НАЛАЗ STAPHYLOCOCCUS AUREUS У БРИСУ ГРЛА И НОСА КОД ПАСА ЛУТАЛИЦА У НОВОМ САДУ

Transcript

1 УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за ветеринарску медицину Дипл. вет. Маја Симић НАЛАЗ STAPHYLOCOCCUS AUREUS У БРИСУ ГРЛА И НОСА КОД ПАСА ЛУТАЛИЦА У НОВОМ САДУ Мастер рад Нови Сад, 2014.

2 УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за ветеринарску медицину Кандидат Дипл. вет. Маја Симић Ментор Проф. др Весна Лалошевић НАЛАЗ STAPHYLOCOCCUS AUREUS У БРИСУ ГРЛА И НОСА КОД ПАСА ЛУТАЛИЦА У НОВОМ САДУ Мастер рад Нови Сад, 2014.

3 КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ МАСТЕР РАДА 1. Др. Весна Лалошевић, редовни професор, ментор, у.н.о. Ветеринарска микробиологија и заразне болести животиња, Департман за ветеринарску медицину, Пољопривредни факултет Нови Сад 2. Др. Љубица Спасојевић Косић, доцент, председница комисије, у.н.о. Болести животиња и хигијена анималних производа, Департман за ветеринарску медицину, Пољопривредни факултет Нови Сад 3. Др. Драгица Стојановић, ванредни професор, члан комисије, у.н.о. Фармакологија са токсикологијом, Департман за ветеринарску медицину, Пољопривредни факултет Нови Сад

4 САДРЖАЈ Сажетак...1 Summary Увод Преглед литературе Staphylococcus aureus Морфолошке и културелне особине Биохемијске особине Ћелијска грађа Ћелијски зид Ћелијска мембрана Цитоплазматски матрикс Нуклеоид Фактори вируленције...13

5 2.2. Антибиотици и резистенција на антибиотике Пеницилини Механизам дејства Резистенција на пеницилине Пеницилин Г или бензил пеницилин Ампицилин Амоксицилин и клавулонска киселина Метицилин Цефалоспорини Механизам дејства Резистенција на цефалоспорине Цефалексин Аминогликозидни антибиотици Механизам дејства Резистенција на аминогликозидне антибиотике Токсичност Гентамицин Макролидни антибиотици Механизам дејства Резистенција на макролидне антибиотике Еритромицин...28

6 Линкозамиди Механизам дејства Резистенција на линкозамиде Клиндамицин Тетрациклини Механизам дејства Резистенција на тетрациклине Окситетрациклин Триметоприм сулфаметаксазол Значај у клиничкој патологији паса Циљ рада Материјал и методе рада Резултати Дискусија Закључак Литература...48

7 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад Сажетак САЖЕТАК Staphylococcus aureus је округла, грам позитивна бактерија пречника 0,5 1,5 µm. Налази се на кожи и слузокожама људи и животиња. Углавном је условно патогена бактерија тако да се може наћи и код здравих животиња. Код паса најчешће изазива пиодерму, отитисе и запаљење рана. Последњих година постаје све значајнији патоген у ветеринарској и хуманој мецидини због стицања резистенције на антибиотике. Најчешће се јавља резистенција на β-лактамске антибиотике због продукције великог броја β-лактамаза, ензима који инактивишу β-лактамске антибиотике, а чија је синтеза кодирана плазмидима. Циљ овог истраживања је да се утврди преваленца Staphylococcus aureus-а у популацији паса луталица у Новом Саду, као и да се испита осетљивост изолованих сојева на антимикробне лекове. Прикупљено је 68 брисева носа и исто толико брисева грла паса луталица. Из брисева носа стафилокок је изолован код 9 паса што указује да је преваленца 13,24%, а изолован је код 3 пса из узорака грла (4,41%). Резистенција на антибиотике је утврђена код 7 стафилокока изолованих из носа (77,77%) и код једног стафилокока изолованог из грла (33,33%). Утврђена је резистенција на пеницилин Г и ампицилин код свих резистентних сојева стафилокока. Није утврђено постојање резистенције на амоксицилин и клавулoнску киселину, метицилин, цефалексин, гентамицин, еритромицин, окситетрациклин и триметоприм сулфаметаксазол. Кључне ријечи: Staphylococcus aureus, пси луталице, преваленца, резистенција на антибиотике. 1

8 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад Summary SUMMARY Staphylococcus aureus is spherical Gram positive bacterium, 0,5 1,5 µm in diameter. It is present on skin and mucosae of humans and animals. Staphylococcus is opportunistic pathogen being found even on clinically healthy animals. The most common infections in dogs caused by Staphylococcus aureus are pyoderma, otitis and wound infections. In recent years staphylococcus becomes more significant as pathogen because of its increasing resistance to antimicrobials. Resistance to β-lactams is most common form of resistance in staphylococci, caused by production of β-lactamases, enzymes that cleave β-lactams, whose synthesis is coded by plasmids. The goal of this research is determine prevalence of Staphylococcus aureus in stray dogs in Novi Sad and to test if resistance to antimicrobials occurs in isolated strains. 68 nose and throat swabs from stray dogs are collected. In sample obtained from nose, staphylococcus is isolated in 9 dogs which indicates prevalence of 13,24%, and is isolated from 3 dogs in sample obtained from throat (4,41%). Resistance to antibiotics has been confirmed in 7 staphylococcal strains isolated from the nose (77,77%) and in one strain isolated from the throat (33,33%). Resistance to penicillin G and ampicillin is confirmed in all resistant strains. There was no resistance to amoxicillin/clavulonic acid, methicillin, cephalexin, gentamicin, erythromycin, oxytetracycline and trimethoprim sulphamethoxazole. Keywords: Staphylococcus aureus, stray dogs, prevalence, resistance to antibiotics 2

9 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад 1. Увод 1. УВОД Staphylococcus aureus је грам позитивна кока која припада роду Staphylococcus, фамилији Micrococcaceae (McVey et al., 2013.). Пречника је 0,5 1,5 µm, а на микроскопским препаратима уочавају се појединачно, у пару, тетрадама или краћим ланцима. На подлогама расту округле, глатке, сјајне и испупчене колоније. Колоније могу бити пигментисане, а боја је жута или наранџаста. На крвном агару даје β- хемолизу. Staphylococcus aureus je факултативни анаероб, али боље расте у аеробним условима, оптимална температура раста је од О С. Коагулаза је позитиван, ферментује малтозу и манитол (Whitman, 2009.; McVey et al., 2013.; Prescott, 2002.). Стафилокок је бактерија која није специфична за врсту. Условно је патогена јер се налази и код здравих животиња. Налази се на слузокожи и кожи 12 14% клинички здравих паса (Greene, 2012.). До појаве обољења може да дође код имунокомпромитованих јединки или код нарушавања природне баријере нпр. код појаве лезија на кожи или слузокожи. Код паса најзначајнија обољења изазвана Staphylococcus aureus-ом су пиодерма, отитиси, инфекције рана (Greene, 2012). 3

10 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад 1. Увод Последњих година Staphylococcus aureus постаје све значајнији како у хуманој тако и у ветеринарској медицини, првенствено због појаве сојева резистентних на антибиотике (Zecconi and Scali, 2013.). Резистенција најчешће настаје мутацијама и ресеквенционирањем стафилококног генома (Mc Callum et al., 2010.). Све је учесталија појава резистенције на β-лактамске антибиотике, што је последица плазмидски кодиране продукције β-лактамаза. Циљ овога рада је да се утврди преваленца Staphylococcus aureus-a у популацији паса луталица у Новом Саду, као и резистенција на антимикробне лекове изолованих сојева. 4

11 2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 2.1. STAPHYLOCOCCUS AUREUS Staphylococcus aureus је округла грам-позитивна бактерија која припада роду Staphylococcus, фамилији Micrococcaceae. Име родa је сложеница која се састоји од две грчке рeчи: ''staphylоs'', што значи грозд, и ''cоccus'', што значи бобица. Реч ''aureus'' је придев пореклом из латинског језика и значи златан. Име златни стафилокок дугује својој способности да ствара златне или жуте колоније Морфолошке и културелне особине Стафилококе су пречника 0,5 1,5 µm и боје се изразито грам-позитивно (McVey et al., 2013.). Јављају се појединачно, у паровима, тетрадама, краћим ланцима (3-4 ћелије) и карактеристично се простиру у више равни формирајући неправилне гроздове (Whitman, 2009.). Стафилокок не ствара споре, али је врло отпоран и можe преживети дуже временске периоде у спољашњој средини и на неживим предметима. Ова отпорност омогућава бактерији да дуго опстане у блиској околини домаћина док се услови унутар домаћина не промене и омогуће настанак инфекције (McVey et al., 2013.). На крвном агару расту округле колоније пречника >5mm, глатке, испупчене и сјајне. Колоније (слика 1.) могу бити пигментисане, а пигментација варира од 5

12 сиве преко жуте до наранџасте. Пигменти су каротеноиди или њихови деривати и налазе се у ћелијској мембрани (Whitman, 2009.). Производња пигмената не служи само да олакша диференцијацију Staphylococcus aureus од других врста из овог рода, чије су колоније углавном Слика 1: колоније Staphylococcus aureus-a на манитол сланом агару, ориг. микроорганизма (McVey et al., 2013.). беле, него је директно повезана са повећањем вируленције овог β-хемолизу на крвном агару ствара већина сојева Staphylococcus aureus, а зона хемолизе је двострука при чему је централна зона зона потпуне хемолизе, а око ње се налази зона непотпуне хемолизе (Carter et al., 1999.). Хемолизу изазивају токсини. Стафилокок продукује три хемолитична токсина: α-, β- и δ-токсин, сваки са јединственим својствима. α-токсин је токсин који оштећује ћелијске мембране стварајући поре у њима и изазива потпуну хемолизу еритроцита. β-токсин је сфингомијелиназа која ствара зону непотпуне хемолизе на крвном агару. Активност β-токсина се може појачати инкубацијом на 4 0 C, због чега се овај токсин назива и ''хладни'' хемолизин. δ-токсин је модулин растворљив у фенолу који стимулише продукцију екстрацелуларних протеина, укључујући и токсине. α- и β- токсини стафилокока делују антагонистички, док β- и δ- делују синергистички (McVey et al., 2013.). Велики број сојева Staphylococcus aureus продукује капсулу. Постоји 11 различитих капсуларних серотипова, међутим, само 4 серотипа су значајна за медицину (серотипови 1, 2, 5 и 8). Капсула је грађена од полисахарида и онемогућава фагоцитозу од стане неутрофила која је прва линија одбране код стафилококних инфекција (McVey et al., 2013.). Капсуларни полисахариди садрже N ацетил D-амино галактуронску киселину, N-ацетил D - фукозамин и таурин. Инкапсулирани сојеви на подлогама расту у мањим и испупченијим колонијама (Whitman, 2009.). Серотипови 1 и 2 имају дебљу капсулу и због ње на 6

13 хранљивим подлогама изгледају мукоидно, али се ређе изолују од серотипова 5 и 8 (McVey et al., 2013.) Биохемијске особине Staphylococcus aureus је факултативни анаероб, али боље расте у аеробним условима. Расте на температури од C, а оптимална температура раста је C. Добро расте на подлогама које садрже 10% NaCl, а слабије на подлогама са 15% NaCl. Анаеробно ствара d- и l - лактат из глукозе. Једна од основних особина које бактерија мора да поседује да би се дефинисала као S. aureus је да буде коагулаза позитивна. Коагулаза је ензим који активира протромбин и тако изaзива коагулацију крви. Пошто су и друге бактерије овог рода коагулаза позитивне, ова особина није довољна за коначну потврду изолата. Зато се испитује низ биохемијских реакција. S. aureus даје хемолизу на крвном агару, каталаза је позитиван, алкална фосфатаза позитиван, термонуклеаза позитиван, хијалуродиназа позитиван, казеиназа позитиван, аргинин дихидролаза позитиван, фибринoлизин позитиван, желатиназа позитиван, β-глукозидаза позитиван, липаза и естераза позитиван, редукује уреу и нитрате. Оксидаза је негативан, β-глукуронидаза и β-галактозидаза негативан, орнитин и лизин декарбоксилаза негативан. Уобичајено не хидролизује скроб и ескулин (Whitman, 2009.). Аеробно продукује киселину из фруктозе, малтозе, сахарозе, галактозе, глукозе, глицерола, манитола, малтозе, лактозе, рибозе, трехалозе и туранозе. Не продукује киселину из арабинозе, арабитола, адонитола, целобиозе, декстрина, дулцитола, еритриола, еритрозе, фукозе, инозитола, малезитозе, мелибиозе, рафинозе, рамнозе, сорбитола и ксилозе (Whitman, 2009.). 7

14 Ћелијска грађа Staphylococcus aureus je бактерија прокариотске грађе. Ћелију обавија чврсти ћелијски зид. Између ћелијског зида и ћелијске мембране се налази периплазматски простор. Испод ћелијског зида се налази ћелијска мембрана. Прокариотске ћелије немају органеле које су обавијене мембранама и одвојене од цитоплазме стога је унутрашњост ћелије хомогена. Ова хомогена масе се назива цитоплазматски матрикс. У цитоплазматском матриксу се налази генетски материјал који је груписан у подручју које се назива нуклеоид. Нуклеоид нема мембрану која га одваја од цитоплазматског матрикса Ћелијски зид Ћелијски зид је спољашњи омотач бактеријске ћелије који даје облик и чврстину бактеријској ћелији и штити је од осмотске лизе. Грађа ћелијског зида стафилокока је веома комплексна и слична је грађи ћелијског зида других грам позитивних бактерија. Ћелијски зид је дебљине nm и хомогене је грађе. Грађен је од пептидогликана, теихоичне киселине и протеина. Пептидогликан или муреин је полимер састављен од великог броја идентичних подјединица (Prescott, 2002.). Грађен је од N ацетилглукозамина и N ацетилмураминске киселине и аминокиселина од којих три: d глутаминска киселина, d аланин и мезо диаминопимелинска киселина не улазе у састав протеина. Присуство d амино киселина чини ћелијски зид отпорним на разлагање већином протеаза. Основу полимера чине наизменично повезани N ацетилглукозамин и N ацетилмураминска киселина. За карбоксилну групу N ацетилмураминске киселине везани су пептидни ланци од 4 наизменично повезане d i l аминокиселине (Prescott, 2002.). Пептидогликан Staphylococcusaureus садржи l-лизин као диаминокиселину на трећој позицији пептидне подјединице (Whitman, 2009.). Пептидне подјединице се полимеризују везама које се остварују између пептида. Карбоксилна група d аланина се 8

15 директно везује за амино групу мезо диаминопимелинске киселине, а често су, уместо овом везом, повезани интерпептидним мостовима (Sussman, 2002.). Интерпептидни мостови Staphylococcus aureus су богати глицином и најчешће су пентаглицински мостови. Глицин у интерпептидним мостовима чини стафилокок имуним на лизу лизозомима, али осетљивим на лизостафин, синтетски ензим који се тренутно истражује у терапеутске сврхе (McVey et al., 2013.). Међутим, сојеви код којих су l-лизин и l-аргинин заменили глицин у интерпептидним мостовима пептидогликана су мање осетљиви на овај ензим (Whitman, 2009.). На овај начин пептидне подјединице у пептидогликану формирају густу мрежу која је довољно чврста да задржи свој облик и интегритет чак и ако је издвојена из ћелије. Осим тога, мрежа је и порозна јер омогућава неометан промет молекула у оба смера (Prescott, 2002.). Друга градивна јединица ћелијског зида је теихоична киселина. Теихоична киселина је грађена од полихидроксилног алкохола рибитола и N- ацетилглукозамина (Whitman, 2009.). Теихоична киселина може бити ковалентним везама везана за пептидогликан па се назива структурна теихоична киселина, или је утиснута у ћелијску мембрану па се назива липотеихоична киселина. Теихоична киселина допире до површине пептидогликана, a пошто је негативно наелектрисана доприноси негативном набоју грам-позитивне ћелије (Sussman, 2002.). Структурна и липотеихоична форма теихоичне киселине имају двоструку улогу. Служе као адхезини који олакшавају колонизацију домаћина и доприносе резистенцији Staphylococcus aureus-а на катјонске пептиде антимикробних лекова. Пептидогликан и теихоична киселина у организму домаћина делују синергистички и изазивају септични шок па се могу сврстати и у ендотоксине (McVey et al., 2013.). На површини ћелијског зида, ковалентним везама везани за пептидогликан или утиснути у сам ћелијски зид, налазе се протеини. Везивање протеина ковалентном везом за пептидогликан врши се посредством бактеријског ензима сортазе А. Протеини који су повезани ковалентним везама посредством сортазе А се у англосаксонској литератури означавају као ''microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules'' или скраћено MSCRAMM (McVey et al., 2013.). Ови протеини су адхезини и омогућавају стафилококу да се споји са ћелијским протеинима домаћина, a MSCRAMM протеини код Staphylococcus 9

16 aureus се називају протеин А и изразито су имуногени. Сви протеини који се налазе у ћелијском зиду играју одлучујућу улогу у колонизацији ткива домаћина (McVey et al., 2013.) Ћелијска мембрана Ћелијска мембрана обавија бактеријску ћелију, одваја је од њене околине и чини једниственом и засебном целином, али истовремено омогућава размену материја са спољашњoм средином. Преко ћелијске мембране бактерија комуницира са светом око себе. Ћелијска мембрана је селективно пропустљива, омогућава размену јона и молекула између бактеријске ћелије и њене околине, док онемогућава другим материјама да напусте ћелију. Пошто се поједнине материје крећу супротно од градијента концентрације, мембрана активно учествује и у транспорту нутријената. На бактеријској ћелијској мембрани се одвијају и многи за живот значајни процеси: респирација, синтеза липида и градивних компоненти ћелијског зида (Prescott, 2002.). Ћелијска мембрана налази се испод ћелијског зида. Ћелијска мембрана је дебљине 5 10 nm и видљива је само помоћу електронског микроскопа (Prescott, 2002.). Липопротеинског је састава. Фосфолипиди који граде мембрану су асиметрични са поларним и неполарним крајем. Поларни крај садржи фосфор и хидрофилан је, док је неполарни крај грађен од масних киселина које нису растворљиве у води и хидрофобан је. Хидрофилни крајеви фосфолипида реагују са водом, док хидрофобни реагују међусобно. На овај начин фофсолипиди формирају двослој који чини основу грађе ћелијске мембране. Хидрофилни полови фосфолипида су окренути ка спољашњој средини, односно унутрашњости ћелије, док су хидрофобни ланци окренути један ка другом. У липидни двослој ћелијске мембране су уроњени протеини. Ћелијска мембрана Staphylococcus aureus-a има већи број протеина у свом саставу него ћелијска мембрана еукариотске ћелије, зато што ови протеини обављају бројне улоге које су код еукариотске ћелије преузеле органеле. Протеини ћелијске мембране се могу поделити у две групе: интегралне и периферне протеине. Интегрални протеини не могу да се лако одвоје од ћелијске мембране и чине 70 80% 10

17 мембранских протеина. Као и фосфолипиди и они су биполарни: хидрофобним крајем су уроњени у липидни двослој, док се хидрофилни крај налази на површини ћелијске мембране. Периферни протеини чине 20 30% укупног броја мембранских протеина и лабаво су везани за ћелијску мембрану, тако да се лако могу одвојити од ње. Периферни протеини су растворљиви у воденим растворима (Sussman, 2002.) Цитоплазматски матрикс Цитоплазма бактеријске ћелије не садржи органеле које су обавијене мембранама. Супстанца која испуњава простор између ћелијске мембране и нуклеоида назива се цитоплазматски матрикс. Матрикс је сачињен углавном од воде. Вода чини 70% масе бактерије (Prescott, 2002.). У матрикс су уроњена инклузиона телашца и рибозоми. Инклузиона телашца су грануле органског или неорганског порекла које се често могу видети и под светлосним микроскопом (Sussman, 2002.). Инклузиона телашца служе као резервоари градивних материја и енергије, а могу да учествују и у регулацији осмотског притиска накупљајући молекуле у одређеном облику. Инклузиона телашца органског порекла садрже гликоген и равномерно су респоређена у цитоплазматском матриксу. Ове грануле су nm у пречнику и видљиве су само електронским микроскопом. Гликогенска инклузиона телашца су резервоари угљеника и обезбеђују енергију и градивни материјал за процесе биосинтезе (Prescott, 2002.). Инклузиона телашца неорганског порекла су најчешће резервоари фосфора. Рибозоми се налазе или слободни у цитоплазматском матриксу или су лабаво спојени са ћелијском мембраном. Рибозоми су мале органеле димензија nm и 20 nm, молекулске масе 2,8 милиона далтона (Sussman, 2002.). Рибозоми Staphylococcus aureus-а су 70S и састоје се од две подјединице: мање 30S и веће 50S подјединице. Слово S означава Сведбергову јединицу, меру коефицијента седиментације. Сведбергова јединица означава брзину седиментације честица приликом центрифугирања. Што је већа брзина кретања честица приликом центрифугирања, то је већа и Сведбергова јединица. На коефицијент 11

18 седиментације утиче величина честице, запремина и облик (Prescott, 2002.). Обе подјединице рибозома се састоје од рибозомалне рибонуклеинске киселине (ррнк) и полипептида. Рибозомална РНК бактеријске ћелије има двоструку улогу: доприноси структури рибозома и учествује у синтези протеина. Рибозоми су места синтезе бактеријских протеина. На рибозомима који се налазе у цитоплазматском матриксу синтетишу се протеини који изграђују различите ћелијске структуре, а на рибозомима који су спојени са ћелијском мембраном синтетишу се протеини који се излучују у спољашњу средину (Prescott, 2002.) Нуклеоид Нуклеоид или лажно једро представља генетски материјал Staphylococcus aureus-а. Нуклеоид нема мембрану која га одваја од цитоплазматског матрикса него је то хромозом који заузима подручје неправилног облика у цитоплазматском матриксу. Нуклеоид се састоји од 60% дезоксирибонуклеинске киселине (ДНК), 30% РНК и 10% протеина. Стафилококна ДНК је у облику двоструког хеликса, циркуларног облика. Понекад се у ћелији могу наћи два нуклеоида и они представљају нуклеоиде кћерки ћелија. Код бактерија које активно расту, нуклеоид има изданке који се пружају у цитоплазматски матрикс (Prescott, 2002.). Претпоставља се да ови изданци садрже ДНК који се транскрибује у ирнк, која садржи упутство за синтезу неопходног протеина која ће се обавити у рибозомима. Поред хромозомалне ДНК која се налази у нуклеоиду, стафилокок поседује и плазмиде. Плазмиди представљају двоструку ДНК обично циркуларног облика која се налази у цитоплазматском матриксу и репликује се независно од хромозома (Whitman, 2009.). Како плазмиди нису причвршћени за ћелијску мембрану, деси се да само једна кћерка ћелија наследи плазмиде. Плазмиди нису неопходни за раст и размножавање бактеријске ћелије, али могу да носе гене који бактерији олакшавају опстанак. Најчешће преносе гене за резистенцију на антибиотике, могу да учине и бактерију патогенијом или да модификују метаболичке процесе. Плазмиди који преносе гене за резистенцију на антибиотике се називају Р фактори. Пошто се плазмиди често крећу између 12

19 бактерија, резистенција на антибиотике може брзо да се прошири кроз популацију (Sussman, 2002.). Хромозомална и плазмидска ДНК стафилокока може да се преноси до пријемчивих ћелија трансформацијом или трансдукцијом (Whitman, 2009.). Трансформација је процес у коме бактеријска ћелија преузима целу ДНК или њен део из своје околине и инкорпорира је у свој геном у облику у коме може да се преноси на потомство (Prescott, 2002.). Слободан ДНК доспева у бактеријско окружење лизом бактеријских ћелија. Трансдукција је процес у коме бактеријске гене преносе бактериофаги (Prescott, 2002.), вируси којима су бактерије домаћини у којима се размножавају. Бактериофаги су ДНК вируси и приликом инфекције убацују своју ДНК у домаћина. Вирусна ДНК се инкорпорира у геном бактерије и преузима контролу над биохемијским процесима домаћина. Сада бактерија синтетише вирусну ДНК и протеине који изграђују вирусни омотач. Затим се вирусна ДНК и омотач спајају и формирају вирусну честицу. Овај процес води до лизе бактеријске ћелије и вирус се ослобађа у спољашњу средину у потрази за пријемчивим домаћином. Међутим, понекад долази до грешака у процесу склапања вирусних честица и уместо вирусне ДНК у омотач вируса се уграђује фрагмент бактеријске ДНК. Када вирус који носи бактеријску ДНК инфицира ћелију домаћина, бактеријска ДНК из бактериофага се спаја са геномом инфициране бактерије и настаје нови рекомбиновани геном који се преноси на потомство Фактори вируленције Staphylococcus aureus поседује велики број фактора вируленције. Фактори вируленције имају различите улоге у настанку инфекције па се могу поделити у више група. Једни омогућавају адхезију и колонизацију ткива домаћина, други су токсини и ензими који оштећују ткива домаћина и олакшавају настанак инфекције док трећи штите бактерију од неповољних услова спољашње средине и осигуравају опстанак бактерије. Интеракције између фактора вируленције се 13

20 сматрају пресудним за настанак болести јер ниједан фактор вируленције сам није довољно јак да изазове настанак болести (Greene, 2012.). Адхезини су фактори вируленције који се налазе на површини стафилокока. Адхезини не оштећују директно ткива домаћина, али стварају повољну средину у којој бактерија може да опстане на површини ткива домаћина док се услови не промене тако да омогућавају настанак инфекције нпр. док не дође до оштећења коже или слузокоже као физичке баријере за настанак инфекције или док не дође до пада имунитета (Greene, 2012.). Осим што омогућавају опстанак бактерије на површини ткива домаћина, адхезини могу и да избегну имуни систем домаћина. Стафилококни протеин А се везује за Fc фрагмент имуноглобулина G и тако онемогућава лизу посредовану имуноглобулинима. Ензими које стафилокок излучује у спољашњу средину разарају ткиво домаћина на месту инфекције и одржавају инфекцију омогућавајући бактерији да искористи разорено ткиво као извор хране. Протеазе су ензими који разарају ткиво домаћина и разграђују антитела онемогућавајући имуном систему да се избори са инфекцијом. Хијалуродиназа је ензим који разлаже хијалуронску киселину која се налази између ћелија и омогућава ширење инфекције у дубље слојеве ткива (Prescott, 2002.). Липазе разлажу липиде и омогућавају бактерији да искористи хранљиве материје из своје околине. Леукоцидини оштећују леукоците и липидне мембране. Најзначајни леукоцидин је Пантон-Валентајн леукоцидин који инхибира фагоцитозу од стране гранулоцита и лизира их стварајући поре у њиховим мембранама (Prescott, 2002.). Staphylococcus aureus је бактерија која производи велики број токсина који, осим што учествују у настанаку инфекције, помажу и у идентификацији бактерије. Токсини које продукује стафилокок подељени су у 5 функционалних група које се међусобно преклапају: хемолизини/цитотоксини, модулини растворљиви у фенолу, ентеротоксини, ексфолијативни токсини и суперантигени (McVey et al., 2013.). Хемолизини/цитотоксини су токсини који разарају ћелије односно еритроците оштећујући ћелијске мембране. Модулини растворљиви у фенолу су мале молекуле које лизирају неутрофиле. Ентеротоксини су термостабилни токсини који изазивају гастроинтестиналне сметње и доводе се у везу са тровањима храном. Ентеротоксини имају и карактеристике суперантигена. 14

21 Ексфолијативни токсини су токсини који изазивају некролизу епидермиса и губитак површинских слојева коже. Суперантигени су бактеријски протеини који изазивају драстичан имуни одговор. Они стимулишу ослобађање велике количине цитокина. Типични представник суперантигена Staphylococcus aureus је токсични шок синдром токсин 1. Овај токсин изазива високу температуру, пад крвног притиска, пролив и промене на кожи. Стафилокок може да опстане и у неповољним условима са мало хранљивих материја формирајући биофилмове. Биофилм је екстрацелуларна мрежа коју чини један или више слојева бактеријских ћелија међусобно повезаних полисахаридима. Биофилмови су микросистеми у којима стафилокок може да опстане на металу, стаклу, у води. Такође, биофилмови штите бактерије од имуног система и антимикробних средстава АНТИБИОТИЦИ И РЕЗИСТЕНЦИЈА НА АНТИБИОТИКЕ Када је Александар Флеминг године прегледао поглоге на које је засејао сатфилокок, наишао је на необјашњив феномен. На једној подлози је израсла гљивица и стафилок није растао у њеној близини. Гљивицу је назвао Penicillium notatum и доказао је да екстракт добијен из ове гљивице инхибира раст неколико патогених сојева бактерија. Александар Флеминг је, а да то није ни схватао, отворио врата новој епохи у развоју човечанства: епохи антибиотика. Пеницилин јесте открио Флеминг, али су Чејн и Флори 12 година касније развили лек који данас називамо пеницилин Г и који је покренуо антибиотску револуцију. Антибиотици су нам дали контролу над бактеријским инфекцијама. Омогућили су нам да делујуемо селективно на бактеријску ћелију и да је уништимо, а да притом не оштетимо и не наудимо ћелијама домаћина. Може се рећи да су антибиотици постали ''магични меци'', супстанце са селективном токсичношћу које ће помоћи у борби против инфективних болести, за којима је трагао Паул Ерлих. 15

22 Иако је откривен је велики број антибиотика од открића пеницилина до данас, сви антибиотици се по механзму дејства могу поделити у 4 основне групе: инхибиторе синтезе ћелијског зида, инхибиторе синтезе протеина, инхибиторе синтезе и функције нуклеинских киселина и антибиотике који нарушавају функцију ћелијске мембране. Употреба антибиотика постала је рутинска и притисак на бактеријски свет је порастао. Међутим, бактерије нису ову новину дочекале неспремно. Брже него што смо могли и замислити бактерије су еволуирале и почеле да стичу резистенцију на антибиотике. Еволуција се може објаснити кратким генерацијским периодом бактерија, а способност да манипулишу својим генетским материјалом олакшала је развој резистенције при чему су, под притиском антибиотика, преживљавали само сојеви који су поседовали плазмиде за резистенцију. Механизми резистенције на антибиотике могу се поделити у 4 категорије: антибиотик не може да допре до места дејства због смањеног продора у бактеријску ћелију, антибиотик бива избачен у спољашњу средину помоћу пумпи на ћелијској мембрани, антибиотик бива инактивисан модификацијом или деградацијом пре него што продре у бактеријску ћелију и таргет место антибиотика на бактеријској ћелији може бити измењено или заклоњено другим молекулом тако да се антибиотик не може везати и остварити своје дејство Пеницилини Пеницилини или β-лактамски антибиотици су широко распрострањена група антибиотика. Идентификовани су и првобитно су се добијали из гљивице Penicillium notatum, а данас се добијају из гљивице Penicillium chrysogenum, која је бољи произвођач пеницилина (Sköld, 2011.). Пеницилини испољавају своје дејство преко β-лактамског прстена. Уколико је прстен оштећен, антибиотик неће испољити антимикробну активност. 16

23 Механизам дејства Пеницилини испољавају своје дејство уплићући се у последњу фазу синтезе ћелијског зида. Да би се формирао пептидогликан, потребно је да се створе интерпептидни мостови између пептидогликанских подјединица. Стварање пептидних веза катализује ензим транспептидаза, протеин који је везан за ћелијску мембрану (Sköld, 2011.). Транспептидаза и карбоксипептидаза су ензими који учествују у синтези пептидогликана и називају се пеницилин везујући протеини-пбп (penicillin-binding proteins ) (Giguère et al., 2013.). Бактеријска ћелија обично садржи 4 7 ПБП за које се везују пеницилини (Giguère et al., 2013.). β-лактамски антибиотици инхибишу транспептидазу преко структурне аналогије између β-лактамског прстена и d-аланил-d-аланил дипептида на крају интерпептидног моста. Укључивање β-лактамског прстена у структуру ћелијског зида чини новонасталу структуру нестабилном и ћелијски зид више није у стању да штити бактеријску ћелију од осмотске лизе. Подложност бактерија пеницилинима зависи од броја и структуре ПБП, способности пеницилина да продру кроз ћелијски зид и од способности пеницилина да избегну лизу β-лактамазама. Код грам негативних бактерија, бактерицидни ефекат настаје изазивањем осмотске лизе као последице губитка пептидогликанског слоја. Код грам позитивних бактерија, које садрже знатно веће количине пептидогликана у свом ћелијском зиду, β-лактамски антибиотици не само да ометају синтезу ћелијског зида, него и ослобађају липотеихоичну киселину која стимулише разлагање пептидогликана аутолизинима, ендогеним пептидазама саме бактерије (Giguère et al., 2013.). Пеницилини испољавају бактерицидно дејство, али само код ћелија које расту, односно код бактерија које активно синтетишу ћелијски зид (Giguère et al., 2013.). Уколико нема синтезе ћелијског зида, уколико бактерија није метаболички активна због недостатка нутријената у животној средини, бактерицидна активност пеницилина ће изостати. 17

24 Резистенција на пеницилине Постоје два механизма резистенције на пеницилине: продукција β-лактамаза, односно ензима који разлажу β-лактамске антибиотике, и смањен афинитет ПБП према пеницилинима. Продукција β-лактамаза је најчешћи облик резистенције на пеницилине, а β- лактамазе су ензими који се луче у екстрацелуларни простор, цепају β-лактамски прстен већине пеницилина и инактивишу антибиотик. Синтеза ових ензима је кодирана плазмидима. Пошто се плазмиди независно умножавају и деле приликом деобе бактеријске ћелије, плазмидски посредована резистенција на антибиотике се брзо и лако шири бактеријском популацијом. Пеницилин везујући протеини су протеини на ћелијској мембрани који су таргет места за пеницилине. Везивањем за ове протеине, пеницилини ремете нормалну синтезу ћелијског зида и нарушавају његову стабилност. Бактерије су почеле да развијају ПБП који имају смањен афинитет према пеницилинима. Афинитет се смањио увођењем нових амнино киселина у састав ензима које доводе до промене активног центра ензима. Овако измењен ензим се не везује за антибиотик, али измена не утиче на способност ензима да препозна аналогну струкутуру β- лактамског прстена, d-аланин d-аланин дипептид у транспептидазној реакцији (Sköld, 2011.). Код грам негативних бактерија у периплазматски простор се лучи велики број β- лактамаза које су хромозомски кодиране, што поред слабо пропустљивог ћелијског зида и малог броја ПБП, доприноси наследној резистенцији ових бактерија на β-лактамске антибиотике. Упркос широкој и интензивној примени пеницилина у малој ветеринарској пракси, већина грам позитивних бактерија није развила резистенцију на ове антибиотике. Изузетак је Staphylococcus aureus који синтетише велики број β- лактамаза. 18

25 Пеницилин Г или бензил пеницилин Пеницилин Г је органска киселина која се у промету налази у облику натријумове или калијумове соли. Налази се у облику белог кристалног прашка, растворљивог у води, а нерастворљивог у масним киселинама и парафину. Чува се у затвореним контејнерима (European Pharmacopoeia, 2008.). Пеницилин Г се апликује парентерално јер га разлаже желудчана киселина. Након интрамускуларне апликације врло брзо достиже високе концентраије у крви. Након апсорпције се равномерно распоређује у организму, изузев цереброспиналне течности, зглобова и млека (Plumb, 1999.). Пеницилин се излучује у потпуности непромењен преко бубрега механизмима гломеруларне филтрације и тубуларне секреције. Пеницилин Г делује синергистички са аминогликозидним антибиотицима. Не изазива токсичне ефекте чак и када се даје и у значајно већим дозама од предвиђених. Може да изазове алергијске реакције. Јединка алергична на пеницилин вероватно ће алергијски одреаговати и на друге β-лактамске антибиотике. Пеницилин Г делује на многе грам позитивне бактерије, првенствено стрептококе, стафилококе, Actinomyces spp., Arcanobacterium spp., Bacillus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., и Erysipelothrix rhuseopathiaе, а од грам негативних делује на Bacteroides spp., Haemophilus spp. и Pasteurella spp. (Giguère et al., 2013.). Доза пеницилина Г за псе износе и.ј./кг телесне масе, а апликује се и.м. или и.в., на 6 8 сати (Saunders, 2008.) Ампицилин Ампицилин је полусинтетски пеницилин који се налази у облику кристалног прашка беле боје. Ампицилин је растворљив у води, а нерастворљив у масним киселинама. Чува се у затвореним контејнерима, а ако је стерилан, чува се у стерилним, вакуумираним контејнерима (European Pharmacopoeia, 2008.). 19

26 Ампицилин је стабилан у киселој средини па се може примењивати и п.о. Препоручује се да се даје на празан стомак јер храна може да успори апсорпцију ампицилина из дигестивног тракта. Након апсорпције распоређује се у многим ткивима, укључујући јетру, плућа, мишиће, плеуралну и синовијалну течност. Ампицилин пролази кроз плаценту, али се сматра да је сигуран за употребу код гравидних животиња. Ампицилин се из организма излучује преко бубрега тубуларном секрецијом (Plumb, 1999.). Ампицилин делује синергистички са аминогликозидним антибиотицима. Пошто је антибиотик широког спектра може да поремети нормалну флору дигестивног тракта и изазове пролив. Ампицилин делује против истих грам позитивних бактерија као и пеницилин Г, али испољава снажнију активност против грам негативних бактерија: E. coli, Proteus mirabilis и Salomella spp. (Giguère et al., 2013.). Доза ампицилина за псе износи мг/кг, и.в., и.м., с.ц. или п.о. три до четири пута дневно, а у колико се користи за лечење перитонитиса доза износи мг/кг (Saunders, 2008.) Амоксицилин и клавулонска киселина Амоксицилин, као и ампицилин, спада у пеницилине широког спектра дејства. Осим на грам позитивне бактерије, делује и на E. coli, Proteus mirabilis i Salomella spp. Боље се апсорбује из дигестивног тракта од ампицилина. Након апсорпције се распоређује у многим ткивима укључујући јетру, плућа, мишиће, плеуралну и синовијалну течност (Plumb, 1999.). Амоксицилин пролази кроз плаценту, али се сматра де је безбедан за употребу током гравидитета. Излучује се преко бубрега, тубуларном секрецијом. Клавулонска киселина је β-лактамски антибиотик веома слабог дејства па се због тога не користи као антимикробни лек. Међутим, има још једну особину због које је веома ефикасна у лечењу бактеријских инфекција када се комбинује са пеницилинима. Клавулонска киселина инхибише β-лактамазе. Као и код осталих β-лактамских антибиотика, и β-лактамски прстен клавулонске киселине је 20

27 подложан хидролизи β-лактамазама, али приликом ове реакције долази до иреверзибилне инактивације бактеријског ензима. Зато клавулонска киселина у комбинацији са амоксицилином може да се користи и за лечење инфекција изазваних сојевима који продукују β-лактамазе. Амоксицилин и клавулонска киселина су у облику белог кристалног прашка. Као комерцијални производи налазе се у облику таблета, капсула и прашка за оралну суспензију. Чувају се на собној температури, заштићени од влаге. Једном растворен, прашак за оралну суспензију ће задржати своју активност 10 дана уколико се чува на температури фрижидера (Plumb, 1999.). Оралне дозе амоксицилина и клавулонске киселине за псе износе 12,5 25 мг/кг телесне масе, два пута дневно (Plumb, 1999.; Saunders, 2008; Greene, 2012.) Метицилин Метицилин је антистафилококни пеницилин јер је углавном резистентан на β-лактамазе које синтетише Staphylococcus aureus. Метицилин је нестабилан у киселој средини желуца, стога се мора апликовати парентерално. β-лактамазе које синтетише S. aureus разлажу β-лактамски прстен метицилина 30 пута спорије него пеницилина Г (Sköld, 2011.). Један је од лекова избора код сојева стафилокока који су резистентни на пеницилине Цефалоспорини Цефалоспорини су антибиотици који се добијају из гљивице Cephalosporium acremonium и спадају у групу β-лактамских антибиотика. Код цефалоспорина β- лактамски прстен спојен је са шесточланим дихидротиазинским прстеном што чини цефалоспорине опторнијим на β-лактамазе. Осим што су стабилнији према β-лактамазама, цефалосорини се добро везују за ПБП и лако пролазе кроз ћелијски зид. Као и остали β-лактамски антибиотици, углавном се апликују парентерално, слабо су токсични и излучују се преко бубрега. 21

28 Цефалоспорини су хронолошки класификовани у 4 генерације. Свака наредна генерација цефалоспорина садржи особине претходне генерације проширене новом карактеристиком. Цефалоспорини прве генерације делују првенствено на грам позитивне бактерије и апликују се парентерално (и.в., и.м., с.ц.). Цефалоспорини друге генерације делују на грам позитивне и на грам негативне бактерије, а апликују се и перорално и парентерално. Трећа генерација цефалоспорина делује слабије на грам позитивне, али има јаче дејство против грам негативних бактерија, апликује се парентерално, док четврта генерација има јаче дејство и против грам позитивних и грам негативних бактерија, а апликује се перорално и парентерално (Giguère et al., 2013.). Цефалоспорини треће и четврте генерације изазивају бол када се апликују и.м. или с.ц., стога се саветује и.в. апликација ових цефалоспорина Механизам дејства Цефалоспорини, као и пеницилини, инхибишу синтезу ћелијског зида. Преко порина у ћелијском зиду доспевају до транспептидаза и карбопептидаза на мембрани бактеријске ћелије, ензима који су одговорни за синтезу интерпептидиних мостова пептидогликана. Због уграђивања β-лактамског прстена у интерпептидни мост, ћелијски зид губи структуру и стабилност и више не може да штити бактеријску ћелију од осмотске лизе Резистенција на цефалоспорине Три су механизма настанка резистенције на цефалоспорине: промене састава ПБП, смањена пермеабилност и инактивација цефалоспорина β-лактамазама. Трансформацијом бактеријске ДНК може доћи до промена у генима који кодирају структуру ПБП, таргет протеина за све β-лактамске антибиотике. Овим генетским променама настају ПБП који имају смањен афинитет за β-лактамске антибиотике. Смањење пермеабиности се постиже смањеном продукцијом порина кроз које цефалоспорини пролазе кроз ћелијски зид грам негативних бактерија. Антибиотик 22

29 више не може да допре до таргет места и веже се за исто и његова активност изостаје. Иако су цефалоспорини отпорнији на инактивацију β-лактамазама од пеницилина, под притиском нових антибиотика, бактерије су се прилагодиле и почеле да синтетишу ензиме способне да цепају β-лактамски прстен цефалоспорина Цефалексин Цефалексин припада првој генерацији цефалоспорина за оралну употребу, а постоје и уљани раствори за перентералну употребу. Цефалексин се налази у форми белог прaшка, слабо растворљивог у води, а нерастворљивог у алкохолу. Чува се у затвореним посудама заштићен од светлости (European Pharmacopoeia, 2008.). Брзо се апсорбује из дигестивног тракта, присуство хране нема утицаја на апсорпцију цефалексина (Giguère et al., 2013.). Равномерно се распоређује у ткивима, а инфламација олакшава пролаз цефалексина кроз мембране. Излучује се преко бубрега, тубуларном секрецијом. Делује синергистички са аминогликозидним антибиотицима. Може да изизове алергијску реакцију. Код паса може да изазове саливацију, тахипнеју и ексцитабилност, а код мачака повраћање и температуру (Plumb, 1999.). Цефалексин делује на стафилококе, стрептококе, Асtinomyces spp., Bacillus spp., Corynbacterium spp., E. rhusiopathiae, Clostridium spp., Pasteurella spp., E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., and Salmonella spp. (Giguère et al., 2013.). Дозе за псе су мг/кг, а у случају тежих инфекција мг/кг телесне масе, п.о., с.ц., и.м., или и.в. два или три пута дневно (Saunders, 2008.). 23

30 Аминогликозидни антибиотици Аминогликозидни антибиотици су бактерицидни антибиотици који се користе за лечење инфекција изазваних аеробним грам негативним бактеријама и стафилококама. Пошто су изразито токсични, данас их из шире употребе потискују мање токсични флуорохинолони, али и даље аминогликозидни антибиотици остају антибиотици избора за лечење сепси изазваних грам негативиним аеробима (Giguère et al., 2013.) Механизам дејства Аминогликозидни антибиотици су антибиотици који инхибишу синтезу протеина. Да би деловали, аминогликозидни антибиотици морају да продру у бактеријску ћелију. Продор аминогликозидних антибиотика у ћелију олакшавају антибиотици који инхибишу синтезу ћелијског зида као што су β-лактамски антибиотици. Аеробне бактерије активно убацују аминогликозидне антибиотике у ћелију. Ово омогућава кисеоник зависна интеракција између катјона антибиотика и негативно наелектрисаних липополисахарида на бактеријској мембрани. Када доспеју у бактеријску ћелију, аминогликозидни антибиотици се везују за 30S подјединицу рибозома и изазивају грешке у читању генетске информације са ирнк (Giguère et al., 2013.). Ове грешке ремете нормалну синтезу протеина. Измењени протеини повећавају пермеабилност ћелијске мембране тако да све више антибиотика улази у ћелију. Ово доводи до зачараног круга који неминовно изазива смрт бактеријске ћелије. Улазак аминогликозидних антибиотика у бактеријску ћелију је зависан од кисеоника зато аминогликозидни антибиотици делују само на аеробне грам негативне бактерије. Не делују на анаеробе и факултативне аеробе у средини без кисеоника. 24

31 Резистенција на аминогликозидне антибиотике Резистенција на аминогликозидне антибиотике се јавља у два облика: мутације на 30S подјединици и ензимска инактивација амоногликозидних антибиотика. У присуству аминогликозидних антибиотика временом може да дође до мутација, што има за последицу промене у аминокиселинском саставу 30S подјединице рибозома. Ова промена смањује афинитет подјединице за аминогликозидне антибиотике чиме је умањен инхибиоциони ефекат на синтезу протеина, а у појединим случајевима настаје и резистенција на аминогликозидне антибиотике јер више не могу да се вежу за таргет место на 30S подјединици рибозома (Sköld, 2011.). Овај механизам резистенције је ређи и мање важан од ензимске инактивације антибиотика. Фосфотрансферазе, ацетилтрансферазе и аденилтрансферазе су ензими који инактивишу аминогликозидне антибиотике и преносе се плазмидима. Ови ензими модификују аминогликозидне антибиотике тако да не могу да се вежу за 30S подјединицу рибозома. Ензими делују у периплазматском простору тако да нема екстрацелуларне инактивације антибиотика (Giguère et al., 2013.) Токсичност Аминогликозидни антибиотици су нефротоксични и ототоксични. Нефротоксичност је далеко значајнија код клиничке употребе ових антибиотика. Нефротоксичност аминогликозидних антибиотика се манифестује акутном тубуларном некрозом. Аминоликозидни антибиотици, након филтрације у гломерулу, доспевају у реналне тубуле. Ту се негативно наелектрисани аминогликозидни антибиотици везују за позитивно наелектрисане фосфолипиде тубуларних ћелија. Посредованом пиноцитозом аминогликозидни антибиотици доспевају у цитоплазматске вакуоле које се спајају са лизозомима. Лизозомални ензими не могу да разложе аминогликозидне антибиотике и они настављају да се накупљају у лизозомима што доводи до њиховог пуцања. Лизозомални ензими, 25

32 фосфолипиди и аминогликозидни антибиотици доспевају у цитоплазму, нарушавају функцију органела и изазивају смрт ћелије (Giguère et al., 2013.). Фактори ризика који повећавају нефротоксичност су: дуготрајна терапија (дуже од 7-10 дана), више дневних доза, дисбаланс електролита, шок, ендотоксемија, употреба других нефротоксичних лекова, старост (младе и старе животиње су подложније) и постојећа оштећења бубрега (Giguère et al., 2013.). Нефротоксичност аминогликозидних антибиотика се може смањити ако се пацијенту у исхрани да калцијум или ако се пређе на храну богату протеинима, на храну која има више од 25% протеина у саставу код малих животиња, јер се калцијум и протеини везују за исте фосфолипиде као и аминогликозидни антибиотици. Такође, храна богата протеинима повећава гломеруларну филтацију и проток крви кроз бубреге што смањује накупљање аминогликозидних антибиотика у бубрезима. И начин апликације аминогликозидних антибиотика смањује њихову токсичност. Аминогликозидни антибиотици се дају једном дневно у високој дози. Токсичност аминогликозидних антибиотика је узрокована њиховом акумулацијом у ћелијама проксималних реналних тубула, тако да пик концентрације нису повезане са токсичношћу, а дужи интервал између апликације резултује мањим контактом укупне количине лека са мембраном ћелија (Giguère et al., 2013.). Ототоксичност аминогликозидни антибиотици изазивају истим механизмом као и нефротоксичност. Оштећују унутрашње ухо тако да могу да изазову оштећење слуха и/или равнотеже, стога се не препоручује употреба ових антибиотика код радних паса (полицијски, војни, ловни пси или пси водичи слепих особа) Гентамицин Гентамицин је аминогликозидни антибиотик који се добија из културе Micromonospora purpurea (Giguèreet al., 2013; Plumb, 1999.). Јавља се као бели хигроскопни прашак растворљив у води, а нерастворљив у алкохолу. Чува се у затвореним посудама (European Pharmacopoeia, 2008.). 26

33 Гентамицин се слабо апсорбује након оралне апликације. Након парентералне апликације и апсорпције, првенствено се налази у екстрацелуларној течности: плеуралној, перитоеналној, перикардијалној и синовијалној течности. Добро се распоређује и у ткивима као што су кости, срце и плућа. Излучује се бубрезима гломеруларном филтрацијом (Plumb, 1999.). Синергистички делује са β-лактамским антибиотицима против грам позитивних бактерија и са триметоприм-сулфонамидом против E. coli. Антагонизам се јавља код употребе са хлорамфениколом, тетрациклинима и еритромицином (Giguère et al., 2013.). Гентамицин изазива брадикардију и пад крвног притиска па се не препоручује брза и.в. апликација. Првенствено је ототоксичан и нефротоксичан. Оштећење бубрега је углавном реверзибилно и нестаје када се прекине апликација антибиотика. Гентамицин делује првенствено на грам негативне аеробе. Делује на Enterobacter spp., E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Serratia spp., Yersinia spp., Brucella spp., Campylobacter spp., Haemophilus spp. и Pasteurella spp. Staphylococcus aureus је посебно осетљив од грам позитивних бактерија (Giguère et al., 2013.). Не делује на грам позитивне и грам негативне анаеробе и факултативне аеробе у средини без кисеоника. Дозе гентамицина за псе су 4 6 мг/кг телесне масе, једном дневно и.м., с.ц. или и.в. (Giguère et al., 2013; Saunders, 2008.) Макролидни антибиотици Механизам дејства Макролидни антибиотици су антибиотици који инхибишу синтезу протеина, реверзибилно се везујући за 50S подјединицу рибозома. Инхибишу процесе транспептидације и транслокације тако да долази до преурањеног одвајања непотпуних полипептидних ланаца. Макролидни антибиотици делују 27

34 бактериостатски, а у вишим концентрацијама против осетљивих врста бактерија могу да делују и бактерицидно (Giguère et al., 2013.) Резистенција на макролидне антибиотике Резистенија на макролидне антибиотике настаје преко три механизма: метилацијом ррнк, појачаним избацивањем макролидних антибиотика из ћелије и ензимском инактивацијом антибиотика. Метилација ррнк је процес у коме се аденин који улази у састав ррнк у 50S подјединици добија метил групу. Уобичајено, аденин нема метил групу, али под дејством ензима N-метил трансфераза метил група се додаје аденину. Аденину додата метил група мења терцијарну струкутуру ррнк омогућавајући синтезу протеина, али онемогућавајући макролидним антибиотицима да се вежу за 50S подјединицу рибозома (Sköld, 2011.). Синтеза ензима који метилишу ррнк је кодирана erm (erythromycin-resistant methylase) генима који се преносе плазмидима (Giguère et al., 2013.). Резистенција на макролидне антибиотике која настаје метилацијом ррнк је укрштена резистенција и са линкозамидима, јер се линкозамиди везују за исто место на рибозомима. Избацивање макролидних антибиотика из ћелије се врши на два начина: преко аденозин трифосфат (АТП) протеинске пумпе или преко суперфамилије транспортних протеина. Ови протеини избацују антибиотике из ћелије и омогућавају рибозомима да неометано обављају своју функцију. До данас је откривено 20 различитих гена који кодирају синтезу ових протеина (Giguère et al., 2013.). Ензимска инактивација је најмање заступљен механизам резистенције на макролидне антибиотике. Естеразе и фосфорилазе су ензими који могу да инактивишу макролидне антибиотике. 28

35 Еритромицин Еритромицин је антибиотик кога синтетише Saccharopolyspora erythraea, ранији назив је Streptomyces erythraeus (Giguère et al., 2013.). У облику је белог до бледо жутог хигроскопног прашка. Еритромицин је слабо растворљив у води. Растворљивост у води му опада на вишим температурама. Нерастворљив је у алкохолу. Чува се у контејнерима заштићен од светлости (European Pharmacopoeia, 2008.). Еритромицин је подложан разгардњи желудчаном киселином тако да таблете за оралну употребу долазе са филм овојницом. Апсорбује се у горњим партијама танког црева. Присуство хране може негативно да утиче на апсорпцију па се препоручује да се еритромицин даје на празан стомак. Добро се распоређује у ткивима. Не прелази у цереброспиналну течност. Најзначајнији пут излучивања еритромицина је путем жучи у непромењеном облику, а само у мањем проценту се излучује путем урина у непромењеном облику (Plumb, 1999.). Не препоручује се употреба еритромицина се линкозамидима и хлорамфениколом јер имају исто таргет место на 50S подјединици рибозома и долази до компетиције за место везивања (Giguère et al., 2013.). Еритромицин изазива болност на месту апликације када се даје и.м. Приликом оралне примене антибиотика може да се јави пролив, повраћање и анорексија. Контраиндикована је употреба еритромицина код одраслих коња јер доводи до смрти услед пролива којег изазива Clostridium difficile (Giguère et al., 2013.). Еритромицин може довести до повећања јетриних ензима (АЛТ и АСТ). Еритромицин се користи за лечење инфекција изазваних грам позитивним аеробима: стрептококама, стафилококама, Bacillus spp., Corynebacteriom spp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria spp., Clostridium spp. (изузев C. difficile), Rhodococcus equi. Од грам негативних бактерија делује на: Actinobacillus spp., Bacterioides spp., и Mycoplasma spp. Не делује на Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Nocardia spp. и Mycobacterium spp. (Giguère et al., 2013.). Доза еритромицина за псе износи мг/кг телесне масе п.о., два или три пута дневно (Giguère et al., 2013.; Saunders, 2008.; Greene, 2012.). 29

36 Линкозамиди Механизам дејства Линкозамиди су антибиотици који инхибишу синтезу протеина. Везују се за исто место на 50S подјединици рибозома као и макролидни антибиотици и инхибишу дејство трансферазе чиме се стварају непотпуни полипептидни ланци. Зависно од концентрације антибиотика и осетљивост бактерија на линкозамиде могу деловати бактериостатски или бактерицидно Резистенција на линкозамиде Резистенција на линкозамиде је најчешће укрштена се резистенцијом на макролидне антибиотике. Механизам настанка резистенције је метилација ррнк. Метилација настаје додавњем метил групе аденину који улази у састав РНК. Ову реакцију катализује ензим метилаза кога кодирају erm гени који се преносе плазмидима. Метилација аланина доводи до промена у терцијарној структури ррнк 50S подјединице рибозома тако да се линкозамиди више не могу везати за таргет место и инхибисати синтезу протеина. Појачано избацивање линкозамида из бактеријске ћелије и ензимска инактивација су механизми који су мање заступљени Клиндамицин Клиндамицин је полусинтетски дериват линкомицина, антибиотика добијеног из Streptomyces lincolensis. Клиндамицин се налази у облику белог или скоро белог кристалног прашка. Растворљив је у води, а слабо растворљив у алкохолу. Чува се у затвореним посудама (European Pharmacopoeia, 2008.). Клиндамицин се добро раствара у липидима, има широку дистрибуцију у организму и пролази кроз ћелијске баријере (Giguère et al., 2013.). Клиндамицин се брзо апсорбује из дигестивног тракта. Присуство хране не смањује апсорпцију, 30

37 али продужује време за које се лек апсорбује. Равномерно се распоређује у ткивима, пролази и у цереброспиналну течност у значајном проценту уколико су менинге инфламиране (Plumb, 1999.). Клиндамицин се разграђује у јетри на 7 метаболита од којих само један има антимикробно дејство. Углавном се излучује из организма путем јетре, али око 20% лека се излучује урином у непромењеном облику (Giguère et al., 2013.). Клиндамицин делује антагонистички са еритромицином и хлорамфениколом. Изазива болност на месту апликације када се апликује и.м. Код паса и мачака може да изазове повраћање и пролив, али студије су показале де не изазива токсичност и када се даје у 10 пута већој дози. Контраиндикована је употреба овог лека код коња, глодара и преживара јер изазива дијареје које могу имати смртни исход. Доводи до повећања ензима јетре (АЛТ, АСТ и алкалне фосфатазе). Може да изазове алергијске реакције (Plumb, 1999.). Клиндамицин делује на грам позитивне бактерије: Bacillus spp., Corynebacterium spp., Erysipelothrix rhusiopathiae, стафилококе, стрептококе, Actinomyces spp., Clostridium perfringens (не делује на остале Clostridium spp.), делује на протозоу Toxoplasma gondii. Не делује на грам негативне бактерије (Giguère et al., 2013.). Дозе клиндамицина за псе су: за лечење обољења усне дупље од 5 11 мг/кг телесне масе п.о. два пута дневно, за остеомијелитис 11 мг/кг, и.в. или и.м. два или три пута дневно, а за пиодерму 5 33 мг/кг, п.о. два пута дневно, или 11 мг/кг ако се даје једном дневно (Saunders, 2008.) Тетрациклини Тетрациклини су антибиотици широког спектра дејства који су прилично заступљени у ветеринарској медицини. Добијају се из Streptomyces spp., али данас се добијају и полусинтетским путем из окситетрациклина, првог изолованог тетрациклина. Као што им се из имена може наслутити, хемијски се састоје из четири прстена са различитим функционалним групама. 31

38 Механизам дејства Тетрациклини су антибиотици који инхибишу синтезу протеина. Везују се за 70S рибозоме и онемогућавају трнк која носи аминокиселину да се веже за рибозом. На овај начин се зауставља синтеза протеина у бактеријској ћелији. Тетрациклини имају бактериостатско дејство. Могу да испоље и бактерицидно дејство код пријемчивих бактерија ако се апликују дужи временски период (Giguère et al., 2013.). У великим концентрацијама тетрациклини могу да инхибишу и синтезу протеина у ћелијама сисара (Plumb, 1999.). Осим што делују на бактеријске рибозоме, тетрациклини имају и антипаразитско дејство делујући на органеле које имају геном и компоненте сличне прокариотским рибозомима. Тетрациклини мењају структуру апикопласта Plasmodium falcipаrum i Babesia spp. тако да њихови развојни облици имају краћи животни век. Делују и бактерицидно на Wolbachia pipientis, симбионта нематоде Dirofilaria immits, који је неопходан за плодност и раст нематоде (Giguère et al., 2013.) Резистенција на тетрациклине Да би доспели до рибозома, тетрациклини морају прво да доспеју у унутрашњост бактеријске ћелије. Да би прошли ћелијску мембрану молекули антибиотика се везују за јоне магнезијума и кроз порине пролазе кроз ћелијски зид (Giguère et al., 2013.). Резистенција на тетрациклине је посредована различитим механизмима. Први је систем за избацивање антибиотика из ћелије који је зависан од енергије. Основу овог механизма чине антипортери, градивни протеини ћелијске мембране који у бактеријску ћелију убацују један Н + јон из екстрацелуларног простора истовремено избацујући комплекс тетрациклин-mg 2+ из интрецелуларног простора (Giguère et al., 2013.). Други механизам је продукција заштитних рибозомалних протеина који одвајају тетрациклине од таргет места на рибозомима. Ова два механизма су најзначајнији механизми резистенције на тетрациклине. Трећи механизам резистенције су мутације на ррнк тако да се мења таргет место тетрациклина, а синтеза протеина се обавија несметано. 32

39 Четврти механизам је смањење броја порина у ћелијском зиду кроз које тетрациклини доспевају у ћелију Окситетрациклин Окситетрациклин је антибиотик који се добија из Streptomyces rimosus. У облику је жутог прашка слабо растворљивог у води, а растворљивог у киселим и базним растворима. Чува се на собној температури, заштићен од светла (European Pharmacopoeia, 2008.). Окситетрациклин се добро апсорбује након пероралне примене. Присуство хране у дигестивном тракту, нарочито млечних прозивода, може да смањи ресорпцију тетрациклина из дигестивног тракта. Поливаленти јони Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+, Cu 2+, Fe 2+, Fe 3+, Al 3+ преципитирају окситетрациклин и смањују његову активност (Giguère et al., 2013.). Након и.м. или с.ц. апликације изазива иритацију ткива што успорава његову ресорпцију. Окситетрациклин се надуже задржава у органима који су најбоље прокрвљени: бубрези, јетра, плућа, крв, синовијална течност и мишићи. Пролази плаценту. Окситетрациклин се примарно излучује преко бубрега у непромењеном облику механизмом гломеруларне филтрације. Један део се излучује преко жучи. Излучена количина зависи од растворљивости у липидима. Окситетрациклин подлеже ентерохепатичној циркулацији (Giguère et al., 2013.). Окситетрациклин може да изазове повраћање након пероралне примене. Иритира ткиво након локалне апликације што може да продужи ресорпцију са места апликације. Могу да наруше равнотежу цревне микрофлоре и изазову пролив. Изазива апоптозу остеокласта тако да хронична употреба може имати негативне ефекте на развој костију (Giguère et al., 2013.). Не саветује се употреба окситетрациклина код младих животиња јер доводи до промене боје костију и зуба у жуту, смеђу или сиву (Plumb, 1999.). Окситетрациклин се користи за лечење инфекција изазваних са Bacillus spp., Corynebacterium spp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria monocytogenes, Actinobacillus spp., Bordetella spp., Borellia spp., Brucella spp., Francisella tularensis, Leptospira spp., Mannheimia spp., Pasteurella spp., укључујући и P. multocida, 33

40 Yersinia spp., Anaplasma spp., Chlamydia spp., Chlamydophila spp., Coxiella burnetii, Ehrlichia spp., Rickettsia spp., Mycoplasma spp. Због настанка резистенције, може се десити да не делује на стафилококе, стрептококе, E.coli, i Salmomella spp. Не делује на Mycobacterium spp., Proteus mirabilis i Pseudomonas aeruginosa (Giguère et al., 2013.). Код паса се тетрациклини првенствено користе за лечење инфекција изазваних са Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis i Rickettsia spp. (Giguère et al., 2013.). Дозе окситетрациклина за псе су: мг/кг п.о. или и.в. три пута дневно (Saunders, 2008.) Триметоприм - сулфаметаксазол Триметоприм и сулфаметаксазол се налазе у фиксном 1:5 односу у коме имају најјаче синергистичко дејство (Giguère et al., 2013.). Свака компонента понаособ има бактериостатско дејство, а заједно делују бактерицидно. Механизам дејства: триметоприм сулфаметаксазол инхибише синтезу бактеријске ДНК. Триметоприм и сулфаметаксазол се уплићу у процес синтезе фолне киселине. Сулфаметаксазол спречава уградњу парааминобензоеве киселине (ПАБА) у дихидрофолну киселину, а триметоприм делује на следећи корак у метаболизму фолне киселине: онемогућава синтезу тетрахидрофолне киселине из дихидрофолне. Без тетрахидрофолне киселине као кофактора, изостаје синтеза пуринских база, а самим тим и синтеза ДНК. Резистенција на триметоприм сулфаметаксазол настаје као резистенција на појединачне компоненте: триметоприм или сулфаметаксазол или као резистенција на обе компоненте истовремено. Резистенција на триметоприм настаје због синтезе резистентног ензима дихидрофолат редуктазе. Овај ензим кодира хромозомална ДНК или плазмиди. Резистенција на сулфаметаксазол настаје као последица мутације на хромозому која настаје под притиском антибиотика. Мутација доводи до смањеног продора 34

41 антибиотика у ћелију, продукције ензима који је неосетљив на сулфаметаксазол или до хиперпродукције ПАБА. Триметоприм се налази у облику белог или жућкасто белог прашка, слабо растворљивог у алкохолу. Сулфаметаксазол је бели кристални прашак, нерастворљив у води, а слабо растворљив у алкохолу. Триметоприм сулфаметаксазол се чува у затвореним посудама заштићен од светлости (European Pharmacopoeia, 2008.). Триметоприм сулфаметаксазол се добро апсорбује након пероралне примене. Добро се распоређује у организму. Излучује се преко бубрега гломеруларном филтрацијом и тубуларном секрецијом, а и метаболише се у јетри. Овај лек код паса може да изазове кератокоњуктивитис, повраћање, анорексију, пролив, хепатитис праћен иктерусом, хемолитичну анемију, утрикарију, полидипсију, полиурију и алергијске реакције. Алергијским реакцијама су склоније веће расе паса, нарочито добермани (Plumb, 1999.). Триметоприм сулфаметаксазол делује на: стрептококе, Staphylococcus aureus, Corynebacterium spp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Actinobacillus spp., Bordatella spp., Brucella spp., E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Haemophilus spp., Pasteurella spp., Actinomyces spp., Bacteroides spp. i Chlamydia spp. Не делује на Rickettsia spp., Leptospira spp., Pseudomonas aeruginosa i Mycoplasma spp. (Giguère et al., 2013.). Дозе за пса су: мг/кг, п.о., два пута дневно (Saunders, 2008.) ЗНАЧАЈ У КЛИНИЧКОЈ ПАТОЛОГИЈИ ПАСА Staphylococcus aureus се код паса најчешће налази на кожи и слузокожама, првенствено на слузокожи носа и грла, али се може наћи и у другим органским системима: плућима, срцу, јетри и у уринарним путевима. Staphylococcus aureus код паса најчешће изазива гнојно запаљење коже (pyoderma) и запаљење 35

42 спољашњег ушног канала (otitis externa). Ређе изазива инфкције рана и хируршких рана, запаљење плућа, запаљење уринарних путева и ендокардитис (Greene, 2012., Sykes, 2014.). Пиодерма код паса се најчешће јавља секундарно када стафилокок, који се налази као коменсал на кожи, искористи пробој заштитне баријере. Обично се јавља код демодикозе или алергијских стања код којих пси чешањем направе лезије на кожи. Отитиси обично почињу трешењем главе пса. Повремено трешење главе власници паса често превиде и код ветерианра дођу када је процес већ одмакао. Гној непријатног мириса цури из ушију пса, а ушни канал је отечен, задебљао и улцерисан. Лечење је обично дуготрајно. Лечење инфекција изазваних са S. aureus се заснива на антибиограму. Цефалоспорини прве генерације (цефалексин) или β-лактамски антибиотици у комбинацији са инхибиторима β лактамазе (амоксицилин и клавулoнска киселина) су први избор у лечењу инфекција уколико се не може чекати на резултате антибиограма (Greene, 2012.). Све учесталија појава резистенције на антибиотике сојева Staphylococcus aureus-a представља фактор који знатно отежава борбу против инфекција изазваних овом бактеријом. 36

43 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад 4. Материјал и методе рада 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ РАДА Стерилиним брисевима узимани су брисеви из носа и грла паса луталица. Пси луталице су били клинички здрави у тренутку узимања брисева. Пси су били три дана под ветеринарским надзором после операције и током овог периода нису показали симптоме болести. Брисеви су узимани у ЈКП Зоохигијена и Ветерина у Новом Саду. Пси су се налазили у оквиру Pet friendly програма стерилизације и кастрације паса луталица. Прикупљено је 68 брисева носа и грла паса луталица који потичу из различитих делова града. Брисеви су засeјавани на селективну подлогу манитол слани агар и култивисани су 24 часа на 37 О С у Лабораторији за микробиологију Департмана за ветеринарску медицину Пољопривредног факултета. Од 68 брисева носа 23 су дала пораст на агару, а од 68 брисева грла позитиван пораст је забележен на 10 подлога. Изолати су пресејани на нове подлоге и послати у Институт за јавно здравље Војводине на идентификацију и испитивање осетљивости на антибиотике. Добијени изолати су диференцирани на основу коагулаза и манитол теста. Staphylococcus aureus је коагулаза и манитол позитиван. Од 23 позитивна узорка из бриса носа паса 9 их је идентификовано као Staphylococcus aureus, а од 10 узорака из 38

44 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад 4. Материјал и методе рада грла, три су идентификована као стафилокок. Остали узорци су били коагулаза негативне врсте стафилокока. Изолати Staphylococcus aureus-а су испитивани на антимикробне лекове помоћу диск дифузионе методе. Испитана је осетљивост изолата на: пеницилин, ампицилин, метицилин, амоксицилин и клавулoнску киселину, цефалексин, гентамицин, еритромицин, клиндамицин, окситетрациклин и триметоприм сулфаметаксазол. 39

45 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад 4. Материјал и методе рада 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ РАДА Стерилиним брисевима узимани су брисеви из носа и грла паса луталица. Пси луталице су били клинички здрави у тренутку узимања брисева. Пси су били три дана под ветеринарским надзором после операције и током овог периода нису показали симптоме болести. Брисеви су узимани у ЈКП Зоохигијена и Ветерина у Новом Саду. Пси су се налазили у оквиру Pet friendly програма стерилизације и кастрације паса луталица. Прикупљено је 68 брисева носа и грла паса луталица који потичу из различитих делова града. Брисеви су засeјавани на селективну подлогу манитол слани агар и култивисани су 24 часа на 37 О С у Лабораторији за микробиологију Департмана за ветеринарску медицину Пољопривредног факултета. Од 68 брисева носа 23 су дала пораст на агару, а од 68 брисева грла позитиван пораст је забележен на 10 подлога. Изолати су пресејани на нове подлоге и послати у Институт за јавно здравље Војводине на идентификацију и испитивање осетљивости на антибиотике. Добијени изолати су диференцирани на основу коагулаза и манитол теста. Staphylococcus aureus је коагулаза и манитол позитиван. Од 23 позитивна узорка из бриса носа паса 9 их је идентификовано као Staphylococcus aureus, а од 10 узорака из 38

46 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад 4. Материјал и методе рада грла, три су идентификована као стафилокок. Остали узорци су били коагулаза негативне врсте стафилокока. Изолати Staphylococcus aureus-а су испитивани на антимикробне лекове помоћу диск дифузионе методе. Испитана је осетљивост изолата на: пеницилин, ампицилин, метицилин, амоксицилин и клавулoнску киселину, цефалексин, гентамицин, еритромицин, клиндамицин, окситетрациклин и триметоприм сулфаметаксазол. 39

47 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад 5. Резултати 5. РЕЗУЛТАТИ Staphylococcus aureus је изолован код 9 паса луталица (13,24%) од укупно 68 прикупљених брисева носа (график 1), а код истог толиког броја брисева грла Staphylococcus aureus је изолован код три пса (4,41%) (график 2). Остали изолати су припадали коагулаза негативним врстама стафилокока. Симптоми болести нису утврђени ни код једног пса од којих су узимани брисеви. Стафилокок је изолован из носа и из грла код само једног пса. Преостали позитивни изолати из грла и носа воде порекло од различитих паса. Испитивањем осетљивости на антибиотике утврђена је резистенција на пеницилине и то на пеницилин Г и ампицилин код 7 изолата (77,77%) из носа и код једног изолата (33,33%) из грла. Није утврђена резистенција на комбинацију пеницилина са инхибиторима β-лактамазе (амоксицилин и клавулонска киселина) ни код једног изолованог стафилокока као ни резистенција на метицилин, цефалексин, гентамицин, еритромицин, клиндамицин, окситетрациклин и триметоприм сулфаметаксазол (табела 1.). Пас код кога је изолован стафилокок из носа и из грла није поседовао укрштену резистенцију на антибиотике. Стафилокок изолован из носа пса је резистентан на пеницилин Г и ампицилин, а стафилокок изолован из грла је осетљив на оба антибиотика. 40

48 Дипл. вет. Маја Симић Мастер рад 5. Резултати График 1: Налаз Staphylococcus aureus у брису носа паса луталица 13,24% Није изолован S. aureus Изолован Staphylococcus aureus 86,76% График 2: Налаз Staphylococcus aureus у брису грла паса луталица 4.41% Изолован S. aureus Није изолован S. aureus 95.59% 41