrome (PTEN hamartoma tumor syndrome) Gene: PTEN Related cancer types: Breast, thyroid, endometrial (uterine lining), and other cancers Lynch syndrome (hereditary non polyposis colorectal cancer) Genes: MSH2, MLH1, MSH6, PMS2, EPCAM Related cancer types: Colorectal, endometrial, ovarian, renal pelvis, pancreatic, small intestine, liver and biliary tract, stomach, brain, and breast cancers Source: NCI

34 Familial adenomatous polyposis (οικογενής αδενωματώδης πολυποδίαση) Gene: APC Related cancer types: Colorectal cancer, multiple non-malignant colon polyps, and both non-cancerous (benign) and cancerous tumors in the small intestine, brain, stomach, bone, skin, and other tissues Retinoblastoma Gene: RB1 Related cancer types: Eye cancer (cancer of the retina), pinealoma (cancer of the pineal gland), osteosarcoma, melanoma, and soft tissue sarcoma Multiple endocrine neoplasia type 1 (Wermer syndrome) Gene: MEN1 Related cancer types: Pancreatic endocrine tumors and (usually benign) parathyroid and pituitary gland tumors Multiple endocrine neoplasia type 2 Gene: RET Related cancer types: Medullary thyroid cancer and pheochromocytoma (benign adrenal gland tumor) Von Hippel-Lindau syndrome Gene: VHL Related cancer types: Kidney cancer and multiple noncancerous tumors, including pheochromocytoma Source: NCI

35 BRCA1 και BRCA2 Ογκοκατασταλτικά γονίδια απαραίτητα για την επιδιόρθωση του DNA. ~20-25% των κληρονομικών μορφών καρκίνου του μαστού και ~5-10% όλων των καρκίνων του μαστού. ~15% των καρκίνων των ωοθηκών 55-65% και ~45% των γυναικών που κληρονομούν μια επιβλαβή μετάλλαξη στο BRCA1 ή στο BRCA2 αντίστοιχα θα αναπτύξουν καρκίνο του μαστού μέχρι την ηλικία των % των γυναικών με μετάλλαξη στο BRCA1 και 11-17% με μετάλλαξη στο BRCA2 θα αναπτύξουν καρκίνο των ωοθηκών. Πηγή: NCI

36 Mεταλλάξεις στο BRCA1 Χρωμόσωμα 17 >600 μεταλλάξεις 1863 αμινοξέα 11a 11b 11c 11d Εξώνιο 20: 5382insC, R1751X, G1738R Εξώνιο 23: 5586G>A 1623del5, 3099delT, 3277insG, R1203X, 3741insA, 3896delT (exon 11) Πηγή: Ελληνική Εταιρεία Μαστολογίας

37 Mεταλλάξεις στο BRCA2 Χρωμόσωμα 13 >300 μεταλλάξεις 3418 αμινοξέα 10 11a 11b 11c 11d 11e 11f G4X 2024del5, 3034del4, 3058delA, 4147delG, 6024delTA, 6631del5 Πηγή: Ελληνική Εταιρεία Μαστολογίας

38 2. Screening (Προσυμπτωματικός έλεγχος)

39 Ηuman Papilloma Virus FDA-approved DNA test for women >25 yrs (april 14) primary screening tool in 2011 it was approved as a tool with or after Pap-test detects 14 high-risk HPV types associated with cervical cancer Roche: Real-Time PCR

40 3. Diagnosis and Prognosis (Διάγνωση-Πρόγνωση)

41 Old Way Patient s tissue sample Pathology New Way Proteomics Proteins Mass spectrometry Proteomic image Patient s tissue sample or blood sample Genomics DNA Gene chip Microarray image

42 DNA microarrays to compare Cancer Cells to Normal Cells Normal cell Cancer cell Isolate mrnas Make red and green fluorescent cdnas Add to DNA microarray Both red and green match Only green matches No matches Scanned microarray Only red matches

43 Making Sense of the Data Cancer gene expressed 18 times more than normal gene

44 Moριακή ταξινόμηση του καρκίνου του μαστού

45 «Κλασσική» ταξινόμηση Histopathology ductal (in situ or invasive) and invasive lobular carcinoma Grade well differentiated (low-grade), moderately differentiated (intermediate-grade), and poorly differentiated (high-grade) Stage (TNM classification) Size (T), lymph node metastases (N), distal metastases (M) Receptor status ΕR, PR, HER2

46 Gene expression patterns of 85 experimental samples representing 78 carcinomas, three benign tumors, and four normal tissues, analyzed by hierarchical clustering. 427 γονίδια είχαν τη μεγαλύτερη διακύμανση στην έκφρασή τους και χρησιμοποιήθηκαν για την ομαδοποίηση των όγκων >8000 γονίδια Sørlie T et al. PNAS 2001;98:

47 Breast Cancer Subtypes Determined by Luminal (λοβιακός) Luminal A Luminal B HER2+ Basal-like Νormal breast-like Gene Expression Profiling

48 Χαρακτηριστικά των μοριακών υποτύπων Luminal A 40% καρκίνων μαστού υψηλό βαθμό έκφρασης ΕR, PR και σχετικών γονιδίων χαμηλό βαθμό έκφρασης των Her2 clusters χαμηλό βαθμό έκφρασης γονιδίων πολλαπλασιασμού Luminal Β 20% των καρκίνων μαστού, μειωμένο βαθμό έκφρασης ER, PR διάφορο βαθμό έκφρασης των Her2 clusters υψηλό βαθμό έκφρασης γονιδίων πολλαπλασιασμού

49 Χαρακτηριστικά των μοριακών υποτύπων Her2 θετικών 10%-15% του καρκίνου του μαστού υψηλό βαθμό έκφρασης των Her2 clusters υψηλό βαθμό έκφρασης των γονιδίων πολλαπλασιασμού χαμηλό βαθμό έκφρασης ΕR, PR Basal-like (συχνά ταυτίζονται με τριπλά αρνητικούς) - 15% του καρκίνου του μαστού - συνήθως ER/PR/HER2 αρνητικοί - συχνές BRCA1 μεταλλάξεις

50 Γιατί οι γιατροί ενδιαφέρονται για τους μοριακούς υποτύπους του καρκίνου του μαστού;

51 Διαφορετική πρόγνωση Luminal A: καλή πρόγνωση Διαφορετική ανταπόκριση σε θεραπείες Luminal A: oρμονική Luminal B: δυσμενέστερη πρόγνωση από Α Luminal B: ορμονική και χημειοθεραπεία HER2 Basal-like κακή πρόγνωση HER2: αντισώματα αντι-her2 Basal-like: χημειοθεραπεία

52 Τhe genomic and transcriptomic architecture of 2000 breast tumours reveals novel subgroups DNA microarrays SNPs Copy number variation Gene expression Cluster Outlook Copy number defects Comparisons and other notes 1 Intermediate Chromosome 17 Luminal B -like, generally ER+ 2 Poor 2 x faults on Mixture of luminal A&B chromosome 11 3 Good Very few Luminal A -like 4 Good Very few, mainly High levels of immune cells immune system genes in tumour 5 Extremely Chromosome 17 (Her2 Mixture of Luminal B and poor gene) Her2 6 Intermediate Region of chromosome ER+, generally Luminal 8 deleted 7 Good Chromosome 16 Luminal A 8 Good Chromosomes 1 & 16 Luminal A 9 Intermediate Ch 8 and/or 20 Luminal/ER+ 10 Poor 5-year outcome; good longterm outcome if alive at 5 years Chrs 5, 8, 10 and 12 Basal-like Nature, 2012

53 Γονιδιακές υπογραφές των όγκων του μαστού στην κλινική πράξη Oncotype Dx test 21 γονίδια (RT-PCR) recurrence score (RC) χρήση χημειοθεραπείας (πέρα από ορμονική) πιθανότητα επανεμφάνισης καρκίνου σε 10 χρόνια έγκριση από ASCO και NCCN Μammaprint 70 γονίδια (DNA microarray) πιθανότητα επανεμφάνισης της νόσου έγκριση από FDA PAM50 test 50 γονίδια (RT-PCR) για την ταξινόμηση σε υπότυπο risk of recurrence (ROR) πιθανότητα επανεμφάνισης της νόσου έγκριση από FDA

54 4. Therapy selection/pharmacogenomics Επιλογή της κατάλληλης θεραπείας/ φαρμακογονιδιωματική

55 Using Expression Patterns to Choose Treatments Same cancer, different treatment Before Treatment Different Treatments After Treatment Effective Microarray guides choice Effective

56 H φαρμακογονιδιωματική στην αντιμετώπιση του... ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ

57 HER-2/NEU Protein as Target Growth factor HER-2/NEU receptor Breast cancer patient Growing cancer cells Her-2/neu gene

58 An Antibody Called Herceptin Growth factor Herceptin blocks receptor Breast cancer patient Growth slows

59 H φαρμακογονιδιωματική στην αντιμετώπιση του...

60 ...μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα υπερενεργοποίηση του EGFR και των σηματοδοτικών μονοπατιών που ελέγχει και οδηγούν σε εμφάνιση καρκίνου πιο ευαίσθητοι σε αναστολείς

61 μεταστατικού ορθοκολικού καρκίνου ΕGFR υπερεκφράζεται στον ΟΚ καρκίνο Σχετίζεται με κακή πρόγνωση και μειωμένη επιβίωση Αναστολή του κάνει τα καρκινικά κύτταρα πιο ευαίσθητα σε χημειοθεραπεία Μονοκλωνικά αντισώματα (panitumumab και cetuximab) μη αποτελεσματικά σε ασθενείς με μεταλλάξεις σε KRAS, BRAF, NRAS Επιβάλλεται ο έλεγχος συγκεκριμένων μεταλλάξεων (PCR ή sequencing)

62 ...μελανώματος Σε % υπάρχει BRAF μετάλλαξη συνεχή ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ μονοπατιού κακοήθεια 80-90% είναι V600E Εξέταση (PCR, sequencing) Χορήγηση αναστολέα

63 ...στρωματικούς όγκους του γαστρεντερικού Πιο συχνά μεσεγχυματικά νεοπλάσματα γαστρεντερικού ~90% φέρει μεταλλάξεις συνεχώς ενεργά μονοπάτια καρκίνος Μεταλλαγμένος υποδοχέας πιο ευαίσθητος σε imatinib (αναστολέας) responsive Εξέταση (PCR, sequencing) χορήγηση και δόση

64 ...στρωματικούς όγκους του γαστρεντερικού Πιο συχνά μεσεγχυματικά νεοπλάσματα γαστρεντερικού ~90% φέρει μεταλλάξεις συνεχώς ενεργά μονοπάτια καρκίνος Μεταλλαγμένος υποδοχέας πιο ευαίσθητος σε imatinib (αναστολέας) resistant Εξέταση (PCR, sequencing) χορήγηση και δόση

65 In the Future... Cancer patient Patient s tissue sample or blood sample Gene microarray shows marker protein pattern Patient should respond to drugs A and B Combination chemo disrupts one of cancer s networks Patient is in remission Protein microarray shows active proteins

66 Άλλες εφαρμογές της Μοριακής Διαγνωστικής Μεταθέσεις σε λευχαιμίες FISH, RT-PCR

67 Άλλες εφαρμογές της Μοριακής Διαγνωστικής Προ-εμφυτευτικός έλεγχος Ελεγχος για μονογονιδιακές νόσους Μεσογειακή αναιμία Δρεπανοκυτταρική αναιμία Κυστική ίνωση

68 Άλλες εφαρμογές της Μοριακής Προγενετικός έλεγχος Διαγνωστικής Down syndrome (cell free fetal DNA testingsequencing)

69 Η μοριακή διαγνωστική αλλάζει την Ιατρική... Επιλογή θεραπείας Παρακολούθηση επανεμφάνισης Ανίχνευση της νόσου Προδιάθεση για νόσο Προγενετικός έλεγχος Κρίσιμες ερωτήσεις είναι το μωρό υγιές; Ποιες νόσους είναι σε κίνδυνο να εμφανίσει ο ασθενής Νοσεί ο ασθενής; Ποια φάρμακα να χορηγήσω; Πώς επανεμφανίστηκε η νόσος; -> Ανάγκη για μοριακές εξετάσεις