ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ «ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ - ΒΙΟΑΝΑΛΥΣΗ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΙ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΑΣ ΓΙΑ ΜΕΤΑΒΟΛΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΛΕΝΗ ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΘΕΟΔΩΡΟΥ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΘΕΟΔΩΡΙΔΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ «ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΥΣΗ - ΒΙΟΑΝΑΛΥΣΗ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΙ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΑΣ ΓΙΑ ΜΕΤΑΒΟΛΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΛΕΝΗ ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΘΕΟΔΩΡΟΥ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΘΕΟΔΩΡΙΔΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ «ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΥΣΗ - ΒΙΟΑΝΑΛΥΣΗ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΙ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΑΣ ΓΙΑ ΜΕΤΑΒΟΛΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΘΕΟΔΩΡΟΥ ΕΛΕΝΗ, ΧΗΜΙΚΟΣ Εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Τομέα Φυσικής, Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής, Γεώργιος Θεοδωρίδης- Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγήτρια, Αναστασία Ζώτου - Μέλος εξεταστικής επιτροπής Λέκτορας, Ελένη Γκίκα - Μέλος εξεταστικής επιτροπή Η τριμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε σύμφωνα με την απόφαση της Γ.Σ.Ε.Σ. του Τμήματος στη συνεδρίασή της αριθμ. 292/ , για την κρίση της Μεταπτυχιακής Διπλωματικής Εργασίας της Θεοδώρου Ελένης, Χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την 08/06/2016, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της εργασίας με τίτλο <<Ανάπτυξη Πολυδύναμης Αναλυτκής Μεθόδου Χρωματογραφίας Υδρόφιλων Αλληλεπιδράσεων Φασματομετρίας Μάζας για Μεταβολομική Ανάλυση.>> και την ενέκρινε με βαθμό εννέα (09).

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία, εκπονήθηκε το ακαδημαϊκό έτος στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του τμήματος Χημείας, της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, καθώς και στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας της Σχολής Tεχνολογίας Τροφίμων του Αλεξάνδρειου Τεχνολογικού Εκπαιδευτικού Ιδρύματος Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη του Καθηγητή Γεωργίου Θεοδωρίδη στα πλαίσια του ΔΠΜΣ Χημική Ανάλυση - Βιοανάλυση. Κύριος στόχος της διπλωματικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη και η επικύρωση πολυδύναμης μεθόδου Υγρής Χρωματογραφίας Υδρόφιλης Αλληλεπίδρασης με συζευγμένη Φασματομετρία Μαζών (HILIC-LC-MS/MS) για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό μεγάλου αριθμού πολικών μεταβολιτών και η εφαρμογή της σε θυμαρίσια δείγματα μελιού. Η παρούσα διπλωματική εργασία χωρίζεται σε δύο τμήματα: το θεωρητικό και το πειραματικό. Στο πρώτο γίνεται αναφορά στη Φασματομετρία Μαζών στην Υγρή Χρωματογραφία, και στις βασικές αρχές που τις διέπουν. Επίσης γίνεται αναφορά στη Μεταβολομική ανάλυση και στο μέλι. Στο πειραματικό μέρος, αναφέρονται αναλυτικά οι συσκευές και τα υλικά, που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας. Περιγράφεται η διαδικασία βελτιστοποίησης των χρωματογραφικών και φασματομετρικών συνθηκών για την επικύρωση της αναλυτικής μεθόδου, καθώς και αναλυτικά τα στάδια της πειραματικής διαδικασίας. Τέλος παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από την εφαρμογή της μεθόδου σε θυμαρίσια μέλια. Κατά τη διάρκεια της παρούσας διπλωματική εργασίας είχα την ευχαρίστηση να έχω ως επιβλέποντα καθηγητή τον Καθηγητή του Τμήματος Χημείας Α.Π.Θ. κ. Γεώργιο Θεοδωρίδη, ο οποίος μου προσέφερε ανεκτίμητη βοήθεια μέσα από την πολύχρονη πείρα του και την επιστημονική του κατάρτιση. Γι αυτό θα ήθελα να τον ευχαριστήσω ιδιαίτερα για την υπομονή του, της καθοδήγησή του και για το ότι με δέχτηκε στην ομάδα του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την κα. Γκίκα Ελένη, Λέκτορα του Τμήματος Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ και την κα. Ζώτου Αναστασία Στέλλα, Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας Α.Π.Θ για τις πολύτιμες γνώσεις και εύστοχες επισημάνσεις τους, που αποδείχτηκαν ιδιαίτερα χρήσιμες, καθώς επίσης και τον κ. Καλογιάννη Σταυριανό Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Διατροφής και Διαιτολογίας Α.Τ.Ε.Ι., ο οποίος παρείχε τις εργαστηριακές εγκαταστάσεις του Εργαστηρίου Α.Τ.Ε.Ι. Ευχαριστίες οφείλω και στην κα. Τανανάκη Χρυσούλα Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Γεωπονίας Α.Π.Θ., για τις γνώσεις και τις επισημάνσεις της για το μέλι, καθώς και στο εργαστήριο Μελισσοκομίας Α.Π.Θ για την παραχώρηση των δειγμάτων μελιού και σε όλη την ομάδα των εργαστηρίων για την άψογη συνεργασία και το ευχάριστο και φιλικό κλίμα κατά την παραλαβή των δειγμάτων, τους σχολιασμούς και ανταλλαγή απόψεων πάνω στο ερευνητικό αντικείμενο. Θερμές ευχαριστίες οφείλω επίσης στη συνάδελφό μου Πίνα Αθανασία, για τις πολύτιμες συμβουλές, την άριστη συνεργασία και τις πολυάριθμες και εποικοδομητικές συζητήσεις καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων, καθώς όλο το κομμάτι της ανάπτυξης και επικύρωσης της μεθόδου έγινε από κοινού.

5 Ένα μεγάλο ευχαριστώ σε όλη την ομάδα του κ. Θεοδωρίδη και κυρίως την υποψήφια διδάκτορα Μπέγου Όλγα που με την προσφορά τους και τις γνώσεις τους συνετέλεσαν, με τη σειρά τους, στη διεξαγωγή της διπλωματικής αυτής εργασίας. Τέλος, θα ήθελα να πω το μεγαλύτερο ευχαριστώ στους γονείς μου, τον αδερφό μου και τη σύντροφό του, τον σύντροφό μου και όλους τους κοντινούς μου ανθρώπους για την υπομονή τους, την ηθική, και ψυχολογική συμπαράσταση που μου προσέφεραν κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας. Τους οφείλω λιτά και απέριττα τα πάντα... Ελένη Θεοδώρου Θεσσαλονίκη, Ιούνιος 2016

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΝΣΜΖΔΗ ΔΤΡΔΣΖΡΗΟ ΠΗΝΑΚΧΝ ΔΤΡΔΣΖΡΗΟ ΥΖΜΑΣΧΝ ΘΔΧΡΖΣΗΚΟ ΜΔΡΟ ΚΔΦΑΛΑΗΟ 1 Ο : ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΑ 1.1 ΗΣΟΡΗΚΖ ΑΝΑΓΡΟΜΖ ΓΔΝΗΚΔ ΑΡΥΔ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΑ ΠΔΗΡΑΜΑΣΗΚΖ ΓΗΑΣΑΞΖ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΟΤ ΜΑΕΑ ΤΣΖΜΑ ΔΗΑΓΧΓΖ ΓΔΗΓΜΑΣΟ Σύζηεκα Μεκνλσκέλεο Δηζαγσγήο Γείγκαηνο (Batch Inlet) Σύζηεκα Άκεζεο Δηζαγσγήο Γείγκαηνο (Direct Probe) Σύδεπμε κε Φξσκαηνγξαθία ΠΖΓΖ ΗΟΝΣΧΝ Ινληζκόο Αέξηαο Φάζεο (Gas Phase Ionization) Δθξόθεζε θαη Ινληζκόο Πεδίνπ (Field Desorption and Ionization) Βνκβαξδηζκόο κε Σσκαηίδηα (Particle Bombardment) Ινληζκόο Αηκνζθαηξηθήο Πίεζεο (Atmospheric Pressure Ionization) Δθξόθεζε κε Φξήζε Λέηδεξ (Laser Desorption) ΑΝΑΛΤΣΔ ΣΖ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΧΝ Αλαιπηήο Μαγλεηηθνύ Τνκέα ή Απιήο Δζηίαζεο Αλαιπηήο Μαγλεηηθνύ θαη Ηιεθηξνζηαηηθνύ Πεδίνπ ή Γηπιήο Δζηίαζεο (Double Focusing) Αλαιπηέο Παγίδαο Ιόλησλ (Ion Trap) Αλαιπηέο Φξόλνπ Πηήζεο (Time of Flight Υβξηδηθόο Αλαιπηήο (Orbitrap) Τεηξαπνιηθνί Αλαιπηέο (Quadrupole MS) Τξηπιό Τεηξάπνιν (QQQ) Τερληθέο Σάξσζεο ΑΝΗΥΝΔΤΣΔ ΣΖ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΧΝ Φαξαληατθό Κύπειιν (Faraday Cup) Ηιεθηξνληνπνιιαπιαζηαζηήο (Electron Multiplier) ΤΣΖΜΑ ΚΔΝΟΤ 28 i iv v 18

7 1.9 ΤΕΔΤΞΖ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΧΝ ΜΔ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΚΔ ΣΔΥΝΗΚΔ ΚΔΦΑΛΑΗΟ 2 Ο : ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΠΔΡ-ΤΦΖΛΖ ΠΗΔΖ 2.1 ΗΣΟΡΗΚΑ ΣΟΗΥΔΗΑ ΓΔΝΗΚΑ ΓΗΑ ΣΖΝ ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΜΖΥΑΝΗΜΟΗ ΓΗΑΥΧΡΗΜΟΤ ΚΑΗ ΔΗΓΖ ΣΖΝ ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ Γηαρσξηζκνί κε Βάζε ηελ Πνιηθόηεηα Γηαρσξηζκόο κε Βάζε ην Φνξηίν Γηαρσξηζκόο κε Βάζε ην Μνξηαθό Μέγεζνο Φξσκαηνγξαθία Σπγγέλεηαο (Affinity Chrmatography) ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΗΑ ΣΖ ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΠΔΡ- ΤΦΖΛΖ ΑΠΟΓΟΖ ΚΔΦΑΛΑΗΟ 3 Ο : ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΓΡΟΦΗΛΖ ΑΛΛΖΛΔΠΗΓΡΑΖ (HILIC) 3.1 ΓΔΝΗΚΑ ΓΗΑ ΣΖ HILIC ΜΖΥΑΝΗΜΟ HILIC ΣΑΣΗΚΔ ΦΑΔΗ ΚΑΗ ΓΗΑΛΤΣΔ ΣΖ HILIC Δπηινγή Σηαηηθήο Φάζεο Δπηινγή Γηαιύηε ΠΛΔΟΝΔΚΣΖΜΑΣΑ ΚΑΗ ΜΔΗΟΝΔΚΣΖΜΑΣΑ ΣΖ HILIC 46 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 4 Ο : ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ 4.1 ΓΔΝΗΚΑ ΓΗΑ ΣΖ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ ΣΡΟΦΗΜΧΝ (FOOD METABOLOMICS) ΜΔΣΑΒΟΛΗΣΔ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ ΑΝΑΛΤΖ Ζ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΑ ΣΖ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ 50 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 5 Ο : ΣΟ ΜΔΛΗ 5.1 ΣΟ ΜΔΛΗ ΚΑΗ ΣΑ ΔΗΓΖ ΣΟΤ ΤΣΑΖ ΜΔΛΗΟΤ Φπζηθά θαη Οξγαλνιεπηηθά Φαξαθηεξηζηηθά ηνπ Μειηνύ Φεκηθή Σύζηαζε ηνπ Μειηνύ Σάθραξα Οξγαληθά Ομέα Ακηλνμέα Βηηακίλεο

8 5.3 ΒΟΣΑΝΗΚΖ ΚΑΗ ΓΔΧΓΡΑΦΗΚΖ ΠΡΟΛΔΤΖ ΣΟΤ ΜΔΛΗΟΤ 60 ΚΟΠΟ 62 ΠΔΗΡΑΜΑΣΗΚΟ ΜΔΡΟ ΚΔΦΑΛΑΗΟ 6 Ο : ΤΣΖΜΑ LC-TSQ QUANTUM ACCESS MAX 6.1 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΗΑ ΓΔΝΗΚΖ ΠΔΡΗΓΡΑΦΖ ΤΚΔΤΔ ΑΝΑΛΧΗΜΑ ΤΛΗΚΑ- ΑΝΣΗΓΡΑΣΖΡΗΑ 68 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 7 Ο : ΑΝΑΠΣΤΞΖ ΑΝΑΛΤΣΗΚΖ ΜΔΘΟΓΟΤ 7.1 ΔΝΧΔΗ ΚΑΗ ΠΑΡΑΚΔΤΖ ΠΡΟΣΤΠΧΝ ΓΗΑΛΤΜΑΣΧΝ ΠΑΡΑΜΔΣΡΟΗ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΟΤ ΜΑΕΑ Γηαδηθαζία Λήςεο MRM ΠΑΡΑΜΔΣΡΟΗ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΠΔΡ-ΤΦΖΛΖ ΠΗΔΖ ΒΔΛΣΗΣΟΠΟΗΖΖ ΠΑΡΑΜΔΣΡΧΝ LC-MS Φξσκαηνγξαθηθέο Σπλζήθεο Παξάκεηξνη Φαζκαηνκέηξνπ Μάδαο 79 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 8 Ο : ΔΠΗΚΤΡΧΖ ΜΔΘΟΓΟΤ 8.1 ΚΑΜΠΤΛΔ ΑΝΑΦΟΡΑ ΠΡΟΣΤΠΧΝ ΓΗΑΛΤΜΑΣΧΝ ΟΡΗΑ ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΚΑΗ ΠΟΟΣΗΚΖ ΑΠΟΣΗΜΖΖ ΠΗΣΟΣΖΣΑ ΜΔΘΟΓΟΤ 89 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 9 Ο : ΔΦΑΡΜΟΓΖ ΜΔΘΟΓΟΤ 9.1 ΠΡΟΚΑΣΔΡΓΑΗΑ ΓΔΗΓΜΑΣΧΝ Γνθηκέο Πξνθαηεξγαζίαο ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ΓΔΗΓΜΑΣΧΝ 96 ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ 100 ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ 101 ΠΔΡΗΛΖΦΖ 110 ABSTRACT 112 ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ I 113

9 Συντμή σεις και Ξενό γλωσσόι Όρόι ACN Acetonitrile Αθεηνληηξίιην APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization Υεκηθφο Ηνληζκφο ζε Αηκνζθαηξηθή Πίεζε B Magnetic Sector Αλαιπηήο Μαγλεηηθνχ Σνκέα C.E Collision Energy Δλέξγεηα Θξαπζκαηνπνίεζεο CI Chemical Ionization Υεκηθφο Ηνληζκφο CRM Charge Residue Model Μνληέιν Τπνιεηκκαηηθνχ Φνξηίνπ C.V Cone Voltage Γπλακηθφ Κψλνπ CV Coefficient of Variation πληειεζηήο Μεηαβιεηφηεηαο CZE Capillary Zone Electrophoresis Σξηρνεηδήο Ζιεθηξνθφξεζε Εσλψλ EBC Effective Buffer Concentration Δλεξγή πγθέληξσζε Ρπζκηζηηθνχ Γηαιχκαηνο EI Electron Impact Πξφζθξνπζε Ζιεθηξνλίσλ ELSD Evaporative Light Scattering Detection Δμαηκηζηηθφο Αληρλεπηήο θέδαζεο Φσηφο ESI Electrospray Ionization Ηνληζκφο κε Ζιεθηξνςεθαζκφ EtOH Ethanol Αηζαλφιε FAB Fast Atom Bombardment Βνκβαξδηζκφο κε Σαρέσο Κηλνχκελα Άηνκα FD Field Desorption Δθξφθεζε Πεδίνπ FI Field Ionization Ηνληζκφο Πεδίνπ FID Flame Ionization Detector Αληρλεπηήο Ηνληζκνχ Φιφγαο FLD Fluorescence Detector Αληρλεπηήο Φζνξηζκνχ FTMS Fourier Transform Mass Spectrometry Φαζκαηνκεηξία Μάδαο κε Μεηαζρεκαηηζκφ Fourier GC Gas Chromatography Αέξηα Υξσκαηνγξαθία GPC Gel Permeation Chromatography Υξσκαηνγξαθία Γηάρπζεο Πεθηήο HIC HILIC Hydrophobic Interaction Chromatography Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Υξσκαηνγξαθία Τδξφθνβεο Αιιειεπίδξαζεο Υξσκαηνγξαθία Τδξφθηιεο Αιιειεπίδξαζεο HPAEC- High Performance Anion-exchange Υξσκαηνγξαθία Ηνληναληαιιαγήο i

10 PAD HPLC Chromatography with Pulsed Amperometric Detection High Pressure Liquid Chromatography Τςειήο Απφδνζεο κε Παικηθφ Ακπεξνκεηξηθφ Αληρλεπηή Τγξή Υξσκαηνγξαθία Τςειήο Πίεζεο ICR Ion Cyclotron Resonance Ηνληηθνχ Κπθινηξνληθνχ πληνληζκνχ IEC Ion Exchange Chromatography Υξσκαηνγξαθία Ηνληναληαιιαγήο IEM Ion Evaporation Model Μνληέιν Ηνληηθήο Δμάηκηζεο IPA Isopropanol 2-Πξνπαλφιε IT Ion Trap Παγίδα Ηφλησλ K Partition Coefficient πληειεζηήο Καηαλνκήο LC Liquid Chromatography Τγξή Υξσκαηνγξαθία LOD Limit of Detection Όξην Αλίρλεπζεο LOQ Limit of Quantification Όξην Πνζνηηθνπνίεζεο MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MeOH Methanol Μεζαλφιε Ηνληζκφο Δθξφθεζεο Τπνβνεζνχκελνο κε Λέηδεξ MRM Multiple Reaction Monitoring Παξαθνινχζεζε Πνιιαπιψλ Αληηδξάζεσλ MS Mass Spectrometry Φαζκαηνκεηξία Μάδαο MS/MS Tandem Mass Spectrometry Γηαδνρηθή Φαζκαηνκεηξία Μαδψλ NICI Negative Ion Chemical Ionization Αξλεηηθφο Υεκηθφο Ηνληζκφο NL Neutral Loss Απψιεηα Οπδέηεξνπ Ηφληνο NMR Nuclear Magnetic Resonance Ππξεληθφο Μαγλεηηθφο πληνληζκφο NP Normal Phase Καλνληθήο Φάζεο PDA Photodiode Array Φσηνδηφδσλ PICI Positive Ion Chemical Ionization Θεηηθφο Υεκηθφο Ηνληζκφο PS Precursor Ion Πξφδξνκν Ηνλ Q Quadrupole Σεηξάπνιν QQQ Triple Quadrupole Σξηπιφ Σεηξάπνιν R 2 Linear Correlation Factor πληειεζηήο γξακκηθήο ζπζρέηεζεο RP Reversed Phase Αληίζηξνθεο Φάζεο RSD Relative Standard Deviation ρεηηθή Σππηθή Απφθιηζε ii

11 SD Standard Deviation Σππηθή Απφθιηζε SEC Size Exclusion Chromatography Υξσκαηνγξαθία Απνθιεηζκνχ Μεγέζνπο SIM Single Ion Monitoring Παξαθνινχζεζε Δπηιεγκέλνπ Ηφληνο SIMS Secondary Ion Mass Spectrometry Φαζκαηνζθνπία Μαδψλ Γεπηεξεπφλησλ Ηφλησλ SPE Solid Phase Extraction Δθρχιηζε ηεξεήο Φάζεο SRM Selected Reaction Monitoring Παξαθνινχζεζε Δπηιεγκέλεο Αληίδξαζεο THF Tetrahydrofuran Σεηξαυδξνθνπξάλην TOF Time of Flight Αλαιπηήο Υξφλνπ Πηήζεο UPLC Ultra Pressure Liquid Chromatography UV Ultraviolet Τπεξηψδεο Τγξή Υξσκαηνγξαθία Τπεξ Τςειήο Πίεζεο UV-Vis Ultraviolet - Visible Τπεξηψδνπο - Οξαηνχ iii

12 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίλαθαο 1.1: Πίλαθαο 1.2: Πίλαθαο 2.1: Πηλαθαο 5.1: Πίλαθαο 5.2: Πίλαθαο 5.3: Πίλαθαο 5.4: Πίλαθαο 7.1: Δλψζεηο νκάδαο Α. Πίλαθαο 7.2: Δλψζεηο νκάδαο Β. Πίλαθαο 7.3: Δλψζεηο νκάδαο Γ. Ηζηνξηθή αλαδξνκή θαζκαηνκεηξίαο κάδαο. Kχξηεο ηερληθέο ηνληηζκνχ θαη δπλαηνί ζπλδπαζκνί κεζφδσλ. Ηδηφηεηεο ησλ πην θνηλψλ δηαιπηψλ πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζηελ HPLC. Αλαιπηηθέο ηερληθέο γηα ηελ εχξεζε ηνπ πξνθίι ζαθράξσλ ζην κέιη. Αλαιπηηθέο ηερληθέο γηα ηελ εχξεζε ηνπ πξνθίι νξγαληθψλ νμέσλ ζην κέιη. Αλαιπηηθέο ηερληθέο γηα ηελ εχξεζε ηνπ πξνθίι ακηλνμέσλ ζην κέιη. Υαξαθηεξηζηηθά ηεο ζχζηαζεο ηνπ κειηνχ ζχκθσλα κε ηελ Δπξσπατθή Οδεγία. Πίλαθαο 7.4: Πίλαθαο 7.5: Πίλαθαο 7.6: Πίλαθαο 8.1: Πίλαθαο 8.2: Πίλαθαο 9.1: Πίλαθαο 9.2: Παξάκεηξνη ESI πνπ πξνηείλεη ν θαηαζθεπαζηήο, αλάινγα κε ηηο ρξσκαηνγξαθηθέο ζπλζήθεο. Γνθηκέο βαζκσηήο έθινπζεο. Υαξαθηεξηζηηθέο παξάκεηξνη θαζκαηνκέηξνπ κάδαο γηα θάζε πξνζδηνξηδφκελε έλσζε. πγθεληξψζεηο πξφηππσλ δηαιπκάησλ, ηα νπνία ρξεζηκνπνηήζεθαλ θαηά ηελ θαηαζθεπή ησλ θακππιψλ αλαθνξάο ηεο κεζφδνπ. Δμηζψζεηο θακππιψλ αλαθνξάο, ζπληειεζηέο γξακκηθήο ζπζρέηηζεο φξηα αλίρλεπζεο θαη πνζνηηθνπνίεζεο, αλαιπηηθά ζηνηρεία ησλ θακππιψλ αλαθνξάο. Γνθηκέο αξαίσζεο δεηγκάησλ κειηνχ. Δλψζεηο πνπ πξνζδηνξίζηεθαλ πνηνηηθά ζην κέιη. iv

13 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ρήκα 1.1: ρήκα 1.2: ρήκα 1.3: (α) ην πξψην θαζκαηφκεηξν καδψλ, (β) ην πξψην θάζκα καδψλ ηνπ Ru κέζσ πεξηνδηθήο δηαθνξνπνίεζεο ηεο ζπρλφηεηαο, (γ) δηπιή θνξπθή κάδαο Kr-C 2 H 2. Ηζηνξηθή αλαδξνκή θαζκαηνκεηξίαο κάδαο, ζρεκαηηθά. ρεκαηηθή δηάηαμε ελφο θαζκαηνκέηξνπ καδψλ. ρήκα 1.4: Πεξηγξαθή ησλ ζηαδίσλ ζρεκαηηζκνχ ησλ ηφλησλ αέξηαο θάζεο. ρήκα 1.5: ρήκα 1.6: ρήκα 1.7: ρήκα 1.8: ρήκα 1.9: ρήκα 1.10: ρήκα 1.11: ρήκα 1.12: ρήκα 1.13: ρήκα 1.14: Φαζκαηφκεηξν κάδαο κε καγλεηηθφ αλαιπηή απιήο εζηίαζεο. Φαζκαηφκεηξν κάδαο κε αλαιπηή καγλεηηθνχ-ειεθηξνζηαηηθνχ πεδίνπ δηπιήο εζηίαζεο. ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε αλαιπηή παγίδαο ηφλησλ. ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε αλαιπηή ρξφλνπ πηήζεο. Απεηθφληζε ηεο αξρήο ιεηηνπξγίαο ηνπ LTQ Orbitrap. ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ηεηξαπνιηθνχ αλαιπηή. Φαζκαηφκεηξν κάδαο κε αλαιπηή ηξηπιφ ηεηξάπνιν. Απεηθφληζε ησλ δηαθφξσλ ηχπσλ ζάξσζεο. Κχπειιν Faraday Ζιεθηξνληνπνιιαπιαζηαζηήο. ρήκα 2.1: ρήκα 2.2: ρήκα 2.3: ρήκα 2.4: Πνξεία κνξίσλ δχν δηαθνξεηηθψλ νπζηψλ δηακέζνπ κίαο ζηήιεο. Σν κπιε κφξην θαηαλέκεηαη πην ζεκαληηθά ζηελ θηλεηή θάζε θαη ζπλεπψο παξαζχξεηαη απφ απηήλ ηαρχηεξα, δηφηη δελ αιιειεπηδξά ηζρπξά κε ηε ζηαηηθή θάζε. Αληίζεηα ην θίηξηλν κφξην αιιειεπηδξά ηζρπξφηεξα κε ηε ζηαηηθή θάζε, κε απνηέιεζκα λα επηβξαδχλεηαη. Καηά ζπλέπεηα ην θίηξηλν ζπζηαηηθφ ζα θηλείηαη βξαδχηεξα απφ ην κπιε, κε απνηέιεζκα ηνλ δηαρσξηζκφ ηνπο. Φάζκα ρξσκαηνγξαθηθήο πνιηθφηεηαο κνξίσλ ζε ζρέζε κε ηε ιεηηνπξγηθή νκάδα πνπ δηαζέηεη ην θαζέλα. Μεραληζκφο Ηνλαληαιιαγήο. Α) Ζ αληαιιαγή θαηηφλησλ ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα δηαηεξήζεη θαη λα δηαρσξίζεη ζεηηθά θνξηηζκέλα ηφληα ζε κηα αξλεηηθή επηθάλεηα. Β)Ζ αληαιιαγή αληφλησλ ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα ζπγθξαηήζεη θαη λα δηαρσξίζεη αξλεηηθά θνξηηζκέλα ηφληα ζε κηα ζεηηθή επηθάλεηα. ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε κηαο κνλάδαο UPLC. (1) Γνρεία δηαιχηε, (2) Απαεξσηήο δηαιπηψλ, (3) Βαιβίδα επηινγήο δηαιχηε, (4) Γνρείν κίμεο γηα ηελ πξνψζεζε ηεο θηλεηήο θάζεο, (5) Αληιία v

14 ρήκα 2.5: ρήκα 3.1: ρήκα 3.2: ρήκα 3.3: ρήκα 3.4: ρήκα 5.1: ρήκα 6.1: ρεκα 6.2: ρήκα 6.3: ρήκα 6.4: ρεκα 6.5: ρήκα 6.6: ρήκα 6.7: ρήκα 6.8: ρήκα 6.9: ρήκα 7.1: ρήκα 7.2: ρήκα 7.3: ρήκα 7.4: ρήκα 7.5: ρήκα 7.6: ππέξ-πςειήο πίεζεο, (6) Βαιβίδα εηζαγσγήο δείγκαηνο ζηε ζέζε "inject ", (6') Βαιβίδα εηζαγσγήο δείγκαηνο ζηε ζέζε "load", (7) Κπςειίδα (loop) εηζαγσγήο δείγκαηνο, (8) Πξνζηήιε, (9) Αλαιπηηθή ζηήιε, (10) Αληρλεπηήο, (11) χζηεκα ζπιινγήο θαη επεμεξγαζίαο δεδνκέλσλ, (12) Γνρείν απνβιήησλ. ρεκαηηθή παξάζηαζε βαιβίδαο εηζαγσγήο rheodyne. Θέζε Α:Πιήξσζε ηεο θπςειίδαο. Θέζε Β:Δηζαγσγή ηνπ δείγκαηνο ζηε ζηήιε. Ζ HILIC ζπλδπάδεη ηα ραξαθηεξηζηηθά ησλ ηξηψλ θχξησλ ηερληθψλ LC. Αξηζκφο δεκνζηεχζεσλ ζρεηηθά κε HILIC απφ ην πξψην έηνο ηεο ιεηηνπξγίαο δηαρσξηζκνχ, ην 1990, έσο ην 2014 (κέρξη ην 2008, ηα δεδνκέλα πνπ ιακβάλνληαη απφ ην γξάθεκα Lämmerhofer, θαη αξγφηεξα, ρξεζηκνπνηήζεθαλ ηα απνηειέζκαηα αλαδήηεζεο απφ SciFinder). Απεηθφληζε ηνπ πξνηεηλφκελνπ κεραληζκνχ θαηαθξάηεζεο ζηε HILIC. ηαηηθή θάζε κε ακίδην. Πνζνζηηαία ζπκκεηνρή ησλ θπξηφηεξσλ ζπζηαηηθψλ ηνπ κειηνχ. Απηφκαηνο δεηγκαηνιήπηεο κε ζεξκνζηαηνχκελν ρψξν. Αληιία πγξνχ ρξσκαηνγξάθνπ. Αληιία γηα απηφκαηε έγρπζε δείγκαηνο Βαιβίδα γηα απεπζείαο θφξησζε/ έγρπζε δείγκαηνο. Φαζκαηφκεηξν καδψλ. χζηεκα LC-MS TSQ Quantum Access MAX (Thermo Scientific). Πξνβνιή ηνκήο ηνπ αληρλεπηή MS. ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ησλ πεξηνρψλ θελνχ. Δζσηεξηθφ ηνπ ζαιάκνπ θελνχ. ESI / MS πδξαπιηθέο ζπλδέζεηο γηα ηελ εηζαγσγή ηνπ δείγκαηνο απφ ηελ αληιία ζχξηγγαο γηα άκεζε έγρπζε. Παξάζπξν δηαιφγνπ εηπινγήο πιήξνπο ζάξσζεο. Παξάζπξν δηαιφγνπ ιεηηνπξγίαο MS only. Βειηηζηνπίεζε δπλακηθνχ θψλνπ (tube lens voltage) γηα ηελ αδελίλε. Παξάζπξν δηαιφγνπ απηφκαηεο επηινγήο ζπγαηξηθψλ ηφλησλ. Κακπχιεο ζρεηηθήο έληαζεο ελέξγεηαο ζξαχζεο ησλ ζπγαηξηθψλ ηφλησλ ηεο αδελίλεο. Μάδεο ζπγαηξηθψλ κε ηηο αληίζηνηρεο ηηκέο C.E. vi

15 ρήκα 7.7: Κνξπθέο βελδντθνχ θαη γαιαθηνπξνληθνχ νμένο Α) κε ph 5.5 ζηελ θηλεηή θάζε Α. Β) κε ph 5.1 ζηελ θηλεηή θάζε Β αληίζηνηρα. ρήκα 7.8: ρήκα 8.1: ρήκα 8.2: ρήκα 8.3: ρήκα 8.4: ρήκα 8.5: ρήκα 9.1: ρήκα 9.2: ρήκα 9.3: ρήκα 9.4: ρήκα 9.5: Πξφγξακκα βαζκσηήο έθινπζεο πνπ επηιέρηεθε. Δλδεηθηηθή θακπχιε αλαθνξάο θξεαηηλίλεο. Πνζνζηηαία θαηαλνκή ησλ ελψζεσλ ζχκθσλα κε ηηο ηηκέο ησλ LOQ. Intra day επαλαιεςηκφηεηα ηεο κεζφδνπ. Πνζνζηφ ελψζεσλ κε αθξίβεηα κεηαμχ 80%-120% ζηα 8 επίπεδα ζπγθεληξψζεσλ. Inter day, αλαπαξαγσγηκφηεηα ηεο κεζφδνπ. Πνζνζηηαία θαηαλνµή ρξφλνπ ζηελ αλαιπηηθή δηαδηθαζία. (1.Πξνθαηεξγαζία δείγµαηνο, 2.Αλάιπζε, 3.πιινγή δείγµαηνο, 4.Δπεμεξγαζία δεδνµέλσλ). ηάδηα πξνθαηεξγαζίαο δεηγκάησλ κειηνχ γηα αλάιπζε. Υξσκαηνγξάθεκα δείγκαηνο κειηνχ. Αξηζηεξά θνξπθέο ζαξθνζίλεο,αιαλίλεο, θπηνζίλεο, ηζηακίλεο θαη ρνιίλεο. Γεμηά θνξπθέο πξνιίλεο, ππνμαλζίλεο, ηζνιεπθίλεο, ιεπθίλεο θαη βηηακίλεο Β12. Υξσκαηνγξάθεκα δείγκαηνο κειηνχ. Αξηζηεξά θνξπθέο κειηθνχ νμένο, ξηβφδεο, ηπξνζίλεο, καλληηφιεο θαη ππξηδνμίλεο. Γεμηά θνξπθέο θπηηδίλεο, ζεηακίλεο, ηλνζίλεο, ηξεαιφδεο, ξαθηλφδεο. Υξσκαηνγξάθεκα δείγκαηνο κειηνχ. Αξηζηεξά θνξπθέο θηληθνχ νμένο, παληνζεληθνχ νμένο, θειινβηφδεο, γ-ακηλνβνπηπξηθνχ νμένο, θαηλπιαιαλίλεο θαη ηζηηδίλεο. Γεμηά θνξπθέο γινπηακίλεο, ηξππηνθάλεο, βεηαΐλεο, νπξηδίλεο, αδελνζίλεο. vii

16 ΘΕΩΡΗΣΙΚΟ ΜΕΡΟ ΚΔΦΑΛΑΗΟ 1 Ο : ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΑ 1.1. ΗΣΟΡΗΚΖ ΑΝΑΓΡΟΜΖ Ζ εειεθζχδδξ απανπή ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ (mass spectrometry, MS) ηέεδηε ιε ηδκ ενβαζία ημο J. J. Thomson, ημ 1897 [1]. «At first there were very few who believed in the existence of these bodies smaller than atoms. I was even told long afterwards by a distinguished physicist who had been present at my [1897] lecture at the Royal Institution that he thought I had been 'pulling their legs» (J.J. Thomson, 1936) [1]. Καηά ηδ δζάνηεζα ημο πνχημο ιζζμφ αζχκα, μζ εθανιμβέξ ηδξ ηεπκζηήξ MS πενζμνίγμκηακ ηονίςξ ζημκ αηνζαή πνμζδζμνζζιυ ηςκ ιαγχκ ζηαεενχκ κμοηθζδίςκ ηαζ ηδξ θοζζηήξ αθεμκίαξ ζζμηυπςκ. Καηά ηδ δζάνηεζα, ηαζ αιέζςξ ιεηά ημ δεφηενμ παβηυζιζμ πυθειμ, άνπζζακ κα ειθακίγμκηαζ ακαθοηζηέξ εθανιμβέξ ηαζ εειεθζχδεζξ θοζζηέξ ιεηνήζεζξ πάκς ζε ιυνζα. Καηά ηδ δζάνηεζα ημο ηεθεοηαίμο ιζζμφ αζχκα, οπήνλε ιζα ζοκεπήξ ιεηαηυπζζδ ημο εκδζαθένμκημξ πνμξ εθανιμβέξ ζπεηζηέξ ιε ιυνζα υθμ ηαζ ιεβαθφηενδξ πμθζηυηδηαξ, ηαζ ιέζα ζηδκ ηεθεοηαία εζημζαεηία, μζ αζμθμβζηέξ εθανιμβέξ έπμοκ βίκεζ ημ ηφνζμ ηαζ ηαπέςξ ελεθζζζυιεκμ πεδίμ ένεοκαξ. Σα εειέθζα ηδξ MS ανίζημκηαζ ζηδκ ενβαζία ημο J.J. Thomson ηαζ ημο F.W. Aston ζηα ενβαζηήνζα Cavendish, ζημ πακεπζζηήιζμ ημο Cambridge. Απυ ημ 1897, δ ενβαζία πμο έβζκε ανπζηά απυ ημκ J.J. Thomson ηαζ ημοξ ζοκενβάηεξ ημο απέζπαζε 7 ανααεία Nobel ζηδ θοζζηή ηαζ ηδ πδιεία. Ζ ανπζηή ενβαζία ημο J.J. Thomson ζπεηζηά ιε ηδκ φπανλδ ηαζ ηζξ ζδζυηδηεξ αβςβχκ αηηίκςκ-εεηζηχκ ζυκηςκ (canal rayspositive ions) θήθεδηε απυ ημκ F.W. Aston, μ μπμίμξ ζημ ηέθμξ ημο πνχημο παβημζιίμο πμθέιμο απέδεζλε ηδκ φπανλδ ανηεηχκ ζζμηυπςκ ιδ ναδζεκενβχκ ζημζπείςκ. Ο F.W. Aston πνδζζιμπμίδζε δθεηηνμζηαηζηά ηαζ ιαβκδηζηά πεδία βζα κα δζαπςνίζεζ ζζμημπζηά ζυκηα ζφιθςκα ιε ηζξ ιάγεξ ημοξ ηαζ κα ηα ζοβηεκηνχζεζ πάκς ζε ιζα θςημβναθζηή πθάηα. Tα επυιεκα πνυκζα, πμθθμί επζζηήιμκεξ αζπμθήεδηακ ιε ηδκ πνυδνμιδ ακάπηολδ ηδξ MS, ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ μ Dempster, μ Herzog, μ Bainbridge ηαζ μ Nier (ζπήια 1.1). ημ ηέθμξ ημο 1930 δ MS είπε βίκεζ ιζα εδναζςιέκδ ηεπκζηή βζα ημ δζαπςνζζιυ ηςκ αημιζηχκ ζυκηςκ ζφιθςκα ιε ηδ ιάγα ημοξ [2]. 1

17 Σρήκα 1.1 :(α) ην πξώην θαζκαηόκεηξν καδώλ, (β) ην πξώην θάζκα καδώλ ηνπ Ru κέζσ πεξηνδηθήο δηαθνξνπνίεζεο ηεο ζπρλόηεηαο, (γ) δηπιή θνξπθή κάδαο Kr-C 2 H 2. Σμ 1940 μζ εθανιμβέξ ηδξ MS άνπζζακ κα δζαπέμκηαζ απυ ημοξ αηαδδιασημφξ πχνμοξ ζε πζμ πναηηζηά πεδία. Σμ πνχημ ειπμνζηά δζαεέζζιμ υνβακμ MS ζημκ ηυζιμ πμο ηαηαζηεοάζηδηε ημ 1948 (ημ MS-2), έηακε πνήζδ ζμκζζιμφ ιε πνυζηνμοζδ δθεηηνμκίςκ (EI), είπε ιζα πμθφ πενζμνζζιέκδ πενζμπή ιαγχκ, ηδξ ηάλδξ ηςκ 300 Da ηαζ πμθφ πενζμνζζιέκδ δζαηνζηζηή ζηακυηδηα. ηζξ ανπέξ ημο 1950, δ εναοζιαημπμίδζδ ιζηνχκ μνβακζηχκ ιμνίςκ άνπζζε κα βίκεηαζ ηαηακμδηή, αθθά ηα θαζιαηυιεηνα ιαγχκ ήηακ αηυια πμθφ πενζμνζζιέκα υζμκ αθμνά ζηδκ ηθίιαηα ιαγχκ ηαζ ζηδ δζαηνζηζηή ζηακυηδηα. Αοηυ ημκ ηαζνυ λεηίκδζε δ δέα βζα ημοξ ακαθοηέξ πνυκμο πηήζδξ (Wiley ηαζ Mclaren) ηαζ ηςκ ηεηναπμθζηχκ ακζπκεοηχκ (Paul). Σα πνχζια αοηά υνβακα ήηακ μζ πνυδνμιμζ ηςκ ζδιενζκχκ <<μζημκμιζηχκ>> μνβάκςκ πάβημο πμο ανίζημκηαζ ζπεδυκ ζε ηάεε πδιζηυ, αζμπδιζηυ ενβαζηήνζμ ζημκ ηυζιμ. Ζ επυιεκδ ιεβάθδ ελέθζλδ ήηακ δ δζαζφκδεζδ ηδξ αένζαξ πνςιαημβναθίαξ (Gas Chromatography, GC) ιε MS. Αοηυ επέηνερε βζα πνχηδ θμνά ηδκ ακάθοζδ ιζβιάηςκ μοζζχκ πςνίξ πνμδβμφιεκμ επίπμκμ πεζνμκαηηζηυ δζαπςνζζιυ. Ζ ακάπηολδ GC-MS ήηακ ημ έκαοζια βζα ηδκ ακάπηολδ ηδξ ιμκηένκαξ MS [2]. Μζα ζοκμπηζηή ζζημνζηή ελέθζλδ ηδξ MS πανμοζζάγεηαζ ζημκ πίκαηα 1.1 ηαζ ζημ ζπήια 1.2. Οζ ηαζκμηυιεξ ηεπκζηέξ ζμκζζιμφ πμο ακαπηφπεδηακ ηδκ ηεθεοηαία 25εηία (εηνυθδζδ ηαπέςκ ζςιαηζδίςκ, ζμκζζιυξ ιε εηνυθδζδ απυ ημ οπυζηνςια οπμαμδεμφιεκμξ απυ 2

18 laser, ζμκζζιυξ απυ δθεηηνζηυ πεδίμ ιε ρεηαζιυ) άκμζλακ ημ δνυιμ ηδξ αζμθμβζηήξ πδιείαξ ζηδ θαζιαημιεηνία ιάγαξ. Μπμνεί κα εζπςεεί πςξ ζπεδυκ ηάεε ηαηδβμνία εκχζεςκ (εφνμξ ιάγαξ MDa) δφκαηαζ πθέμκ κα ακαθοεεί εκδεθεπχξ ιε ηδ πνήζδ ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ [3]. Πίκαηαξ 1.1: Ηζημνζηή ακαδνμιή θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ Έημξ Δνεοκδηέξ Δφνδια 1886 Goldstein Ακμδζηέξ αηηίκεξ ζε αένζα απμθυνηζζδ Thomson Βνααείμ Nobel 1906 Wien Βνααείμ Nobel 1911 Ακαηάθορδ δθεηηνμκίμο. Πνμζδζμνίγεηαζ μ θυβμξ m/z. Ακάθοζδ ακμδζηχκ αηηζκχκ ιε ιαβκδηζηή πανεηηνμπή. Καεμνζζιυξ εεηζημφ θμνηίμο Kaufmann Ακάθοζδ ακμδζηχκ αηηζκχκ ιε πνήζδ πανάθθδθςκ δθεηηνζηχκ ηαζ ιαβκδηζηχκ πεδίςκ 1909 Millikan, Fletcher Πνμζδζμνζζιυξ ζημζπεζχδμοξ δθεηηνζημφ θμνηίμο 1912 Thomson 1918 Dempster Καηαζηεοή πνχημο θαζιαηυιεηνμο ιαγχκ (Πανααμθζηυξ Φαζιαημβνάθμξ). Λήρδ θαζιάηςκ, παναηήνδζδ ανκδηζηχκ ηαζ πμθθαπθά θμνηζζιέκςκ ζυκηςκ, ιεηαζηαεή ζυκηα. Ακαηάθορδ ζζμηυπςκ 20 ηαζ 22 ημο Ne (1913). Ακάπηολδ πδβήξ EI ηαζ 1 μο θαζιαηυιεηνμο ιάγαξ ιαβκδηζημφ ημιέα ηαζ εζηίαζδ ηαηεφεοκζδξ Aston Βνααείμ Nobel 1922 Ακάπηολδ 1 μο θαζιαηυιεηνμο ιάγαξ ιε εζηίαζδ ηαπφηδηαξ. Απχθεζεξ ιάγαξ (1923) Bainbridge Απυδεζλδ οπυεεζδξ ημο Einstein πενί ζζμδοκαιίαξ ιάγαξ εκένβεζαξ Conrad Smythe, Rumbaugh, West Δθανιμβή θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ ζηδκ μνβακζηή πδιεία. 1 μξ παναζηεοαζηζηυξ ζζμημπζηυξ δζαπςνζζιυξ Nier Απμιυκςζδ μονακίμο Hipple, Condon Ακαβκχνζζδ ιεηαζηαεχκ ημνοθχκ Cameron, Eggers 1949 Sommer, Thomas, Hippie πεδζαζιυξ βναιιζημφ θαζιαηυιεηνμο ιάγαξ πνυκμο πηήζδξ (TOF). Γδιμζίεοζδ θαζιάηςκ ιάγαξ (δ ζδέα ήηακ ημο Stephens, ημ 1946). 1 δ εθανιμβή ζμκηζημφ ηοηθμηνμκζημφ ζοκημκζζιμφ (ICR) ζημ θαζιαηυιεηνμ ιάγαξ. 3

19 Πίκαηαξ 1.1: Ηζημνζηή ακαδνμιή θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ - (ζοκέπεζα) Έημξ Δνεοκδηέξ Δφνδια 1952 Marcus Βνααείμ Nobel 1992 Johnson, Nier Ζ ιμκμιμνζαηή εναοζιάηςζδ ζυκηςκ ελδβείηαζ απυ ηζξ εεςνίεξ ηδξ εκδζάιεζδξ ζζμννμπίαξ. Ακάπηολδ μνβάκςκ δζπθήξ εζηίαζδξ Paul, Steinwedel Παηέκηα ηεναπμθζημφ ακαθοηή ηαζ παβίδαξ ζυκηςκ Wiley, McLaren Ακααάειζζδ βναιιζημφ ακαθοηή πνυκμο πηήζδξ 1956 McLafferty, Gohlke φκδεζδ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ ιε αένζα πνςιαημβναθία Διπμνζηή δζάεεζδ ημο 1 μο θαζιαηυιεηνμο ιάγαξ δζπθήξ εζηίαζδξ Paul, Reinhaed, VonZahn Πενζβναθή ηεηναπμθζημφ θαζιαηυιεηνμο ιάγαξ Απμκμιή Βνααείμο Nobel 1989 ζημκ Paul Διπμνζηή δζάεεζδ ημο 1 μο θαζιαημιέηνμο ιάγαξ πνυκμο πηήζδξ 1966 Munson, Field Μέεμδμξ πδιζημφ ζμκζζιμφ 1967 McLafferty, Jennings Θναοζιάηςζδ επαβυιεκδ απυ ζφβηνμοζδ Διπμνζηή δζάεεζδ ημο 1 μο θαζιαημιέηνμο ιάγαξ ιε ηεηναπμθζηυ ακαθοηή Beckey Φαζιαημιεηνία ιάγαξ μνβακζηχκ ιμνίςκ ιε εηνυθδζδ πεδίμο Horning, Carroll, Dzidic, Haegele, Stillwell Arpino, Baldwin, McLafferty Comidarow, Marshall Διπμνζηή δζάεεζδ 1 μο McFarlane, Torgerson Υδιζηυξ ζμκζζιυξ οπυ αηιμζθαζνζηή πίεζδ. φκδεζδ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ ιε οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ απυδμζδξ. Ακάπηολδ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ FTICR. θαζιαημιέηνμο ζε ζφγεολδ ιε αένζα πνςιαημβναθία, ιε ηνζπμεζδείξ ζηήθεξ. Πδβή εηνυθδζδξ οπμαμδεμφιεκδ απυ πθάζια Yost, Enke 1 μ θαζιαηυιεηνμ ιάγαξ ιε ηνζπθυ ηεηνάπμθμ Houk, Fassel, Flesch, Gray, Taylor Barber, Bordoli, Sedgwick, Tyler Απυδεζλδ ημο δοκαιζημφ ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ ιε ICP. Πενζβναθή πδβήξ ζμκζζιμφ ιέζς αμιαανδζζιμφ ιε ηαπέςξ ηζκμφιεκα άημια (FAB). 4

20 Πίκαηαξ 1.1: Ηζημνζηή ακαδνμιή θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ - (ζοκέπεζα) Έημξ Δνεοκδηέξ Δφνδια 1982 Διπμνζηή δζάεεζδ ημο 1 μο θαζιαημιέηνμο ιάγαξ ιε ηνζπθυ ηεηνάπμθμ απυ ηζξ εηαζνείεξ Finnigan ηαζ Sciex. Blakney, Vestal Πενζβναθή ηδξ ηεπκζηήξ ημο εενιμρεηαζιμφ (TSP) Stafford, Kelly, Syka, Πενζβναθή ημο GC - ion trap (Finnigan). Reynolds, Todd 1987 Smith φκδεζδ ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ ηαζ ηνζπμεζδμφξ δθεηηνμθυνδζδξ Fenn Βνααείμ Nobel 2002 Katta, Chait, Gamen, Li, Henion Spengler, Kirsch, Kaufmann Ακάπηολδ ζμκζζιμφ απυ δθεηηνζηυ πεδίμ ιε ρεηαζιυ. Λήρδ πνχηςκ θαζιάηςκ πνςηεσκχκ ιε ΜΒ > 20 KDa. Απμδεζηκφεηαζ πςξ μζ εζδζηέξ ιδ μιμζμπμθζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ δφκαηαζ κα ακζπκεοημφκ ιε πνήζδ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ. Λήρδ δμιζηχκ πθδνμθμνζχκ ιέζς TOF - MS ιε ακαηθαζηήνα ηαζ ζμκζζιυ MALDI (post source decay) Wilm, Mann Πενζβνάθεηαζ δ πδβή κακμ - ζμκζζιμφ απυ δθεηηνζηυ πεδίμ ιε ρεηαζιυ. Σρήκα 1.2. Ιζηνξηθή αλαδξνκή θαζκαηνκεηξίαο κάδαο, ζρεκαηηθά [3]. 5

21 1.2. ΓΔΝΗΚΔ ΑΡΥΔ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΑ Ζ θαζιαημιεηνία ιάγαξ είκαζ ιία μιάδα ηεπκζηχκ βζα ημκ πμζμηζηυ (ηαοημπμίδζδ ηαζ πνμζδζμνζζιυξ δμιήξ) ηαζ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ πδιζηχκ εκχζεςκ ζε δζάθμνα οπμζηνχιαηα. Βαζίγεηαζ ζημκ ζμκζζιυ ηςκ ιμνίςκ ηαζ ηδκ παναβςβή ιμνζαηχκ ηαζ/ή εοβαηνζηχκ ζυκηςκ, ημκ δζαπςνζζιυ ηςκ ιαγχκ ηςκ ζυκηςκ (ζοκήεςξ ηαηζυκηςκ) ζφιθςκα ιε ημκ θυβμ ιάγαξ (m) πνμξ ημ θμνηίμ ημοξ (z) (mass to charge ratio, m/z) ιε ηδκ αμήεεζα ηαηάθθδθδξ δζάηαλδξ ηαζ ηέθμξ ηδκ ηαηαβναθή ηδξ ζπεηζηήξ έκηαζδξ ημο ζμκηζημφ νεφιαημξ ηαζ ηδκ εφνεζδ ηδξ ακηζζημζπίαξ ηςκ ιαγχκ ηςκ θαιαακμιέκςκ ζυκηςκ ιε ηδ δμιή ηδξ πνυδνμιδξ έκςζδξ [4,5]. Ζ ακίπκεοζδ ηςκ ζυκηςκ πμο είκαζ πνμξ εκδζαθένμκ, θαιαάκεζ πχνα αάζεζ ηδξ αθεμκίαξ ημοξ. Σμ ζοκμθζηυ θμνηίμ ηςκ ζυκηςκ, q, δίκεηαζ απυ ηδκ ελίζςζδ q = z * e, (Δλίζςζδ 1.1) υπμο e, είκαζ ημ ζημζπεζχδεξ θμνηίμ ημο δθεηηνμκίμο (1,6 π 10" 19 Coulomb) ηαζ z, μ ανζειυξ ηςκ θμνηίςκ ημο ζυκημξ. Όηακ δ ιάγα (m) δίκεηαζ ζε dalton (Da) ηαζ ημ θμνηίμ ζε ανζειυ δθεηηνμκζαηχκ θμνηίςκ, μ θυβμξ m/z δίκεηαζ ζε thomson (Th). Δκίμηε, δ ιάγα (m) δίκεηαζ ςξ ανζειυξ ιάγαξ ηαζ ημ z ςξ ανζειυξ θμνηίμο, μπυηε ηαζ ηα δφμ ιεβέεδ ζηενμφκηαζ δζαζηάζεςκ. Σμ δζάβναιια ηδξ έκηαζδξ ημο ζήιαημξ ηάεε ζυκημξ εκυξ ακαθφηδ έκακηζ ημο θυβμο m/z μνίγεηαζ ςξ ημ θάζια ιάγαξ ημο οπυ ιεθέηδ ακαθφηδ. ημ πεδίμ ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ ςξ ιμνζαηυ ζυκ (molecular ion) μνίγεηαζ ημ ζυκ πμο ζπδιαηίγεηαζ ηαηυπζκ ηδξ απμιάηνοκζδξ απυ (εεηζηά ζυκηα) - ή πνμζεήηδξ ζε (ανκδηζηά ζυκηα) - έκα ιυνζμ ακαθφηδ εκυξ ή πενζζζυηενςκ δθεηηνμκίςκ, δίπςξ εναοζιαημπμίδζδ ηδξ ιμνζαηήξ δμιήξ. Ζ ιάγα ημο ιμνζαημφ ζυκημξ ακηζζημζπεί ζημ άενμζζια ηςκ ιαγχκ ηςκ πζμ άθεμκςκ θοζζηά οπανηηχκ ζζμηυπςκ ηςκ πμζηίθςκ αηυιςκ πμο ζοκζζημφκ ηα ιυνζα ημο ακαθφηδ (ιε ιζα δζυνεςζδ βζα ηζξ ιάγεξ ηςκ δθεηηνμκίςκ πμο πνμζηέεδηακ ή αθαζνέεδηακ). Καηά ηδκ εθανιμβή ήπζςκ ιεευδςκ ζμκζζιμφ (FAB, πδιζηυξ ζμκζζιυξ, ζμκζζιυξ απυ δθεηηνζηυ πεδίμ ιε ρεηαζιυ), ημ ιμνζαηυ ζυκ δφκαηαζ κα απμθέζεζ έκα πνςηυκζμ (ανκδηζηυξ ζμκζζιυξ, -ISP) ή κα πνμζθάαεζ έκα ή πενζζζυηενα πνςηυκζα ή έηενα ηαηζυκηα (εεηζηυξ ζμκζζιυξ, +ISP), μπυηε ηαζ μνίγεηαζ ημ ρεοδμ ιμνζαηυ ζυκ. ε έκα θάζια ιάγαξ, δ ορδθυηενδ απεζημκζγυιεκδ ημνοθή μκμιάγεηαζ ααζζηή ημνοθή (base peak) ηαζ δ έκηαζδ ηςκ θμζπχκ ημνοθχκ ημο θάζιαημξ ιάγαξ εηθνάγεηαζ ςξ ημ % πμζμζηυ ηδξ έκηαζδξ ηδξ ααζζηήξ ημνοθήξ. Οζ ημνοθέξ ηάεε θάζιαημξ ιάγαξ, επζπνυζεεηα, θένμοκ ηζξ ζζμημπζηέξ ημοξ ημνοθέξ (isotopic peaks), μζ μπμίεξ μθείθμοκ ηδκ φπανλή ημοξ ζηα ζζυημπα (άημια ιε ημκ ίδζμ αημιζηυ ανζειυ, αθθά δζαθμνεηζηυ ιαγζηυ ανζειυ) ηαζ ηςκ μπμίςκ δ ακαθμβία δφκαηαζ κα πνμζδζμνζζηεί ιε αηνίαεζα. Οζ εονείεξ ημνοθέξ πμο δφκαηαζ κα ειπενζέπμκηαζ ζε έκα θάζια ιάγαξ αθμνμφκ ζε ιεηαζηαεή ζυκηα (metastable ions) ηαζ δ ιεθέηδ ημοξ πανέπεζ ζδιακηζηή δμιζηή πθδνμθμνία ακαθμνζηά ιε ημκ οπυ ιεθέηδ ακαθφηδ. Σα ιεηαζηαεή ζυκηα είκαζ ζυκηα (i) ιε ιζηνή 6

22 πενίζζεζα εζςηενζηήξ εκένβεζαξ, (ii) πνυκμ γςήξ πμο ηοιαίκεηαζ ιεηαλφ 10-6 s ηαζ 10-7 s ηαζ (iii) ανβή εναοζιαημπμίδζδ. Έηενεξ ημνοθέξ ζε έκα θάζια ιάγαξ ηαζ ηαηυπζκ εθανιμβήξ εκένβεζαξ εναοζιαημπμίδζδξ αθμνμφκ ζε πανάβςβα ζυκηα. Σα ηεθεοηαία πνμένπμκηαζ απυ ηδ ζφβηνμοζδ ιεηαλφ ηςκ δναζηζηχκ δθεηηνμκίςκ ηαζ ηςκ ιμνίςκ ημο ακαθφηδ ηαζ εκ ηέθεζ, ηδ εναοζιαημπμίδζδ ηςκ ιμνζαηχκ ζυκηςκ πνμξ ζυκηα ιζηνυηενδξ ιάγαξ [3] ΠΔΗΡΑΜΑΣΗΚΖ ΓΗΑΣΑΞΖ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΟΤ ΜΑΕΑ Έκα ηοπζηυ θαζιαηυιεηνμ ιαγχκ απμηεθείηαζ απυ ηα ελήξ επζιένμοξ ηιήιαηα (ζπήια 1.3): 1. Σν ζύζηεκα ηεο εηζαγσγήο ηνπ δείγκαηνο. Ο ζημπυξ αοημφ ημο ηιήιαημξ είκαζ δ εζζαβςβή ιζηνχκ πμζμηήηςκ δείβιαημξ ζημ υνβακμ. Σμ δείβια εζζάβεηαζ ζηδκ αένζα ή ζηδκ οβνή ημο ιμνθή. 2. Σελ πεγή ηόλησλ. Δδχ ηα εζζενπυιεκα ζοζηαηζηά ιεηαηνέπμκηαζ ζε ζυκηα, είηε ιε αμιαανδζζιυ ιε δθεηηνυκζα, ζυκηα, ιυνζα ή θςηυκζα, είηε ιε εθανιμβή δθεηηνζημφ πεδίμο ή ορδθήξ εενιμηναζίαξ. οπκά ημ ζφζηδια εζζαβςβήξ ζοκεκχκεηαζ ιε ηδκ πδβή ζυκηςκ. Σμ πνμσυκ ημο εκζαίμο αοημφ ηιήιαημξ είκαζ έκα νεφια ζυκηςκ (ζοκήεςξ εεηζηά θμνηζζιέκςκ) ηα μπμία ζηδ ζοκέπεζα επζηαπφκμκηαζ ηαζ εζζένπμκηαζ ζημκ ακαθοηή ιαγχκ. 3. Σνλ αλαιπηή καδώλ. Δδχ βίκεηαζ δζαπςνζζιυξ ηςκ ζυκηςκ ακάθμβα ιε ημ θυβμ m/z πμο θένμοκ. Δίκαζ δ πναβιαηζηή "ηανδζά" ημο ζοζηήιαημξ. Τπάνπμοκ δζάθμνεξ ηαηδβμνίεξ ακαθοηχκ ιαγχκ, ηςκ μπμίςκ δ θεζημονβία ααζίγεηαζ ζε δζαθμνεηζηέξ ανπέξ. 4. Σνλ αληρλεπηή. ημπυξ ηδξ δζάηαλδξ αοηήξ είκαζ κα ζοθθάαεζ ηα δζαπςνζγυιεκα ζυκηα ηαζ κα ηα ιεηαηνέρεζ ζε δθεηηνζηυ ζήια. ηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ επελενβαζία ημο ζήιαημξ ιε εζδζηυ θμβζζιζηυ ζε δθεηηνμκζηυ οπμθμβζζηή. 5. Σν ζύζηεκα θελνύ. Οθυηθδνμ ημ θαζιαηυιεηνμ (πένακ ημο ζοζηήιαημξ επελενβαζίαξ δεδμιέκςκ) ανίζηεηαζ οπυ ηεκυ πμο δδιζμονβείηαζ απυ εζςηενζηέξ ηαζ ελςηενζηέξ ακηθίεξ ηεκμφ [6]. 7

23 Σρήκα 1.3: Σρεκαηηθή δηάηαμε ελόο θαζκαηνκέηξνπ καδώλ [5] ΤΣΖΜΑ ΔΗΑΓΩΓΖ ΓΔΗΓΜΑΣΟ Ο ζημπυξ ημο ζοζηήιαημξ εζζαβςβήξ δείβιαημξ είκαζ δ πνμεημζιαζία ημο δείβιαημξ βζα ηδκ εζζαβςβή ημο ζημ πχνμ ζμκζζιμφ (πδβή ζυκηςκ), ηάης απυ ζοκεήηεξ ζηαεενήξ νμήξ ηαζ ζε αένζα πάκημηε ηαηάζηαζδ. Ζ ελαένςζδ δεζβιάηςκ πμο πενζέπμοκ εκχζεζξ ιε πενζμνζζιέκδ πηδηζηυηδηα ή ζηενεχκ δεζβιάηςκ, δζεοημθφκεηαζ ιε εένιακζδ ζε ζοκεήηεξ ορδθμφ ηεκμφ. ημ δμπείμ δείβιαημξ δ πίεζδ πμο επζηναηεί είκαζ ηδξ ηάλδξ ηςκ 10-2 Torr [7]. Σα ζοζηήιαηα πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ εζζαβςβή ημο δείβιαημξ ζηδκ πδβή ζμκζζιμφ ζε έκα θαζιαημβνάθμ ιάγαξ, ελανηχκηαζ απυ ηδ θοζζηή ημο ηαηάζηαζδ, ηζξ πδιζηέξ ημο ζδζυηδηεξ ηαζ ημκ ηνυπμ ζμκζζιμφ ημο ύζηεκα Μεκνλσκέλεο Δηζαγσγήο Γείγκαηνο (Batch Inlet) Υνδζζιμπμζείηαζ βζα ηζξ ακαθφζεζξ αενίςκ ηαζ πηδηζηχκ οβνχκ, υπμο ημ δείβια εζζάβεηαζ ζε ιζα δελαιεκή ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (ζφζηδια ροπνήξ εζζυδμο). Ζ είζμδμξ απυ πμνχδεξ βοαθί ηναηάεζ ζηαεενή ηδκ ηαπφηδηα νμήξ ηςκ αηιχκ ημο δείβιαημξ ζημκ εάθαιμ ζμκζζιμφ. Οζ θζβυηενμ πηδηζηέξ εκχζεζξ εζζάβμκηαζ ζηδ δελαιεκή, δ μπμία ιπμνεί κα εενιακεεί ιέπνζ 350 C (ζφζηδια εενιήξ εζζυδμο). ε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ πνδζζιμπμζείηαζ ζφζηδια ηεκμφ βζα κα επζηεοπεεί πίεζδ αηιχκ δείβιαημξ 10-4 έςξ 10-5 Torr ύζηεκα Άκεζεο Δηζαγσγήο Γείγκαηνο (Direct probe) Γζα κα απμθεοπεεί ιζα ηοπυκ εενιζηή δζάζπαζδ, μζ εοαίζεδηεξ εκχζεζξ, υπςξ επίζδξ ηα ζηενεά ηαζ ηα ιδ πηδηζηά οβνά εζζάβμκηαζ ηαη εοεείακ ζημ εάθαιμ ζμκζζιμφ, πμο ανίζηεηαζ ζε ορδθυ ηεκυ, ζημ άηνμ εκυξ ηεναιζημφ ζςθήκα ιε έκακ δεζβιαημθήπηδ πμο δεκ επδνεάγεζ ημ ηεκυ (vacuum lock) ημο εαθάιμο ζμκζζιμφ. οκήεςξ οπάνπεζ δοκαηυηδηα ηυζμ βζα ρφλδ υζμ ηαζ βζα εένιακζδ ημο δείβιαημξ ζημ δεζβιαημθήπηδ [8,9]. 8

24 ύδεπμε κε Υξσκαηνγξαθία Ζ ζφγεολδ ηδξ Υνςιαημβναθίαξ ιε ηδ θαζιαημιεηνία ιαγχκ απμηεθεί έκα απμ ηα ιεβαθφηενα επζηεφβιαηα ηδξ ζφβπνμκδξ επζζηήιδξ. Ζ ζφγεολδ ηδξ αένζαξ πνςιαημβναθίαξ πναηηζηά βίκεηαζ άιεζα. Γζα ηδκ οβνή Υνςιαημβναθία, ηδκ ηνζπμεζδή δθεηηνμθυνδζδ ηαζ άθθεξ οβνέξ ηεπκζηέξ δζαπςνζζιμφ απζηείηαζ εζδζηή δζάηαλδ ζφγεολδξ (interface) [6]. ηδ ζοκδοαζιέκδ ηεπκζηή LC-MS, ημ οβνυ πμο εηθμφεηαζ απυ ηδ πνςιαημβναθζηή ζηήθδ μδδβείηαζ ζηδκ πδβή ζυκηςκ, αθμφ πνμδβμοιέκςξ απαθθαβεί απυ ηδ ιεβαθφηενδ πμζυηδηα δζαθφηδ [7] ΠΖΓΖ ΗΟΝΣΧΝ Κάεε δζαηνζηυ ηιήια ημο θαζιαημιέηνμο ιαγχκ παίγεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ θεζημονβία ηαζ απυδμζδ ημο ζοκυθμο. Έηζζ δ επζθμβή ηδξ ηεπκζηήξ ζμκζζιμφ πμο εα εθανιμζεεί είκαζ ιεβάθδξ ζδιαζίαξ βζα ηδκ ακάθοζδ πμο εα αημθμοεήζεζ [6]. Οζ πδβέξ ζμκζζιμφ ζηδ θαζιαημιεηνία ιάγαξ δζαηνίκμκηαζ ζε πδβέξ ζμκζζιμφ βζα πηδηζηέξ εκχζεζξ, υπμο ημ δείβια πνχηα ελαενχκεηαζ ηαζ ιεηά ζμκίγεηαζ ζε ζοκεήηεξ ηεκμφ ηαζ ζε πδβέξ ζμκζζιμφ βζα ιδ πηδηζηέξ εκχζεζξ, υπμο ημ δείβια ζε οβνή ή ζηενεά ηαηάζηαζδ ιεηαηνέπεηαζ ηαη εοεείακ ζε αενζχδδ ζυκηα ηαηά ημκ ζμκζζιυ ημο ζε ζοκεήηεξ αηιμζθαζνζηήξ πίεζδξ [8]. Οζ πδβέξ ζμκζζιμφ δζαηνίκμκηαζ επίζδξ ζε ζηθδνέξ (hard ionization) ηαζ ιαθαηέξ (soft ionization), ακάθμβα ιε ηδκ εκένβεζα πμο ιεηαδίδμοκ ζηα ιυνζα ημο ακαθφηδ ηαζ ζημ ζπάζζιμ ηςκ δεζιχκ ημο ιμνίμο ζε ιζηνυηενα εναφζιαηα. ηζξ ζηθδνέξ πδβέξ ζμκζζιμφ δ εκένβεζα πμο ιεηαδίδεηαζ είκαζ ανηεηά ιεβάθδ ιε απμηέθεζια ηδ δζάζπαζδ ημο ιμνίμο ζε εναφζιαηα ιε θυβμοξ m/z ιζηνυηενμοξ απυ αοηυκ ημο ιμνζαημφ ζυκημξ, εκχ μζ ιαθαηέξ πδβέξ πνμηαθμφκ πενζμνζζιέκδ εναφζδ, ιε απμηέθεζια κα θαιαάκμκηαζ δζαθμνεηζηά θάζιαηα ιάγαξ ακάθμβα ιε ηδκ έκηαζδ ηδξ πδβήξ ζμκζζιμφ [6]. Σα θάζιαηα ηυζμ ιζαξ ζηθδνήξ, υζμ ηαζ ιζαξ ιαθαηήξ πδβήξ, είκαζ πνήζζια ζηδκ ακάθοζδ. Οζ πμθθέξ ημνοθέξ ζε έκα θάζια ζηθδνήξ πδβήξ πανέπμοκ πνήζζιεξ πθδνμθμνίεξ βζα ηα είδδ ηςκ δναζηζηχκ μιάδςκ ηαζ επμιέκςξ βζα ηδ δμιή ηςκ ακαθοηχκ. Σα θάζιαηα ιαθαηχκ πδβχκ είκαζ πνήζζια επεζδή πανέπμοκ αηνζαείξ πθδνμθμνίεξ ςξ πνμξ ημ ιμνζαηυ αάνμξ ηςκ ιμνίςκ ημο ακαθφηδ. Παναηάης δίκμκηαζ μζ ηονζυηενεξ ιέεμδμζ ζμκζζιμφ. ηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ δζπθςιαηζηήξ ενβαζίαξ, εα δμεεί έιθαζδ ζηδ ιέεμδμ ζμκζζιμφ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ηαηά ηδκ εθανιμβή ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ οπυ ιεθέηδ ακαθοηχκ (ζμκζζιυξ απυ δθεηηνζηυ πεδίμ ιε ρεηαζιυ, electrospray ionization, ESI). 9

25 Ηνληζκόο Αέξηα Φάζεο (Gas-Phase Ionization) a) Ημκζζιυξ ιε πνυζηνμοζδ δθεηηνμκίςκ (Electron Impact - EI): Με ηδκ εζζαβςβή ημοξ ζηδκ πδβή ζυκηςκ ηα πνμξ ακάθοζδ ιυνζα εζηζάγμκηαζ πενκχκηαξ ιέζα απυ ιεηαθθζηέξ πθάηεξ απχεδζδξ (repellers). ηδ ζοκέπεζα αμιαανδίγμκηαζ ιε δθεηηνυκζα πμο εηθφμκηαζ απυ εενιαζκυιεκμ κήια Βμθθναιίμο ή Ρδκίμο. Με ηδ ζφβηνμοζδ ηςκ ιμνίςκ ιε ηδ δέζιδ ηςκ δθεηηνμκίςκ πανάβμκηαζ εεηζηά θμνηζζιέκεξ νίγεξ: M e M. 2 Ζ εναφζδ ζημκ ζμκζζιυ ιε δθεηηνυκζα είκαζ ελαζνεηζηά επακαθήρζιδ. Σμ βεβμκυξ αοηυ επζηνέπεζ ημ ζπδιαηζζιυ αάζεςκ δεδμιέκςκ πμο δζαηδνμφκηαζ ηαζ ακακεχκμκηαζ απυ πμθθμφξ ενεοκδηέξ ζε δζάθμνα ενβαζηήνζα, υπμο ηαηαβνάθμκηαζ ηα παναηηδνζζηζηά ζυκηα βζα πμθθέξ πζθζάδεξ εκχζεςκ. Γζ αοηυ ημ θυβμ δ ηεπκζηή αοηή ζμκζζιμφ είκαζ δ ιέεμδμξ επζθμβήξ βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ δμιήξ άβκςζηςκ εκχζεςκ. Πθεμκεηηήιαηα ημο ζμκζζιμφ ιε δθεηηνυκζα είκαζ δ απθυηδηα, δ εοημθία ηαζ δ ιεβάθδ απυδμζδ ημο ζμκζζιμφ ηαζ δ παναβςβή εοβαηνζηχκ ζυκηςκ, πμο αμδεά ηα ιέβζζηα ζηδκ ηαοημπμίδζδ εκχζεςκ ιε πενίπθμηδ δμιή. Όιςξ αοηή δ εναφζδ ιπμνεί κα απμηεθεί ηαζ ιεζμκέηηδια ζε άθθεξ πενζπηχζεζξ, υπμο ημ ιμνζαηυ (ιδηνζηυ) ζυκ μοζζαζηζηά ελαθακίγεηαζ, θυβς ηδξ μθζηήξ εναφζδξ. Έκαξ ζδιακηζηυξ πενζμνζζηζηυξ πανάβμκηαξ είκαζ δ ελάηιζζδ ημο δείβιαημξ, πμο είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδ θεζημονβία ηδξ δζάηαλδξ. Μδ πηδηζηέξ εκχζεζξ (ιεβαθμιυνζα, πμθζηέξ εκχζεζξ) ιπμνεί κα δζαζπαζημφκ ηαηά ηδ εένιακζή ημοξ ηαζ πνζκ ημκ ζμκζζιυ ημοξ. Ωξ απμηέθεζια δ ακάθοζδ ιαηνμιμνίςκ ή πμθζηχκ εκχζεςκ δεκ είκαζ δοκαηή ιε ηδκ ηεπκζηή αοηή [6]. b) Υδιζηυξ ζμκζζιυξ (Chemical Ionization - CI) Ο πδιζηυξ ζμκζζιυξ πναβιαημπμζείηαζ ζοκήεςξ ζε ζπεηζηά ορδθή πίεζδ ( Pa). Ζ ορδθή πίεζδ έπεζ ςξ απμηέθεζια ζοπκέξ ζοβηνμφζεζξ ηςκ πνμζδζμνζγυιεκςκ ιμνίςκ, είηε ιεηαλφ ημοξ, είηε ιε ζυκηα πμο δζμπεηεφμκηαζ ζημ ζφζηδια ηαζ πνμένπμκηαζ απυ αένζμ ακηζδναζηήνζμ (π.π. αιιςκία ή ιεεάκζμ). Σμ αένζμ ακηζδναζηήνζμ πμο ανίζηεηαζ ζε πενίζζεζα ζμκίγεηαζ ανπζηά, είηε ιε αμιαανδζζιυ ιε δθεηηνυκζα, είηε θυβς ηδξ νμήξ ημο πάκς απυ θμνηζζιέκμ δθεηηνυδζμ εηηέκςζδξ (6 kv). ηδ ζοκέπεζα ηα ζυκηα ημο αένζμο ακηζδναζηδνίμο ακηζδνμφκ ιε ηα ιυνζα ηδξ πνμζδζμνζγυιεκδξ έκςζδξ ζμκίγμκηάξ ηα. Τπάνπμοκ δομ ηνυπμζ πδιζημφ ζμκζζιμφ: ιε εεηζηυ πδιζηυ ζμκζζιυ (Positive ion chemical ionization, PICI) ηαζ ιε ανκδηζηυ πδιζηυ ζμκζζιυ (Negative ion chemical ionization, NICI). Ο ανκδηζηυξ πδιζηυξ ζμκζζιυξ είκαζ 2-3 θμνέξ πζμ εοαίζεδηδ 10

26 ηεπκζηή ζε ζπέζδ ιε ημκ εεηζηυ πδιζηυ ζμκζζιυ ηαζ εθανιυγεηαζ ηονίςξ ζε εκχζεζξ πμο έπμοκ μιάδεξ ιε ορδθή δθεηηνμθζθία υπςξ αθμβυκα ηαζ κζηνμ-μιάδεξ [10]. Σα θάζιαηα πμο θαιαάκμκηαζ ιε πνήζδ πδιζημφ ζμκζζιμφ πενζέπμοκ ιζηνυηενμ ανζειυ ζδιάηςκ (είκαζ "ηαεανυηενα") ζε ζφβηνζζδ ιε αοηά πμο θαιαάκμκηαζ υηακ εθανιυγεηαζ ζμκζζιυξ ιε δθεηηνυκζα [6] Δθξόθεζε θαη Ηνληζκόο Πεδίνπ (Field Desorption and Ionization) Ηυκηα δδιζμονβμφκηαζ ιε ηδκ επίδναζδ ζζπονμφ δθεηηνζημφ πεδίμο. Συζμ ζζπονά πεδία πανάβμκηαζ ιε εθανιμβή ορδθχκ ηάζεςκ (10 ςξ 20 kv) ζε εζδζηά ηαηαζηεοαζιέκμοξ εηπμιπμφξ, πμο απμηεθμφκηαζ απυ έκα ιεβάθμ ανζειυ ιζηνμαηίδςκ ιε δζαιέηνμοξ ιζηνυηενεξ απυ 1 ιm. Ο εηπμιπυξ ζοπκά είκαζ έκα θεπηυ ζφνια αμθθναιίμο (δζάιεηνμξ ~ 10 pm), ζηδκ επζθάκεζα ημο μπμίμο έπμοκ ακαπηοπεεί ιζηνμζημπζημί δεκδνίηεξ άκεναηα ςξ απμηέθεζια πονυθοζδξ αεκγμκζηνζθίμο ζε ορδθυ δθεηηνζηυ πεδίμ. Απμηέθεζια ηδξ δζαδζηαζίαξ αοηήξ είκαζ δ ακάπηολδ πμθθχκ εηαημκηάδςκ ιζηνμαηίδςκ άκεναηα, πμο πνμαάθθμοκ απυ ηδκ επζθάκεζα ημο ζφνιαημξ. a) Δηνυθδζδ πεδίμο (Field Desorption FD) Σμ δείβια απμηίεεηαζ επί ημο εηπμιπμφ ηαζ μ εηπμιπυξ πμθχκεηαζ ζε ορδθυ δοκαιζηυ (ανηεηά kv) ηαζ έκα νεφια δζένπεηαζ δζαιέζμο ημο πμιπμφ βζα κα γεζηαεεί ημ κήια. Σα θάζιαηα ιάγαξ απμηημφκηαζ ηαεχξ ημ νεφια ζημκ εηπμιπυ αολάκεηαζ ζηαδζαηά ηαζ ημ δείβια ελαηιίγεηαζ απυ ημκ εηπμιπυ ζηδκ αένζα θάζδ. Σα ιυνζα ακαθφηδ ζμκίγμκηαζ απυ ηζξ ιζηνμαηίδεξ ημο εηπμιπμφ [10]. b) Ημκζζιυξ πεδίμο (Field Ionization FI) ηδκ πενίπηςζδ αοηή, ημ δθεηηνυδζμ ημπμεεηείηαζ ζε δεζβιαημθήπηδ (probe), πμο ελένπεηαζ απυ ημκ πχνμ δείβιαημξ ημο μνβάκμο. Ο δεζβιαημθήπηδξ ηαθφπηεηαζ ιε δζάθοια ημο δείβιαημξ, επακεζζένπεηαζ ζημ υνβακμ ηαζ ημ δείβια ζμκηίγεηαζ ιε εθανιμβή ορδθμφ δοκαιζημφ. Γζα ιενζηά δείβιαηα είκαζ απαναίηδημ κα εενιαίκεηαζ μ εηπμιπυξ ιε δζέθεοζδ δθεηηνζημφ νεφιαημξ, μπυηε είκαζ πζεακή ηαζ εενιζηή απμζημδυιδζδ πνζκ απυ ηδκ μθμηθήνςζδ ημο ζμκζζιμφ. Έκα ιεζμκέηηδια ηδξ ηεπκζηήξ FI είκαζ δ εοαζζεδζία ηδξ, δ μπμία είκαζ ημοθάπζζημκ ιζα ηάλδ ιεβέεμοξ ιζηνυηενδ απυ αοηή ηςκ πδβχκ πνυζηνμοζδξ [10] Βνκβαξδηζκόο κε σκαηίδηα (Particle Bombardment) ηζξ δομ αοηέξ ηεπκζηέξ μ ζμκζζιυξ ημο δείβιαημξ επζηοβπάκεηαζ ζε έκα ζηάδζμ ιε αμιαανδζζιυ ημο δείβιαημξ ιε ιζα εζηζαζιέκδ δέζιδ ηαπέςκ αηυιςκ εκυξ εοβεκμφξ αενίμο (Ar ή Xe) (FAB) ή ιε ιζα εζηζαζιέκδ δέζιδ ζυκηςκ (3He +, 40Ar + ) ημο αενίμο (SIMS). 11

27 a) Βμιαανδζζιυξ ιε ηαπέςξ ηζκμφιεκα άημια (Fast Atom Bombardment FAB) ηδκ ηεπκζηή FAB ημ δείβια δζαθφεηαζ ζε βθοηενυθδ ή άθθμοξ δζαθφηεξ ακάθμβδξ ηάζδξ αηιχκ ηαζ ημπμεεηείηαζ ιε ηδκ ιμνθή θεπημφ οιεκίμο (θζθι) ζε ιεηαθθζηυ θμνέα υπμο εζηζάγεηαζ δ δέζιδ ηαπέςκ αηυιςκ. Ζ ιέεμδμξ έπεζ ιεβαθφηενδ εθανιμβή βζα ημκ ζμκζζιυ ιδ πηδηζηχκ εκχζεςκ, ιεβαθμιμνίςκ ηαζ εενιζηά εοαίζεδηςκ εκχζεςκ. Πθεμκεηηήιαηα ηδξ ηεπκζηήξ FAB είκαζ δ απθυηδηα ηδξ δζενβαζίαξ, δ παναβςβή απθχκ θαζιάηςκ ιε ιμνζαηά ζυκηα ηαζ ζζπονά ζμκζηά νεφιαηα, δ ακάθοζδ πμζηίθςκ αθθά ηαζ εενιζηά αζηαεχκ ιμνίςκ. Μεζμκεηηήιαηά ηδξ είκαζ μ ορδθυξ ευνοαμξ οπμαάενμο, δ πνμαθδιαηζηή θεζημονβία βζα εκχζεζξ ιε m/z <250 Da ηαζ δ απαναίηδηδ ζηαεενυηδηα ηαζ δζαθοηυηδηα ημο ακαθφηδ ζημ οβνυ οπυζηνςια. b) Φαζιαημζημπία ιαγχκ ιε δεοηενεφμκηα ζυκηα (Secondary Ion Mass Spectrometry SIMS) Ζ ηεπκζηή SIMS πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ιεθέηδ ζηενεχκ δεζβιάηςκ ηαζ ανίζηεζ εθανιμβέξ ζδζαίηενα ζηδκ πδιεία επζθακεζχκ. Ζ επίδναζδ ηδξ δέζιδξ ορδθήξ εκένβεζαξ (8 kev) ζηα ιυνζα ηδξ έκςζδξ επζηοβπάκεζ ημκ ζμκηζζιυ ημοξ ζε έκα ζηάδζμ ηαζ ηδκ ιεηαθμνά ημοξ (εηνυθδζδ) ζηδκ αένζα θάζδ. Ο αηνζαήξ ιδπακζζιυξ ζμκζζιμφ δεκ είκαζ βκςζηυξ [10] Ηνληζκόο Αηκνζθαηξηθήο Πίεζεο (Atmospheric Pressure Ionization) a) Ημκζζιυξ ιε ρεηαζιυ ζε δοκαιζηυ (Electrospray Ionization ESI) Ζ ηεπκζηή ημο ρεηαζιμφ ζε δθεηηνζηυ πεδίμ πνδζζιμπμζείηαζ ςξ δ ηονζυηενδ ιέεμδμξ ζφγεολδξ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ιε θαζιαημιεηνία ιαγχκ [6]. Ο ζμκζζιυξ ιε δθεηηνμρεηαζιυ είκαζ ιία ιέεμδμξ ζμκζζιμφ ηαηά ηδκ μπμία μζ μοζίεξ πμο ανίζημκηαζ δζαθοιέκεξ ζε έκα δζάθοια ιεηαθένμκηαζ ζηδκ αένζα θάζδ ςξ ζυκηα. Σα ζυκηα αένζαξ θάζδξ ακζπκεφμκηαζ ζηδ ζοκέπεζα απυ ημ θαζιαηυιεηνμ ιάγαξ. Σα ηφνζα ζηάδζα βζα ημκ ζπδιαηζζιυ ηςκ ζυκηςκ αένζαξ θάζδξ ζηδ δζάηαλδ δθεηηνμρεηαζιμφ είκαζ: i. Ζ παναβςβή θμνηζζιέκςκ ζηαβμκζδίςκ ζηδκ έλμδμ ημο ηνζπμεζδμφξ ρεηαζιμφ. Καεχξ ημ δζάθοια ημο δείβιαημξ ελςεείηαζ ιέζς ημο ηνζπμεζδμφξ ρεηαζιμφ, ζημ άηνμ ημο μπμίμο εθανιυγεηαζ ορδθυ δοκαιζηυ, μ δζαθφηδξ οθίζηαηαζ δθεηηνμπδιζηή ακηίδναζδ, ιε απμηέθεζια ηδ νμή δθεηηνμκίςκ πνμξ ή απυ ημ ιεηαθθζηυ ηνζπμεζδέξ 12

28 (ακάθμβα ιε ηδκ πμθζηυηδηα ημο εθανιμγυιεκμο δοκαιζημφ). Ζ μλείδςζδ ημο δζαθφηδ θαιαάκεζ πχνα ηαηά ημκ εεηζηυ ζμκζζιυ, εκχ δ ακαβςβή ημο δζαθφηδ θαιαάκεζ πχνα ηαηά ημκ ανκδηζηυ ζμκζζιυ. Αοηέξ μζ μλεζδμακαβςβζηέξ ακηζδνάζεζξ πανέπμοκ ζημ δζάθοια εεηζηά ή ανκδηζηά ζυκηα ακάθμβα ιε ηδκ πμθζηυηδηα ημο εθανιμγυιεκμο δοκαιζημφ ζημ άηνμ ημο ηνζπμεζδμφξ ρεηαζιμφ. Γεκζηά, ζηδ θαζιαημιεηνία ιάγαξ ιε δθεηηνμρεηαζιυ πνδζζιμπμζμφκηαζ πμθζημί δζαθφηεξ, υπςξ κενυ, ιεεακυθδ, αηεημκζηνίθζμ η.ά. ηαζ μζ μπμίμζ εφημθα οθίζηακηαζ δθεηηνμπδιζηέξ ακηζδνάζεζξ. Σα ζοζζςνεοιέκα θμνηία (εεηζηά ή ανκδηζηά) πμο δδιζμονβμφκηαζ, απςεμφκηαζ απυ ημ ζζπονυ δοκαιζηυ πμο εθανιυγεηαζ (ηδξ ίδζαξ πμθζηυηδηαξ) ηαζ παναζφνμκηαζ πνμξ ηδκ επζθάκεζα ημο οβνμφ, ζηδκ έλμδμ ημο ηνζπμεζδμφξ. Σρήκα 1.4:Πεξηγξαθή ησλ ζηαδίσλ ζρεκαηηζκνύ ησλ ηόλησλ αέξηαο θάζεο [11]. ηδκ επζθάκεζα, ηα θμνηία απμζηαεενμπμζμφκηαζ ηαζ μ ιδκίζημξ ιεηαζπδιαηίγεηαζ ζε ηχκμ (ηχκμξ ημο Taylor) οπυ ηδκ επίδναζδ ζζπονμφ δθεηηνζημφ πεδίμο. Άιεζα, μ ηχκμξ ανπίγεζ κα εηημλεφεζ ιζα θεπηή δέζιδ οβνμφ απυ ηδκ ημνοθή ημο πνμξ ημ ακηίεεημ δθεηηνυδζμ. Ζ δέζιδ οβνμφ εφημθα δζαζπάηαζ ζε ιζηνά θμνηζζιέκα ζηαβμκίδζα, ηα μπμία απςεμφκηαζ ιεηαλφ ημοξ ηαεχξ ηζκμφκηαζ ηαηά ιήημξ ηδξ ηαηεφεοκζδξ ημο δθεηηνζημφ πεδίμο. οκμθζηά, οπυ ζοκεήηεξ εεηζημφ ζμκζζιμφ ζπδιαηίγεηαζ εεηζηά θμνηζζιέκμ αενυθοια, εκχ οπυ ζοκεήηεξ ανκδηζημφ ζμκζζιμφ ανκδηζηά θμνηζζιέκμ αενυθοια. Γζα ηα εεηζηά θμνηία είκαζ οπεφεοκα ηονίςξ ηα πνςηυκζα, εκχ βζα ηα ανκδηζηά θμνηία μνζζιέκα ανκδηζηά ζυκηα. ii. Ζ ζοννίηκςζδ ηςκ θμνηζζιέκςκ ζηαβμκζδίςκ ζε πμθφ ιζηνά ζηαβμκίδζα ορδθμφ θμνηίμο, θυβς ηδξ ελάηιζζδξ ημο δζαθφηδ (απμδζαθφηςζδ) ηαζ ηςκ επακαθαιαακυιεκςκ δζαζπάζεςκ ηςκ ζηαβμκζδίςκ. Σα θμνηία ηαηακέιμκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ζηαβμκζδίςκ ζε ίζεξ απμζηάζεζξ ιεηαλφ ημοξ. ε αοηά ηα θμνηζζιέκα ζηαβμκίδζα δνμοκ δφμ ακηίεεηεξ δοκάιεζξ: δ 13

29 επζθακεζαηή ηάζδ, δ μπμία πνμζπαεεί κα δζαηδνήζεζ ημ ζθαζνζηυ ζπήια ηςκ ζηαβμκζδίςκ ηαζ δ απςζηζηή δφκαιδ coulomb ιεηαλφ ηςκ μιχκοιςκ θμνηίςκ ηδξ επζθάκεζαξ, δ μπμία πνμζπαεεί κα δζαζπάζεζ ημ ζθαζνζηυ ζπήια ηςκ ζηαβμκζδίςκ. Καεχξ ηα ζηαβμκίδζα δζαζπίγμοκ ημκ πχνμ ιεηαλφ ημο ηνζπμεζδμφξ ρεηαζιμφ ηαζ ημο ακηίεεημο δθεηηνυδζμο (ζπήια 1.4), μ δζαθφηδξ ελαηιίγεηαζ, ιε απμηέθεζια ηδ ιείςζδ ημο ιεβέεμοξ ηςκ ζηαβμκζδίςκ ιέπνζ ημ ζδιείμ Rayleigh (Rayleigh limit), υπμο δ απςζηζηή δφκαιδ coulomb λεπενκά ηδκ επζθακεζαηή ηάζδ. ε αοηυ ημ ζδιείμ ζοιααίκεζ δ ζπάζδ coulomb (Coulomb fission or explosion), δδθαδή ηα ανπζηά ζηαβμκίδζα δζαζπχκηαζ ζε πμθφ ιζηνυηενα ζηαβμκίδζα, ηα μπμία έπμοκ ηαζ ορδθυηενμ θυβμ θμνηίμο πνμξ ιάγα ζε ζπέζδ ιε ηα ανπζηά ζηαβμκίδζα. Ζ παναπάκς δζαδζηαζία επακαθαιαάκεηαζ ζοκεπχξ ιέπνζ ημκ ζπδιαηζζιυ θμνηζζιέκςκ κακμζηαβμκζδίςκ, απ υπμο ηεθζηά εα πνμηφρμοκ ηα ζυκηα ηδξ μοζίαξ ζηδκ αένζα θάζδ [11]. iii. Ο ζπδιαηζζιυξ ηςκ ζυκηςκ αένζαξ θάζδξ ιέζς ημο ιμκηέθμο ζμκηζηήξ ελάηιζζδξ (Ion Evaporation Model, IEM) ή ιέζς ημο ιμκηέθμο οπμθεζιιαηζημφ θμνηίμο (Charge Residue Model, CRM). -Μνληέιν ηνληηθήο εμάηκηζεο Ακαπηφπεδηε ανπζηά απυ ημοξ Iribarne ηαζ Thomson, ημ Σμ ιμκηέθμ αοηυ πνμηείκεζ πςξ υηακ δ αηηίκα ηςκ θμνηζζιέκςκ ζηαβμκζδίςκ ιεζςεεί ζηδκ ηάλδ ιεβέεμοξ ιενζηχκ δεηάδςκ κακμιέηνςκ, θυβς ηδξ ελάηιζζδξ ημο δζαθφηδ ηαζ ηςκ επακαθαιαακυιεκςκ δζαζπάζεςκ (ζπάζεςκ), είκαζ πζεακή δ απεοεείαξ εηπμιπή ζυκηςκ ζηδκ αένζα θάζδ. -Μνληέιν ππνιεηκκαηηθνύ θνξηίνπ Ακαπηφπεδηε απυ ημοξ Dole ηαζ ζοκενβάηεξ, ημ Σμ ιμκηέθμ αοηυ πνμηείκεζ υηζ δ δζαδζηαζία δθεηηνμρεηαζιμφ, ιεηά ηζξ επακαθαιαακυιεκεξ δζαζπάζεζξ ηςκ ζηαβμκζδίςκ ηαζ ηδκ ελάηιζζδ ημο δζαθφηδ, πανάβεζ ιζηνμζημπζηά ζηαβμκίδζα (ηδξ ηάλδξ ιενζηχκ κακμιέηνςκ) πμο πενζέπμοκ ιυκμ έκα ζυκ, ηαζ ημ μπμίμ απεθεοεενχκεηαζ ιε ηδκ ελάηιζζδ ημο δζαθφηδ [12]. Γζαθφηεξ υπςξ ιεεακυθδ ηαζ αηεημκζηνίθζμ ζε ζοκδοαζιυ ιε κενυ είκαζ ζδακζημί βζα ζμκζζιυ ESI, υπςξ ηαζ πηδηζηά μλέα ηαζ αάζεζξ, εκχ άθαηα ιε ζοβηέκηνςζδ πάκς απυ 10 mμ ηαζ ζζπονέξ αάζεζξ ηαζ μλέα είκαζ ζδζαίηενα επζαθααή. Ζ ηεπκζηή επδνεάγεηαζ άιεζα απυ ημ ιέβεεμξ ηδξ ζηαβυκαξ, ημ επζθακεζαηυ θμνηίμ, ηδκ επζθακεζαηή ηάζδ ημο οβνμφ ηαζ ηδκ πηδηζηυηδηα ημο δζαθφηδ. Δπμιέκςξ ιεβάθα ζηαβμκίδζα ιε ορδθή επζθακεζαηή ηάζδ, παιδθή πηδηζηυηδηα, παιδθυ επζθακεζαηυ θμνηίμ ηαζ ορδθή αβςβζιυηδηα ειπμδίγμοκ ημκ απμηεθεζιαηζηυ ημοξ ζμκζζιυ [13]. Ζ ηεπκζηή ζμκζζιμφ ESI είκαζ ζδζαίηενα απμηεθεζιαηζηή βζα ηδκ ακάθοζδ πμθζηχκ ιμνίςκ, υπςξ αζμθμβζηχκ πμθοιενχκ (πνςηεΐκεξ, πεπηίδζα, βθοημπνςηεΐκεξ ηαζ κμοηθεμηίδζα), θανιαηεοηζηχκ μοζζχκ ηαζ ιεηααμθζηχκ ηαεχξ ηαζ αζμιδπακζηχκ πμθοιενχκ. Γζα ημοξ θυβμοξ αοημφξ έπεζ δζαδμεεί ζδζαίηενα ηαζ απακηάηαζ ζηα πενζζζυηενα κέα υνβακα. Σμ electrospray είκαζ δ πζμ δζαδεδμιέκδ ηεπκζηή ζφγεολδξ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ιε θαζιαημιεηνία ιαγχκ (LC-MS interface) [6]. 14

30 b) Υδιζηυξ ζμκζζιυξ ζε αηιμζθαζνζηή πίεζδ (Atmospheric Pressure Chemical Ionization APCI) Ο εηκεθςηήξ ιε ημ δείβια εενιαίκεηαζ ζημοξ C ζε αηιμζθαζνζηή πίεζδ, ελαηιίγμκηαξ ημ δζαθφηδ. Σμ αένζμ πμο πνμηφπηεζ απυ ημ δζαθφηδ ζμκίγεηαζ ιε ηδ αμήεεζα αηίδαξ. Σα ζυκηα ημο δζαθφηδ ιεηαθένμοκ ημ θμνηίμ ημοξ ζηα ιυνζα ημο δείβιαημξ ιέζς πδιζηχκ ακηζδνάζεςκ (πδιζηυξ ζμκζζιυξ). Σα ζυκηα πμο πνμηφπημοκ απυ ημ ιυνζμ ημο δείβιαημξ πενκμφκ ιέζς εκυξ ηνζπμεζδμφξ ζημκ ακαθοηή ιαγχκ. Ζ ηεπκζηή πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ ζμκζζιυ πμθζηχκ ηαζ ιδ πμθζηχκ ιμνίςκ ιε m/z <2000 Da. Γεκ εκδείηκοηαζ βζα ιαηνμιυνζα ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζε ζοκδοαζιυ ιε οβνή πνςιαημβναθία θυβς ηδξ ιδ πμθζηυηδηαξ ηςκ ιμνίςκ [8] Δθξόθεζε κε Υξήζε Λέτδεξ (Laser Desorption) a) Ημκζζιυξ εηνυθδζδξ οπμαμδεμφιεκμξ ιε θέσγεν (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - MALDI) Ζ ηεπκζηή MALDI είκαζ ιζα ηεπκζηή ζμκζζιμφ βζα ηδ ιεθέηδ αζμπμθοιενχκ ιεβάθμο ιμνζαημφ αάνμοξ ηαζ ςξ ηεπκζηή εηνυθδζδξ μδδβεί ζε ιζηνή εναοζιαημπμίδζδ. Καηά ηδ ιέεμδμ αοηή, ζοκήεςξ πνδζζιμπμζείηαζ κζημηζκζηυ μλφ, ημ μπμίμ απμννμθά αηηζκμαμθία ζημ UV, ςξ οπυζηνςια (matrix) ιε ημ μπμίμ ακαιζβκφεηαζ ιε ημ πνμξ ακάθοζδ δείβια. Μζηνμπμζυηδηα απυ ημ δζάθοια πμο πνμηφπηεζ ημπμεεηείηαζ ζε εζδζηή πθάηα πμθθαπθχκ εέζεςκ (96 ή ηαζ παναπάκς) υπμο ηαζ ελαηιίγεηαζ. ηδ ζοκέπεζα, δ πθάηα ημπμεεηείηαζ ζηδκ πδβή ζυκηςκ, υπμο ημ δείβια αηηζκμαμθείηαζ ιε δέζιδ θέσγεν. Ζ εκένβεζα ημο θέσγεν απμννμθάηαζ απυ ημ οθζηυ ημο οπμζηνχιαημξ ηαζ ιεηαδίδεηαζ ζημ ιυνζμ ημ μπμίμ εηνμθάηαζ ηαζ ζμκίγεηαζ. Ζ ηεπκζηή MALDI πνδζζιμπμζείηαζ ηονίςξ ιε ακαθοηή ιάγαξ πνυκμο-πηήζδξ μ μπμίμξ θεζημονβεί ιε παθιζηυ ζμκζζιυ ηαζ εκδείηκοηαζ βζα ηδκ ακάθοζδ ιζηνχκ ιμνίςκ ιε ιμνζαηά αάνδ ιζηνυηενα ηςκ 500 Da θυβς ηδξ απμζφκεεζδξ ημο οθζημφ ημο οπμζηνχιαημξ [6,8]. ημκ πίκαηα 1.2 δίκμκηαζ ζοκμπηζηά μζ ηφνζεξ ηεπκζηέξ ζμκζζιμφ, δ ζοιααηυηδηά ημοξ ιε ακαθοηέξ ιαγχκ ηαζ δ εθανιμζζιυηδηά ημοξ ζηδκ ακάθοζδ. Πίκαηαξ 1.2: Kφνζεξ ηεπκζηέξ ζμκζζιμφ ηαζ δοκαημί ζοκδοαζιμί ιεευδςκ [6]. Σεπκζηή Ημκζζιμφ Κφνζα Ηυκηα Ακαθοηήξ Μαγχκ Σάλεζξ Δκχζεςκ Ημκζζιυξ δθεηηνμκίςκ M + Θοβαηνζηά ζυκηα B a, Q b, TRAP c Μδ πμθζηέξ, ηάπμζεξ πμθζηέξ <1000 dalton Υδιζηυξ Ημκζζιυξ [M+H] + M -, [M-H] - M -, B, Q, TRAP Μδ πμθζηέξ, ηάπμζεξ πμθζηέξ <1000 dalton Βμιαανδζζιυξ άημια (FAB) ιε [M+H] + B, Q Πμθζηέξ μνβακζηέξ, πνςηεΐκεξ, 15

31 [M-H] - Thermospray [M+H] + [M+NH 4 ] + μνβακμιεηαθθζηέξ < dalton B, Q Πμθζηέξ, ηάπμζεξ ιδ πμθζηέξ μνβακζηέξ <1000 dalton MALDI [M+H] + [M-H] - Electrospray [M+H] + [M+NH 4 ] + [M-H] - TOF d B, Q, TRAP, TOF, ORBITRAP, QTOF, FTMS e Πμθζηέξ, ηάπμζεξ ιδ πμθζηέξ, αζμπμθοιενή, ζοκεεηζηά πμθοιενή <10 6 dalton Πμθζηέξ, ηάπμζεξ ιδ πμθζηέξ μνβακζηέξ, πνςηεΐκεξ < dalton a: Magnetic Sector, b:quadrupole, c: Ion Trap, d: Time of flight, e: Fourier Transform Mass Spectrometer 1.6 ΑΝΑΛΤΣΔ ΣΖ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΧΝ Μυθζξ ηα ζυκηα ημο δείβιαημξ ιεηααμφκ ζηδκ αένζα ηαηάζηαζδ πνέπεζ κα δζαπςνζζημφκ ακάθμβα ιε ηδ ιάγα ημοξ. Ζ ααζζηή θεζημονβία ημο θαζιαημιέηνμο ιαγχκ είκαζ κα δζαπςνίζεζ ηα ζυκηα, πμο πανάβμκηαζ ζηδκ πδβή ζυκηςκ, ακάθμβα ιε ηζξ δζαθμνεηζηέξ ηζιέξ ηςκ θυβςκ m/z. Ο δζαπςνζζιυξ είκαζ απαναίηδημξ, έηζζ χζηε ημ ιεηνμφιεκμ ζμκηζηυ νεφια ζημκ ακζπκεοηή ζυκηςκ, πμο αημθμοεεί ημκ ακαθοηή ιαγχκ, κα ακηζζημζπεί ζε ζυκηα ιε ζοβηεηνζιέκμ θυβμ m/z. Απυ ημκ ηφπμ ημο ακαθοηή ιαγχκ ελανηάηαζ δ δζαπςνζζηζηή ζηακυηδηα (resolution) ημο μνβάκμο, πμο είκαζ ημ ζπμοδαζυηενμ παναηηδνζζηζηυ πμζυηδηαξ εκυξ θαζιαημιέηνμο ιαγχκ. Ζ δζαπςνζζηζηή (ή δζαηνζηζηή) ζηακυηδηα (R) μνίγεηαζ απυ ηδ ζπέζδ 1.2. R = Μ/ΓΜ ( Δλίζςζδ 1.2) υπμο: Μ είκαζ δ ιάγα ηδξ πνχηδξ ημνοθήξ ηαζ ΓΜ είκαζ δ δζαθμνά ιαγχκ δφμ δζαδμπζηχκ ημνοθχκ. Σα θαζιαηυιεηνα ιαγχκ δζαηνίκμκηαζ ζε θαζιαηυιεηνα παιδθήξ ηαζ ορδθήξ δζαπςνζζηζηήξ ζηακυηδηαξ. Με ηα πνχηα, πμο έπμοκ δζαπςνζζηζηή ζηακυηδηα απυ

32 έςξ 1.000, ηα δζάθμνα ζυκηα δζαηνίκμκηαζ ιε αάζδ ηδκ μκμιαζηζηή ιάγα (nominal mass), πμο ακηζζημζπεί ζηδκ πθδζζέζηενδ αηέναζδ ηζιή πνμξ ηδ ιμνζαηή ιάγα. Με ηα θαζιαηυιεηνα ορδθήξ δζαπςνζζηζηήξ ζηακυηδηαξ υιςξ (R= ) ιπμνμφκ κα δζαπςνζζημφκ ζυκηα ιε ίδζα μκμιαζηζηή ιάγα, αθθά ιε δζαθμνεηζηέξ ηζιέξ αηνζαμφξ ιάγαξ (exact mass), πμο δζαθένμοκ ζημ ηνίημ ή ηαζ ζημ ηέηανημ δεηαδζηυ ρδθίμ. Τπάνπεζ ιζα πθδεχνα ακαθοηχκ ιάγαξ μζ μπμίμζ δφκαηαζ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ηαζ μ ηάεε έκαξ εκδέπεηαζ κα δζαπςνίγεζ αάζεζ δζαθμνεηζηήξ ανπήξ. Ο ηάεε ακαθοηήξ έπεζ ηα πθεμκεηηήιαηα ηαζ ηα ιεζμκεηηήιαηά ημο [6,8] Αλαιπηήο Mαγλεηηθνύ Tνκέα ή Aπιήο Eζηίαζεο Σμ ιαβκδηζηυ πεδίμ αζηεί ζηα θμνηζζιέκα ζςιαηίδζα ιζα ιαβκδηζηή δφκαιδ Lorenz ηαζ ηα ακαβηάγεζ κα δζαβνάρμοκ ιζα διζ-πενζθένεζα αηηίκαξ r υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 1.5 [14]. ημ ιαβκδηζηυ πεδίμ Ζ ηα θμνηζζιέκα ζςιαηίδζα απμηημφκ ιζα ιαβκδηζηή δφκαιδ F ηαζ ιία ακηζζηαειζζηζηή θοβυηεκηνδ δφκαιδ E. Γζα κα δζακφζεζ έκα ζυκ ηδκ ηοηθζηή δζαδνμιή ημο ιαβκδηζημφ ημιέα εα πνέπεζ μζ δοκάιεζξ E ηαζ F κα είκαζ ίζεξ ηαζ επεζδή υθα ηα θμνηζζιέκα ζυκηα έπμοκ ζ έκα δεδμιέκμ δοκαιζηυ επζηάποκζδξ V ηδκ ίδζα ηζκδηζηή εκένβεζα πνμηφπηεζ: (Δλίζςζδ 1.3) Όπμο, m = ιάγα ζυκημξ, z = θμνηίμ ζυκημξ, Ζ = ιαβκδηζηυ πεδίμ ζε Tesla, r = αηηίκα ηοηθζηήξ δζαδνμιήξ ημο ζυκημξ, e = δθεηηνμκζαηυ θμνηίμ, V= δοκαιζηυ επζηάποκζδξ. Ηυκηα ιε ίζμ θμνηίμ θαιαάκμοκ ίζδ ηζκδηζηή εκένβεζα ηαηά ηδκ επζηάποκζή ημοξ, ακελανηήηςξ ηδξ ιάγαξ ημοξ. Δπμιέκςξ ηα εθαθνφηενα ζυκηα ηζκμφκηαζ ιε ιεβαθφηενδ ηαπφηδηα απυ ηα αανφηενα ιέζα ζημκ ακαθοηή [6]. ηα πενζζζυηενα θαζιαηυιεηνα ιάγαξ ηα ιεβέεδ Ζ ηαζ r δζαηδνμφκηαζ ζηαεενά, μπυηε δ ιάγα πνμξ ημ θμνηίμ πμο ζοθθέβεηαζ είκαζ ακηίζηνμθα ακάθμβδ ημο δοκαιζημφ επζηάποκζδξ V. Έηζζ δζαθμνεηζημφ ιεβέεμοξ ζυκηα ακζπκεφμκηαζ ζε δζαθμνεηζηέξ πνμκζηέξ ζηζβιέξ. [8,9]. 17

33 Σρήκα 1.5:. Φαζκαηόκεηξν κάδαο κε καγλεηηθό αλαιπηή απιήο εζηίαζεο [15] Αλαιπηέο Μαγλεηηθνύ θαη Ζιεθηξνζηαηηθνύ Πεδίνπ ή Γηπιήο Δζηίαζεο (Double Focusing) Ακαθοηέξ δζπθήξ εζηίαζδξ ηαηαζηεοάγμκηαζ ιε ηαηάθθδθμ ζοκδοαζιυ δθεηηνμζηαηζηχκ ηαζ ιαβκδηζηχκ πεδίςκ υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 1.6. Ο ηφπμξ αοηυξ εεςνείηαζ υνβακμ ακαθμνάξ ζε μνζζιέκεξ πενζπηχζεζξ πμο απαζηείηαζ ορδθή δζαπςνζζηζηή ζηακυηδηα ( R ). Γοζηοπχξ θυβς ηαηαζηεοήξ ηα υνβακα αοηά είκαζ ζδζαζηένςξ αηνζαά ηαζ μβηχδδ [6]. Δπεζδή υθα ηα ζυκηα πμο έπμοκ ημκ ίδζμ θυβμ m/z δεκ έπμοκ ηδκ ίδζα ηζκδηζηή εκένβεζα αθθά αημθμοεμφκ ιζα εκενβεζαηή ηαηακμιή ηαηά Boltzmann, ελένπμκηαζ απυ ηδκ πδβή ιε δζαθμνεηζηέξ εκένβεζεξ ημ μπμίμ έπεζ επίπηςζδ ζηδκ εζηίαζδ ηδξ δέζιδξ ηαζ ζημ δζαπςνζζιυ ηςκ ζυκηςκ, δζυηζ δεκ οπάνπεζ ιμκμεκενβεζαηή δέζιδ ζυκηςκ. Ζ εθθάηςζδ ηδξ εκενβεζαηήξ δζαζπμνάξ ηςκ ζυκηςκ πνζκ ιπμοκ ζημ ιαβκδηζηυ πεδίμ επζηοβπάκεηαζ ιε υνβακα δζπθήξ εζηίαζδξ, υπμο έκα αηηζκςηυ δθεηηνμζηαηζηυ πεδίμ ζοθθέβεζ ιυκμ εηείκα ηα ζυκηα πμο έπμοκ ιζα μνζζιέκδ ηαπφηδηα ή ηζκδηζηή εκένβεζα [8,9]. 18

34 Σρήκα 1.6: Φαζκαηόκεηξν κάδαο κε αλαιπηή καγλεηηθνύ-ειεθηξνζηαηηθνύ πεδίνπ δηπιήο εζηίαζεο Αλαιπηέο Παγίδαο Ηόλησλ (Ion Trap) Ζ παβίδα ζυκηςκ θεζημονβεί ιε ηδ δδιζμονβία ηνζζδζάζηαημο πεδίμο ζημ μπμίμ παβζδεφμκηαζ ηα πνμζδζμνζγυιεκα ζυκηα ηαζ εζηζάγμκηαζ ζε έκα επίπεδμ. Σα ζυκηα μοζζαζηζηά πενζμνίγμκηαζ απυ δθεηηνμιαβκδηζηυ πεδίμ ηεζζάνςκ πυθςκ, δφμ διζηοθζκδνζηά δθεηηνυδζα (ring electrode) ηαζ δφμ εθάζιαηα (end cap). Σα εζζενπυιεκα ζυκηα ηοηθμθμνμφκ ζημκ ηνζζδζάζηαημ πχνμ πμο μνίγεηαζ απυ ηα ηέζζενα δθεηηνυδζα ηαζ εζηζάγμκηαζ ζημ επίπεδμ πμο μνίγεηαζ απυ ημκ ακζπκεοηή ηαζ ημ πθέβια ζμκηζζιμφ. ηδ ζοκέπεζα εθανιυγεηαζ δοκαιζηυ ναδζμζοπκυηδηαξ πμο αολάκεζ βναιιζηά πνμζθένμκηαξ αολακυιεκδ ηζκδηζηή εκένβεζα ζηα ζυκηα. Όθα ηα ζυκηα ημο ίδζμο θμνηίμο θαιαάκμοκ ηδκ ίδζα εκένβεζα, αθθά ζυκηα ιζηνμφ m/z επζηαπφκμκηαζ πενζζζυηενμ ζε ζπέζδ ιε ηα αανφηενα ζυκηα. Ωξ απμηέθεζια ηα ιζηνυηενα ζυκηα ανπίγμοκ κα λεθεφβμοκ απυ ηδκ παβίδα ηαζ κα μδδβμφκηαζ ζημκ ακζπκεοηή ηαζ αημθμοεμφκ ηα ιεβαθφηενα ζυκηα ακάθμβα ιε ηδ ιάγα ημοξ, υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 1.7 [6]. Οζ ακαθοηέξ αοημί είκαζ απθμφζηενμζ ηαζ θεδκυηενμζ απυ ηα υνβακα ιαβκδηζημφ ημιέα ή ηεηναπμθζημφ θίθηνμο ιάγαξ, αθθά πζμ εοαίζεδηα. Καθφπημοκ πενζμπέξ ιαγχκ απυ Da ηαζ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζοκήεςξ ζε ζοκδοαζιέκεξ ηεπκζηέξ GC-MS, LC-MS [8]. 19

35 Σρήκα 1.7: Σρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε αλαιπηή παγίδαο ηόλησλ Αλαιπηέο Υξόλνπ Πηήζεο (Time of Flight, TOF) ημοξ ακαθοηέξ αοημφξ, ιζα δθεηηνμιαβκδηζηή δφκαιδ επζαάθθεηαζ ζε υθα ηα ζυκηα πμο δδιζμονβμφκηαζ ιε παθιζηυ ζμκζζιυ, ζημκ ίδζμ πνυκμ ηαζ ηα ακαβηάγεζ κα επζηαποκεμφκ ηαζ κα δζαζπίζμοκ ιζα δεδμιέκδ απυζηαζδ d ιέζα ζε έκα ζςθήκα πςνίξ ηδκ φπανλδ δθεηηνμιαβκδηζηχκ πεδίςκ. Δθαθνφηενα ζυκηα ιεηαηζκμφκηαζ βνδβμνυηενα απ υηζ αανφηενα μπυηε θεάκμοκ κςνίηενα ζημκ ακζπκεοηή. Οζ πνυκμζ πηήζδξ ηςκ ζυκηςκ (t), ελανηχκηαζ απυ ηδ ιάγα ημοξ ηαζ πμζηίθθμοκ απυ 1 έςξ 30 ιs. Γζα ημκ δζαπςνζζιυ ιαγχκ ζφιθςκα ιε ημ πνυκμ πηήζδξ ημοξ ζζπφεζ δ ζπέζδ: ( ) (Δλίζςζδ 1.4) Όπμο m = ιάγα ημο ζυκημξ, z = θμνηίμ ημο ζυκημξ, t = πνυκμξ πηήζδξ ηαζ d = ιήημξ ζςθήκα εθεφεενδξ πηήζδξ. Οζ ακαθοηέξ TOF ζοβηαηαθέβμκηαζ ιεηαλφ ηςκ πζμ εοαίζεδηςκ. Έπμοκ ορδθή δζαηνζηζηή ζηακυηδηα ηαζ ιεβάθδ αηνίαεζα ιάγαξ. Σα ιεζμκεηηήιαηα ηςκ ακαθοηχκ αοηχκ είκαζ δ πενζμνζζιέκδ δοκαιζηή πενζμπή βζα πμζμηζηή ακάθοζδ ηαζ δ απαίηδζδ ορδθμφ ηεκμφ. (10-6 Torr) [6,8]. 20

36 Σρήκα 1.8: Σρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε αλαιπηή ρξόλνπ πηήζεο Τβξηδηθόο Αλαιπηήο Orbitrap O οανζδζηυξ ακαθοηήξ Orbitrap είκαζ ζοκδοαζιυξ βναιιζηήξ ηαζ δθεηηνμζηαηζηήξ παβίδαξ ζυκηςκ. Πνμζθένεζ ορδθή εοαζζεδζία, δζαπςνζζηζηή ζηακυηδηα, αηνίαεζα ιάγαξ, δοκαιζηυ εφνμξ ηαζ ορδθή ζηαεενυηδηα. Δίκαζ ζδακζηυξ βζα ακάθοζδ ιεηααμθζηχκ ηαζ άβκςζηςκ εκχζεςκ. H ανπή θεζημονβίαξ ημο οανζδζημφ ακαθοηή ιαγχκ είκαζ δ ελήξ: Σα ζυκηα ζοζζςνεφμκηαζ ζηδ βναιιζηή παβίδα ζυκηςκ (linear ion trap), επζηαπφκμκηαζ εοεφβναιια ηαζ μδδβμφκηαζ ζηδκ C-παβίδα ζυκηςκ (C-trap). ηδ ζοκέπεζα ζοιπζέγμκηαζ ζε έκα ιζηνυ κέθμξ ηαζ εζζένπμκηαζ ζημ Orbitrap. Σα ζοιιεηνζηά αλμκζηά δθεηηνυδζα ημο Orbitrap δδιζμονβμφκ έκα δθεηηνμζηαηζηυ δοκαιζηυ. Tα ζυκηα πναβιαημπμζμφκ πενζζηνμθζηή ηίκδζδ βφνς απυ ημ ηεκηνζηυ δθεηηνυδζμ ηαζ ηαοηυπνμκα ηαθάκηςζδ ζηδκ ηαηεφεοκζδ ημο άλμκα z. Σα ηαθακηεουιεκα ζυκηα πνμηαθμφκ έκα νεφια ημ μπμίμ ιπμνεί κα ακζπκεοηεί ιε έκακ δζαθμνμπμζδιέκμ εκζζποηή. Ηυκηα ζοβηεηνζιέκδξ ιάγαξ πανάβμοκ έκα ηοιαηζηυ ζήια. Πμθθά ζυκηα δζαθμνεηζηήξ ιάγαξ πανάβμοκ έκα ζφκεεημ ζήια ηςκ μπμίςκ μζ ζοπκυηδηεξ πνμζδζμνίγμκηαζ ιε ιεηαζπδιαηζζιμφξ fourier. Ο θυβμξ m/z ημο ηάεε ζυκημξ ζπεηίγεηαζ άιεζα ιε ηδ ζοπκυηδηα ηδξ ηαθάκηςζδξ (ς) ημο ζυκημξ. Ηυκηα ιε δζαθμνεηζηυ θυβμ m/z εα δζαθένμοκ ζηδκ πενζζηνμθή ηαζ ηδκ αλμκζηή ηαθάκηςζδ ιε απμηέθεζια κα πανάβμοκ ζπεηζηά δζαθμνμπμζδιέκα ηεθζηά ζήιαηα ζημκ εκζζποηή [16,17]. 21

37 Σρήκα 1.9 : Απεηθόληζε ηεο αξρήο ιεηηνπξγίαο ηνπ LTQ Orbitrap [17] Σεηξαπνιηθνί Αλαιπηέο (Quadrupole MS) Οζ ηεηναπμθζημί ακαθοηέξ είκαζ μζ πζμ δζαδεδμιέκμζ ακαθοηέξ ιαγχκ βζαηί πανμοζζάγμοκ ιζα ζεζνά απυ πθεμκεηηήιαηα: παιδθή ζπεηζηά ηζιή, ζοιπαβή ηαηαζηεοή, ιεβαθφηενεξ ακμπέξ, ηαπφηενδ ζάνςζδ (< 100 ms), δοκαηυηδηα ζοκδοαζιχκ ζε οανζδζηά υνβακα (υνβακα ιε άκς ημο εκυξ ακαθοηή ιαγχκ π.π. Q- ΣΟF) ηαζ ηέθμξ αιεζυηενδ ζοιααηυηδηα ιε πνςιαημβναθζηέξ ηεπκζηέξ. Ο ηεηναπμθζηυξ ακαθοηήξ θεζημονβεί ακάθμβα ιε ηα μπηζηά θίθηνα επζηνέπμκηαξ ζε ζυκηα ιίαξ ιυκμ ηζιήξ m/z κα πενάζμοκ ηαζ κα θηάζμοκ ζημκ ακζπκεοηή. Όθα ηα άθθα ζυκηα ελμοδεηενχκμκηαζ ηαζ απμιαηνφκμκηαζ. Γζα ημ θυβμ αοηυ μ ηεηναπμθζηυξ ακαθοηήξ απμηαθείηαζ ζοπκά ηαζ θίθηνμ ιαγχκ. Έκα απθμπμζδιέκμ δζάβναιια ηεηναπμθζημφ ακαθοηή δίκεηαζ ζημ ζπήια Σέζζενζξ ιεηαθθζηέξ ηοθζκδνζηέξ νάαδμζ (πυθμζ) ανίζημκηαζ θμνηζζιέκεξ ακά απέκακηζ γεφβδ ζημ ίδζμ ζοκεπέξ δθεηηνζηυ νεφια. ημ ζφζηδια εθανιυγεηαζ ιε δζαθμνά θάζδξ 180 ιμίνεξ εκαθθαζζυιεκμ νεφια ορδθήξ ζοπκυηδηαξ (ναδζμζοπκυηδηα). Σα ζυκηα εζζένπμκηαζ ζημ ηεηνάπμθμ ιεηά απυ επζηάποκζδ ζε δοκαιζηυ 5-15 V. Σρήκα 1.10: Σρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ηεηξαπνιηθνύ αλαιπηή [6]. 22

38 Ο ζοκδοαζιυξ ηδξ θεζημονβίαξ ηςκ ηεζζάνςκ πυθςκ επζηνέπεζ ζε ζυκηα ζοβηεηνζιέκμο ιυκμ m/z κα πενάζμοκ ημκ ακαθοηή ηαζ κα θηάζμοκ ζημκ ακζπκεοηή. Γζα ηδ ζάνςζδ ζε έκα ηεηναπμθζηυ ακαθοηή ηα δοκαιζηά ηςκ δφμ νεοιάηςκ (εκαθθαζζυιεκμο ηαζ ζοκεπμφξ) αολάκμκηαζ απυ ηζιή 0 έςξ ιζα ιέβζζηδ ηζιή, ιε ημ θυβμ ηςκ δφμ πενίπμο ζημ 6. Με ημκ ηνυπμ αοηυ ημ δοκαιζηυ ιεηααάθθεηαζ απυ 0 έςξ πενί ηα ±250 V βζα ημ ζοκεπέξ νεφια ηαζ απυ 0 έςξ ±1500 V βζα ημ εκαθθαζζυιεκμ. Ζ ζάνςζδ αοηή ηςκ δοκαιζηχκ επδνεάγεζ ηδκ ηίκδζδ ηςκ ζυκηςκ ιε ηνυπμ πμο μνίγεηαζ απυ πενίπθμηεξ δζαθμνζηέξ ελζζχζεζξ. Σα ζυκηα μοζζαζηζηά ηζκμφκηαζ δζαβνάθμκηαξ εθζημεζδείξ πμνείεξ ιέζα ζημ ηεηνάπμθμ. Ζ δζαπςνζζηζηή ζηακυηδηα ηέημζςκ μνβάκςκ θηάκεζ ηζξ 3.000, εκχ έπμοκ δοκαηυηδηα ακάθοζδξ ζυκηςκ ιε m/z έςξ ηζξ [6] Σξηπιό ηεηξάπνιν (QQQ) Σμ ηνζπθυ ηεηνάπμθμ είκαζ έκαξ ζοκδοαζιυξ ηνζχκ ηεηναπυθςκ, υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια Σνζπθά ηεηνάπμθα απακηχκηαζ ζοπκυηαηα, βζα ηδκ εηιεηάθθεοζδ ηςκ εεηζηχκ ζημζπείςκ ημο ηεηναπυθμο (ηαπεία ζάνςζδ, δοκαηυηδηα εθανιμβήξ θαζιαημιεηνίαξ ιαγχκ ζε ζεζνά/tandem MS). Όηακ ημ ηνζπθυ ηεηνάπμθμ θεζημονβεί ςξ απθυξ ακαθοηήξ νοειίγεηαζ χζηε δφμ ηεηνάπμθα κα ζοκεζζθένμοκ ιυκμ ζημκ εζηζαζιυ ηδξ δέζιδξ ηςκ ζυκηςκ (Q2 ηαζ Q3, ή Q1 ηαζ Q2, ακηίζημζπα) ηαζ μ δζαπςνζζιυξ κα βίκεηαζ ζημ ηνίημ ηεηνάπμθμ (ζημκ ηφπμ ζάνςζδξ Q1MS, ημ Q1 πνδζζιμπμζείηαζ ςξ μ ακαθοηήξ ιαγχκ, εκχ ζημκ ηφπμ ζάνςζδξ Q3MS, ημ Q3 πνδζζιμπμζείηαζ ςξ μ ακαθοηήξ ιαγχκ). Σρήκα Φαζκαηόκεηξν κάδαο κε αλαιπηή ηξηπιό ηεηξάπνιν. 23

39 Ζ ιεβάθδ πνδζζιυηδηα ημο ζοζηήιαημξ έβηεζηαζ ζηδ δοκαηυηδηα ηδξ δζαδμπζηήξ θαζιαημιεηνίαξ ιαγχκ MS-MS. Ανπζηά επζθέβεηαζ ζημ πνχημ ηεηνάπμθμ (Q1) ιυκμ έκα ζυκ. ηδ ζοκέπεζα ημ ιδηνζηυ ζυκ μδδβείηαζ ζημ δεφηενμ ηεηνάπμθμ (Q2), υπμο ζοβηνμφεηαζ ιε πενίζζεζα εκυξ αδνακμφξ αενίμο (ανβυ ή ήθζμ) ηαζ δζαζπάηαζ πανάβμκηαξ εοβαηνζηά ζυκηα. Σμ δεφηενμ ηεηνάπμθμ (Q2) απμηεθεί ηδκ ηορεθίδα ζοβηνμφζεςκ (collision cell) ηαζ θεζημονβεί ςξ πχνμξ εναοζιαημπμίδζδξ ημο ιδηνζημφ ζυκημξ. Ο δζαπςνζζιυξ ηαζ δ ιέηνδζδ ηςκ εοβαηνζηχκ ζυκηςκ πναβιαημπμζείηαζ ζημ ηνίημ ηεηνάπμθμ (Q3) [18] Σερληθέο άξσζεο Ζ παναημθμφεδζδ ηςκ ζυκηςκ ιπμνεί κα πναβιαημπμζδεεί ιε δζάθμνμοξ ηφπμοξ ζάνςζδξ (ζπήια 1.12): ηδκ πθήνδ ζάνςζδ (Full Scan), ηδκ παναημθμφεδζδ επζθεβιέκμο ζυκημξ (Single Ion Monitoring-SIM), ηδκ παναημθμφεδζδ επζθεβιέκδξ ακηίδναζδξ (Selected Reaction Monitoring-SRM ή Multiple Reaction Monitoring- MRM), ηδ ζάνςζδ εοβαηνζηχκ ζυκηςκ (Product Ion Scanning) ηαζ ηδ ζάνςζδ ιδηνζημφ ζυκημξ (Precursor Ion Scanning). ημ ζπήια 1.9 απεζημκίγμκηαζ μζ δζάθμνμζ ηφπμζ ζάνςζδξ. Ο ηφπμξ πθήνμοξ ζάνςζδξ πανέπεζ έκα θάζια πθήνμοξ ζάνςζδξ βζα ηάεε μοζία. Ζ πθήνδξ ζάνςζδ αμδεάεζ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ηαοηυηδηαξ ιζαξ άβκςζηδξ μοζίαξ (πνμζδζμνζζιυ ιμνζαημφ αάνμοξ). Μπμνεί κα δχζεζ πενζζζυηενεξ πθδνμθμνίεξ απυ άθθμοξ ηφπμοξ ζάνςζδξ, αθθά οζηενεί ζε εοαζζεδζία ηαζ δεκ εοκμεί ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ηδξ μοζίαξ. ημκ ηφπμ SIM παναημθμοεείηαζ έκα ζοβηεηνζιέκμ ζυκ ή μιάδα ζυκηςκ. Δίκαζ απμηεθεζιαηζηυξ ζηδκ ακίπκεοζδ ιζηνχκ πμζμηήηςκ (ζε ίπκδ) ιζαξ βκςζηήξ μοζίαξ ζε πμθφπθμηα ιίβιαηα υηακ ημ θάζια ιαγχκ ηδξ μοζίαξ είκαζ βκςζηυ. Δπεζδή παναημθμοεμφκηαζ ζοβηεηνζιέκα ζυκηα ιπμνμφκ κα επζηεοπεμφκ παιδθυηενα υνζα ακίπκεοζδξ ηαζ ιεβαθφηενεξ ηαπφηδηεξ ζάνςζδξ απυ ημκ ηφπμ ηδξ πθήνμοξ ζάνςζδξ. Όιςξ εκδέπεηαζ κα ιεζςεεί δ εηθεηηζηυηδηα, δζυηζ μπμζαδήπμηε μοζία δίκεζ ημ ζοβηεηνζιέκμ ζυκ εα ειθακζζηεί ςξ δ μοζία ζηυπμξ μδδβχκηαξ ζε ρεοδχξ εεηζηά απμηεθέζιαηα. ημκ ηφπμ SRM (ή MRM) παναημθμοεείηαζ ιζα ζοβηεηνζιέκδ ακηίδναζδ ή μιάδα ακηζδνάζεςκ, υπςξ δ ακηίδναζδ εναοζιαημπμίδζδξ εκυξ ζυκημξ. ηδκ πενίπηςζδ αοηή παναημθμοεείηαζ ζοβηεηνζιέκμξ ανζειυξ ιδηνζηχκ/εοβαηνζηχκ ζυκηςκ, επζηνέπμκηαξ βνήβμνδ ζάνςζδ ηαζ ορδθή εηθεηηζηυηδηα. Οπμζαδήπμηε πανειπμδίγμοζα μοζία εα πνέπεζ κα ζπδιαηίζεζ υπζ ιυκμ έκα ιδηνζηυ ζυκ ημο ίδζμο θυβμο m/z ιε ηδκ μοζία ζηυπμ, αθθά εα πνέπεζ κα δζαζπαζηεί ηαζ κα ζπδιαηίζεζ ηαζ ηα ίδζα εοβαηνζηά ζυκηα. Δπίζδξ, ημ οπυααενμ εμνφαμο είκαζ πμθφ παιδθυ, άνα έκα 24

40 ζοβηεηνζιέκμ ζήια ακηζζημζπεί ζε πμθφ ορδθυηενδ ακζπκεοζζιυηδηα, αολάκμκηαξ ζδζαίηενα ηδκ εοαζζεδζία ηδξ ιεευδμο. Ζ ζάνςζδ εοβαηνζηχκ ζυκηςκ πναβιαημπμζείηαζ ζε δφμ ζηάδζα ακάθοζδξ. ημ πνχημ ζηάδζμ, ζυκηα ιε ζοβηεηνζιέκμ θυβμ m/z εζζένπμκηαζ ζημ ηεηνάπμθμ Q1. ηδ ζοκέπεζα, ηα επζθεβιέκα ζυκηα m/z εζζένπμκηαζ ζημ ηεηνάπμθμ Q2, υπμο οπυηεζκηαζ ζε δζάζπαζδ ζπδιαηίγμκηαξ εοβαηνζηά ζυκηα. Σα εοβαηνζηά ζυκηα ιπμνμφκ κα παναπεμφκ ιε απμζφκεεζδ ιεηαζηαεχκ ζυκηςκ ή ιε αθθδθεπζδνάζεζξ ιε αένζμ ανβυ. Σα ζπδιαηζγυιεκα ζυκηα εζζένπμκηαζ ζημ ηεηνάπμθμ Q3 βζα ημ δεφηενμ ζηάδζμ ακάθοζδξ. Σμ θάζια ιαγχκ πμο πνμηφπηεζ δείπκεζ ηα εοβαηνζηά ζυκηα πμο πανήπεδζακ απυ ηδ εναοζιαημπμίδζδ ημο επζθεβιέκμο ιδηνζημφ ζυκημξ. Ο ηφπμξ αοηυξ ζάνςζδξ πανέπεζ πθδνμθμνίεξ βζα ηδ δμιή ιζαξ μοζίαξ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ελέηαζδ πμθφπθμηςκ μνβακζηχκ ιζβιάηςκ (π.π. αζμθμβζηά δείβιαηα) οζηενεί υιςξ θυβς ηδξ ανβήξ ζάνςζδξ, ιε απμηέθεζια κα ιδκ εοκμείηαζ δ εθανιμβή ημο ζε πμζμηζηέξ ακαθφζεζξ. Ζ ζάνςζδ ιδηνζημφ ζυκημξ πναβιαημπμζείηαζ ζε δφμ ζηάδζα ακάθοζδξ. ημ πνχημ ζηάδζμ, ηα ζυκηα πμο πανάβμκηαζ ζηδκ πδβή εζζένπμκηαζ ζημ ηεηνάπμθμ Q1 πμο θεζημονβεί ζε ζάνςζδ. ηδ ζοκέπεζα, ηα ζυκηα εζζένπμκηαζ ζημ ηεηνάπμθμ Q2, υπμο οπυηεζκηαζ ζε δζάζπαζδ ζπδιαηίγμκηαξ εοβαηνζηά ζυκηα. Σμ ηεηνάπμθμ Q3 ζημ δεφηενμ ζηάδζμ ακάθοζδξ επζηνέπεζ ιυκμ ζε εοβαηνζηά ζοβηεηνζιέκμο θυβμο m/z κα ελέθεμοκ απυ ημκ ακζπκεοηή. Σμ θάζια ιαγχκ πμο πνμηφπηεζ δείπκεζ ηα ιδηνζηά ζυκηα πμο δζαζπάζηδηακ βζα ηδκ παναβςβή ημο επζθεβιέκμο εοβαηνζημφ ζυκημξ. Ο ηφπμξ αοηυξ ζάνςζδξ ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ιεθέηεξ ζπεηζηά ιε ηδ δμιή ηαζ ηδ εναοζιαημπμίδζδ ιζαξ μοζίαξ [3,18]. 25

41 Σρήκα 1.12: Απεηθόληζε ησλ δηαθόξσλ ηύπσλ ζάξσζεο [18]. 26

42 1.7 ΑΝΗΥΝΔΤΣΔ ΣΖ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΧΝ Ο ακζπκεοηήξ πανάβεζ ζηδκ έλμδυ ημο δθεηηνζηυ ζήια (ζοκήεςξ δθεηηνζηυ νεφια) ακάθμβμ ημο ανζειμφ ζυκηςκ ηαζ ημο θμνηίμο ημοξ, πμο δέπεηαζ ζηδκ είζμδυ ημο ζηδ πνμκζηή ιμκάδα [7]. Σφπμζ ακζπκεοηχκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ θαζιαημιεηνία ιαγχκ είκαζ: Φαξαληατθό Κύπειιν (Faraday Cup) Ζ απθμφζηενδ ιμνθή ακζπκεοηή είκαζ ιία θςημβναθζηή πθάηα ή έκα ηφπεθθμ Faraday. ημ ηφπεθθμ Faraday ημ δθεηηνζηυ νεφια πανάβεηαζ υηακ έκα ζυκ πηοπήζεζ ηδκ επζθάκεζα ιίαξ δοκυδμο, εηπέιπμκηαξ έηζζ δθεηηνυκζα. Ο ζοβηεηνζιέκμξ ηφπμξ ακζπκεοηή είκαζ βεκζηά παιδθήξ εοαζζεδζίαξ [19]. Σρήκα 1.13: Κύπειιν Faraday [19] Ζιεθηξνληνπνιιαπιαζηαζηήο (Electron Multiplier) Δίκαζ δ πζμ ζοπκά απακηχιεκδ δζάηαλδ ακίπκεοζδξ ζημ θαζιαηυιεηνμ ιαγχκ. Απμηεθείηαζ απυ βοάθζκμ ή ιεηαθθζηυ ζςθήκα ιε ιεηαθθζηή επίζηνςζδ πμο πανμοζζάγεζ παιδθή δθεηηνζηή αβςβζιυηδηα. Δθανιυγεηαζ δζαθμνά δοκαιζημφ ζηα δφμ άηνα έηζζ χζηε κα ειθακίγεηαζ βναιιζηή ιεηααμθή ημο δοκαιζημφ ηαηά ιήημξ ημο ζςθήκα. Ζ ηάεμδμξ ηαθφπηεηαζ απυ επζθάκεζα Cu/Be απυ υπμο ιε ζφβηνμοζδ ζυκημξ αημθμοεεί εηπμιπή δθεηηνμκίςκ. Αημθμοεχκηαξ ηδκ ανπζηή ζφβηνμοζδ ηςκ ζυκηςκ, δ δέζιδ ηςκ δθεηηνμκίςκ πμο έπεζ δζαθφβεζ, πνμζπίπηεζ ζημ απέκακηζ εζςηενζηυ πθεονυ ημο ζςθήκα ηαζ εηπέιπεζ πενζζζυηενα δθεηηνυκζα ιε ηάεε ηνμφζδ. Σέημζεξ δζαηάλεζξ επζηοβπάκμοκ πμθθαπθαζζαζιυ ηδξ δέζιδξ (άνα ηαζ ηδξ έκηαζδξ ημο ζήιαημξ) ηαηά [6]. Σρήκα 1.14: Ηιεθηξνληνπνιιαπιαζηαζηήο [19] 27

43 1.8 ΤΣΖΜΑ ΚΔΝΟΤ Ζ θεζημονβία ηςκ θαζιαημιέηνςκ ιαγχκ πνμτπμεέηεζ ηδ ζοκεπή θεζημονβία ζοζηήιαημξ παναβςβήξ ορδθμφ ηεκμφ ζηδκ πενζμπή Torr, μπυηε δδιζμονβείηαζ επανηήξ πμζυηδηα αηιχκ βζα ηδ θήρδ ημο θάζιαημξ. Ζ παναιζηνή δζαννμή αηιμζθαζνζημφ αένα π.π. ζηδκ πδβή ζυκηςκ, εα έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ ιείςζδ ηδξ παναβςβήξ ζυκηςκ ηδξ ελεηαγυιεκδξ έκςζδξ ηαζ ηδκ ειθάκζζδ ζδιάηςκ πμο ακηζζημζπμφκ ζημκ ζμκζζιυ ηςκ ζοζηαηζηχκ ηδξ αηιυζθαζναξ. ηα πενζζζυηενα θαζιαηυιεηνα ιαγχκ ημ ηεκυ επζηοβπάκεηαζ ιε ζοκδοαζιυ ακηθζχκ. Πενζζηνμθζηέξ ακηθίεξ ιεζχκμοκ ανπζηά ηδκ πίεζδ ζηα 10-3 Torr ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ακαθαιαάκμοκ ακηθίεξ δζάποζδξ εθαίμο. ηα ζφβπνμκα θαζιαηυιεηνα ιαγχκ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηνμαζθμιμνζαηέξ ακηθίεξ, πμο θεζημονβμφκ πςνίξ οβνά [18]. 1.9 ΤΕΔΤΞΖ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΧΝ ΜΔ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΚΔ ΣΔΥΝΗΚΔ Ζ πνήζδ ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιαγχκ ςξ ηεπκζηή ακίπκεοζδξ βζα πνςιαημβναθζημφξ δζαπςνζζιμφξ πνμζθένεζ εζδζηα πθεμκεηηήιαηα, ημ ηονζυηενμ απμ ηα μπμία είκαζ δ πανμπή ιμκαδζηχκ πθδνμθμνζχκ ζπεηζηχκ ιε ηδ πδιζηή ζφζηαζδ ημο ακαθφηδ. Σα θαζιαηυιεηνα ιαγχκ επζδεζηκφμοκ ορδθή εοαζζεδζία βζα πηδηζηά ζοζηαηζηά ηαζ επεζδή πνυηεζηαζ βζα ακζπκεοηέξ εοαίζεδημοξ ζηδ νμή ιάγαξ, δ απυηνζζή ημοξ ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα πμζμηζημφξ ζημπμφξ. Οζ πνχηεξ εθανιμβέξ αένζαξ πνςιαημβναθίαξ θαζιαημιεηνίαξ ιαγχκ πναβιαημπμζήεδηακ ζηα ηέθδ ημο Οζ πνχηεξ πναηηζηά εθανιυζζιεξ δζαζοκδέζεζξ GC-MS έβζκακ ιε πνήζδ ακαθοηχκ πνυκμο πηήζδξ. Ζ ζφγεολδ ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιαγχκ ιε οβνή πνςιαημβναθία ήηακ βζα πμθθά πνυκζα ημ ακηζηείιεκμ ηδξ ένεοκαξ, ηυζμ απυ ηδκ πθεονά ηδξ πνςιαημβναθίαξ, υζμ ηαζ απυ ηδκ πθεονά ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιαγχκ. Απυ ηδκ πθεονά ηδξ πνςιαημβναθίαξ ηα ιεβάθα ηένδδ απυ ηδ ζφγεολδ (ζζπφμοκ ηαζ βζα ημ GC-MS) είκαζ: i. Ζ εθανιμβή εκυξ μθζημφ ακζπκεοηή (universal detector). ii. Ζ ιεβάθδ εοαζζεδζία ηδξ ηεπκζηήξ. iii. Ζ ιεβάθδ εηθεηηζηυηδηα ηδξ ιεευδμο (απυθοηδ ηαοημπμίδζδ). iv. H δοκαηυηδηα ηαοημπμίδζδξ αβκχζηςκ εκχζεςκ ζε άβκςζηα δείβιαηα. Απυ ηδκ πθεονά ηδξ θαζιαημιεηνίαξ ιαγχκ ηα ηένδδ είκαζ: i. H άιεζδ εζζαβςβή ιδ πηδηζηχκ εκχζεςκ πςνίξ ηδκ ακάβηδ ηνμπμπμίδζδξ ημο ιμνίμο ηδξ πνμζδζμνζγυιεκδξ έκςζδξ. 28

44 ii. Ζ εηιεηάθθεοζδ ηδξ ορδθήξ δζαπςνζζηζηήξ ζηακυηδηαξ ηδξ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ. iii. Ο πενζμνζζιυξ ακεπζεφιδηςκ θαζκμιέκςκ (π.π. ιείςζδ ηδξ απυδμζδξ ζμκζζιμφ θυβς ηδξ επίδναζδξ οπμζηνχιαημξ) θυβς ηδξ ηθαζιαημπμίδζδξ πενίπθμηςκ δεζβιάηςκ. Σμ εφνμξ ηςκ ζοζηαηζηχκ πμο ιπμνμφκ κα ακαθοεμφκ ιε LC, πενζθαιαακμιέκςκ εενιμεοαίζεδηςκ ηαζ ιδ πηδηζηχκ μοζζχκ, πμο δε ιπμνμφζακ κα ακαθοεμφκ ιε GC, έηακε αζζεδηή ηδκ ακαβηδ δζαζφκδεζδξ ηδξ LC ιε ηδκ MS. Χζηυζμ, πανα ημ βεβμκυξ υηζ δ LC είκαζ παθαζυηενδ ηεπκζηή απυ ηδκ GC, μζ πνχηεξ πναηηζηέξ εθανιμβέξ LC- MS επεηεφπεδζακ ηδ δεηαεηία ημο Σα ηεπκζηα πνμαθήιαηα πμο ακαηφπημοκ απυ ηδκ εζζαβςβή οβνχκ ζε εκα ζφζηδια ορδθμο ηεκμφ, ήηακ μζ ηφνζμζ θμβμζ αοηήξ ηδξ ηαεοζηένδζδξ. Ζ ζφγεολδ ιε οβνή πνςιαημβναθία απαζηεί ηδ πνήζδ δζάηαλδξ ζφγεολδξ (interface) αθμφ μοζζαζηζηά ημ γδημφιεκμ είκαζ δ ζφγεολδ δφμ αζφιααηςκ ηεπκζηχκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ έπμοκ ακαπηοπεεί πμθθέξ δζαθμνεηζηέξ δζαηάλεζξ ζφγεολδξ ιενζηέξ απυ ηζξ μπμίεξ θεζημονβμφκ ιε ηεθείςξ δζαθμνεηζηέξ ανπέξ δ ιζα απυ ηδκ άθθδ. Ονζζιέκεξ ιυκμ απυ αοηέξ έπμοκ θηάζεζ ζηδκ αβμνά, ελμπθίγμκηαξ υνβακα. Απυ ηδκ πθεζάδα ηςκ δζαηάλεςκ ζφγεολδξ πμο έπμοκ ακαπηοπεεί, ηα πζμ ζδιακηζηά επζηεφβιαηα εεςνμφκηαζ αοηά πμο επζηοβπάκμοκ ζμκζζιυ ζε ήπζεξ ζοκεήηεξ ηαζ οπυ αηιμζθαζνζηή πίεζδ. Σμ πζμ εονέςξ πνδζζιμπμζμφιεκμ interface είκαζ μ ρεηαζιυξ ζε δοκαιζηυ (electrospray). Ζ πνήζδ αοημφ έπεζ ηάκεζ δοκαηή ηδκ ακάθοζδ ιεβάθμο ανζειμφ μνβακζηχκ εκχζεςκ ιε ιμνζαηυ αάνμξ έςξ dalton, ζε αζμθμβζηά δείβιαηα, ηνυθζια ηαζ άθθα πενίπθμηα δείβιαηα. Ο ζοκδοαζιυξ GC-MS είκαζ ημ υνβακμ ακαθμνάξ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ πμθθχκ πηδηζηχκ-διζπηδηζηχκ εκχζεςκ, εκχ μ ζοκδοαζιυξ LC-MS είκαζ ημ υνβακμ ακαθμνάξ βζα ηδκ ακάθοζδ ηςκ οπμθμίπςκ ηάλεςκ εκχζεςκ (ιεβαθμιυνζα, ιδ πηδηζηέξ, εενιμεοαίζεδηεξ εκχζεζξ). Ζ εθανιμβή GC-MS θυβς ηδξ απθυηδηαξ ηαζ αιεζυηδηάξ ηδξ έπεζ πμθφ ιζηνυηενμ ηυζημξ, ιεβαθφηενδ αιεζυηδηα, εοημθία ηαζ ακημπή ζε ζπέζδ ιε ηδ ζφγεολδ LC-MS. Ζ ηεπκζηή GC-MS ανίζηεζ εηηεηαιέκδ εθανιμβή ζηδκ ακάθοζδ μνβακζηχκ εκχζεςκ: πεηνεθαζμεζδχκ, αζεένζςκ εθαίςκ, γζγακζμηηυκςκ, θανιάηςκ, κανηςηζηχκ ηαζ βεκζηυηενα ζε ιζα ιεβάθδ ζεζνά πδιζηχκ εκχζεςκ. Πμθφ ζοπκά εεςνείηαζ απαναίηδηδ δ ακάθοζδ ιε GC-MS βζα ηδκ απυθοηδ ηαοημπμίδζδ ιζαξ έκςζδξ ζε άβκςζηα δείβιαηα (ημλζημθμβζηή ακάθοζδ, ιέηνδζδ νφπςκ ζε πενζααθθμκηζηά δείβιαηα, ακάθοζδ ηνμθίιςκ ηθπ). Ζ ζφγεολδ ιε οβνή πνςιαημβναθία (LC-MS) εθανιυγεηαζ ζηζξ πενζπηχζεζξ πμο απαζηείηαζ μ πνμζδζμνζζιυξ εκχζεςκ, ηςκ μπμίςκ μ πνμζδζμνζζιυξ δεκ είκαζ εθζηηυξ ιε GC, π.π. εκχζεςκ πμο είηε δεκ είκαζ πηδηζηέξ, είηε δζαζπχκηαζ ζε αολδιέκδ εενιμηναζία. ηδκ ηαηδβμνία αοηή μοζζαζηζηά εκηάζζεηαζ δ πθεζμρδθία ηςκ αζμθμβζηά δναζηζηχκ εκχζεςκ, βζ αοηυ ημ θυβμ ηαζ δ επίηεολδ ηδξ δφζημθδξ αοηήξ ζφγεολδξ αμήεδζε ηα ιέβζζηα ηδκ ένεοκα ζηζξ αζμθμβζηέξ επζζηήιεξ. Ζ ηεπκζηή 29

45 εεςνείηαζ πζα απαναίηδημ ενβαθείμ ζε ιεβάθδ ζεζνά ακαθοηζηχκ ενβαζζχκ ηαζ απακηάηαζ ζε πμθθά ενβαζηήνζα: θανιαηεοηζηήξ ακάθοζδξ, αζμακάθοζδξ, εθέβπμο ηνμθίιςκ, αζμηεπκμθμβίαξ, πμθοιενχκ η.θ.π. [3,6,7]. 30

46 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 2 Ο : ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΠΔΡ-ΤΦΖΛΖ ΠΗΔΖ 2.1 ΗΣΟΡΗΚΑ ΣΟΗΥΔΗΑ Ζ οβνή πνςιαημβναθία (Liquid Chromatography LC) είκαζ ιζα ηεπκζηή δζαπςνζζιμφ δ μπμία εθεονέεδηε ζηζξ ανπέξ ημο 20μο αζχκα απυ ημ Ρχζμ αμηακμθυβμ Mikhail Tswett, ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ένεοκάξ ημο ζπεηζηά ιε ηζξ πνςζηζηέξ μοζίεξ ηςκ θοηχκ [20]. Ο Tswett πνδζζιμπμίδζε πνςιαημβναθζηή ζηήθδ ιε ακεναηζηυ αζαέζηζμ ςξ πθδνςηζηυ οθζηυ ηαζ έκα ιίβια πεηνεθασημφ αζεένα ηαζ αζεακυθδξ ςξ εηθμοζηζηυ βζα ημ δζαπςνζζιυ πθςνμθοθθχκ ηαζ ηανμηεκμεζδχκ [21]. Με ηδ πνήζδ απμθζηχκ δζαθοηχκ έηθμοζδξ, μζ δζαπςνζγυιεκεξ μοζίεξ ειθακίγμκηακ ςξ έβπνςιεξ γχκεξ ηαζ αοηυξ ήηακ μ θυβμξ βζα ημκ μπμίμ μ Tswett επέθελε ημ παναηηδνζζηζηυ αοηυ υκμια βζα ηδκ ηεπκζηή (απυ ηζξ Δθθδκζηέξ θέλεζξ πνχια ηαζ βνάθς) [20]. Ζ πεζναιαηζηή αοηή δζαδζηαζία, απμηέθεζε ηδ αάζδ βζα ηδκ αθιαηχδδ ελέθζλδ ηδξ πνςιαημβναθίαξ ημκ επυιεκμ αζχκα [21]. Πανυθμ πμο ημ ένβμ ημο Tswett αβκμήεδηε επί πμθθέξ δεηαεηίεξ, ακααίςζε δέηα πνυκζα ιεηά ημ εάκαημ ημο πάνδ ζημ Γενιακυ επζζηήιμκα Edgar Lederer, ημκ Αοζηνζαηυ αζμπδιζηυ Richard Kuhn ηαζ ημ ένβμ ηςκ Martin ηαζ Synge, μζ μπμίμζ ιάθζζηα πήνακ ημ ανααείμ Nobel Υδιείαξ βζα ηζξ ακαηαθφρεζξ ημοξ ζημ πεδίμ ηδξ πνςιαημβναθίαξ. Οζ ηεθεοηαίμζ ηαηά ηδ δεηαεηία ημο 40 έεεζακ μοζζαζηζηά ηζξ ανπέξ ηαζ ηζξ ααζζηέξ ηεπκζηέξ ηδξ πνςιαημβναθίαξ ηαηακμιήξ ηαζ ημ ένβμ ημοξ εκεάννοκε ηδκ ηαπεία ακάπηολδ ηςκ δζαθυνςκ ηφπςκ πνςιαημβναθίαξ, υπςξ δ πνςιαημβναθία επί πάνημο, δ αένζα πνςιαημβναθία ηαζ αοηή πμο εα βζκυηακ ανβυηενα βκςζηή ςξ οβνή πνςιαημβναθίαξ ορδθήξ πίεζδξ (HPLC) [20]. ημ ηέθμξ ηδξ δεηαεηίαξ ημο 1960 ακαπηφπεδηε δ ηεπκμθμβία παναβςβήξ ηαζ πνήζδξ πθδνςηζηχκ οθζηχκ ιε ζςιαηίδζα δζαιέηνμο απυ 3 έςξ 10 ιm. Ζ ηεπκμθμβία αοηή απαζημφζε ελεθζβιέκα υνβακα, ιε δοκαηυηδηα θεζημονβίαξ ζε ορδθέξ πζέζεζξ πμο δεκ ήηακ δοκαηυκ κα επζηεοπεεί ιε ηζξ ηθαζζηέξ βοάθζκεξ ζηήθεξ ηαζ ιε αανοηζηή νμή. Ζ μκμιαζία οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ πίεζδξ πνδζζιμπμζήεδηε βζα κα δζαηνίκεζ ηζξ κευηενεξ αοηέξ ηεπκζηέξ απυ ηζξ παθαζυηενεξ. Οζ εθανιμβέξ ηδξ πνςιαημβναθίαξ αολήεδηακ ιε εκηοπςζζαηυ νοειυ ηα ηεθεοηαία πεκήκηα πνυκζα ηαζ αοηυ μθείθεηαζ ηυζμ ζηδκ ακάπηολδ κέςκ πνςιαημβναθζηχκ ηεπκζηχκ υζμ ηαζ ζηδκ μθμέκα ηαζ αολακυιεκδ απαίηδζδ βζα ακάπηολδ κέςκ ηαζ πζμ απμηεθεζιαηζηχκ ιεευδςκ βζα ημ δζαπςνζζιυ ηαζ ηδκ ηαοημπμίδζδ πμθφπθμηςκ ιζβιάηςκ [22]. 31

47 2.2 ΓΔΝΗΚΑ ΓΗΑ ΣΖΝ ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ Όθμζ μζ πνςιαημβναθζημί δζαπςνζζιμί έπμοκ ηδκ ίδζα ααζζηή ανπή: ηαηά ημ πνςιαημβναθζηυ δζαπςνζζιυ, ηάεε έκςζδ αθθδθεπζδνά ιε ηα δζάθμνα πδιζηά είδδ ημο ζοζηήιαημξ ιε ηάπμζμκ παναηηδνζζηζηυ ηνυπμ. Ζ πνςιαημβναθία θμζπυκ, δνά δζαπςνίγμκηαξ ηα ζοζηαηζηά εκυξ δείβιαημξ αάζδ ηδξ δζαθμνεηζηήξ αθθδθεπίδναζδξ πμο έπεζ ημ ηαεέκα απυ αοηά ιε ηδκ ηζκδηή ηαζ ηδ ζηαηζηή θάζδ [21]. ηδκ οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ πίεζδξ ημ δείβια εζζάβεηαζ ζηδκ ημνοθή ηδξ ζηήθδξ ηαζ ιε ηδ αμήεεζα ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ ηα ζοζηαηζηά ημο ιεηαηζκμφκηαζ ιε ηδ ιμνθή γςκχκ ηαζ ηεθζηά εηθμφμκηαζ ημ έκα ιεηά ημ άθθμ. Οζ εκχζεζξ πμο ακαθφμκηαζ ηαηακέιμκηαζ ιεηαλφ ηδξ ζηαηζηήξ ηαζ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ ιε απμηέθεζια κα ιεηαηζκμφκηαζ ιε δζαθμνεηζηέξ ηαπφηδηεξ ηαηά ιήημξ ηδξ ζηήθδξ. ηδκ οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ πίεζδξ είκαζ δοκαηή δ πνήζδ ιίβιαημξ δζαθοηχκ ηαεχξ ηαζ δ ααειζαία ιεηααμθή ηδξ ζφζηαζδξ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ. Σέθμξ είκαζ δοκαηή δ πνδζζιμπμίδζδ ακαθοηζηχκ ζηδθχκ ζε ζεζνά, χζηε κα επζηοβπάκεηαζ ηαθφηενμξ δζαπςνζζιυξ ηςκ ζοζηαηζηχκ εκυξ ιίβιαημξ. [23]. Ζ οβνή πνςιαημβναθία οπεν-ορδθήξ πίεζδξ (UPLC) είκαζ ιζα ηεπκζηή ακαθοηζηήξ πδιείαξ, δ μπμία πνδζζιμπμζείηαζ ζημ δζαπςνζζιυ εκυξ ιίβιαημξ ζηα ζοζηαηζηά ημο, ηαεχξ ηαζ ζημκ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ημοξ. Βαζίγεηαζ ζε ακηθίεξ, μζ μπμίεξ ζοιπζέγμοκ ημοξ δζαθφηεξ έηθμοζδξ ηςκ ζοζηαηζηχκ (ηζκδηή θάζδ) ιέζα απυ ιζα ζηήθδ δ μπμία έπεζ πθδνςεεί ιε ηαηάθθδθμ πνμζνμθδηζηυ (ζηαηζηή θάζδ). Ζ UPLC δζαθένεζ απυ ηδκ οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ πίεζδξ (HPLC) ζημ ιέβεεμξ ηςκ ζςιαηζδίςκ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ (<2ιm) ηαεχξ ηαζ ζημ υηζ εθανιυγμκηαζ ορδθυηενεξ πζέζεζξ ηαζ ιεβαθφηενεξ νμέξ ηζκδηήξ θάζδξ. [24]. Ο πνυκμξ ακάθοζδξ ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ορδθήξ πίεζδξ είκαζ ζοκήεςξ ιζηνυξ, ηδξ ηάλδξ ηςκ ιενζηχκ θεπηχκ, εκχ δ αηνίαεζα ηαζ δ επακαθδρζιυηδηά ηδξ είκαζ πμθφ ηαθέξ. Γεκζηά δ HPLC είκαζ ιζα εοαίζεδηδ, πμζμηζηή ηαζ πμζμηζηή ακαθοηζηή ηεπκζηή πμο οπενέπεζ ζε ζπέζδ ιε ηζξ οπυθμζπεξ πνςιαημβναθζηέξ ηεπκζηέξ [23]. H οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ πίεζδξ είκαζ ζήιενα δ πζμ δζαδεδμιέκδ απυ υθεξ ηζξ ακαθοηζηέξ ηεπκζηέξ δζαπςνζζιμφ. Οζ ηφνζμζ θυβμζ βζα ηδκ ηυζμ εονεία απμδμπή ηδξ, είκαζ δ εοαζζεδζία ηδξ, δ εφημθδ πνμζανιμβή ηδξ ζε πμζμηζημφξ πνμζδζμνζζιμφξ, δ ηαηαθθδθυηδηα ηδξ βζα δζαπςνζζιμφξ εκχζεςκ πμο έπμοκ επζζηδιμκζηυ εκδζαθένμκ, υπςξ βζα πανάδεζβια ηα αιζκμλέα μζ πνςηεΐκεξ, ηα ααναζημονζηά, μζ ηαηεπμθαιίκεξ, μζ αζηαιζκέξ, μζ πνςηεΐκεξ, μζ πνμζηαβθακδίκεξ, ηα εκγοια, ηα κμοηθεσηά μλέα, μζ οδνμβμκάκεναηεξ, μζ οδαηάκεναηεξ, ηα θανιαηεοηζηά, ηα ηενπεκμεζδή, ηα θοημθάνιαηα, ηα ακηζαζμηζηά, ηα ζηενμεζδή, μζ μνβακμιεηαθθζηέξ εκχζεζξ ηαζ έκα πθήεμξ ακυνβακςκ εκχζεςκ [22]. 32

48 2.3 ΜΖΥΑΝΗΜΟΗ ΓΗΑΥΧΡΗΜΟΤ ΚΑΗ ΔΗΓΖ ΣΖΝ ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ Όπςξ ακαθένεδηε, ηάεε πνςιαημβναθζηή ηεπκζηή πενζθαιαάκεζ ιία ηζκδηή θάζδ (mobile phase), δ μπμία νέεζ ιεηαθένμκηαξ ηζξ δζαπςνζγυιεκεξ μοζίεξ ζοζηαηζηά εκυξ ιίβιαημξ- ιέζς ιίαξ ζηαηζηήξ θάζδξ (static phase). Ζ ηζκδηή θάζδ απμηεθείηαζ απυ έκα δζαθφηδ ή ζφζηδια δζαθοηχκ, εκχ δ ζηαηζηή θάζδ απυ πμνχδεξ ζηενευ οθζηυ ή απυ οβνυ ηαεδθςιέκμ ζε ζηενευ οπυζηνςια. Ο δζαπςνζζιυξ ηςκ ζοζηαηζηχκ ζηδ πνςιαημβναθία ααζίγεηαζ ζημ δζαθμνεηζηυ ααειυ αθθδθεπίδναζδξ ημο ηάεε ζοζηαηζημφ ιε ηζξ δφμ θάζεζξ, μ μπμίμξ ηαεμνίγεηαζ απυ ηδκ αβπζζηεία (θοζζημπδιζηή ζοββέκεζα) ημο ζοζηαηζημφ ιε ηδκ ηάεε θάζδ. Κάεε ιυνζμ ιίαξ μοζίαξ ηαηά ηδ ιεηακάζηεοζή ημο ιέζς ηδξ ζηήθδξ ιεηαηζκείηαζ πάνα πμθθέξ θμνέξ ιεηαλφ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ, υπμο δζαθφεηαζ, ηαζ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ (υπμο πνμζνμθάηαζ ή ηαηακέιεηαζ ή δεζιεφεηαζ θυβς αβπζζηείαξ η.η.θ.) ηαζ ακηίζηνμθα υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 2.1. Σρήκα 2.1 Πνξεία κνξίσλ δύν δηαθνξεηηθώλ νπζηώλ δηακέζνπ κίαο ζηήιεο. Τν κπιε κόξην θαηαλέκεηαη πην ζεκαληηθά ζηελ θηλεηή θάζε θαη ζπλεπώο παξαζύξεηαη από απηήλ ηαρύηεξα, δηόηη δελ αιιειεπηδξά ηζρπξά κε ηε ζηαηηθή θάζε. Αληίζεηα ην θίηξηλν κόξην αιιειεπηδξά ηζρπξόηεξα κε ηε ζηαηηθή θάζε, κε απνηέιεζκα λα επηβξαδύλεηαη. Καηά ζπλέπεηα ην θίηξηλν ζπζηαηηθό ζα θηλείηαη βξαδύηεξα από ην κπιε, κε απνηέιεζκα ηνλ δηαρσξηζκό ηνπο [25]. Ζ δζαθμνεηζηή αοηή αβπζζηεία μθείθεηαζ ζηζξ δζαθμνέξ ηςκ ζοζηαηζηχκ ημο ιίβιαημξ ζε μνζζιέκα θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά ημοξ, υπςξ π.π. δζαθμνέξ ζημ ιέβεεμξ ημο ιμνίμο, ημ θμνηίμ, ηδκ πηδηζηυηδηα ηαζ ηδ δζαθοηυηδηα. Ζ αβπζζηεία αοηή πενζβνάθεηαζ απυ ημκ ζοκηεθεζηή ηαηακμιήξ Κ (partition coefficient) μ μπμίμξ μνίγεηαζ ςξ: Κ=Cs/Cm (Δλίζςζδ 2.1) υπμο: C s : δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ακαθουιεκδξ μοζίαξ ζηδ ζηαηζηή θάζδ ηαζ C m : δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ακαθουιεκδξ μοζίαξ ζηδκ ηζκδηή θάζδ. Ο ζοκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ εηθνάγεηαζ δδθαδή απυ ημ θυβμ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηδξ μοζίαξ ζηδ ζηαηζηή θάζδ πνμξ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηδξ μοζίαξ ζηδκ ηζκδηή θάζδ. Ζ ηαηακμιή αοηή ηαεμνίγεηαζ απυ ηα θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά ηδξ μοζίαξ, αθθά ηαζ απυ ηδ θφζδ ηδξ ηζκδηήξ, υπςξ ηαζ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ. Ζ πανάιεηνμξ Κ είκαζ ιία παναηηδνζζηζηή ζηαεενά βζα ηδ δεδμιέκδ πδιζηή έκςζδ ηαζ ημ γεφβμξ ζηαηζ- 33

49 ηήξ/ηζκδηήξ θάζδξ, ζε ιζα δεδμιέκδ εενιμηναζία. Έηζζ, ιία μοζία πμο αθθδθεπζδνά ζζπονά ιε ηδ ζηαηζηή θάζδ «επζαναδφκεηαζ» ζε ζπέζδ ιε ιία μοζία πμο ηαηακέιεηαζ πζμ ζδιακηζηά ζηδκ ηζκδηή θάζδ ηαζ «παναζφνεηαζ ηαπφηενα» απυ αοηή. Χξ απμηέθεζια, μζ δφμ μοζίεξ δζαπςνίγμκηαζ. Πνέπεζ κα ημκζζεεί υηζ μ πνςµαημβναθζηυξ δζαπςνζζµυξ είκαζ ημ απμηέθεζµα επακαθαµαακμµέκςκ ζζμννμπζχκ ηςκ ζοζηαηζηχκ µεηαλφ ηςκ δφμ θάζεςκ ηαηά ηδ µεηαηίκδζή ημοξ. Πνμηεζιέκμο κα δζαπςνζζημφκ δφμ μοζίεξ εα πνέπεζ κα δζαθένμοκ μζ ζοκηεθεζηέξ ηαηακμιήξ αοηχκ [25]. Γεκζηά, ηα ηνία (3) ηφνζα παναηηδνζζηζηά ιε ηα μπμία πναβιαημπμζμφκηαζ μζ δζαπςνζζιμί ζηδκ HPLC είκαζ δ πμθζηυηδηα, ημ δθεηηνζηυ θμνηίμ ηαζ ημ ιμνζαηυ ιέβεεμξ [26] Γηαρσξηζκνί κε Βάζε ηελ Πνιηθόηεηα Ζ δμιή, δ δναζηζηυηδηα, ηαζ ηα θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά εκυξ ιμνίμο, ηαεμνίγμκηαζ απυ ηδ δζάηαλδ ηςκ αηυιςκ πμο ημ απανηίγμοκ ηαζ ηςκ δεζιχκ πμο ακαπηφζζμκηαζ ιεηαλφ αοηχκ. Μέζα ζε έκα ιυνζμ, ιζα ζοβηεηνζιέκδ δζάηαλδ μνζζιέκςκ αηυιςκ πμο είκαζ οπεφεοκα βζα ηζξ παναηηδνζζηζηέξ ζδζυηδηεξ ηαζ ηζξ πνμαθέρζιεξ πδιζηέξ ακηζδνάζεζξ, μκμιάγεηαζ θεζημονβζηή μιάδα. Αοηή δ δμιή πνμζδζμνίγεζ ζοπκά ηαηά πυζμ ημ ιυνζμ είκαζ πμθζηυ ή ιδ-πμθζηυ. Σα μνβακζηά ιυνζα ηαλζκμιμφκηαζ ζε ηαηδβμνίεξ ακάθμβα ιε ηδκ ηφνζα θεζημονβζηή μιάδα(εξ) πμο δζαεέηεζ ημ ηαεέκα. Υνδζζιμπμζχκηαξ ιζα θεζημονβία δζαπςνζζιμφ ιε αάζδ ηδκ πμθζηυηδηα, δ ζπεηζηή πνςιαημβναθζηή ηαηαηνάηδζδ ηςκ δζαθυνςκ εζδχκ ηςκ ιμνίςκ ηαεμνίγεηαζ ζε ιεβάθμ ααειυ απυ ηδ θφζδ ηαζ ηδ εέζδ αοηχκ ηςκ θεζημονβζηχκ μιάδςκ. Όπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 2.2, μζ ηαηδβμνίεξ ηςκ ιμνίςκ ιπμνμφκ κα δζαηαπεμφκ ζε ζπέζδ ιε ηδ ζπεηζηή ζοβηνάηδζδ ημοξ ζε ιζα ζεζνά ή θάζια πνςιαημβναθζηήξ πμθζηυηδηαξ λεηζκχκηαξ απυ άηνςξ πμθζηέξ ζε ελαζνεηζηά ιδ-πμθζηέξ. Σρήκα 2.2: Φάζκα ρξσκαηνγξαθηθήο πνιηθόηεηαο κνξίσλ ζε ζρέζε κε ηε ιεηηνπξγηθή νκάδα πνπ δηαζέηεη ην θαζέλα [25]. Μυνζα ιε πανυιμζα πμθζηυηδηα ηείκμοκ κα έθημκηαζ ιεηαλφ ημοξ, εκχ ιυνζα ιε ακυιμζα πμθζηυηδηα ειθακίγμοκ πμθφ αζεεκέζηενδ έθλδ, ακ οπάνπεζ, ηαζ ιπμνεί αηυιδ ηαζ κα απςεμφκηαζ ιεηαλφ ημοξ. Αοηυ απμηεθεί ηδ αάζδ βζα πνςιαημβναθζημφξ δζαπςνζζιμφξ ιε αάζδ ηδκ πμθζηυηδηα [26]. 34

50 Οζ δζαπςνζζιμί αοημί είκαζ: I. Ζ πνςιαημβναθία ηακμκζηήξ θάζδξ (normal-phase chromatography NP), ζηδκ μπμία δ ζηαηζηή θάζδ είκαζ πμθζηή ηαζ δ ηζκδηή θάζδ ιδ-πμθζηή. οκήεςξ ςξ ζηαηζηή θάζδ πνδζζιμπμζείηαζ δζμλείδζμ ημο πονζηίμο ηαζ δ ηζκδηή θάζδ είκαζ 100% μνβακζηή (ππ ελάκζμ) ηαζ δε πνδζζιμπμζείηαζ κενυ. II. III. IV. Ζ πνςιαημβναθία ακηίζηνμθδξ θάζδξ (reversed phase chromatography - RP), ζηδκ μπμία μ δζαπςνζζιυξ πναβιαημπμζείηαζ ιε ημκ αηνζαχξ ακηίεεημ ηνυπμ απυ ηδ πνςιαημβναθία ηακμκζηήξ θάζδξ. Ζ ζηαηζηή θάζδ είκαζ ιδ-πμθζηή (οδνυθμαδ) ηαζ δ ηζκδηή θάζδ πμθζηή (ππ ιεεακυθδ, κενυ). Ζ πνςιαημβναθία οδνυθζθςκ αθθδθεπζδνάζεςκ (hydrophilic interaction chromatography - HILIC), δ μπμία απμηεθεί ιζα παναθθαβή ηδξ πνςιαημβναθίαξ ηακμκζηήξ θάζδξ ηαζ δ μπμία εα ακαπηοπεεί ζε επυιεκμ ηεθάθαζμ. Ζ πνςιαημβναθία οδνυθμαςκ αθθδθεπζδνάζεςκ (hydrophobic interaction chromatography - HIC), δ μπμία είκαζ πανυιμζα ιε ηδκ πνςιαημβναθία ακηίζηνμθδξ θάζδξ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζημ δζαπςνζζιυ ιεβάθςκ αζμιμνίςκ, υπςξ ππ. πνςηεΐκεξ. Δίκαζ ζοκήεςξ επζεοιδηυ αοηά ηα ιυνζα κα δζαηδνμφκηαζ ακέπαθα ζε έκα οδαηζηυ δζάθοια, απμθεφβμκηαξ ηδκ επαθή ιε μνβακζημφξ δζαθφηεξ ή ηζξ επζθάκεζεξ πμο εα ιπμνμφζακ κα ηα ιεημοζζχζμοκ. οκήεςξ δε πνδζζιμπμζμφκηαζ μνβακζημί δζαθφηεξ ηαζ δ έηθμοζδ απυ ηδ ζηήθδ πναβιαημπμζείηαζ εθαηηχκμκηαξ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ ζε άθαξ [23,26] Γηαρσξηζκόο κε Βάζε ην Φνξηίν I. Υνςιαημβναθία ζμκημακηαθθαβήξ (Ion Exchange Chromatography - IEC). Ο δζαπςνζζιυξ ζηδνίγεηαζ ζηζξ δθεηηνμζηαηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ ακαθουιεκςκ ζυκηςκ ηαζ ηςκ θμνηζζιέκςκ μιάδςκ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ ηαζ υζμκ αθμνά ηδκ ηαηζμκημακηαθθαβή ααζίγεηαζ ζηδκ ζζμννμπία: RSO3 - X + Y + RSO3 - Y + + X + Όπμο RSO3 - X είκαζ δ δναζηζηή μιάδα ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ ηαζ Y + ημ πνμζδζμνζγυιεκμ ηαηζυκ. Ακάθμβδ ζζμννμπία ζζπφεζ ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ ακζμκημακηαθθαβήξ. ημ ζπήια 2.3 θαίκεηαζ μ ιδπακζζιυξ ηδξ πνςιαημβναθίαξ ζμκακηαθθαβήξ. Οζ ηονζυηενεξ παναιέηνμζ πμο ηαεμνίγμοκ ηδ ζοβηνάηδζδ ζηδ πνςιαημβναθία ζμκημακηαθθαβήξ είκαζ ημ ακηίεεημ ζυκ ηδξ ζηαηζηήξ μιάδα, δ ζμκζηή ζζπφξ, ημ ph, μ ηνμπμπμζδηήξ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ ηαζ δ εενιμηναζία. Ωξ οθζηά πθήνςζδξ πνδζζιμπμζμφκηαζ δζάθμνεξ νδηίκεξ, μζ μπμίεξ απμηεθμφκ ζοιπμθοιενή ζηονεκίμο-δοαζκοθμαεκγμθίμο ζηα μπμία έπμοκ εζζαπεεί ζμοθθμκζηέξ ή 35

51 ηαναμλοθζηέξ μιάδεξ, ηνζημηαβείξ ή ηεηανημηαβείξ αιίκεξ [23]. Υνδζζιμπμζμφκηαζ δομ εζδχκ ζμκακηαθθάηηεξ, ζζπονμί ηαζ αζεεκείξ [26]. Α) Β) Σρήκα 2.3:Μεραληζκόο Ινλαληαιιαγήο. Α) Η αληαιιαγή θαηηόλησλ ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα δηαηεξήζεη θαη λα δηαρσξίζεη ζεηηθά θνξηηζκέλα ηόληα ζε κηα αξλεηηθή επηθάλεηα. Β)Η αληαιιαγή αληόλησλ ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα ζπγθξαηήζεη θαη λα δηαρσξίζεη αξλεηηθά θνξηηζκέλα ηόληα ζε κηα ζεηηθή επηθάλεηα [25] Γηαρσξηζκόο κε Βάζε ην Μνξηαθό Μέγεζνο. I. Υνςιαημβναθία Απμηθεζζιμφ ιεβέεμοξ ή δζάποζδξ πδηηήξ (Size Exclusion SEC ή Gel Permeation Chromatography GPC). Ο δζαπςνζζιυξ βίκεηαζ ιε αάζδ ημ ζπήια ηαζ ημ ιέβεεμξ ηςκ ιμνίςκ ηςκ πνμζδζμνζγυιεκςκ εκχζεςκ. Βνίζηεζ εθανιμβέξ ζηδκ ακάθοζδ ηαζ ημ παναηηδνζζιυ ηςκ πμθοιενχκ. Σα ιεβάθα ιυνζα ελένπμκηαζ πνχηα απυ ηδ ζηήθδ εκχ ηα ιζηνά ιυνζα ηαεχξ εζζένπμκηαζ ηαζ ζημοξ πυνμοξ ηςκ ζςιαηζδίςκ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ ηαεοζηενμφκ ηαζ εηθμφμκηαζ ανβυηενα Υξσκαηνγξαθία πγγέλεηαο (Affinity Chromatography). I. Δίκαζ κεχηενδ ηαζ πενζζζυηενμ εηθεηηζηή ηεπκζηή. Βαζίγεηαζ ζηδκ ελαζνεηζηά ελεζδζηεοιέκδ αθθδθεπίδναζδ εκυξ ιμνίμο ημο ιίβιαημξ ιε έκα ιυνζα πδιζηά δεζιεοιέκμ (αηζκδημπμζδιέκμ) ζηδ ζηενεή ζηαηζηή θάζδ [23]. 36

52 2.4 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΗΑ ΣΖ ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΠΔΡ- ΤΦΖΛΖ ΑΠΟΓΟΖ Ζ δζενβαζία ημο πνςιαημβναθζημφ δζαπςνζζιμφ ανπίγεζ ιε ηδκ εζζαβςβή ημο δείβιαημξ ζηδ ζηήθδ ιε ηδ αμήεεζα εζδζηήξ ααθαίδαξ. Κάεε έκα απυ ηα ζοζηαηζηά ημο δείβιαημξ εηθμφεηαζ ηαζ ειθακίγεηαζ ςξ ημνοθή (ηςδςκμεζδήξ ηαιπφθδ ημο Gauss) ζημ ζφζηδια ηαηαβναθήξ. Ζ ακίπκεοζδ ηςκ εηθμουιεκςκ ζοζηαηζηχκ απμηεθεί ιζα πμθφ ζδιακηζηή πανάιεηνμ ηαζ ιπμνεί κα είκαζ είηε εηθεηηζηή, είηε υπζ ακάθμβα ιε ημ πνδζζιμπμζμφιεκμ ακζπκεοηή. Ζ απυηνζζδ ημο ακζπκεοηή βζα ηαεέκα απυ ηα ζοζηαηζηά ημο δείβιαημξ είηε ηαηαβνάθεηαζ ζε πανηί, είηε απεζημκίγεηαζ ζηδκ μευκδ οπμθμβζζηή ηαζ απμηεθεί ημ ηεθζηυ πνςιαημβνάθδια ημο δζαπςνζζιμφ, εκχ δ απμεήηεοζδ ηςκ ακαθοηζηχκ δεδμιέκςκ βίκεηαζ ζημκ δθεηηνμκζηυ οπμθμβζζηή [23]. Ζ οβνή πνςιαημβναθία οπέν-ορδθήξ απυδμζδξ απαζηεί ελεζδζηεοιέκμ ελμπθζζιυ θυβς ηςκ πμθφ ορδθχκ πζέζεςκ ηαζ ηςκ παιδθχκ ακμπχκ ηάης απυ ηζξ μπμίεξ πναβιαημπμζείηαζ μ δζαπςνζζιυξ. Σα απμηεθέζιαηα πνέπεζ κα είκαζ επακαθήρζια ηαζ βζα ημ θυβμ αοηυ μζ ζοκεήηεξ ηάης απυ ηζξ μπμίεξ πναβιαημπμζείηαζ μ δζαπςνζζιυξ πνέπεζ κα είκαζ επίζδξ επακαθήρζιεξ. Γζα ημοξ παναπάκς θυβμοξ μ ελμπθζζιυξ ηδξ UPLC πνέπεζ κα είκαζ ορδθήξ πμζυηδηαξ. ημ ζπήια 2.4 θαίκεηαζ δ μνβακμθμβία εκυξ ζοζηήιαημξ UPLC. Σρήκα 2.4: Σρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε κηαο κνλάδαο UPLC. (1) Γνρεία δηαιύηε, (2) Απαεξσηήο δηαιπηώλ, (3) Βαιβίδα επηινγήο δηαιύηε, (4) Γνρείν κίμεο γηα ηελ πξνώζεζε ηεο θηλεηήο θάζεο, (5) Αληιία ππέξ-πςειήο πίεζεο, (6) Βαιβίδα εηζαγσγήο δείγκαηνο ζηε ζέζε "inject ", (6') Βαιβίδα εηζαγσγήο δείγκαηνο ζηε ζέζε "load", (7) Κπςειίδα (loop) εηζαγσγήο δείγκαηνο, (8) Πξνζηήιε, (9) Αλαιπηηθή ζηήιε, (10) Αληρλεπηήο, (11) Σύζηεκα ζπιινγήο θαη επεμεξγαζίαο δεδνκέλσλ, (12) Γνρείν απνβιήησλ [27]. 37

53 Σα ηφνζα ιένδ εκυξ ζοζηήιαημξ UPLC είκαζ ηα ελήξ: 1. Φζάθεξ απμεήηεοζδξ δζαθοηχκ οκήεςξ δ ηζκδηή θάζδ δ μπμία πνδζζιμπμζείηαζ ζηδκ οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ πίεζδξ, είκαζ έκα ιείβια πμθζημφ ηαζ ιδ πμθζημφ δζαθφηδ. Οζ δζαθφηεξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ πνέπεζ κα είκαζ ακάθμβδξ ηαεανυηδηαξ ιε αοηή πμο απαζηεί δ εηάζημηε εθανιμβή. Γζα κα ιπμνεί έκαξ μνβακζηυξ δζαθφηδξ κα πνδζζιμπμζδεεί ζηδκ οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ πίεζδξ πνέπεζ κα πθδνμί μνζζιέκεξ πνμτπμεέζεζξ: - Να είκαζ ορδθήξ ηαεανυηδηαξ ηαζ εζδζηυξ βζα πνςιαημβναθία. - Να είκαζ ζπεηζηά θεδκυξ. - Να έπεζ παιδθή ημλζηυηδηα. - Να είκαζ δναζηζηυξ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ. - Να ιδκ ηαηαζηνέθεζ ημ δείβια. - Να ιδκ απμζοκηίεεηαζ εφημθα. - Να ιδκ είκαζ πηδηζηυξ. - Να έπεζ παιδθυ ζλχδεξ, παιδθή πίεζδ επακαθμνάξ ηαζ ιεβαθφηενδ ζηακυηδηα δζαπςνζζιμφ [23]. ημκ πίκαηα 2.1 δίκμκηαζ ακαθοηζηά μζ ζδζυηδηεξ ηςκ πζμ ημζκχκ δζαθοηχκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδκ HPLC [22]. Δίκαζ πμθφ ζδιακηζηυ μζ θζάθεξ ηςκ δζαθοηχκ κα είκαζ ηαεανέξ ηαζ μζ δζαθφηεξ ηαηά ηδκ εζζαβςβή ημοξ ζημ ακαθοηζηυ ζφζηδια κα θζθηνάνμκηαζ ηαζ κα απαενχκμκηαζ ηαηαθθήθςξ [23]. Πίκαηαξ 2.1: Ηδζυηδηεξ ηςκ πζμ ημζκχκ δζαθοηχκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδκ HPLC [22] Ηδηόηεηεο Γηαιύηεο Γείηηδξ Πμθζηυηδηαξ (P) θ min (nm) ζ.γ (C o ) Ηλχδεξ (cp) ηζννθηάλην n-μάλην δηρισξνκεζάλην πξνπαλόιε ρισξνθόξκην αθεηόλε αθεηνληηξίιην κεζαλόιε λεξό ι: κήθνο θύκαηνο ζ.δ: ζεκείν δέζεσο 38

54 2. Ακηθία Οζ ακηθίεξ πμο πνδζζµμπμζμφκηαζ ζηδκ οβνή πνςµαημβναθία είκαζ ορδθήξ πίεζδξ. Ο νυθμξ ημοξ είκαζ δ άκηθδζδ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ απυ ημ δμπείμ ηδξ ηαζ δ δζααίααζή ηδξ ηάης απυ µεβάθδ πίεζδ ζηδ ζηήθδ. Οζ ακηθίεξ αοηέξ πνέπεζ κα είκαζ ζηακέξ κα θαµαάκμοκ αηνζαή υβημ δζαθφηδ, πςνίξ παθµμφξ ηαζ µε επακαθήρζµα ζηαεενή ηαπφηδηα νμήξ ηαζ πίεζδ, βζ αοηυ ηαζ πνέπεζ κα έπμοκ ζοβηεηνζιέκεξ πνμδζαβναθέξ ακάθμβα ιε ηδκ εθανιμβή. οκήεςξ πνδζζιμπμζμφκηαζ ακηθίεξ πμθθαπθχκ πζζημκζχκ. 3. Μμκάδα εζζαβςβήξ ημο δείβιαημξ Ζ µμκάδα εζζαβςβήξ ημο δείβµαημξ ζε έκα ζφζηδµα οβνήξ πνςµαημβναθίαξ πανεµαάθθεηαζ µεηαλφ ηδξ ακηθίαξ ηαζ ηδξ πνςµαημβναθζηήξ ζηήθδξ. Ζ ιμκάδα εζζαβςβήξ δείβιαημξ ιπμνεί κα είκαζ ιζα απθή ααθαίδα έλζ (6) ηακαθζχκ ηαζ δομ (2) εέζεςκ, ηφπμο rheodyne. Απμηεθείηαζ απυ έκα ανυπμ (loop). Σμ δείβµα εζζάβεηαζ ζημ ανυπμ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα µεηαθένεηαζ µε ηδ αμήεεζα ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ, µε πενζζηνμθή ηδξ ααθαίδαξ ηαζ μδδβείηαζ ζηδ ζηήθδ. Όηακ δ ααθαίδα είκαζ ζηδ εέζδ «πθήνςζδξ» (load), ημ δείβµα απμαάθθεηαζ απυ εζδζηή έλμδμ. ηδ ζοκέπεζα, µε ηδκ πενζζηνμθή ηδξ ααθαίδαξ ζηδ εέζδ «εζζαβςβήξ» (inject), ημ δείβµα εζζάβεηαζ ζημ εηθμοζηζηυ ζφζηδµα, ημ μπμίμ δζααζαάγεηαζ ζοκεπχξ ηαζ ηάης απυ ορδθή πίεζδ ζηδκ ακαθοηζηή ζηήθδ υπςξ θαίκεηαζ ηαζ ζημ ζπήια 2.5. Ζ εζζαβςβή ημο δείβιαημξ ιπμνεί κα βίκεζ ηαζ ιε ελεζδζηεοιέκμ ζφζηδια αοηυιαημο δεζβιαημθήπηδ. Οζ αοηυµαημζ δεζβµαημθήπηεξ απμηεθμφκηαζ απυ ηδ ααθαίδα εζζαβςβήξ, ημ ανυπμ δείβµαημξ, ηδ ζφνζββα, ηα θζαθίδζα πμο πενζέπμοκ ηα δείβµαηα ηαζ ημκ πενζζηνεθυµεκμ δίζημ, υπμο ημπμεεημφκηαζ ηα δείβµαηα. Καηά ηδκ εζζαβςβή ημο δείβµαημξ, μ δίζημξ πενζζηνέθεηαζ, µέπνζξ υημο ημ πνμβναµµαηζζµέκμ θζαθίδζμ ανεεεί ηάης απυ ηδ µζηνμζφνζββα. ηδ ζοκέπεζα, δ µζηνμζφνζββα εζζένπεηαζ ζηδ θζάθδ ημο δείβµαημξ, θαµαάκεζ μνζζµέκδ πμζυηδηα απυ αοηυ, ημ μπμίμ ηαζ ημ δζμπεηεφεζ ζημ ανυπμ ηδξ ααθαίδαξ [23]. Σρήκα 2.5: Σρεκαηηθή παξάζηαζε βαιβίδαο εηζαγσγήο rheodyne.. Θέζε Α:Πιήξσζε ηεο θπςειίδαο. Θέζε Β:Δηζαγσγή ηνπ δείγκαηνο ζηε ζηήιε. 39

55 4. Υνςιαημβναθζηή ζηήθδ Ζ πνςιαημβναθζηή ζηήθδ απμηεθεί ημ ημιιάηζ ημο ζοζηήιαημξ ζημ μπμίμ πναβιαημπμζείηαζ μ δζαπςνζζιυξ ηαζ θαιαάκμοκ πχνα μζ δζάθμνεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ημο δείβιαημξ ιε ηδ ζηαηζηή θάζδ. Δάκ έκα ζοζηαηζηυ ημο δείβιαημξ αθθδθεπζδνά ζζπονά ιε ηδ ζηαηζηή θάζδ, δζακφεζ ιεβαθφηενμ πνμκζηυ δζάζηδια ιέζα ζηδ ζηήθδ απυ έκα ζοζηαηζηυ ημ μπμίμ αθθδθεπζδνά ζε ιζηνυηενμ ααειυ. οκήεςξ μζ ζηήθεξ πνςιαημβναθίαξ έπμοκ ςξ αάζδ δζμλείδζμ ημο πονζηίμο ή αθμοιίκα, πάκς ζηδκ μπμία ζοκδέμκηαζ μζ δζάθμνεξ παναηηδνζζηζηέξ μιάδεξ πμο πνμζδίδμοκ ζημ ηάεε ηφπμ ζηήθδξ παναηηδνζζηζηέξ ζδζυηδηεξ. ηδ UPLC ημ ιέβεεμξ ηςκ ζςιαηζδίςκ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ είκαζ ζοκήεςξ ιζηνυηενμ απυ 2ιm. 5. Ακζπκεοηήξ Ο ακζπκεοηήξ ζ έκα ζφζηδµα οβνήξ πνςµαημβναθίαξ πνδζζµμπμζείηαζ βζα ημ ζοκεπή έθεβπμ ημο οβνμφ πμο αβαίκεζ απυ ηδ ζηήθδ. Έκαξ ακζπκεοηήξ οβνήξ πνςµαημβναθίαξ, ακελάνηδηα απυ ηδκ ανπή ζηδκ μπμία ααζίγεηαζ δ θεζημονβία ημο, πνέπεζ κα πθδνμί μνζζµέκεξ πνμτπμεέζεζξ: 1. Υαµδθυ επίπεδμ εμνφαμο. 2. Τρδθή εοαζζεδζία ηαζ µεβάθμ εφνμξ βναµµζηήξ πενζμπήξ. 3. Μζηνυξ πνυκμξ απυηνζζδξ. 4. Μζηνυξ κεηνυξ υβημξ (κα µδ ζοκεζζθένεζ ζηδ δζεφνοκζδ ηςκ ημνοθχκ). 5. Ακελανηδζία ζηζξ µεηααμθέξ ηδξ εενµμηναζίαξ ηαζ ηδξ νμήξ. 6. Δοεθζλία ζηζξ µεηααμθέξ ηδξ ζφζηαζδξ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ. 7. Αλζμπζζηία ηαζ εοημθία ζηδ πνήζδ. 8. οκαηυηδηα ακίπκεοζδξ δζαθμνεηζηχκ εκχζεςκ ηαζ πανμπή ζημζπείςκ βζα ηδκ ηαοημπμίδζή ημοξ. 9. Μδ ηαηαζηνμθή ημο ακαθουµεκμο δείβµαημξ. Ακζπκεοηέξ πμο µπμνμφκ κα πνδζζµμπμζδεμφκ ζηδκ οβνή πνςµαημβναθία είκαζ μζ παναηάης: i) Ακζπκεοηέξ μναημφ οπενζχδμοξ ii) Ακζπκεοηέξ πανάηαλδξ θςημδζυδςκ iii) Αβςβζµμµεηνζημί ακζπκεοηέξ iv) Ακζπκεοηέξ δείηηδ δζάεθαζδξ v) Φαζµαημβνάθμζ µάγαξ vi) Ζθεηηνμπδµζημί ακζπκεοηέξ vii) Φεμνζζµμµεηνζημί ακζπκεοηέξ viii) Ακζπκεοηέξ ναδζεκένβεζαξ ix) Ακζπκεοηέξ ζηεδαζµμφ θςηυξ x) Ακζπκεοηέξ θθυβαξ [25]. 6. φζηδια ζοθθμβήξ ηαζ ηαηαβναθήξ ηςκ απμηεθεζιάηςκ Σμ ζφζηδια ζοθθμβήξ ηαζ ηαηαβναθήξ απμηεθεζιάηςκ ιπμνεί κα είκαζ εκα απθυ ηαηαβναθζηυ ή έκαξ δθεηηνμκζηυξ οπμθμβζζηήξ ιε ελεζδζηεοιέκμ θμβζζιζηυ ημ μπμίμ ζοκήεςξ ηαηαβνάθεζ ηαζ επελενβάγεηαζ ηα απμηεθέζιαηα αθθά ηαζ εθέβπεζ ηα οπυθμζπα ιένδ ημο ακαθοηζημφ ζοζηήιαημξ. 40

56 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 3 Ο :ΤΓΡΖ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΓΡΟΦΗΛΧΝ ΑΛΛΖΛΔΠΗΓΡΑΧΝ (HILIC) 3.1 ΓΔΝΗΚΑ ΓΗΑ ΣΖ HILIC Ακαηνέπμκηαξ ζηδκ ζζημνία ηδξ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ, ηα πνςημπυνα ζοζηήιαηα θεζημονβμφζακ ιε πνςιαημβναθία ηακμκζηήξ θάζδξ (NP), πμο ζδιαίκεζ υηζ δ ζηαηζηή θάζδ ήηακ πμθζηή ηαζ δ έηθμοζδ επζηοβπακυηακ ιε ιδ πμθζημφξ δζαθφηεξ. Σμ ιεζμκέηηδια αοηχκ ηςκ θάζεςκ ήηακ δ ακμιμζμβέκεζα ηδξ επζθάκεζαξ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ, ιε απμηέθεζια ηδ ιδ βναιιζηή ζζυεενιμ πνμζνυθδζδ ηςκ εκχζεςκ ηαζ ηδκ ειθάκζζδ ιδ ζοιιεηνζηχκ ημνοθχκ [28]. Ανβυηενα ιε ηδκ ακάπηολδ ηςκ πνμζδεδειέκςκ ζηαηζηχκ θάζεςκ, ακαπηφπεδηε δ πνςιαημβναθία ακηίζηνμθδξ θάζδξ (RP) δ μπμία έπεζ ηαεζενςεεί ιέπνζ ζήιενα ηαεχξ επέηνερε ημκ απμδμηζηυ δζαπςνζζιυ ηςκ ακαθοηχκ ιέζα ζε έκα εονφ θάζια πμθζηυηδηαξ ηαζ βνήβμνδ ελζζμννυπδζδ ηδξ ζηήθδξ. Ζ έθθεζρδ ηαηαηνάηδζδξ εκχζεςκ ιε ορδθή οδνμθζθζηυηδηα ηαζ ιε ζμκζγυιεκεξ μιάδεξ, ακηζιεηςπίζηδηε ιε ηδκ ακάπηολδ ηδξ πνςιαημβναθίαξ ζμκακηαθθαβήξ ηαζ ιε ηδκ ηεπκζηή ζπδιαηζζιμφ γεφβμοξ ζυκηςκ ζε ζηήθεξ ακηίζηνμθδξ θάζδξ. Χζηυζμ, μζ εκχζεζξ πμο είκαζ πμθφ οδνυθζθεξ ηαζ ηαοηυπνμκα μοδέηενεξ, απμηεθμφκ ιία απυ ηζξ πμ πνμαθδιαηζηέξ ηαηδβμνίεξ. Σμ πνυαθδια έπεζ λεπεναζηεί εκίμηε ζε ζοζηήιαηα αένζαξ πνςιαημβναθίαξ ιε παναβςβμπμίδζδ, ηαζ πνυζθαηα ζηα ζοζηήιαηα οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ιε ηδκ ακάπηολδ ηδξ πνςιαημβναθίαξ οδνυθζθςκ αθθδθεπζδνάζεςκ (HILIC) [29]. Ζ πνςιαημβναθία οδνυθζθςκ αθθδθεπζδνάζεςκ πνμηάεδηε ημ 1990 απυ ημκ Alpert μπμίμξ εζζήβαβε ιζα παναθθαβή ηδξ πνςιαημβναθίαξ ηακμκζηήξ θάζδξ, ιε ημ αηνςκφιζμ "HILIC hydrophilic interaction liquid chromatography", βζα ημ δζαπςνζζιυ πμθζηχκ εκχζεςκ υπςξ πνςηεΐκεξ, πεπηίδζα, αιζκμλέα, κμοηθεμηίδζα ηαζ οδαηάκεναηεξ πνδζζιμπμζχκηαξ οδαημ μνβακζηή ηζκδηή θάζδ [30]. Ζ HILIC ζοκδοάγεζ ιενζηά απυ ηα παναηηδνζζηζηά ηςκ ηνζχκ ηφνζςκ ιεευδςκ LC. Ζ ηζκδηή θάζδ ζε HILIC είκαζ πμθφ ημκηά ζε ιζα ηζκδηή θάζδ LC ακηίζηνμθδξ θάζδξ. Έηζζ, μ ηφπμξ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, δ ζοβηέκηνςζδ, ημ pζ, ηαζ ημ είδμξ ημο μνβακζημφ ηνμπμπμζδηή είκαζ ζπεδυκ ζζμδφκαιεξ. Χζηυζμ, δ HILIC είκαζ επίζδξ πμθφ ημκηά ζηδκ LC ηακμκζηήξ θάζδξ απυ άπμρδ ζηαηζηήξ θάζδξ ηαζ βεκζηά ζηδ HILIC πνδζζιμπμζμφκηαζ πμθζηέξ ζηαηζηέξ θάζεζξ, υπςξ δζμλείδζμ ημο πονζηίμο, αιίδζμ, ή αιζκμ θάζεζξ. Δπίζδξ μζ εκχζεζξ πμο ιπμνμφκ κα ακαθοεμφκ ιε HILIC είκαζ ίδζεξ ιε εηείκεξ πμο ιπμνμφκ κα ακαθοεμφκ ιε πνςιαημβναθία ακηαθθαβήξ ζυκηςκ, δδθαδή θμνηζζιέκεξ εκχζεζξ. Αοηυξ είκαζ μ θυβμξ πμο δ HILIC είκαζ έκα οανίδζμ ηςκ ηνζχκ αοηχκ δζαθμνεηζηχκ ηεπκζηχκ (ζπήια 2.6) [31]. 41

57 Σρήκα 3.1: Η HILIC ζπλδπάδεη ηα ραξαθηεξηζηηθά ησλ ηξηώλ θύξησλ ηερληθώλ LC [31]. Ακ ηαζ δ HILIC είπε πνδζζιμπμζδεεί ανηεηά πνυκζα κςνίηενα, δ ναβδαία αφλδζδ ηδξ πνήζδξ ηδξ ηεπκζηήξ λεηίκδζε ηα ηεθεοηαία πέκηε πενίπμο πνυκζα υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 3.2 [32]. Σρήκα 3.2: Αξηζκόο δεκνζηεύζεσλ ζρεηηθά κε HILIC από ην πξώην έηνο ηεο ιεηηνπξγίαο δηαρσξηζκνύ, ην 1990, έσο ην 2014 (κέρξη ην 2008, ηα δεδνκέλα πνπ ιακβάλνληαη από ην γξάθεκα Lämmerhofer, θαη αξγόηεξα, ρξεζηκνπνηήζεθαλ ηα απνηειέζκαηα αλαδήηεζεο από SciFinder) [32]. 42

58 3.2 ΜΖΥΑΝΗΜΟ HILIC Ο ιδπακζζιυξ ηδξ HILIC υπςξ πνμηάεδηε απυ ημκ Alpert, πενζθαιαάκεζ ηδκ ηαηακμιή εκυξ ακαθφηδ ιεηαλφ ιζαξ ηονίςξ πμθζηήξ μνβακζηήξ ηζκδηήξ θάζδξ ηαζ ιζαξ ζηζαάδαξ κενμφ πμο είκαζ ιενζηχξ αηζκδημπμζδιέκδ ζηδκ επζθάκεζα ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ. Γζ αοηυ ζηδ HILIC πνδζζιμπμζμφκηαζ ηονίςξ απνςηζημί δζαθφηεξ, υπςξ αηεημκζηνίθζμ ή αηεηυκδ χζηε κα ιδκ αθθδθεπζδνμφκ έκημκα ιε ηδκ οδαηζηή ζηζαάδα. Χζηυζμ, μζ Hemstrom ηαζ Irgum, εεχνδζακ υηζ ζημ ιδπακζζιυ ηδξ HILIC θαιαάκμοκ πχνα δζενβαζίεξ ηυζμ ηαηακμιήξ υζμ ηαζ πνμζνυθδζδξ υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 3.3. Ο ιδπακζζιυξ δζαπςνζζιμφ HILIC, υπςξ ζε μπμζαδήπμηε θεζημονβία πνςιαημβναθίαξ, μθείθεηαζ ζηδκ δζαθμνεηζηή αθθδθεπίδναζδ ηςκ δζαθοιέκςκ μοζζχκ ιεηαλφ ηδξ ηζκδηήξ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ. Ζ ηαηαηνάηδζδ ηαζ δ εηθεηηζηυηδηα ζημκ δζαπςνζζιυ ιε HILIC νοειίγμκηαζ απμ δοκάιεζξ αθθδθεπίδναζδξ πμο θαιαάκμοκ πχνα.. Αοηέξ πενζθαιαάκμοκ: δεζιμφξ οδνμβυκμο, μ ζπδιαηζζιυξ ηςκ μπμίςκ ελανηάηαζ απυ ηδκ μλφηδηα ή αθηαθζηυηδηα ηςκ δζαθοιέκςκ μοζζχκ, δθεηηνμζηαηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηαζ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ δζπυθμο-δζπυθμο, μζ μπμίεξ ααζίγμκηαζ ζηζξ δζπμθζηέξ νμπέξ ηαζ ηδκ ζηακυηδηα πυθςζδξ ηςκ ιμνίςκ.έηζζ ελδβείηαζ ηαζ βζαηί ζηδ HILIC ιπμνμφκ κα ζοβηναηδεμφκ ζμκζγυιεκεξ εκχζεζξ [33]. Σρήκα 3.3: Απεηθόληζε ηνπ πξνηεηλόκελνπ κεραληζκνύ θαηαθξάηεζεο ζηε HILIC [33] 43

59 3.3 ΣΑΣΗΚΔ ΦΑΔΗ ΚΑΗ ΓΗΑΛΤΣΔ ΣΖ HILIC Δπηινγή ηαηηθήο Φάζεο Ζ ζςζηή επζθμβή ημο ηαηάθθδθμο πνμζνμθδηζημφ, είκαζ γςηζηήξ ζδιαζίαξ βζα ηδκ επζηοπία ημο ιδπακζζιμφ HILIC. Ζ μζημβέκεζα ηςκ ζηαηζηχκ θάζεςκ HILIC ιε δζάθμνα οθζηά εκίζποζδξ ηαζ δζαθμνεηζηή πδιεία ζηδκ επζθάκεζα, δζεονφκεηαζ ζοκεπχξ, χζηε κα λεπεναζημφκ υθεξ μζ δοζημθίεξ δζαπςνζζιμφ ακάθμβα ιε ηδκ μιάδα ηςκ πνμξ ακάθοζδ εκχζεςκ [34]. Οζ ζηαηζηέξ θάζεζξ ηαηαηάζζμκηαζ ζε ηνεζξ ηαηδβμνίεξ ιε αάζδ ημ θμνηίμ ηςκ θεζημονβζηχκ μιάδςκ: Οπδέηεξεο ζηαηηθέο θάζεηο: Οζ θεζημονβζηέξ μιάδεξ ζε αοηή ηδκ ηαηδβμνία (π.π., αιίδζμ, ηοάκζμ, δζυθδ, ηαζ ηοηθμδεληνίκδ) δεκ ιπμνμφκ κα θμνηζζημφκ ζηδκ πενζμπή ph πμο είκαζ παναηηδνζζηζηή βζα ηδκ ηζκδηή θάζδ ζε HILIC. Αοηή δ ηαηδβμνία πενζθαιαάκεζ ηζξ πενζζζυηενεξ ζοκδεδειέκεξ θάζεζξ HILIC ηαζ ακηζπνμζςπεφεζ ιζα εονεία πμζηζθία ηςκ θεζημονβζηχκ μιάδςκ, μζ μπμίεξ είκαζ υθεξ πμθζηέξ ζηδκ θφζδ. ηδκ ηαηδβμνία αοηή, δ θάζδ αιζδίμο είκαζ απυ ηζξ πζμ δδιμθζθείξ ηαζ έπεζ ανεζ πμθθέξ εθανιμβέξ ζε HILIC (ζπήια 3.4) [35]. ηήθδ ιε πθδνςηζηυ οθζηυ αιίδζμ πνδζζιμπμζδεήηε βζα ημκ δζαπςνζζιυ ηςκ εκχζεςκ ζηδκ πανμφζα δζπθςαηζηή ενβαζία. Σρήκα 3.4: Σηαηηθή θάζε κε ακίδην. Φνξηηζκέλεο ζηαηηθέο θάζεηο: Οζ θεζημονβζηέξ μιάδεξ ηςκ ζηαηζηχκ θάζεςκ αοηήξ ηδξ ηαηδβμνίαξ ιπμνμφκ κα θμνηζζημφκ ζημ εφνμξ νζ πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζοκήεςξ ζε HILIC (π.π., νζ 3-7). Ζ αιζκμ θάζδ είκαζ έκα ηοπζηυ πανάδεζβια αοηήξ ηδξ ηαηδβμνίαξ ηαζ έπεζ πνδζζιμπμζδεεί εονέςξ βζα ημ δζαπςνζζιυ HILIC. Φάζεηο δηπνιηθνύ ηόληνο: Γζπμθζημφ ζυκημξ θάζεζξ είκαζ ιζα ζπεηζηά κέα ηαηδβμνία πμθζηήξ ζηαηζηήξ θάζεζξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ βζα HILIC δζαπςνζζιμφξ. Έκα παναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια είκαζ δ θάζδ ζμοθθμαεηαΐκδξ [35]. 44

60 3.3.2 Δπηινγή Γηαιύηε Αθμφ επζθεπεεί δ ηαηάθθδθδ ζηαηζηή θάζδ ηαζ ζηήθδ βζα ημ δζαπςνζζιυ, εα πνέπεζ κα νοειζζηεί δ ζφκεεζδ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ. Ζ ηζκδηή θάζδ ζηδκ HILIC απμηεθείηαζ απυ ιίβια δζαθοηχκ ημ μπμίμ ζοκίζηαηαζ απυ κενυ ηαζ έκακ μνβακζηυ δζαθφηδ ακαιίλζιμ ιε ημ κενυ. Σμ κενυ απμηεθεί ημκ ζζπονυ δζαθφηδ έηθμοζδξ ηαζ ηοιαίκεηαζ ζε πμζμζηά 5% έςξ ηαζ 40% (v/v). Οζ δζαθφηεξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζοκήεςξ ζε HILIC απμηεθμφκηαζ απυ 60%-90% μνβακζημ ηαζ είκαζ ηαηάθθδθμζ βζα ακάθοζδ LC / MS πνδζζιμπμζχκηαξ ESI, πςνίξ ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα ζμκζζιμφ ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο πνμβνάιιαημξ έηθμοζδξ. Ζ επζθμβή ημο μνβακζημφ δζαθφηδ έπεζ ζζπονή επίδναζδ ζηδ θεζημονβία ζοβηνάηδζδξ ηδξ HILIC. Ζ δφκαιδ έηθμοζδξ ηςκ μνβακζηχκ δζαθοηχκ ζε θεζημονβία HILIC βεκζηά αολάκεηαζ ιε ηδκ αφλδζδ ηδξ πμθζηυηδηαξ ημο δζαθφηδ ηαζ ηδκ ζηακυηδηα κα ζοιιεηάζπεζ ζε αθθδθεπζδνάζεζξ δυηδ-πνςημκίμο/δέηηδ-πνςημκίμο. Ο ζοκδεέζηενα πνδζζιμπμζμφιεκμξ μνβακζηυξ δζαθφηδξ είκαζ ημ αηεημκζηνίθζμ (ACN). Δπζπθέμκ μνβακζημί δζαθφηεξ πμο ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ είκαζ δ ιεεακυθδ (MeOH), δ αζεακυθδ (EtOH), δ 2-πνμπακυθδ (IPA) ηαζ ημ ηεηνατδνμθμονάκζμ (THF). Σμ ph ηαζ δ ζμκζηή ζζπφξ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ, ιπμνμφκ επίζδξ κα επδνεάζμοκ ζδιακηζηά ηδ ζοβηνάηδζδ ηαζ ηδκ εηθεηηζηυηδηα ημο δζαπςνζζιμφ ηςκ ζμκζγυιεκςκ ακαθοηχκ. Ροειζζηζηά δζαθφιαηα αθάηςκ (buffer) ηαζ πνυζεεηα ζηδκ ηζκδηή θάζδ υπςξ μλζηυ αιιχκζμ, ιονιδηζηυ αιιχκζμ, θςζθμνζηυ αιιχκζμ ηαζ ηνζθεμνμλζηυ μλφ, πνδζζιμπμζμφκηαζ ζοπκά βζα ηδ αεθηίςζδ ημο ζπήιαημξ ηςκ ημνοθχκ ηαζ βζα ημκ έθεβπμ ηδξ πμθζηυηδηαξ ηςκ ακαθοηχκ [29-34]. 45

61 3.4 ΠΛΔΟΝΔΚΣΖΜΑΣΑ ΚΑΗ ΜΔΗΟΝΔΚΣΖΜΑΣΑ ΣΖ HILIC. Ζ ηεπκζηή ηδξ HILIC πανέπεζ δζάθμνα πθεμκεηηήιαηα ζε ζφβηνζζδ ιε ηζξ οπυθμζπεξ ηεπκζηέξ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ. Γίκεζ ηαθυ ζπήια ημνοθχκ ζε ααζζηέξ εκχζεζξ ζε ζφβηνζζδ ιε ηδκ RP. Δίκαζ απμηεθεζιαηζηή βζα ημ δζαπςνζζιυ εκχζεςκ πμο είκαζ πνμαθδιαηζηέξ ζηδκ RP υπςξ μζ πμθζηέξ εκχζεζξ. Ζ εηπφθζζδ οβνμφ οβνμφ ή αηυια ηαζ δ ηαηααφεζζδ πνςηεσκχκ ζε έκα δείβια βίκεηαζ ζοκήεςξ ιε ηδ πνήζδ εκυξ μνβακζημφ δζαθφηδ (π.π. ACN, MeOH, EtOH) ηαζ ηαηά ζοκέπεζα, είκαζ δοκαηή δ απεοεείαξ έβποζδ ημο εηθμφζιαημξ εηπφθζζδξ ζημ ζφζηδια, βεβμκυξ ημ μπμίμ εθαηηχκεζ ζδιακηζηά ημ πνυκμ πνμηαηενβαζίαξ ηαεχξ ηαζ πζεακέξ απχθεζεξ ζοζηαηζηχκ. Ζ ηζκδηή θάζδ έπεζ παιδθυ ζλχδεξ ηαζ ορδθυ πμζμζηυ ζε μνβακζηυ δζαθφηδ ηαζ ζοκεπχξ πανέπεζ δοκαηυηδηα βζα ορδθυηενεξ νμέξ ηζκδηήξ θάζδξ ηαζ πνήζδ ζηδθχκ ιε ιεβαθφηενμ ιήημξ. Ζ ακίπκεοζδ ιε πνήζδ θαζιαημιεηνίαξ ιάγαξ είκαζ αεθηζςιέκδ ζε ζπέζδ ιε ηδκ RP, δζυηζ δ ηζκδηή θάζδ είκαζ πζμ πηδηζηή, μ ρεηαζιυξ ζε δοκαιζηυ έπεζ ορδθυηενδ απμδμηζηυηδηα ηαζ επμιέκςξ δ εοαζζεδζία είκαζ ορδθυηενδ [29]. Ζ ηεπκζηή ηδξ HILIC, εηηυξ απυ πθεμκεηηήιαηα έκακηζ άθθςκ ηεπκζηχκ δζαπςνζζιμφ, πανμοζζάγεζ επίζδξ πενζμνζζιμφξ ηαζ ιεζμκεηηήιαηα. Έκαξ ζδιακηζηυξ πενζμνζζιυξ ηδξ ηεπκζηήξ πνμηφπηεζ απυ ηδ ιεζςιέκδ δζαθοηυηδηα ηςκ αθάηςκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ παναζηεοή νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ, θυβς ηδξ πανμοζίαξ μνβακζημφ δζαθφηδ (ACN) ζε ορδθά πμζμζηά. ηα ιεζμκεηηήιαηα ηδξ HILIC ζοβηαηαθέβμκηαζ ηαζ μζ ιεβάθμζ πνυκμζ ελζζμννυπδζδξ ηδξ ζηήθδξ ηονίςξ ζηδ ααειςηή έηθμοζδ. Έκα άθθμ ιεζμκέηηδια είκαζ δ πμθφ ζζπονή ηαηαηνάηδζδ ή αηυια ηαζ δ ιδ ακηζζηνεπηή πνμζνυθδζδ εκχζεςκ πμο ειθακίγμοκ ιεβάθδ πδιζηή ζοββέκεζα ιε ηδ ζηαηζηή θάζδ. Δπίζδξ δ εοαζζεδζία μνζζιέκςκ ζηαηζηχκ θάζεςκ, ιε αάζδ ηα πονίηζα, ζε ιεβάθεξ πενζεηηζηυηδηεξ κενμφ ζηδκ ηζκδηή θάζδ, μδδβεί ζε ζδιακηζηή ιείςζδ ημο πνυκμο γςήξ ηδξ ζηήθδξ ηαζ δοζπεναίκεζ ηδ πνήζδ βεκζηχκ ακζπκεοηχκ (MS, ELSD) θυβς αολδιέκμο εμνφαμο ή ειθάκζζδξ επζπθέμκ πνςιαημβναθζηχκ ημνοθχκ πένακ ηςκ ακαθουιεκςκ ζοζηαηζηχκ [36]. Σέθμξ, δ HILIC είκαζ ιζα ηεπκζηή δζαπςνζζιμφ θζβυηενμ "θζθζηή" πνμξ ημ πενζαάθθμκ, ζε ζφβηνζζδ ιε ηδκ RP, θυβς ηδξ ηαηακάθςζδξ ιεβαθφηενςκ υβηςκ μνβακζημφ δζαθφηδ [29]. 46

62 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 4 Ο : ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ 4.1 ΓΔΝΗΚΑ ΓΗΑ ΣΖ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ. Ζ Μεηααμθμιζηή είκαζ ιζα κέα ακαδουιεκδ επζζηήιδ πμο ιπμνεί κα εεςνδεεί ςξ ιζα πνμδβιέκδ, ελεζδζηεοιέκδ ιμνθή ηδξ ακαθοηζηήξ αζμπδιείαξ. Ζ ηεπκμθμβία αοηή, είκαζ επζηεκηνςιέκδ βφνς απυ ηδκ ακίπκεοζδ ιζηνχκ ιμνίςκ ηαζ, ελ μνζζιμφ, απμηθείεζ ηα μνβακζηά αζμπμθοιενή υπςξ πνςηεΐκεξ ηαζ θζπανά μλέα. ηζξ ζδιακηζηέξ ηάλεζξ ιζηνχκ ιεηααμθζηχκ πενζθαιαάκμκηαζ π.π. άιζκμ ηαζ άθθα μνβακζηά μλέα, ηα ζάηπανα, πηδηζημί ιεηααμθίηεξ ηαζ ηα πενζζζυηενα απυ ηα είδδ δεοηενμβεκχκ ιεηααμθζηχκ πμο ανίζημκηαζ ζηα θοηά, υπςξ αθηαθμεζδή, θαζκμθζηά ζοζηαηζηά ηαζ έβπνςιμζ ιεηααμθίηεξ υπςξ ηανμηεκμεζδή ηαζ ακεμηοακίκεξ. Κθεζδί βζα μπμζαδήπμηε ιεηααμθμιζηή πνμζέββζζδ είκαζ μ ζηυπμξ κα ηαηακμήζμοιε ηδκ εονφηενδ δοκαηή αζμπδιζηή ζφκεεζδ πμθφπθμηςκ δεζβιάηςκ ζε ιυθζξ ιία ή ζε έκα ιζηνυ ανζειυ ακαθφζεςκ [37]. Αοηυξ μ πνυζθαημξ ηθάδμξ ιεθέηδξ έβζκε βνήβμνα έκα πμθφ ζδιακηζηυ ενβαθείμ ζε δζάθμνμοξ ημιείξ ένεοκαξ, έκαξ απυ ημοξ μπμίμοξ είκαζ αοηυξ ηςκ ηνμθίιςκ[38]. 4.2 ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ ΣΡΟΦΗΜΧΝ (FOOD METABOLOMICS). Σα ηνυθζια απμηεθμφκ ζφκεεηα οπμζηνχιαηα ιε πζθζάδεξ ζοζηαηζηά ζημζπεία, ηα μπμία είκαζ απμηέθεζια ημο πμθφπθμημο ιεηααμθζζιμφ ηςκ θοηχκ ηαζ ηςκ γχςκ. Σα ζοζηαηζηά ηςκ ηνμθίιςκ αθθδθεπζδνμφκ ιεηαλφ ημοξ ηαζ επδνεάγμκηαζ απυ ελςηενζημφξ πανάβμκηεξ, πνζκ, ηαηά ηαζ ιεηά ηδκ επελενβαζία. Οζ θοζζηέξ ηαζ πδιζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ υθςκ ηςκ εκχζεςκ πμο πναβιαημπμζμφκηαζ ζε έκα ηνυθζιμ, ακηζηαημπηνίγμκηαζ ζηζξ ηεθζηέξ ζδζυηδηεξ ημο πνμσυκημξ, υπςξ δ πμζυηδηα, δ αζθάθεζα ηαζ δ δζάνηεζα γςήξ, ιεηαλφ άθθςκ. Χξ εη ημφημο, μ πνμζδζμνζζιυξ ηςκ ζοζηαηζηχκ ηαζ ηςκ αθθδθεπζδνάζεςκ πμο είκαζ οπεφεοκεξ βζα ηα παναηηδνζζηζηά εκυξ ηνμθίιμο επζηνέπμοκ ημκ ηαθφηενμ έθεβπμ ηαζ ηαηακυδζδ ηςκ δζενβαζζχκ πμο ζοιααίκμοκ ζε αοηυ. [37]. Ζ παβηυζιζα ηαζ δ εονςπασηή πμθζηζηή ηςκ ηνμθίιςκ, απαζημφκ ζοκεπχξ αοζηδνυηενδ παναημθμφεδζδ ηαζ έθεβπμ ηδξ πμζυηδηαξ/αζθάθεζαξ ηςκ ηνμθίιςκ ηαζ οπάνπεζ ιζα αολακυιεκδ ακάβηδ βζα κέα ενβαθεία χζηε κα ηαεμνζζηεί ηαζ κα ηαηακμδεεί μ υνμξ «πμζυηδηα» ηαζ πχξ αοηή ιπμνεί κα παναημθμοεείηαζ απμηεθεζιαηζηά [37]. Μζα ζδιακηζηή πνυηθδζδ πμο ζπεηίγεηαζ ζοπκά ιε ηδκ πμζυηδηα ηςκ ηνμθίιςκ είκαζ δ ζπκδθαζζιυηδηα ηςκ ηνμθίιςκ, δ μπμία πνμτπμεέηεζ αηνζαή βκχζδ ηδξ ζφκεεζδξ ηαζ ηδξ πνμέθεοζδξ εκυξ πνμσυκημξ δζαηνμθήξ ηαηά ηδ δζάνηεζα υθςκ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ζηαδίςκ αζμιδπακμπμίδζδξ ζηα μπμία οπμαάθθεηαζ. 47

63 Ζ ζπκδθαζζιυηδηα ηδξ βεςβναθζηήξ πνμέθεοζδξ είκαζ επίζδξ ζδιακηζηή βζα ηδ αζμιδπακία ηνμθίιςκ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ βεςβναθζηήξ πνμέθεοζδξ ηςκ ηνμθίιςκ ηαζ ηςκ πμηχκ ήηακ ιζα αολακυιεκδ πνυηθδζδ ηαηά ηδκ ηεθεοηαία δεηαεηία, ηονίςξ θυβς ηδξ ακδζοπίαξ ηςκ ηαηακαθςηχκ ζπεηζηά ιε ηδκ αοεεκηζηυηδηα ηςκ ηνμθίιςκ πμο ηαηακαθχκμοκ. Απυ μζημκμιζηή άπμρδ, δ πζζημπμίδζδ ημο πνμσυκημξ είκαζ εειεθζχδμοξ ζδιαζίαξ υπζ ιυκμ βζα ηδκ απμηνμπή ηδξ κμεείαξ ηςκ ηνμθίιςκ, αθθά ηαζ βζα κα ελαζθαθζζηεί υηζ έκα πνμσυκ δζαηίεεηαζ ζηδκ αβμνά ςξ ιένμξ ιζαξ πνμζηαηεουιεκδξ μκμιαζίαξ πνμέθεοζδξ (ΠΟΠ) ή πνμζηαηεουιεκδξ βεςβναθζηήξ έκδεζλδξ (ΠΓΔ) [38]. Ζ ιεηααμθμιζηή, πνμζθένεζ ιζα ζοζηδιαηζηή ηαζ μθμηθδνςιέκδ πνμζέββζζδ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ, ηδκ πμζμηζημπμίδζδ, ηαζ ημκ παναηηδνζζιυ εηείκςκ ηςκ ζοζηαηζηχκ πμο επδνεάγμοκ ηα παναηηδνζζηζηά ημο ηεθζημφ πνμσυκημξ ηαζ έπεζ απμδεζπεεί υηζ είκαζ έκα ζδιακηζηυ ενβαθείμ βζα ηδκ πνυμδμ πμθθχκ ηθάδςκ ηδξ επζζηήιδξ ηςκ ηνμθίιςκ υπςξ δ ηήνδζδ ηςκ ηακμκζζιχκ βζα αζθάθεζα ηαζ πμζυηδηα [37, 39]. 4.3 ΜΔΣΑΒΟΛΗΣΔ Γζα μνζζιέκμοξ επζζηήιμκεξ, δ έκκμζα ημο ιεηααμθίηδ πενζθαιαάκεζ υθεξ ηζξ μνβακζηέξ μοζίεξ πμο απακημφκ ζηδ θφζδ απυ ημ ιεηααμθζζιυ εκυξ γςκηακμφ μνβακζζιμφ. Γφμ δζαθμνεηζηά είδδ ιεηααμθίηχκ ιπμνμφκ κα δζαηνζεμφκ ακάθμβα ιε ηδκ πνμέθεοζή ημοξ: εκδμβεκείξ ηαζ ελςβεκείξ ιεηααμθίηεξ. Οζ εκδμβεκείξ ιεηααμθίηεξ ιπμνμφκ κα παναηηδνζζημφκ ςξ πνςημβεκείξ ηαζ ςξ δεοηενμβεκείξ [40]. Οζ πνςημβεκείξ έπμοκ εονεία ηαηακμιή ζε γςκηακά είδδ ηαζ ειπθέημκηαζ άιεζα ζε μοζζαζηζηέξ αζμθμβζηέξ δζενβαζίεξ, υπςξ δ ακάπηολδ ηαζ δ ακαπαναβςβή. Όπςξ είκαζ βζα πανάδεζβια δ πενίπηςζδ ηςκ αιζκμλέςκ ή ηα εκδζάιεζα ηδξ βθοηυθοζδξ. Οζ πνςημβεκείξ ιεηααμθίηεξ είκαζ εκχζεζξ παµδθμφ µμνζαημφ αάνμοξ πμο πανάβμκηαζ απυ ιζηνμμνβακζζµμφξ, δ ζφκεεζδ ηςκ μπμίςκ ελανηάηαζ απυ ηδκ ηοηηανζηή αφλδζδ. Έκαξ πνςημβεκήξ ιεηααμθίηδξ ζοιιεηέπεζ άιεζα ζηδκ ηακμκζηή «ακάπηολδ», ηδκ ελέθζλδ ηαζ ηδκ ακαπαναβςβή [40]. Οζ δεοηενμβεκείξ ιεηααμθίηεξ είκαζ ζοβηεηνζιέκμζ ζε ηάπμζα είδδ, έπμοκ ιζα πενζμνζζιέκδ ηαηακμιή ηαζ ζοκηίεεκηαζ βζα ιζα ζοβηεηνζιέκδ αζμθμβζηή θεζημονβία, υπςξ ηα αθηαθμεζδή βζα ηα θοηά ή μζ μνιυκεξ βζα ηα εδθαζηζηά. Οζ δεοηενμβεκείξ ιεηααμθίηεξ είκαζ μοζίεξ πμο αζμζοκηίεεκηαζ ηαηά ηζξ ιεηααμθζηέξ δζαδζηαζίεξ ηςκ οδαηακενάηςκ, ηςκ θζπχκ ηαζ ηςκ αιζκμλέςκ, πνδζζιμπμζχκηαξ ηάπμζα απυ ηα εκδζάµεζα πνμσυκηα ςξ ααζζηέξ μοζίεξ βζα ηδ δδιζμονβία ηςκ πνμσυκηςκ αοηχκ. Οζ ελςβεκείξ ιεηααμθίηεξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηα πνμσυκηα αζμιεηαηνμπχκ ηαζ ιεηααμθζζιμφ ηςκ ελςβεκχκ εκχζεςκ. [40]. 48

64 Πνιηθνί κεηαβνιίηεο Οζ πμθζημί ιεηααμθίηεξ είκαζ οδνυθζθεξ εκχζεζξ. Τδνυθζθμ ιυνζμ είκαζ έκα ιυνζμ ή άθθδ ιμνζαηή μκηυηδηα πμο έθηεηαζ ηαζ ηείκεζ κα δζαθοεεί απυ ημ κενυ. Έκα οδνυθζθμ ιυνζμ ή ηιήια εκυξ ιμνίμο είκαζ αοηυ πμο έπεζ ιζα ηάζδ κα αθθδθεπζδνάζεζ ιε ή κα δζαθοεεί απυ ημ κενυ ηαζ άθθεξ πμθζηέξ μοζίεξ. Έκαξ ηαηά πνμζέββζζδ ηακυκαξ οδνμθζθίαξ ηςκ μνβακζηχκ εκχζεςκ είκαζ υηζ δ δζαθοηυηδηα ημο ιμνίμο ζημ κενυ είκαζ πενζζζυηενδ απυ 1% ηαηά ιάγα, εάκ οπάνπεζ ημοθάπζζημκ ιία μοδέηενδ οδνυθζθδ μιάδα ακά 5 άκεναηεξ, ή ημοθάπζζημκ ιζα δθεηηνζηά θμνηζζιέκδ οδνυθζθδ μιάδα ακά 7 άκεναηεξ [41]. ηδκ πανμφζα ενβαζία εα πνδζζιμπμζδεεί μ υνμξ πμθζημί ιεηααμθίηεξ βζα κα πενζβνάρεζ ηζξ ιεθεημφιεκεξ εκχζεζξ. 4.4 ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ ΑΝΑΛΤΖ Σμ ιεηααυθςια πμο οπάνπεζ ζηα ηνυθζια, πενζθαιαάκεζ ιζα ιεβάθδ πμζηζθία ζοζηαηζηχκ πμο είκαζ πμθφ δζαθμνεηζηά απυ πδιζηή άπμρδ, ηαζ πνάβιαηζ ακήημοκ ζε ιζα πμζηζθία απυ πδιζηέξ ηαηδβμνίεξ (ζάηπανα, μνβακζηά μλέα, αιίκεξ, αιζκμλέα, πεπηίδζα, κμοηθεσκζηά μλέα, ζηενμεζδή ή θαζκμθζηέξ εκχζεζξ, ιεηαλφ άθθςκ). Αοηυ ηαεζζηά ηδκ μθμηθδνςιέκδ ακάθοζδ μθυηθδνδξ ηδξ ιεηααμθζηήξ ζφκεεζδξ πμθφ δφζημθδ. Δπζπθέμκ, δ δοκαιζηή πενζμπή ζοβηέκηνςζδξ ζηδκ μπμία εα ιπμνμφζακ κα ανεεμφκ μζ δζαθμνεηζημί ιεηααμθίηεξ είκαζ πμθφ ιεβάθδ, ζοκήεςξ απυ millimolar έςξ femtomolar. Καηά ζοκέπεζα, δ ακαθοηζηή πνυηθδζδ είκαζ ηενάζηζα. Οζ ιεηααμθμιζηέξ πνμζεββίζεζξ πμο ακαπηφζζμκηαζ βζα κα ακηζιεηςπζζημφκ αοηέξ μζ δοζημθίεξ ιπμνμφκ κα μιαδμπμζδεμφκ βεκζηά ςξ ζημπεοιέκεξ ή ιδ ζημπεοιέκεξ ζηναηδβζηέξ [38]. ε ιδ ζημπεοιέκεξ πνμζεββίζεζξ ημο ιεηααμθζημφ πνμθίθ, δ ένεοκα λεηζκά απυ ιζα εθεφεενδ οπυεεζδ ιε ζηυπμ ηδκ απυηηδζδ ηαζ ηδκ ακάθοζδ εκυξ ηαηάθθδθμο δείβιαημξ ιε ιζα αιενυθδπηδ, βεκζηά πμζμηζηή, μθζζηζηή ακαθοηζηή ιεεμδμθμβία. Γδιζμονβμφκηαζ ιεβάθα ζφκμθα δεδμιέκςκ ηαζ πμθοπαναβμκηζηή ζηαηζζηζηή ακάθοζδ πνδζζιμπμζείηαζ ζηδ ζοκέπεζα, βζα κα ιεζςεεί δ πμθοπθμηυηδηα ηςκ δεδμιέκςκ ηαζ βζα κα αμδεήζεζ ζηδκ απμηάθορδ οπμηείιεκςκ ηάζεςκ απυ ηζξ μπμίεξ εθπίγεηαζ υηζ ιπμνμφκ κα δδιζμονβδεμφκ οπμεέζεζξ. ε αοηή ηδκ πνμζέββζζδ πνδζζιμπμζμφκηαζ ανηεηά ενβαθεία ηαηακυδζδξ δεδμιέκςκ ηαζ ηα εονήιαηα ηαεμδδβμφκ ηδκ ακάθοζδ [42]. Ο ηφνζμξ ζηυπμξ αοηήξ ηδξ πνμζέββζζδξ είκαζ, ζοκεπχξ, κα πνμζδζμνίγμκηαζ μζ ηάζεζξ ιεηαλφ ηςκ δζαθυνςκ δεζβιάηςκ πμο, πάνδ ζηδκ ηαηάθθδθδ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πμο πνμηφπημοκ, ιπμνμφκ κα παναηδνδεμφκ ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ιεηαλφ ημοξ [38]. Ζ ζημπεοιέκδ ιεηααμθμιζηή ακάθοζδ αημθμοεεί δζαθμνεηζηή δζαδνμιή. Με αάζδ ηζξ οπάνπμοζεξ βκχζεζξ, έκαξ ιεβάθμξ ανζειυξ ιεηααμθζηχκ ακαβκςνίγμκηαζ ςξ ακαθοηζημί ζηυπμζ ηαζ ακαπηφζζεηαζ ιζα ιέεμδμξ ιε ζημπυ κα πνμζδζμνζζημφκ 49

65 πμζμηζηά ζημ δείβια πμο ιαξ εκδζαθένεζ. Αημθμοεεί (διζ-) πμζμηζηυξ πνμζδζμνζζιυξ ζηαηζζηζηήξ ακάθοζδξ, μ μπμίμξ πνδζζιμπμζείηαζ βζα κα απεζημκίζεζ ηζξ ηάζεζξ ζηα δεδμιέκα, βζα ηδκ ηαλζκυιδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ηαζ βζα κα ανεεεί πμζμζ απυ ημοξ ακαθουιεκμοξ ιεηααμθίηεξ ζοκεζζθένμοκ ζημ δζαπςνζζιυ [42]. 4.5 Ζ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΗΑ ΜΑΕΑ ΣΖ ΜΔΣΑΒΟΛΟΜΗΚΖ Ζ θαζιαημιεηνία ιάγαξ (MS) έπεζ ελαζθαθίζεζ έκα ζδιακηζηυ νυθμ ζηζξ ακαθφζεζξ ιε ζηυπμ ηδκ εφνεζδ ημο μθζζηζημφ ιεηααμθζημφ πνμθίθ θυβς ηδξ ιεβάθδξ εοαζζεδζίαξ πμο πνμζθένεζ ηαζ ηδξ εονείαξ δζαεεζζιυηδηάξ ηδξ. Ζ επζθμβή ημο ηνυπμο ζμκζζιμφ έπεζ ζδιακηζηή επίδναζδ ζημ ιεηααμθζηυ πνμθίθ πμο απμηηάηαζ. Μενζηά ιυνζα ζμκίγμκηαζ πζμ απμηεθεζιαηζηά ζε ιία θεζημονβία ζμκζζιμφ, ή ζε ιία πμθζηυηδηα, εκχ άθθα ιυνζα ειθακίγμοκ ορδθυηενδ απυδμζδ ιε δζαθμνεηζηή θεζημονβία. Ο ζμκζζιυξ ιε δθεηηνμρεηαζιυ (ESI) είκαζ μ πνμηζιχιεκμξ ηνυπμξ ζμκζζιμφ ηαζ ηα πνμθίθ θαιαάκμκηαζ ηυζμ ζε εεηζηή υζμ ηαζ ζε ανκδηζηή θεζημονβία ζυκηςκ ζε δζαθμνεηζηά πεζνάιαηα (πανηίδεξ ακάθοζδξ) [42]. Ζ θαζιαημιεηνία ιάγαξ, πμο πνδζζιμπμζείηαζ ιυκδ ή ζε ζοκδοαζιυ ιε ιία ηεπκζηή δζαπςνζζιμφ, ηαηέπεζ παναηηδνζζηζηά πμο οπμδδθχκμοκ ηδκ αολακυιεκδ πνήζδ ηδξ ζε ιεηααμθμιζηέξ ακαθφζεζξ, πανυθμ πμο δ ηεπκζηή ημο πονδκζημφ ιαβκδηζημφ ζοκημκζζιμφ (NMR) ήηακ δ πνςηανπζηή ακαθοηζηή επζθμβή. Με ηδ πνήζδ ηδξ MS, ιπμνμφκ κα οπάνλμοκ ςθέθδ υζμκ αθμνά ηδκ εοαζζεδζία, ηδκ εονςζηία ηςκ ζογεφλεςκ, ηαζ ηδ δζαθεφηακζδ ηδξ δμιήξ, εζδζηά εάκ δζελάβμκηαζ πανάθθδθα MS (MS/MS) ή MS ακαθφζεζξ. Δηηυξ αοημφ, δ πεναζηένς ακάπηολδ ηαζ δ αολδιέκδ ζηακυηδηα ηςκ ζφβπνμκςκ θαζιαημιέηνςκ ιάγαξ ορδθήξ ακάθοζδξ [ηονίςξ πνυκμο πηήζδξ (TOF), ηεηναπμθζημί-πνυκμο πηήζδξ (Q-TOF), παβίδεοζδξ ζυκηςκ-πνυκμο πηήζδξ (IT -TOF) ηαζ ακαθοηέξ Orbitrap] έπεζ αεθηζχζεζ ζδιακηζηά ηζξ δοκαηυηδηεξ ηαοημπμίδζδξ ηδξ ηεπκζηήξ αοηήξ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ιμνζαηχκ ιαγχκ ιε ορδθή αηνίαεζα, είκαζ έκα ελαζνεηζηά πνήζζιμ ενβαθείμ, πνμηεζιέκμο κα ακαβκςνζζημφκ άβκςζημζ ιεηααμθίηεξ ηαζ κα ζοβηνζεμφκ ιε ηζξ αάζεζξ δεδμιέκςκ. Ζ πνμζπάεεζα βζα ηαίνζαζια ιεηαλφ ηδξ αηνζαμφξ ιάγαξ πμο πανέπεηαζ απυ έκα ορδθήξ ακάθοζδξ θαζιαημιέηνμο ιάγαξ ηαζ ημο ιεηααμθίηδ ζηζξ αάζεζξ δεδμιέκςκ είκαζ έκα απυ ηα ζδιακηζηυηενα ενβαθεία βζα ηδκ επίηεολδ ιζαξ εεηζηήξ ακαβκχνζζδξ ζε ζημπεοιέκεξ ακαθφζεζξ ιεηααμθμιζηήξ [38]. Ζ θαζιαημιεηνία ιάγαξ ιε ηνζπθυ ηεηνάπμθμ (QQQ) εθανιυγεηαζ ηονίςξ ζε ζημπεοιέκεξ ιεηααμθμιζηέξ ιεθέηεξ θυβς ηδξ δοκαηυηδηάξ ημο ζηδκ πμζμηζηή ακάθοζδ, ηδκ ζηακυηδηά ημο κα εηηεθεί πεζνάιαηα εθέβπμο πμθθαπθήξ ακηίδναζδξ (MRM), απχθεζα μοδέηενμο (NL) ηαζ πνμδνυιμο ζυκημξ (PS). Οζ ακαθοηζηέξ ζηναηδβζηέξ πενζθαιαάκμοκ ηδκ πμζμηζηή ιεθέηδ ηςκ ιεηααμθζηχκ ηάλεςκ, δζηηφςκ ηαζ ζημπεοιέκδ ακάθοζδ ζοβηεηνζιέκςκ ιεηααμθζηχκ. Καηά ηα ηεθεοηαία πνυκζα, ηα ζφβπνμκα QqQs λεπέναζακ ημκ πενζμνζζιυ ηςκ παιδθχκ ηφηθςκ ιε πνυκμοξ ζάνςζδξ <10 ms / MRM [43]. 50

66 Με αάζδ ημκ ανζειυ δδιμζζεφζεςκ ηαζ ακαθμνχκ, δ οβνή πνςιαημβναθία (LC-MS) έπεζ βίκεζ δ ηφνζα ακαθοηζηή ηεπκζηή ζημκ ημιέα ημο παβηυζιζμο ιεηααμθζημφ πνμθίθ Ζ ακάπηολδ ζημπεοιέκδξ ιεηααμθμιζηήξ ιε LC-MS/MS ιπμνεί κα παναθθδθζζηεί ιε ηδκ ακάπηολδ ηςκ ιεευδςκ πμθθαπθήξ ακάθοζδξ. Σμ LC-MS/MS ζε θεζημονβία παναημθμφεδζδξ πμθθαπθήξ ακηίδναζδξ (MRM) ζημ ηνζπθυ ηεηνάπμθμ πανέπεζ ορδθή εοαζζεδζία, εζδζηυηδηα ηαζ επακαθήρζιμοξ πμζμηζημφξ πνμζδζμνζζιμφξ. Πζεακά ακαθοηζηά θάεδ ιπμνμφκ κα παναημθμοεμφκηαζ ηαζ κα δζμνεχκμκηαζ π.π. επζδνάζεζξ οπμζηνχιαημξ ιπμνμφκ κα αλζμθμβδεμφκ ηαζ ζζμημπζηά ζδιαζιέκα (π.π., 2Ζ, 13C, 15Ν) εζςηενζηά πνυηοπα ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα κα δζμνεχζμοκ ηδκ απχθεζα ακαθφηδ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ πνμηαηενβαζίαξ ημο δείβιαημξ. ηδ ιεηααμθμιζηή ιπμνεί κα ακαιέκεζ ηακείξ κα ανεζ υθμοξ ημοξ ακαθφηεξ κα είκαζ πανυκηεξ ηαζ ζε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ πμο εηηείκμκηαζ ζε πμθθέξ ηάλεζξ ιεβέεμοξ. Χξ απμηέθεζια δ επζηφνςζδ ηδξ ιδ ζημπεοιέκδξ ακάθοζδξ δεκ είκαζ ηυζμ απθή [42]. 51

67 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 5 Ο : ΣΟ ΜΔΛΗ 5.1 ΣΟ ΜΔΛΗ ΚΑΗ ΣΑ ΔΗΓΖ ΣΟΤ φιθςκα ηαζ ιε ηδκ Κμζκμηζηή Νμιμεεζία, ιέθζ είκαζ δ θοζζηή βθοηζά μοζία πμο πανάβμοκ μζ ιέθζζζεξ ημο είδμοξ Apis melifera απυ ημ κέηηαν ηςκ θοηχκ ή απυ εηηνίζεζξ γχκηςκ ιενχκ θοηχκ ή εηηνίιαηα εκηυιςκ απμιογμφκηςκ θοηά πάκς ζηα γχκηα ιένδ ηςκ θοηχκ, ηα μπμία μζ ιέθζζζεξ ζοθθέβμοκ, ιεηαηνέπμοκ ακαιεζβκφμκηαξ ιε εζδζηέξ φθεξ ημο ζχιαηυξ ημοξ, απμεέημοκ, αθοδαηχκμοκ, εκαπμεδηεφμοκ ηαζ θοθάζζμοκ ζηζξ ηδνήενεξ ηδξ ηορέθδξ πνμηεζιέκμο κα ςνζιάζμοκ [44]. Ωξ αµζβέξ εεςνείηαζ ημ µέθζ ζημ μπμίμ οπενζζπφμοκ ηα μνβακμθδπηζηά, θοζζημπδµζηά ηαζ µζηνμζημπζηά παναηηδνζζηζηά εκυξ ζοβηεηνζµέκμο θοημφ ηαζ βεκζηά ηαοηίγεηαζ µε πανμοζία ηςκ βονεμηυηηςκ ημο ζημ µέθζ >45% ημο ζοκυθμο ηςκ βονεμηυηηςκ. Αοηυ ημ πμζμζηυ πμζηίθθεζ ακάθμβα µε ημ θοηυ απυ ημ μπμίμ πνμένπεηαζ ημ µέθζ [45]. Γζαηνίκμοιε ηα ιέθζα ζε δομ ηαηδβμνίεξ. Σα ιέθζα ακεέςκ ή κέηηανμξ πμο πνμένπμκηαζ απυ ημ κέηηαν ηςκ θοηχκ ηαζ ηα ιέθζα ιεθζηχιαημξ πμο πνμένπμκηαζ απυ ημοξ θοζζημφξ ποιμφξ ηςκ θοηχκ ηαζ ηςκ εκηυιςκ πμο ηνέθμκηαζ απυ ηα θοηά αοηά. ηδκ πνχηδ ηαηδβμνία ακήηεζ ημ εοιανίζζμ ιέθζ εκχ ηαηαηάζμκηαζ ηαζ ηα ιέθζα εζπενζδμεζδχκ (πμνημηαθζάξ), εοηαθφπημο, νεζηζμφ, ιέκηαξ, θεαάκηαξ, αηαηίαξ, ιμοζιμοθζάξ, θαζημιδθζάξ, ημοιανζάξ, ηαζηακζάξ, αεθακζδζάξ ηαζ ανηεηχκ άθθςκ μπςνμθυνςκ δέκηνςκ ή απυ ενμφιπζ ηαζ ηζάζ ημο αμοκμφ, πμο έπμοκ ηεθείςξ ημπζηυ παναηηήνα ηαζ πανάβμκηαζ ζε ιζηνυηενεξ πμζυηδηεξ. ηδ δεφηενδ ηαηδβμνία ακήημοκ ηα ιέθζα πεφημο ηαζ εθάημο [46]. Θπκαξίζην κέιη: Σμ εοιανίζζμ ιέθζ είκαζ ημ πνμηζιχιεκμ απυ υθα ηα αιζβή ιέθζα ζηδκ Δθθάδα, ιε ηδκ ηζιή ημο ηοιαίκεηαζ απυ 2 έςξ 3 θμνέξ ορδθυηενδ απυ μπμζαδήπμηε άθθμ ιέθζ. Υάνζξ ζημ λεπςνζζηυ άνςια ηαζ ηδ βεφζδ ημο, έπεζ ηενδίζεζ ηδκ εηηίιδζδ ηςκ ηαηακαθςηχκ. Σμ εοιάνζ απμηεθεί ηδκ πζμ ζδιακηζηή ζοβημιζδή ιεθζμφ ζηδκ Δθθάδα, ηαζ ςξ εη ημφημο έπεζ θάαεζ ιεβάθδ πνμζμπή βζα ιεβάθμ πνμκζηυ δζάζηδια. Αοηυ είκαζ πμο ηάκεζ απαναίηδηδ ηδ δδιζμονβία κέςκ ιέηνςκ χζηε κα ελαζθαθίγεηαζ έκα ηαθφηενμ πνμσυκ βζα ημκ ηαηακαθςηή ηαζ έκαξ απυ ημοξ ηφνζμοξ ζηυπμοξ είκαζ κα ανεεεί ηνυπμξ χζηε κα ηαεμνίγεηαζ δ αμηακζηή ημο πνμέθεοζδ. ηδ αζαθζμβναθία πμθθέξ πηδηζηέξ εκχζεζξ έπμοκ πνμηαεεί ςξ δείηηεξ ημο εοιανίζζμο ιεθζμφ, ζπεδυκ υθεξ απυ αοηέξ είκαζ θαζκμθζηέξ εκχζεζξ. [47,48]. 52

68 5.2. ΤΣΑΖ ΜΔΛΗΟΤ Φπζηθά θαη Οξγαλνιεπηηθά Υαξαθηεξηζηηθά Μειηνύ Υξώκα: Σμ πνχια πμζηίθεζ ακαθυβςξ ιε ηδ αμηακζηή πνμέθεοζδ απυ ηίηνζκμ, πνοζαθί, θαζμιέθακ ή ενοενυθαζμ έςξ ζπεδυκ ιαφνμ. Δπίζδξ ημ πνχια πμζηίθεζ ακάθμβα ηδκ επμπή εκχ επδνεάγεηαζ πμθφ ηαζ απυ ημκ πνυκμ απμεήηεοζδξ αθθά ηαζ ηδκ έηεεζδ ζηδκ εενιυηδηα. Σμ ιεβαβαθφηενμ ιένμξ ηδξ αθθαβήξ ημο πνχιαημξ πνμξ ζημονυηενα πνχιαηα, μθείθεηαζ ζηζξ ακηζδνάζεζξ Maillard ακάιεζα ζηα αιζκμλέα ημο ιεθζμφ ηαζ ζηα ακάβμκηα ζάηπανά ημο. Άξσκα-γεύζε: Σμ άνςια ηαζ δ βεφζδ πμζηίθεζ αηυιδ πενζζζυηενμ απυ ημ πνχια. Σμ ιέθζ ιπμνεί κα έπεζ εθαθνή ή έκημκμ άνςια πάκηα υιςξ αοηυ ελανηάηαζ απυ ηδ αμηακζηή ημο πνμέθεοζδ. Οζ πηδηζηέξ μοζίεξ ηαεμνίγμοκ ηαηά ηφνζμ θυβμ ημ άνςια ημο ιεθζμφ ηαζ ηέημζεξ είκαζ δζάθμνεξ αθδεΰδεξ, ηεηυκεξ, αθημυθεξ ηαεχξ ηαζ εζηένεξ. Ημώδεο: Οζ νεμθμβζηέξ ζδζυηδηεξ ημο ιεθζμφ ελανηχκηαζ απυ ημ είδμξ ηαζ ημ πμζμζηυ ηςκ μοζζχκ πμο ανίζημκηαζ ζ αοηυ είηε ζε δζάθοζδ, είηε ζε δζαζπμνά. Μεβάθμ ιένμξ ηςκ ζδζμηήηςκ αοηχκ ελανηάηαζ ηαζ απυ ηδκ πενζεηηζηυηδηά ημο ζε οβναζία. Σμ ζλχδεξ επδνεάγεηαζ πμθφ ηαζ απυ ηδκ εενιμηναζία. Γεκζηά ιε ηδκ αφλδζδ ηδξ εενιμηναζίαξ ημο ιεθζμφ παναηδνείηαζ ιείςζδ ημο ζλχδμοξ. Έπεζ πνμζδζμνζζηεί υηζ 1% πενζεηηζηυηδηα οβναζίαξ έπεζ ηδκ ίδζα επίδναζδ ζημ ζλχδεξ ημο ιεθζμφ υζμ πενίπμο 3,5 C. Θεξκηθέο ηδηόηεηεο: Ζ εζδζηή εενιυηδηα, πμζηίθθεζ ακάθμβα ιε ηδ ζφκεεζδ. Ζ εενιζηή αβςβζιυηδηα ημο ιεθζμφ είκαζ ζπεηζηά παιδθή, ηαζ αολάκεηαζ ιε ηδ εενιμηναζία ηαζ ηα ζοκμθζηά ζηενεά, ηοιαζκυιεκδ απυ έςξ cal/cm 2 /sec/ 0 C. Αοηή δ ηζιή ηδξ εενιζηήξ αβςβζιυηδηαξ, πμο είκαζ πενίπμο 6 θμνέξ ιζηνυηενδ απυ εηείκδ ημο κενμφ, ζε ζοκδοαζιυ ιε ημ ορδθυ ημο ζλχδεξ, μδδβεί ζηδ βνήβμνδ οπενεένιακζδ απυ ζδιεζαηέξ πδβέξ εενιυηδηαξ ηαζ έηζζ δδιζμονβεί ηδκ ακάβηδ βζα πνμζεηηζηή ακάδεοζδ ηαζ βζα εένιακζδ ιυκμ ζε οδαηυθμοηνμ. Κξπζηάιισζε: Σμ ιέθζ απ ηδκ θφζδ ημο είκαζ έκα οπενημνεζιέκμ δζάθοια ζαηπάνςκ. Σμ χνζιμ ιέθζ έπεζ ηυζμ θίβδ οβναζία (15-20%) ηαζ ηυζα πμθθά ζηενεά (80-85%) χζηε ηα δφμ αοηά ζημζπεία κα ανίζημκηαζ ζε ιζα πναβιαηζηή εοαίζεδηδ ζζμννμπία. Απυ ηα ηνία ζάηπανα ημο ιεθζμφ (θνμοηηυγδ, βθοηυγδ, ζαηπανυγδ) δ βθοηυγδ είκαζ αοηή πμο έπεζ ηδκ ηδ ιεβαθφηενδ ηάζδ ηνοζηάθθςζδξ. Πανυθμ πμο υθα ηα ιέθζα ηνοζηαθθχκμοκ ανβά ή βνήβμνα ιε ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο (ακάθμβα ιε ημ είδμξ ημοξ), εκ ημφημζξ ζηδκ Δθθάδα ζε ακηίεεζδ ιε μνζζιέκεξ άθθεξ πχνεξ ημ γαπάνςια ημο ιεθζμφ εεςνείηαζ έκα απυ ηα ιεβαθφηενα πνμαθήιαηα ηαζ ιεζμκεηηήιαηα ημο. Πμθθμί ηαηακαθςηέξ εεςνμφκ υηζ εάκ ημ ιέθζ έπεζ ηνοζηαθθχζεζ έπεζ αθθμζςεεί ή έπεζ κμεεοηεί ιε γάπανδ. Ζ ηνοζηάθθςζδ ημο ιεθζμφ είκαζ ίζςξ απυ ηα πζμ ιεθεηδιέκα ζημζπεία. 53

69 Τγξαζία: Ζ πενζεηηζηυηδηα ημο ιεθζμφ ζε οβναζία απμηεθεί έκα απυ ηα ααζζηά παναηηδνζζηζηά ημο. Έκα χνζιμ ιέθζ πενζέπεζ οβναζία ζοκήεςξ ηάης απυ 18.5 %. Ζ πνμηζιδηέα πενζεηηζηυηδηα ημο είκαζ ηάης απυ 17%. Ζ πενζέηηζηυηδηα ζε οβναζία ζοκδέεηαζ άιεζα ιε ηδ ζηαεενυηδηα ημο ιεθζμφ εκάκηζα ζηδ γφιςζδ ηαζ ηδκ ηνοζηάθθςζδ. Όηακ δ οβναζία είκαζ ηάης ημο 17% δ πζεακυηδηα γφιςζδξ βίκεηαζ ελαζνεηζηά ιζηνή. Ζ ηάζδ ηνοζηάθθςζδξ, ακηίεεηα ιε ηδκ ηάζδ γφιςζδξ, είκαζ αοζηδνυηενα ζοκδεδειέκδ ιε ηδκ ακαθμβία βθοηυγδ/οβναζία. Δπμιέκςξ, υζμ ιζηνυηενδ δ οβναζία, ή υζμ πενζζζυηενδ δ βθοηυγδ, ηυζμ εοημθυηενα ηνοζηαθθχκεζ ημ ιέθζ [49] Υεκηθή ύζηαζε ηνπ Μειηνύ Σμ ιέθζ απμηεθείηαζ ηονίςξ απυ οδαηάκεναηεξ (60-85%), κενυ (17-20%), ακυνβακδ ηαζ μνβακζηή φθδ (1-2%) υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 5.1. Γεκζηά ημ ιέθζ πενζέπεζ 65-70% ιμκμζαηπανίηεξ, δζζαηπανίηεξ, ηνζζαηπανίηεξ ηαζ μθζβμζαηπανίηεξ. οκακηχκηαζ επίζδξ ημοθάπζζημκ 200 μοζίεξ υπςξ αιζκμλέα, έκγοια, πνςηεΐκεξ, αζηαιίκεξ, μνβακζηά μλέα, θαζκμθζηέξ εκχζεζξ ηαζ πηδηζηέξ εκχζεζξ [50]. Πενζζζυηενδ πνμζμπή ζηδκ πανμφζα δζπθςιαηζηή ενβαζία εα δςεεί ζηζξ μιάδεξ ιεηααμθζηχκ πμο ιεθεηήεδηακ (ζάηπανα, αιζκμλέα, μνβακζηά μλέα, αζηαιίκεξ). Σρήκα 5.1: Πνζνζηηαία ζπκκεηνρή ησλ θπξηόηεξσλ ζπζηαηηθώλ ηνπ κειηνύ άθραξα Μμκμζαηπανίηεξ ακηζπνμζςπεφμοκ πενίπμο ημ 75% ηςκ ζαηπάνςκ πμο απακηχκηαζ ζημ ιέθζ, ιαγί ιε 10-15% δζζαηπανίηεξ ηαζ ιζηνέξ πμζυηδηεξ άθθςκ ζαηπάνςκ. Σα ζάηπανα πμο οπάνπμοκ ζημ ιέθζ είκαζ οπεφεοκα βζα πμθθέξ ζδζυηδηεξ ημο ιεθζμφ, υπςξ δ εκενβεζαηή αλία, ημ ζλχδεξ, οβνμζημπζηυηδηα ηαζ δ ηνοζηάθθςζδ [51]. Ζ ζφκεεζδ ηςκ ζαηπάνςκ ελανηάηαζ ηονίςξ απυ ηδ αμηακζηή πνμέθεοζδ ημο ιεθζμφ, απυ ηδ βεςβναθζηή ημο πνμέθεοζδ ηαζ επδνεάγεηαζ επίζδξ απυ ημ ηθίια ηδκ 54

70 επελενβαζία ηαζ ηδκ απμεήηεοζδ. Ζ ζοβηέκηνςζδ θνμοηηυγδξ ηαζ ηδξ βθοηυγδξ ηαεχξ ηαζ δ ιεηαλφ ημοξ ακαθμβία είκαζ πνήζζιμζ δείηηεξ βζα ηδκ ηαλζκυιδζδ ηςκ ιεθζχκ. ε ζπεδυκ υθα ηα είδδ ιεθζμφ, δ θνμοηηυγδ είκαζ μ οδαηάκεναηαξ πμο οπάνπεζ ζε ιεβαθφηενμ πμζμζηυ [52,53]. Σμ πνμθίθ ζαηπάνςκ ηςκ ιεθζχκ έπεζ ιεθεηδεεί απυ πμθθμφξ εζπζηήιμκεξ παβημζιίςξ υπςξ θαίκεηαζ ζημκ πίκαηα 5.1. Πζκαηαξ 5.1: Ακαθοηζηέξ ηεπκζηέξ βζα ηδκ εφνεζδ ημο πνμθίθ ζαηπάνςκ ζημ ιέθζ. Τπόζηξσκα Πξνθαηεξγαζία Δλώζεηο πνπ Αλαιπηηθή Παξαπ. Σαπηνπνηήζεθαλ Σερληθή Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία ηαζ Ρμοιακία. Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 10mg/l Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, Μεθεγζηυγδ, Μαθηυγδ HPAEC-PAD [52] Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Λζεμοακία. Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Γαθθία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο ζε ηεθζηή ηζιή Brix 5-6. Λομθζθίςζδ. Παναβςβμπμίδζδ ιε TMSI Παναβςβμπμίδζδ ιε HMDS, TFA Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο ζε ηεθζηή ηζιή Brix 5-6. Λομθζθίςζδ. Παναβςβμπμίδζδ ιε TMSI Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ2Ο 1/ Φζθηνάνζζια Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Δλάηιζζδ. Παναβςβμπμίζδ ιε HDMS ηαζ TFA Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, μοηνυγδ Μαθηυγδ, Ηζμιαθηυγδ, Σονακυγδ, Σνεαθυγδ, Παθαηζκυγδ, Κεθθμαζυγδ, Ραθζκυγδ, Πακυγδ Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, μοηνυγδ, Μαθηυγδ, Μαθημοθυγδ, Kojibiose, Ηζμιαθηυγδ, Ραθζκυγδ, Δνθυγδ, Μεθεγζηυγδ Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, μοηνυγδ, Μαθηυγδ, Μαθημοθυγδ, Σονακυγδ, Σνεαθυγδ, Παθαηζκυγδ, Λαιζκανμαζυγδ, Μεθζαζυγδ, Ηζμιαθηυγδ, Γεκηζαζυγδ, Ραθζκυγδ, Νεμηεζηυγδ, 1-ηεζηυγδ, Δνθυγδ, Μεθεγζηυγδ, Μαθημηνζυγδ, Πακυγδ Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, μοηνυγδ, Κεθθμαζυγδ, α- α-ηνεαθυγδ, α-α-ηνεαθυγδ, Δνθυγδ, Λαιζκανμαζυγδ, Μαθημοθυγδ, Νζβενυγδ, Σονακυγδ, Kojibiose, Μαθηυγδ, Σνεαθμοθυγδ, Παθαηζκυγδ, Πακυγδ, Γεκηζαζυγδ, Ηζμιαθηυγδ, Ραθζκυγδ, 6- ηεζηυγδ, Νεμηεζηυγδ, Μεθεγζηυγδ, Πθακηευγδ, Θεακηενυγδ, Μαθημηνζυγδ, Ηζμιαθημηνζυγδ GC-FID [53] GC-FID [54] GC-FID [55] LC-PAD GC-MS [56] 55

71 Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Γαθθία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Δθθάδα Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ ηαζ βεςβναθζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Αθβενία Μέθζα απυ Βναγζθία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Νέα Εδθακδία Μέθζα απυ Κίκα Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Φζθηνάνζζια Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Πνμζεήηδ εκενβμφ άκεναηα Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο ηαζ αηεημκζηνίθζμ Φζθηνάνζζια Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, αηπανυγδ, Δνθυγδ, Ραθζκυγδ, Μεθεγζηυγδ Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, μοηνυγδ, Σνεαθυγδ, Μάθημγδ, Ηζμιαθηυγδ, Ραθζκυγδ, Δνθυγδ, Μεθεγζηυγδ, Πακυγδ, Ηζμιαθημηνζυγδ, Μαθημηνζυγδ, Μαθημηεηνυγδ Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, μοηνυγδ, Σνεαθυγδ, Μάθημγδ, Ηζμιαθηυγδ, Σονακυγδ, Ραθζκυγδ, Δνθυγδ, Μεθεγζηυγδ, Μεθζαζυγδ Φνμοηηυγδ, Γθοηυγδ, μοηνυγδ Φνμοηηυγδ, Ηζμιαθηυγδ, Σονακυγδ, Kojibiose, Μεθεγζηυγδ, Μάθημγδ, Νζβενυγδ, Θεακηενυγδ, Δνθυγδ, Πακυγδ, μοηνυγδ,, Γθοηυγδ, Μαθημνζυγδ Μαθηυγδ, Μαθημηνζυγδ, Μαθημηεηνυγδ, Μαθημπεκηυγδ, Μαθημελυγδ, Μαθημεπηυγδ HPLC-PAD [57] GC-MS [58] HPAEC-PAD [59] CE-DAD [60] HPAEC-PAD [61] UPLC-ELSD [62] Οξγαληθά Ομέα Ζ παναηηδνζζηζηή βεφζδ ηαζ ημ άνςια ημο ιεθζμφ μθείθμκηαζ εκ ιένδ ηαζ ζηδκ πενζεηηζηυηδηά ημο ζε μλέα. Σμ ph ημο ιεθζμφ είκαζ ζοκήεςξ ιε εφνμξ απυ Σα μνβακζηά μλέα, απμηεθμφκ πενίπμο ημ 0,5% ηςκ ζοζηαηζηχκ ημο ιεθζμφ. Ανπζηά είπε εεχνδεεζ υηζ ημ ηφνζμ μλφ ημο ιεθζμφ ήηακ ημ ιονιδηζηυ ηαζ ανβυηενα ημ ηζηνζηυ. ηδ ζοκέπεζα υιςξ ανέεδηε υηζ ημ ηφνζμ μλφ ημο ιεθζμφ είκαζ ημ βθοημκζηυ μλφ, πμο πανάβεηαζ ιε δνάζδ ημο εκγφιμο μλεζδάζδ βθοηυγδξ πάκς ζηδ βθοηυγδ [49]. Ανηεηέξ ακαθμνέξ έπμοκ βίκεζ απυ επζζηήιμκεξ ηαζ βζα ημ πνμθίθ ηςκ μνβακζηχκ μλέςκ ζημ ιέθζ (πίκαηαξ 5.2). 56

72 Πίκαηαξ 5.2: Ακαθοηζηέξ ηεπκζηέξ βζα ηδκ έονεζδ ημο πνμθίθ μνβακζηχκ μλέςκ ζημ ιέθζ. Τπόζηξσκα Πξνθαηεξγαζία Ομέα πνπ Σαπηνπνηήζεθαλ Αλαιπηηθή Σερληθή Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Πνμζανιμβή ph. Γζήεδζδ. SPE Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Πνμζανιμβή ph. Φζθηνάνζζια Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Πνμζανιμβή ph. Γζήεδζδ. SPE Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Φζθηνάνζζια Μαθζηυ, Κζηνζηυ, Ζθέηηνζηυ, Φμοιανζηυ Γθοημκζηυ, Πονμζηαθοθζηυ Ολαθζηυ, Φμνιζηυ, Μαθζηυ, Γθοημκζηυ, Κζηνζηυ, Πονμζηαθζθζηυ, Λαηηζηυ, Ολζηυ Μαθζηυ, Μαθεσηυ, Κζηνζηυ, Ζθεηηνζηυ, Φμοιανζηυ Κζηναιδθζηυ, Κζκζηυ, Ζθεηηνζηυ, Λαηηζηυ, Μονιδηζηυ, Γθμοηανζηυ, Πνμπζμκζηυ, Βμοηονζηυ, Ολαθζηυ, Γθοημονμκζηυ, Κζηνζηυ, Πονμζηαθοθζηυ, Φμοιανζηυ, Φμνιζηυ Παξαπ. HPLC-UV [63] CZE-UV [64] HPLC-UV [65, 66] HPLC-UV-Vis [67, 68] Ακηλνμέα Σα αιζκμλέα ακηζπνμζςπεφμοκ πενίπμο ημ 1% (w/w) απυ ηα ζοζηαηζηά ημο ιεθζμφ ηαζ μζ ζπεηζηέξ ημοξ ακαθμβίεξ ελανηχκηαζ απυ ηδκ πνμέθεοζδ ημο ιεθζμφ (κέηηαν ή ιεθζηχιαημξ) [69]. Σμ πζμ άθεμκμ αιζκμλφ ζημ ιέθζ ηαζ ηδ βφνδ είκαζ δ πνμθίκδ, εκχ άθθα αιζκμλέα πμο ζοκακηχκηαζ ζοπκά ζημ ιέθζ είκαζ ημ βθμοηαιζκζηυ μλφ, δ αθακίκδ, δ θαζκοθαθακίκδ, δ ηονμζίκδ, δ θεοηίκδ ηαζ δ ζζμθεοηίκδ ιαγί ιε πμθθά αηυιδ (πίκαηαξ 5.3). Ζ πνμθίκδ πνμένπεηαζ ηονίςξ απυ ηζξ εηηνίζεζξ ηςκ ζζεθμβυκςκ αδέκςκ ηςκ ιεθζζζχκ (Apis mellifera L.) ηαηά ηδκ ιεηαηνμπή ημο κέηηαν ζε ιέθζ. ημ ιέθζ, δ πνμθίκδ ακηζπνμζςπεφεζ πενίπμο 50-85% ημ απυ ημ ζφκμθμ ηςκ αιζκμλέςκ. Ζ πνμθίκδ έπεζ πνδζζιμπμζδεεί ςξ ηνζηήνζμ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ ςνίιακζδξ ημο ιεθζμφ, ηαζ ζε μνζζιέκεξ πενζπηχζεζξ, ςξ δείηηδξ κμεείαξ ιε γάπανδ. Μζα εθάπζζηδ ηζιή ηςκ 180 mg kg -1 πνμθίκδξ είκαζ απμδεηηή ςξ δ μνζαηή ηζιή βζα ημ αβκυ ιέθζ. Πίκαηαξ 5.3: Ακαθοηζηέξ ηεπκζηέξ βζα ηδκ εφνεζδ ημο πνμθίθ αιζκμλέςκ ζημ ιέθζ. Τπόζηξσκα Πξνθαηεξγαζία Ομέα πνπ Σαπηνπνηήζεθαλ Αλαιπηηθή Σερληθή Παξαπν κπή Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ ηαζ βεςβναθζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία Αναίςζδ ιεθζμφ ιε α- αιζκμαμοηονζηυ μλφ. Παναβςβμπμίδζδ. α-αθακίκδ, α-αθακίκδ, Ανβζκίκδ, Αζπανηζηυ μλφ, Βαθίκδ, Γθμοηαιίκδ, Γθμοηαιζκζηυ μλφ, Γθοηίκδ, Θνεμκίκδ, Ηζμθεοηίκδ, Ηζηζδίκδ, Κοζηεσκδ, Λεοηίκ, Λοζίκδ, HPLC-PDA [69] 57

73 Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Ηζπακία Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ ηαζ βεςβναθζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Δζεμκία. Μέθζ Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Γζήεδζδ ιε πνήζδ νδηίκδξ. Ξήνακζδξ ηαζ επακδζαθοημπμίδζδ. Παναβςβμπμίδζδ ιε εζδζηυ kit. Απμιυκςζδ αιζκμλέςκ ιε πνήζδ νδηίκδξ. Παναβςβμπμίδζδ ιε OPA Γζάθοζδ ιεθζμφ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια θςζθμνζηχκ. Γζήεδζδ. SPE. Ξήνακζδ ηαζ επακδζαθοημπμίδζδ. Παναβςβμπμίδζδ ιε DEEM, MeOH, Εφβζζδ. Φοβμηέκηνδζδ. Φζθηνάνζζια. Μεεεζμκίκδ, Πνμθίκδ, Σνοπημθάκδ, Σονμζίκδ, Φαζκοθαθακίκδ Αθακζκδ, Αζπανηζηυ μλφ, Αζπαναβίκδ, Βαθίκδ, Γθμοηαιίκδ, Γθμοηαιζκζηυ μλφ, Γθοηίκδ, Θνεμκίκδ, Ηζμθεοηίκδ, Ηζηζδίκδ, Λεοηίκδ, Λοζίκδ, Μεεεζμκίκδ, Πνμθίκδ, ενίκδ, Σονμζίκδ, Σνοπημθάκδ, Φαζκοθαθακίκδ Αθακίκδ, Ανβζκίκδ, Αζπανηζηυ μλφ, Αζπαναβίκδ, Βαθίκδ Γθμοηαιίκδ, Γθμοηαιζκζηυ μλφ, Γθοηίκδ, Θνεμκίκδ, Ηζμθεοηίκδ, Ηζηζδίκδ, Λεοηίκδ, Λοζίκδ, Μεεεζμκίκδ, Πνμθίκδ, ενίκδ, Σονμζίκδ, Σνοπημθάκδ, Φαζκοθαθακίκδ α-αθακίκδ, α-αθακίκδ, Ανβζκίκδ, Αζπανηζηυ μλφ, Βαθίκδ, Γθμοηαιίκδ, Γθμοηαιζκζηυ μλφ, Γθοηίκδ, Θνεμκίκδ, Ηζμθεοηίκδ, Ηζηζδίκδ, Κοζηεσκδ, Λεοηίκδ, Λοζίκδ, Μεεεζμκίκδ, Πνμθίκδ, ενίκδ, Σονμζίκδ, Σνοπημθάκδ, Φαζκοθαθακίκδ Αθακίκδ, Ανβζκίκδ, Αζπανηζηυ μλφ, Αζπαναβίκδ, Κοζηεΐκδ, Βαθίκδ Γθμοηαιίκδ, Γθμοηαιζκζηυ μλφ, Γθοηίκδ, Θνεμκίκδ, Ηζμθεοηίκδ, Ηζηζδίκδ, Λεοηίκδ, Λοζίκδ, Μεεεζμκίκδ, Πνμθίκδ, ενίκδ, Σονμζίκδ, Σνοπημθάκδ, Φαζκοθαθακίκδ GC-FID [70] GC-MS HPLC-FLD [71] LC-UV [72] LC-MS LC/APCI-MS [73] 58

74 Μέθζα δζαθμνεηζηήξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ απυ Γαθθία Μέθζ Αναίςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο. Γζήεδζδ. Παναβςβμπμίδζδ ιε OPA ηαζ FMOC. Αναζςζδ ιεθζμφ ιε Ζ 2 Ο ηαζ ACN. Φζθηνάνζζια Αθακίκδ, Ανβζκίκδ, Αζπανηζηυ μλφ, Βαθίκδ, Γθμοηαιίκδ, Γθμοηαιζκζηυ μλφ, Γθοηίκδ, Θνεμκίκδ, Ηζμθεοηίκδ, Ηζηζδίκδ, Κοζηεσκδ, Λεοηίκδ, Λοζίκδ, Μεεεζμκίκδ, Πνμθίκδ, ενίκδ, Σνοπημθάκδ, Φαζκοθαθακίκδ Αθακίκδ, Ανβζκίκδ, Αζπανηζηυ μλφ, Αζπαναβίκδ, Βαθίκδ, Γθμοηαιίκδ, Γθμοηαιζκζηυ μλφ, Γθοηίκδ, Θνεμκίκδ, Ηζμθεοηίκδ, Ηζηζδίκδ, Κοζηεσκδ, Λεοηίκδ, Λοζίκδ, Μεεεζμκίκδ, Πνμθίκδ, ενίκδ, Σνοπημθάκδ, Σονμζίκδ, Φαζκοθαθακίκδ, β-αιζκμαμοηοηζηυ, HPLC-FLD [74] LC-MS [75] Βηηακίλεο Σμ ιέθζ παναηηδνίγεηαζ βεκζηά ςξ θηςπυ ζε αζηαιίκεξ. ε αοηυ έπμοκ εκημπζζηεί ηονίςξ οδαημδζαθοηέξ αζηαιίκεξ ημοξ ζοιπθέβιαημξ Β, υπςξ εεζαιίκδ (Β1), νζαμθθααίκδ (Β2), κζημηζκζηυ μλφ (Β3), πακημεεκζηυ μλφ (Β5), πονζδμλίκδ (Β6), αζμηίκδ (Β8 ή H) ηαζ θμθζηυ μλφ (B9). Ζ αζηαιίκδ C είκαζ επίζδξ πανμφζα. Οζ αζηαιίκεξ πμο οπάνπμοκ ζημ ιέθζ δζαηδνμφκηαζ θυβς ημο παιδθμφ ph. Ζ αζηαιίκδ C ανίζηεηαζ ζπεδυκ ζε υθα ηα είδδ ημο ιεθζμφ ηαζ ζε αοηή έπεζ απμδμεεί δ ακηζμλεζδςηζηή δνάζδ ημο. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ αζηαιίκδξ C είκαζ έκαξ αζηαεήξ δείηηδξ, επεζδή είκαζ πμθφ εοάθςηδ ζηδ πδιζηή ηαζ εκγοιαηζηή μλείδςζδ ηαζ έπεζ έκα επζηαποκυιεκμ νοειυ ιεηααμθήξ πμο μθείθεηαζ ζε δζάθμνμοξ πανάβμκηεξ, υπςξ ημ θςξ, ημ μλοβυκμ ή ηδ εενιυηδηα. Ζ πνχηδ ιεθέηδ ηςκ αζηαιζκχκ ζημ ιέθζ έβζκε ανπζηά ιε αζμθμβζηέξ ιεευδμοξ πνμζδζμνζζιμφ [76]. Μυκμ ιεηά ημ 1940, εζζήπεδζακ πδιζηέξ ιέεμδμζ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο αζημναζημφ μλέμξ. Ο Ciulu ηαζ μζ ζοκενβάηεξ ημο επζηονχζακ ιζα ηαπεία ηαζ απθή ιέεμδμ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ορδθήξ απυδμζδξ-ακηίζηνμθδξ θάζδξ (HPLC-RP) βζα κα πνμζδζμνίζμοκ ηαοηυπνμκα 5 οδαημδζαθοηέξ αζηαιίκεξ (νζαμθθααίκδ, κζημηζκζηυ μλφ, πακημεεκζηυ μλφ, θμθζηυ μλφ ηαζ αζημναζηυ μλφ) [77].. 59

75 5.3 Βνηαληθή θαη Γεσγξαθηθή Πξνέιεπζε ηνπ Μειηνύ. Ο παναηηδνζζιυξ ηςκ αιζβχκ ειπμνζηά δζαεέζζιςκ ιεθζχκ, είκαζ έκα δφζημθμ ένβμ πμο λεηίκδζε ζηδκ Δονχπδ ςξ απάκηδζδ ζηζξ απαζηήζεζξ ηςκ ηαηακαθςηχκ. Πθέμκ δεκ απαζηείηαζ ιυκμ έκα ααζζηυ επίπεδμ πμζυηδηαξ, αθθά ηαζ ζαθήξ πνμζδζμνζζιυξ βεςβναθζηήξ ηαζ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ. ηδκ Δ.Δ, μ ηακμκζζιυξ βζα ημ ιέθζ ακαθένεζ υηζ δ βεςβναθζηή ηαζ αμηακζηή πνμέθεοζδ αοημφ ημο πνμσυκημξ πνέπεζ κα ακαβνάθμκηαζ ζηζξ εηζηέηεξ ηδξ ζοζηεοαζίαξ [78]. Ο έθεβπμξ ημο ιεθζμφ απαζηεί ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ παναιέηνςκ πμο εα ιπμνμφζακ ακαιθίαμθα κα ηαεμνίζμοκ ηδκ πνμέθεοζδ βζ αοηυ ηαζ απαζημφκηαζ πνμζπάεεζεξ βζα ηδ αεθηίςζδ ημο παναηηδνζζιμφ ημο ιεθζμφ. Ζ µεθζζζμπαθοκμθμβζηή ακάθοζδ, δ ακάθοζδ ηαζ ακαβκχνζζδ ηςκ ηυηηςκ βφνδξ πμο πενζέπμκηαζ ζημ ιέθζ, ζε ζοκδοαζµυ µε ηα μνβακμθδπηζηά παναηηδνζζηζηά, εεςνείηαζ αλζυπζζηδ µέεμδμξ ακαθμνάξ βζα ημκ πνμζδζμνζζµυ ηδξ αμηακζηήξ ηαζ βεςβναθζηήξ πνμέθεοζδξ ημο µεθζμφ [79]. Χζηυζμ, μζ πενζμνζζιμί ηδξ έπμοκ εκεαννφκεζ ηδκ ένεοκα βζα θοζζημπδιζηέξ παναιέηνμοξ. Μενζηά αιζβή ιέθζα, έπμοκ ζοβηεηνζιέκεξ πδιζηέξ ή θοζζηέξ ζδζυηδηεξ, μζ μπμίεξ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα κα επζαεααζχζμοκ ηα απμηεθέζιαηα ηςκ ιζηνμζημπζηχκ ακαθφζεςκ [78]. Καηά ηδ δζάεεζή ημο ζημ ειπυνζμ ςξ ιέθζ ή υηακ πνδζζιμπμζείηαζ ζε μζμδήπμηε πνμσυκ πμο πνμμνίγεηαζ βζα ηαηακάθςζδ απυ ημκ άκενςπμ, ημ ιέθζ πνέπεζ κα ακηαπμηνίκεηαζ ζηα παναηηδνζζηζηά ζφζηαζδξ πμο πενζθαιαάκμκηαζ ζημκ πίκαηα 5.4. Ζ ζφζηαζδ ηαζ μζ ζδζυηδηεξ ημο ιεθζμφ παναηίεεκηαζ ζημκ πίκαηα 5.4 πμο αημθμοεεί. Πίκαηαξ 5.4: Υαναηηδνζζηζηά ηδξ ζφζηαζδξ ημο ιεθζμφ ζφιθςκα ιε ηδκ Δονςπασηή Οδδβία [44]. Πεξηεθηηθόηεηα ζε γιπθόδε θαη ζε θξνπθηόδε (άζξνηζκα θαη ησλ δύν) Μέθζ κέηηανμξ Όπζ θζβυηενμ απυ 60 g/100 g Μέθζ ιεθζηχιαημξ Όπζ θζβυηενμ απυ 45 g/ 100 g Πεξηεθηηθόηεηα ζε ζαθραξόδε Γεκζηά Όπζ πενζζζυηενμ απυ 5 g/ 100 g Φεοδαηαηία, Μδδζηή, Βαβλία, Ζδφζανμκ, Όπζ πενζζζυηενμ απυ 10 g/ 100 g Δνοενυξ Δοηάθοπημξ, Δζπενζδμεζδή Τγξαζία Γεκζηά Όπζ πενζζζυηενμ απυ 20 % Μέθζ ενείηδξ ηαζ γαπανμπθαζηζηήξ Όπζ πενζζζυηενμ απυ 23 % Μέθζ γαπανμπθαζηζηήξ απυ ενείηδ Όπζ πενζζζυηενμ απυ 25 % Πεξηεθηηθόηεηα ζε κε πδαηνδηαιπηέο νπζίεο Γεκζηά Όπζ πενζζζυηενμ απυ 0,1 g/100 g Μέθζ πζέζεςξ Όπζ πενζζζυηενμ απυ 0,5 g/100g Ζιεθηξηθή αγσγηκόηεηα Μέθζ ιδ ακαθενυιεκμ ηαηςηένς ηαζ Όπζ πενζζζυηενμ απυ 0,8 ms/cm ιείβιαηα ηςκ ιεθζχκ αοηχκ Μέθζ ιεθζηχιαημξ ηαζ ιέθζ ακεέςκ Όπζ θζβυηενμ απυ 0,8 ms/cm ηαζηακζάξ 60

76 Δλαζνέζεζξ: ημοιανζά, ενείηδ, εοηάθοπημξ, θζθφνα, ηαθμφκα δ ημζκή, Manuka ή Jelly bush, θοηυ ηζαβζμφ Διεύζεξα νμέα Γεκζηά Όπζ πενζζζυηενμ απυ 50 meq/1000 g Μέθζ γαπανμπθαζηζηήξ Όπζ πενζζζυηενμ απυ 80 meq/1000 g Γείθηεο δηαζηάζεο (θιίκαθα Shade) Γεκζηά (εηηυξ απυ ιέθζ γαπανμπθαζηζηήξ) Όπζ θζβυηενμ απυ 8 Μέθζ ιε παιδθή πενζεηηζηυηδηα ζε θοζζηά Όπζ θζβυηενμ απυ 3 έκγοια HMF (πδξνμπκεζπινθνπξθνπξάιε) Γεκζηά (εηηυξ απυ ιέθζ γαπανμπθαζηζηήξ) Μέθζ απυ πενζμπέξ ιε ηνμπζηυ ηθίια ηαζ ιίβιαηά ημοξ Όπζ πενζζζυηενμ απυ 40 mg/ Κg Όπζ πενζζζυηενμ απυ 80 g/ Κg Πμθθέξ ακαθοηζηέξ ηεπκζηέξ εθανιυζηδηακ βζα ηδκ αλζυπζζηδ δμηζιή ηδξ αοεεκηζηυηδηαξ ημο ιεθζμφ, υπςξ δ πνςιαημβναθία ζμκημακηαθθαβήξ βζα εφνεζδ κμεείαξ ιε δζάθμνεξ πνμζεήηεξ ζζνμπζχκ [55, 80, 81], δ οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ απυδμζδξ [62,74,82], δ αένζα πνςιαημβναθία [56] ηαεχξ ηαζ δ ηεπκζηή πονδκζημφ ιαβκδηζημφ ζοκημκζζιμφ (NMR) [83,84] ηαζ ακάθοζδ ηδξ ακαθμβίαξ ζζμηυπςκ άκεναηα [85, 86]. Δπίζδξ δ ηεπκζηή LC-MS/MS έπεζ ανεζ πμθθέξ εθανιμβέξ ζηδκ ακάθοζδ ιεθζχκ βζα θθααμκμεζδή ηαεχξ ηαζ βζα ακαθφζεζξ βζα εφνεζδ νοπακηχκ ζημ ιέθζ [87,88]. 61

77 ΚΟΠΟ Απυ υθα υζα ακαθένμκηαζ ζημ εεςνδηζηυ ιένμξ ηδξ πανμφζαξ δζπθςιαηζηήξ ενβαζίαξ, βίκεηαζ θακενυ υηζ ηα ζοζηήιαηα LC-MS/MS έπμοκ εονεία εθανιμβή ζε υθμοξ ημοξ ημιείξ ηδξ ιεηααμθμιζηήξ. ηδ ιεηααμθμιζηή ηςκ ηνμθίιςκ, μ πμζμηζηυξ ηαζ πμζμηζηυξ πνμζδζμνζζιυξ πμθζηχκ ιεηααμθζηχκ ιπμνεί κα δχζεζ απακηήζεζξ ζε πμθθά εέιαηα πμο απαζπμθμφκ ηδκ επζζηδιμκζηή ημζκυηδηα. ηυπμξ ηδξ πανμφζαξ δζπθςιαηζηήξ ενβαζίαξ, ήηακ δ ακάπηολδ ηαζ επζηφνςζδ ιζαξ πμθοδφκαιδξ ακαθοηζηήξ ιεευδμο ιε πνήζδ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ οδνυθζθςκ αθθδθεπζδνάζεςκ ζε ζφγεολδ ιε θαζιαημιεηνία ιάγαξ (HILIC-MS/MS) βζα ημκ ηαοηυπνμκμ πνμζδζμνζζιυ ιεβάθμο ανζειμφ πμθζηχκ ιεηααμθζηχκ δζαθμνεηζηχκ ηάλεςκ, ιε ζημπυ ηδ πνήζδ ηδξ ζε ιεηααμθμιζηέξ ιεθέηεξ ζε δζάθμνα οπμζηνχιαηα. Ο ζπεδζαζιυξ ακάπηολδξ ηδξ ιεευδμο ααζίζηδηε ζε ιζα ιέεμδμ πμο είπε ήδδ ακαπηοπεεί ζημ ενβαζηήνζμ ηαηά ηδ δζάνηεζα ιζαξ δζδαηημνζηήξ δζαηνζαήξ [89] ζε δζαθμνεηζηυ ακαθοηζηυ υνβακμ ηαζ ζε ιζα δδιμζζεοιέκδ ενβαζία ημο εζπαθέπμκηα ηαεδβδηή [90]. Ζ πνμμπηζηή ακάπηολδξ µζαξ ηαζ µυκμ µεευδμο δ μπμία κα είκαζ ζηακή κα πνμζδζμνίζεζ έκα µεβάθμ ανζεµυ ιεηααμθζηχκ, δίπςξ κα απαζηείηαζ είηε ζοκδοαζµυξ µεευδςκ, είηε πμθφπθμηεξ ηαζ πνμκμαυνεξ πνμηαηενβαζίεξ δεζβµάηςκ ήηακ έκαξ ζδζαίηενα δεθεαζηζηυξ ζηυπμξ, μ μπμίμξ ηεθζηά επζηεφπεδηε. Οοζζαζηζηυξ ζηυπμξ ήηακ δ εθανιμβή ηδξ ιεευδμο ζε οπμζηνχιαηα ηνμθίιςκ. Γζ αοηυ ηαζ έβζκε ιζα πνχηδ εθανιμβή ηδξ ιεευδμο ζε δείβιαηα ιεθζμφ. Αλίγεζ κα ζδιεζςεεί υηζ ζηδ ιέπνζ ηχνα οπάνπμοζα αζαθζμβναθία υπςξ πανμοζζάζηδηε ηαζ ζημ εεςνδηζηυ ιένμξ οπάνπμοκ ιέεμδμζ βζα ημκ πνμζδζμνζιυ ιεηααμθζηχκ ζε δείβιαηα ιεθζμφ αθθά δεκ έπεζ ακαθενεεί ιέεμδμξ πμο κα ζοιπενζθαιαάκεζ ημκ πνμζδζμνζζιυ ιεηααμθζηχκ απυ δζαθμνεηζηέξ ηάλεζξ. 62

78 ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΟ ΜΕΡΟ ΚΔΦΑΛΑΗΟ 6 Ο : ΤΣΖΜΑ LC-TSQ QUANTUM ACCESS MAX 6.1. ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΗΑ Σμ ζφζηδια πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ημ πεζναιαηζηυ ιένμξ ηδξ πανμφζαξ δζπθςιαηζηή ενβαζίαξ είκαζ ημ LC-TSQ Quantum Access Max ηδξ Thermo Fisher Scientific ημ μπμίμ είκαζ έκα ελεθζβιέκμ ακαθοηζηυ υνβακμ πμο πενζθαιαάκεζ: i. Αοηυιαημ δεζβιαημθήπηδ (autosampler) ηαζ πνςιαημβναθζηή ζηήθδ. ii. Ακηθία οβνμφ πνςιαημβνάθμο ιε ιμκάδα απαένςζδξ ηεζζάνςκ δζαθοηχκ (Accela Pump). iii. Ακηθία βζα αοηυιαηδ έβποζδ δείβιαημξ (syringe pump). iv. Βαθαίδα βζα απεοεείαξ θυνηςζδ ηαζ έβποζδ δείβιαημξ. v. Ακζπκεοηή θαζιαηυιεηνμο ιαγχκ (MS). vi. Γεκκήηνζα αγχημο. vii. φζηδια ηαηαβναθήξ δεδμιέκςκ (data system). ηδκ πανμφζα δζπθςιαηζηή ενβαζία, πνδζζιμπμζήεδηε δθεηηνμκζηυξ οπμθμβζζηήξ Dell ιε θμβζζιζηυ εθέβπμο ηαζ επελενβαζίαξ δεδμιέκςκ Xcalibur 2.0. Σρήκα 6.1: Απηόκαηνο δεηγκαηνιήπηεο Σρήκα 6.2:Αληιία πγξνύ κε ζεξκνζηαηνύκελν ρώξν ζηήιεο [91]. Χξσκαηνγξάθνπ [92]. 63

79 Σρήκα 6.3: Αλιία γηα απηόκαηε Σρήκα 6.4: Βαιβίδα γηα απεπζείαο έγρπζε δείγκαηνο [18]. θόξησζε/ έγρπζε δείγκαηνο [18]. Σρήκα 6.5 Φαζκαηόκεηξν καδώλ [18] Σρήκα 6.6: Σύζηεκα LC-MS TSQ Quantum Access MAX (Thermo Scientific). 64

80 6.2 ΓΔΝΗΚΖ ΠΔΡΗΓΡΑΦΖ ημ ζφζηδια LC/MS, ημ δείβια εζζάβεηαζ ζημκ οβνυ πνςιαημβνάθμ ιέζς αοηυιαημο δεζβιαημθήπηδ, υπμο ηαζ δζαπςνίγεηαζ ζηα επζιένμοξ ζοζηαηζηά ημο ηαεχξ αοηά ηζκμφκηαζ ζηδ πνςιαημβναθζηή ζηήθδ. Σα δζαπςνζζιέκα πδιζηά ζοζηαηζηά δζένπμκηαζ ιέζς ηδξ βναιιήξ ιεηαθμνάξ ηαζ εζζένπμκηαζ ζημ θαζιαηυιεηνμ ιαγχκ, υπμο ηαζ ακαθφμκηαζ. Μπμνεί επίζδξ κα βίκεζ εζζαβςβή ημο δείβιαημξ απεοεείαξ ζημκ ακζπκεοηή ιέζς εζδζηήξ ακηθίαξ ηφπμο ζφνζββαξ (ζπήια 6.3). Ο ακζπκεοηήξ ημο θαζιαηυιεηνμο ιαγχκ πενζθαιαάκεζ ηα ελήξ ιένδ (ζπήια 6.7): i. Πδβή ζμκζζιμφ αηιμζθαζνζηήξ πίεζδξ (Atmospheric pressure ionization API source). ii. Οπηζηυ ζφζηδια ζυκηςκ (Ηon Optics). iii. Ακαθοηή ιαγχκ ηνζπθμφ ζδιείμο (triple-stage mass analyzer). iv. Ακζπκεοηή ζυκηςκ (Ion detection system-multiplier). Σρήκα 6.7: Πξνβνιή ηνκήο ηνπ αληρλεπηή MS [18]. Σμ μπηζηυ ζφζηδια, μ ακαθοηήξ ιαγχκ, μ ακζπκεοηήξ ηαζ ιένμξ ηδξ πδβήξ ζμκζζιμφ αηιμζθαζνζηήξ πίεζδξ ανίζημκηαζ ιέζα ζε έκα εάθαιμ ηεκμφ ιε δζαααειζζιέκεξ πενζμπέξ ηεκμφ, υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 6.8. Ο εάθαιμξ ηεκμφ, είκαζ ηαηαζηεοαζιέκμξ απυ έκα παπφ ζηνχια αθμοιζκίμο ηαζ πςνίγεηαζ ζε ηέζζενα λεπςνζζηά ηιήιαηα, υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 3.8. Ζ πενζμπή ιέζα ζημ πνχημ ηιήια (ion transfer tube/skimmer region) έπεζ ηεκυ 1 Torr, ημ μπμίμ επζηοβπάκεηαζ ιε ιία πενζζηνμθζηή ακηθία. Ζ πενζμπή ιέζα ζημ δεφηενμ ηιήια (Q00 ion optics region) έπεζ ηεκυ 50 mtorr, δ πενζμπή ιέζα ζημ ηνίημ ηιήια (Q0 ion optics region) έπεζ ηεκυ 1 mtorr ηαζ ημ ηέηανημ ηιήια (analyzer region) έπεζ ηεκυ 10-5 Torr ηα μπμία επζηοβπάκμκηαζ ιε δφμ ζηνμαζθμιμνζαηέξ ακηθίεξ. Σμ εζςηενζηυ ημο εαθάιμο ηεκμφ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 6.9 [18]. 65

81 Σρήκα 6.8: Σρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ησλ πεξηνρώλ θελνύ [18]. Σρήκα 6.9:Δζσηεξηθό ηνπ ζαιάκνπ θελνύ [18]. Αιέζςξ ιεηά ηδκ εζζαβςβή ημο δείβιαημξ ζηδκ πδβή API, ηα ιυνζά ημο ζμκίγμκηαζ ιε εενιαζκυιεκμ ρεηαζιυ ζε δθεηηνζηυ δοκαιζηυ (heat electrospray ionization, HESI). Σα παναβυιεκα ζυκηα εοεοβναιιίγμκηαζ ηαζ επζηαπφκμκηαζ ιέζς ημο μπηζημφ ζοζηήιαημξ πνμξ ημκ ακαθοηή ιαγχκ ηαζ ακαθφμκηαζ ιε αάζδ ημ θυβμ ιάγα πνμξ θμνηίμ (m/z). ηδ ζοκέπεζα, ηα ζυκηα ημο δείβιαημξ ακζπκεφμκηαζ απυ έκα ζφζηδια ακίπκεοζδξ πμο πανάβεζ ζήια ακάθμβμ ιε ημκ ανζειυ ηςκ ζυκηςκ πμο ακζπκεφμκηαζ. Σμ ζήια ηςκ ζυκηςκ εκζζπφεηαζ απυ έκακ πμθθαπθαζζαζηή δθεηηνμκίςκ (multiplier) ηαζ πενκά ζε έκα ζφζηδια δεδμιέκςκ βζα πεναζηένς επελενβαζία, απμεήηεοζδ ηαζ απεζηυκζζδ [18]. 66

82 6.3 ΤΚΔΤΔ- ΑΝΑΛΧΗΜΑ Γζα ηδκ παναζηεοή ηςκ δζαθοιάηςκ ηαζ βζα ηδκ πνμηαηενβαζία ηςκ δεζβιάηςκ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ ελήξ ζοζηεοέξ: Αοηυιαηεξ πζπέηεξ 20 ιl, 100 ιl ηαζ 1000 ιl, TIPOR-V+ (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Belgium). οζηεοή παναβςβήξ οπενηάεανμο κενμφ, Sation 9000 (Barcelona, Spain). οζηεοή ακάδεοζδξ, Vortex (FALC Vibration Mix 20, Italy). Ακαθοηζηυξ γοβυξ αηνζαείαξ + 0,0001 g, Kern and Sohn. Πεπάιεηνμ, Crison (Barcelona, Spain). Φοβυηεκηνμξ, (Sigma 4-5L, Germany) οζηεοή οπενήπςκ, (Elma X-tra ultra sonic cleaner S30H, German) Τδαηυθμοηνμ, Wattern DG-22 Diagnostic Grifols (Barcelona, Spain). Eppendorf tubes ηςκ 2.0 ml. Τδνυθζθα θζθηνάηζα 0.22ιm (PTFE Syringe filters). Γοάθζκα ζημονυπνςια θζαθίδζα βζα ηδ θφθαλδ ηςκ δζαθοιάηςκ. Γοάθζκεξ θζάθεξ θφθαλδξ δζαθοηχκ. φνζββεξ ηςκ 2.0 ηαζ 5.0 ml. 67

83 6.4 ΤΛΗΚΑ - ΑΝΣΗΓΡΑΣΖΡΗΑ Ζ ακαθοηζηή ζηήθδ πμο πνδζιμπμζήεδηε ήηακ HILIC BEH Amide Waters Acquity stationary phase (1.7 ιm, 2.1 x 150mm, ζηαηζηή θάζδ αιζδίμο) (Milford Massachusetts, USA). Ζ πνμ-ζηήθδ πμο πνδζζιμπμζδεήηε ήηακ Acquity UPLC Van-Guard precolumn (Waters Ltd., Elstree, UK) Σα ακηζδναζηήνζα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ παναζηεοή ηςκ δζαθοιάηςκ ηαεχξ επίζδξ ηαζ βζα ηδκ Παναζηεοή ηςκ ηζκδηχκ θάζεςκ ήηακ LC-MS grade ηαζ ήηακ ηα αηυθμοεα: Μεεακυθδ, MeOH, ηαεανυηδηαξ LC-MS (CHEM-LAB) Αηεημκζηνίθζμ, ACN, ηαεανυηδηαξ LC-MS (CHEM-LAB) Τπενηάεανμ κενυ Millipore Άθαξ ιονιδβηζημφ αιιςκίμο, Sigma Aldrich (Gillingham, Dorset, UK) Φμνιζηυ μλφ NaOH KOH Υνδζζιμπμζήεδηακ, επίζδξ, 86 πνυηοπεξ εκχζεζξ ακαθοηζηήξ (ή ηαθφηενδξ) ηαεανυηδηαξ απυ δζάθμνμοξ ηαηαζηεοαζηέξ. Σα δείβιαηα ιεθζμφ παναπςνήεδηακ απυ ημ ενβαζηήνζμ ιεθζζζμημιίαξ Α.Π.Θ 68

84 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 7 Ο : ΑΝΑΠΣΤΞΖ ΑΝΑΛΤΣΗΚΖ ΜΔΘΟΓΟΤ 7.1 ΔΝΧΔΗ ΚΑΗ ΠΑΡΑΚΔΤΖ ΠΡΟΣΤΠΧΝ ΓΗΑΛΤΜΑΣΧΝ Παναζηεοάζηδηακ ποηκά πνυηοπα stock δζαθφιαηα ζε ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ mg/l, mg/l ηαζ mg/l. Ζ δζαδζηαζία παναζηεοήξ πενζθάιαακε γφβζζδ ηδξ ηάεε έκςζδξ ιε ακαθοηζηυ γοβυ αηνζαείαξ. Αημθμοεμφζε πνμζεήηδ ηαηάθθδθμο υβημο (ml) δζαθφιαημξ 50:50 v/v Ζ 2 Ο:MeOH (ή άθθμο ηαηάθθδθμο δζαθφηδ) ιέπνζ ηδκ επζεοιδηή ζοβηέκηνςζδ. ε ηάπμζεξ πενζπηχζεζξ ήηακ απαναίηδηδ δ πνζεήηδ εθάπζζηδξ πμζυηδηαξ μλέμξ ή αάζδξ, εένιακζδξ ηαζ πνήζδξ θμοηνμφ οπενήπςκ χζηε κα επζηεοπεεί δ δζαθοημπμίδζδ. Αημθμοεμφζε ακάδεοζδ βζα ιενζηά θεπηά ζε ζοζηεοή vortex ηαζ απμεήηεοζδ ηςκ δζαθοιάηςκ ζηδκ ηαηάρολδ ζημοξ C. Απυ ηα ποηκά αοηά δζαθφιαηα, παναζηεοάζηδηακ ηα δζαθφιαηα ενβαζίαξ ιε πεναζηένς αναζχζεζξ, ιε πνμζεήηδ δζαθφιαημξ 95:5 v/v ACN:H 2 O ηαηάθθδθμο υβημο ακάθμβα ιε ηδκ εηάζημηε επζεοιδηή ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ. Καεχξ μζ πνμξ πνμζδζμνζζιυ ιεηααμθίηεξ οπήνπακ ζηα πνμξ ιεθέηδ οπμζηνχιαηα ζε ιεβάθμ εφνμξ ζοβηεκηνχζεςκ, ζφιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία, μζ εκχζεζξ πςνίζηδηακ ζε ηνεζξ μιάδεξ: Α, Β ηαζ C ακάθμβα ιε ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ πμο ακαιέκμκηακ κα ανεεμφκ ζηα πνμξ ιεθέηδ οπμζηνχιαηα υπςξ θαίκεηαζ ηαζ ζημοξ πίκαηεξ 7.1, 7.2, 7.3. Πίκαηαξ 7.1: Δκχζεζξ μιάδαξ Α Οκάδα Α Bεκγμσηυ μλφ Γμοακίκδ Θοιζδίκδ Νζημηζκαιίδζμ Κοηζδίκδ 2- δεμλομονζδίκδ Πονζδμλίκδ Ηζηαιίκδ Πονμοαζηυ μλφ Βζμηίκδ Θεζαιίκδ Ρζαμθθααίκδ Τπμλακείκδ Ολείδζμ ηδξ ηνζιεεοθαιίκδξ Πζημθζκζηυ μλφ Κνεαηζκίκδ β-αιζκμαμοηονζηυ μλφ Γζιεεοθαιίκδ Αηεηοθμηανκζηίκδ Καδααενίκδ Πονμβθμοηαιζηυ μλφ Γθοημονμκζηυ μλφ Φμθζηυ μλφ Τπμηαονίκδ Ξακείκδ Θεμανςιίκδ Φμοιανζηυ μλφ Κοημζίκδ Οοναηίθδ Βζηαιίκδ Β12 Σνζιεεοθαιίκδ Θοιίκδ α-ηεημβθμοηανζηυ μλφ Πακημεεκζηυ μλφ Μεεεζμκίκδ ανημζίκδ Αδζπζηυ μλφ ύλνιν ελώζεσλ: 37 69

85 Πίκαηαξ 7.2: Δκχζεζξ μιάδαξ Β Οκάδα Β μοαενζηυ μλφ Βαθίκδ Ανβζκίκδ Αδεκίκδ Σονμζίκδ Σαονίκδ Οονζδίκδ Αθακίκδ Ονκζείκδ Αδεκμζίκδ Οιμζενίκδ Μδθζηυ μλφ Ηκμζίκδ Θνεμκίκδ Κζηνζηυ μλφ Υμθίκδ Γθοηίκδ Κζκζηυ μλφ Νζημηζκζηυ μλφ Γθμοηαιίκδ πενιίκδ Μακκζηυθδ ενίκδ πενιζδίκδ μναζηυθδ Αζπαναβίκδ Ηζηζδίκδ Bεηαΐκδ Γθμοηαιζηυ μλφ Σνοπημθάκδ Ηζμθεοηίκδ Αζπανηζηυ μλφ Ηκμζζηυθδ Λεοηίκδ Πμοηνεζηίκδ Αζημναζηυ μλφ ύλνιν ελώζεσλ:36 Πίκαηαξ 7.3: Δκχζεζξ μιάδαξ Γ Οκάδα Γ Ρζαυγδ Λοζίκδ Γμοακμζίκδ Φαζκοθαθακίκδ Κοζηίκδ Ραθζκυγδ Πνμθίκδ Γαθαηημονμκζηυ μλφ Μεθζαζυγδ Μεθεγζηυγδ Κεθθμαζυγδ Γθοημκζηυ μλφ Σνεαθυγδ ύλνιν ελώζεσλ: ΠΑΡΑΜΔΣΡΟΗ ΦΑΜΑΣΟΜΔΣΡΟΤ ΜΑΕΑ Ζ αεθηζζημπμίδζδ ηςκ παναµέηνςκ ζημ θαζµαηυµεηνμ ιαγχκ είκαζ πνςηανπζηήξ ζδµαζίαξ βζα ηδκ επίηεολδ υζμ ημ δοκαηυκ ημνοθχκ ιε ιεβαθφηενδ έκηαζδ, µε ζηυπμ ηδκ αφλδζδ ηδξ εοαζζεδζίαξ. ηδ θαζµαημµεηνία ιαγχκ, εκδζαθένμοκ μζ πανάµεηνμζ νφεµζζδξ ημο ακζπκεοηή, μζ μπμίεξ ζπεηίγμκηαζ άµεζα µε ηδκ ηεθζηή εοαζζεδζία ηδξ µεευδμο. Έκα πμθφ ζδιακηζηυ ηιήια ημο θαζιαημιέηνμο ιαγχκ είκαζ δ πδβή ζμκζζιμφ, δ μπμία ιεηαηνέπεζ ηα ιυνζα ημο δείβιαημξ πμο πενζέπμκηαζ ζηδκ οδαηζηή θάζδ ζε ζυκηα ζηδκ αένζα θάζδ. Ζ ζςζηή νφειζζδ δζαθυνςκ παναιέηνςκ ζηδκ πδβή ζμκζζιμφ αεθηζχκεζ αζζεδηά ημ ζήια ημο πνμζδζμνζγυιεκμο ζοζηαηζημφ. Γζα ηδκ πδβή ESI ζδιακηζηέξ πανάιεηνμζ νφειζζδξ απμηεθμφκ δ εενιμηναζία ημο ελαηιζζηή (vaporizer temperature), δ νμή βζα ημ πνμζηαηεοηζηυ (sheath gas) ηαζ ημ αμδεδηζηυ (auxiliary gas) αένζμ, δ ορδθή ηάζδ ηδξ αεθυκαξ (needle) ηαζ δ εενιμηναζία ημο ηνζπμεζδμφξ ιεηαθθζημφ ζςθήκα (capillary temperature). Ζ 70

86 εενιμηναζία υπςξ ηαζ δ νμή ημο αενίμο ελάηιζζδξ είκαζ δομ πανάβμκηεξ πμο ελανηχκηαζ ηονίςξ απυ ηδ ζφζηαζδ ηαζ ηδκ ηαπφηδηα νμήξ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ, υπςξ θαίκεηαζ ζημκ πίκαηα 7.4. Σμ δοκαιζηυ ημο ηνζπμεζδμφξ ζςθήκα ηαζ δ βεςιεηνία ηδξ δζάηαλδξ ημο ρεηαζιμφ (probe) είκαζ δομ πανάιεηνμζ μζ μπμίεξ εκδέπεηαζ κα δνάζμοκ εηθεηηζηά, επδνεάγμκηαξ εεηζηά ημκ ζμκζζιυ μνζζιέκςκ εκχζεςκ ηαζ ανκδηζηά ηάπμζςκ άθθςκ. Οζ ζοβηεηνζιέκεξ πανάιεηνμζ παναιέκμοκ ζηαεενέξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ακάθοζδξ ηαζ βζα ημ θυβμ αοηυ επζθέβμκηαζ ιε αάζδ ηζξ πνςιαημβναθζηέξ ζοκεήηεξ. Πίκαηαξ 7.4: Πανάιεηνμζ ESI πμο πνμηείκεζ μ ηαηαζηεοαζηήξ, ακάθμβα ιε ηζξ πνςιαημβναθζηέξ ζοκεήηεξ [92]. Σαρύηεηα Ρνήο (κl/min) Θεξκνθξαζία Σξηρνεηδνύο ( C) Θεξκνθξαζία Δμαηκηζηή ( C) Αέξην Δμάηκηζεο Βνεζεηηθό Αέξην Τςειή ηάζε (V) (-2500) (-2500) (-2500) (-2500) Οζ ηζιέξ ηςκ παναιέηνςκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ακάπηολδξ ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ ιεευδμο ήηακ μζ ελήξ. οκαµζηυ ηνζπμεζδμφξ (Capillary voltage): +3.0 kv βζα εεηζηυ ζμκζζιυ ηαζ - 2.5kV βζα ανκδηζηυ ζμκζζιυ. Θενµμηναζία ελάηιζζδξ (vaporizer temperature): 300 o C. Θενιμηαναζία πδβήξ (source block temperature): 300 o C. Ρμή πνμζηαηεοηζημφ αενίμο (sheath gas): 40 ιl/min. Ρμή αμδεδηζημφ αενίμο (auxiliary gas):10 ιl/min. Οζ πανάιεηνμζ ζηδκ πδβή, μζ μπμίεξ είκαζ ελανηχιεκεξ απυ ημκ ηάεε ακαθφηδ, υπςξ ημ δοκαιζηυ ηχκμο (cone voltage) ηαζ δ εκένβεζα εναοζιαημπμίδζδξ (collision energy) αεθηζζημπμζήεδηακ βζα ηδκ ηάεε έκςζδ λεπςνζζηά Γηαδηθαζία Λήςεο MRM Ξεηζκήζαµε απυ ημκ πνμζδζμνζζµυ ηςκ µδηνζηχκ ηαζ εοβαηνζηχκ ζυκηςκ ζημ θαζµαηυµεηνμ ιάγαξ ηαζ ηδ αεθηζζημπμίδζδ ηςκ ζοκεδηχκ ακίπκεοζήξ ημοξ. Οζ ζοκεήηεξ βζα ηδκ επζθμβή ηςκ MRM αεθηζζημπμζήεδηακ αοηυιαηα βζα ηάεε έκςζδ, ηυζμ ζε εεηζηυ υζμ ηαζ ζε ανκδηζηυ ζμκζζιυ HESI, ηαηά ηδ δζάνηεζα ηςκ δμηζιαζηζηχκ εβπφζεςκ. Όθα ηα δεδμιέκα ζοκημκζζιμφ πμο θήθεδηακ αοηυιαηα 71

87 ιέζς ημο θμβζζιζημφ TSQTuneMaster εθέβπεδηακ χζηε κα ελαζθαθζζηεί δ ζςζηή επζθμβή ηςκ ιδηνζηχκ ζυκηςκ ηςκ εοβαηνζηχκ ζυκηςκ ηαζ ηδξ εκένβεζαξ εναοζιαημπμίδζδξ. Ζ δζαδζηαζία ελεθζζζυηακ ςξ ελήξ. Δθάπζζηδ πμζυηδηα απυ ηδκ πνμξ πνμζδζμνζζιυ έκςζδ ζοβηέκηνςζδξ 5mg/L ζε δζάθοια MeOH:H 2 O 50:50 v/v εζζαβυηακ ιέζς ιζαξ ακηθίαξ ζφνζββαξ (υπςξ θάζκεηαζ ζημ ζπήια 7.1.) ιε παιδθή νμή (~5 ιl/min) απεοεείαξ ζημ θαζιαηυιεηνμ ιάγαξ, αθμφ είπακ πνμδβδεεί ηάπμζεξ εβπφζεζξ ιε ιεεακυθδ βζα ηαεανζζιυ ημο θαζιαημιέηνμο ιάγαξ. Σρήκα 7.1: ESI / MS πδξαπιηθέο ζπλδέζεηο γηα ηελ εηζαγσγή ηνπ δείγκαηνο από ηελ αληιία ζύξηγγαο γηα άκεζε έγρπζε [92]. Καεχξ βζκυηακ δ έβποζδ ηδξ έκςζδξ, πναβιαημπμζμφηακ πθήνδξ ζάνςζδ (Full scan) (ζπήια 7.2) ζε ιζα πενζμπή ζάνςζδξ (m/z) ιέζα ζηδκ μπμία ακαιεκυηακ κα ανεεεί δ ιμνζαηή ιάγα ηδξ εηάζημηε έκςζδξ, πνμζαολδιέκδ ηαηά ιζα ιμκάδα Da (Dalton) ζηδκ πενίπηςζδ ημο εεηζημφ ζμκζζιμφ ή ιεζςιέκδ ηαηά ιζα ιμκάδα Da ζηδκ πενίπηςζδ ημο ανκδηζημφ ζμκζζιμφ. Γζκυηακ εκαθθαβή εεηζημφ ηαζ ανκδηζημφ ζμκζζιμφ ηαζ παναημθμοεμφηακ έκα ζοκεπέξ δζάβναιια ημ μπμίμ απεζηυκζγε ηδκ έκηαζδ ημο ζήιαημξ ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ ηζιήξ m/z, δ μπμία ακηζζημζπμφζε ζημ ιμνζαηυ ζυκ ηδξ πνμξ ιεθέηδ έκςζδξ. 72

88 Σρήκα 7.2: Παξάζπξν δηαιόγνπ εηπινγήο πιήξνπο ζάξσζεο. Αθμφ ανζζηυηακ ημ m/z ημο ιμνζαημφ ζυκημξ, πμο εα ήηακ δ ηζιή πμο εα πανμοζίαγε ηδκ ορδθυηενδ έκηαζδ, πναβιαημπμζμφηακ ζάνςζδ αοημφ ζηδ θεζημονβία MS only (ζπήια 7.3), δδθαδή ζημ πνχημ ηεηνάπμθμ (Q1) πνμηεζιέκμο κα πνμζδζμνζζηεί δ αέθηζζηδ ηζιή ημο δοκαιζημφ ημο ηχκμο (tube lens voltage) (ζπήια 7.4) ηαζ ηδξ εκένβεζαξ εναοζιαημπμίδζδξ (collision energy). Σρήκα 7.3: Παξάζπξν δηαιόγνπ ιεηηνπξγίαο MS only. 73

89 Σρήκα 7.4: Βειηηζηνπίεζε δπλακηθνύ θώλνπ (tube lens voltage) γηα ηελ αδελίλε. Σμ επυιεκμ αήια ήηακ δ νφειζζδ ημο ακζπκεοηή MS βζα θεζημονβία ζε MS/MS (ζπήια 7.5). Δπζθέβμκηαξ ηδ δοκαηυηδηα αοηυιαηδξ επζθμβήξ ανζειμφ εοβαηνζηχκ ζυκηςκ βζα ημ ζοβηεηνζιέκμ ιδηνζηυ ζυκ, ημ ζφζηδια ιεηέααθθε ηδκ εκένβεζα εναοζιαημπμίδζδξ (Collision Energy-C.E.) ηαζ ελήβαβε ηζξ ζδακζηέξ ιάγεξ εοβαηνζηχκ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ C.E. ηαζ δοκαιζηχκ. Λαιαάκμκηακ δζαδμπζηά θάζιαηα ζάνςζδξ εοβαηνζηχκ ζυκηςκ ηδξ έκςζδξ ζε αολακυιεκδ εκένβεζα εναοζιαημπμίδζδξ ηαζ ηαηυπζκ επζθεβυηακ είηε ημ πζμ εηθεηηζηυ εναφζια (ζοκήεςξ αοηυ ιε ηδ ιεβαθφηενδ ηζιή m/z) είηε ημ εναφζια πμο πανμοζίαγε ιεβαθφηενδ έκηαζδ ζηδ ιζηνυηενδ δοκαηή εκένβεζα εναοζιαημπμίδζδξ (ζπήια 7.6). Σρήκα 7.5: Παξάζπξν δηαιόγνπ απηόκαηεο επηινγήο ζπγαηξηθώλ ηόλησλ. 74

90 Σρήκα 7.6:Κακπύιεο ζρεηηθήο έληαζεο ελέξγεηαο ζξαύζεο ησλ ζπγαηξηθώλ ηόλησλ ηεο αδελίλεο. Μάδεο ζπγαηξηθώλ κε ηηο αληίζηνηρεο ηηκέο C.E. 7.3 ΠΑΡΑΜΔΣΡΟΗ ΥΡΧΜΑΣΟΓΡΑΦΗΑ ΤΠΔΡ-ΤΦΖΛΖ ΠΗΔΖ Ο ζπεδζαζιυξ ηδξ ακαθοηζηήξ ιεευδμο πναβιαημπμζήεδηε ζφιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία ηαζ ιε πνυηοπμ πανυιμζεξ ιεευδμοξ πμο είπακ ήδδ ζηδεεί ζημ ενβαζηήνζμ [89,90]. Ζ επζθμβή ημο ηαηάθθδθμο εηθμοζηζημφ ζοζηήιαημξ ηαζ ηδξ ηαηάθθδθδξ ακαθοηζηήξ ζηήθδξ έπμοκ ιεβάθδ ζδιαζία βζα ηδκ επίηεολδ εκυξ υζμ ημ δοκαηυκ ηαθφηενμο δζαπςνζζιμφ ηςκ εκχζεςκ, ιε ημ αέθηζζημ ζπήια ηαζ έκηαζδ ηςκ ημνοθχκ ημοξ. Υνδζζιμπμζήεδηακ δομ ηζκδηέξ θάζδξ. Ζ ηζκδηή θάζδ Α απμηεθμφηακ απυ ιίβια MeCN:H 2 O ζε ακαθμβία 95%:5% v/v, εκχ δ ηζκδηή θάζδ Β απμηεθμφηακ απυ ιίβια MeCN:H2O ζε ακαθμβία 30%:70% v/v. Καζ ζηζξ δφμ ηζκδηέξ θάζεζξ, οπήνπε ζοβηεηνζιέκδ πμζυηδηα άθαημξ ιονιδβηζημφ αιιςκίμο (HCOONH 4 ) δ μπμία εηθνάγεηαζ ςξ εκενβή ζοβηέκηνςζδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (effective buffer concentration EBC). Ζ EBC πνέπεζ κα είκαζ ίδζα ηαζ ζηζξ δφμ ηζκδηέξ θάζδξ (A ηαζ B), πνμηεζιέκμο κα δζαηδνείηαζ ζηαεενή ηαε' υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ακάθοζδξ. Ζ παναζηεοή ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ βζκυηακ ανπζηά ζημ οδαηζηυ ημιιάηζ ημο δζαθφηδ ηαζ έπεζηα πνμζηίεμκηακ ανβά μ μνβακζηυξ δζαθφηδξ πνμηεζιέκμο κα επζηεοπεμφκ μζ επζεοιδηέξ ακαθμβίεξ. Έβζκακ δμηζιαζηζηεξ εβπφζεζξ ιε ηεθζηέξ ζοβηεκηνχζεζ άθαημξ 15ιΜ ζηδκ ηζκδηή Α ηαζ 10 ιμ ζηδκ ηζκδηή Β ηαεχξ ηαζ ιε 15ιΜ ζηδκ ηζκδηή Α ηαζ 15ιM ζηδκ ηζκδηή Β. Δπζθέπεδηε ςξ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ άθαημξ ηα 15ιΜ ηαζ ζηζξ δφμ ηζκδηέξ ηαεχξ παναηδνήεδηε ηαθφηενμξ δζαπςνζζιυξ ηςκ πνμζδζμνζγυιεκςκ εκχζεςκ. 75

91 Γζα ηδκ νφειζζδ ημο ph πνδζζιμπμζήεδηε πένα απυ ημ άθαξ ηαζ δζάθοια θμνιζημφ μλέμξ HCOOH 5Μ ημ μπμίμ δμηζιάζηδηε ηαζ ζηζξ δφμ ηζκδηέξ ακηίζημζπα. Ζ ιείςζδ ημο ph ηδξ ηζκδηδξ Α απυ ph 6.5 ζε ph 5.5 απμννίθεδηε ηαεχξ πνμηαθμφζε ζπάζζιμ ζε πμθθέξ ημνοθέξ ηαζ ιείςζδ ηδξ έκηαζδξ (ζπήια 7.7). Ακηίεεηα δ νφειζζδ ημο ph ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ Β αεθηίςζε ηδ ιμνθή ηςκ ημνοθχκ, εζδζηά ηςκ μλέςκ (ζπήια 7.7), βζ αοηυ ηαζ επζθέπηδηε ηαζ βζα ηζξ πεναζηένς ακαθφζεζξ. Α Β Σρήκα 7.7: Κνξπθέο βελδντθνύ θαη γαιαθηνπξνληθνύ νμένο Α)κε ph 5.5 ζηελ θηλεηή θάζε Α. Β) κε ph 5.1 ζηελ θηλεηή θάζε Β αληίζηνηρα. Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ελεηαγυιεκςκ ιεηααμθζηχκ, επζθέπηδηε ααειςηή έηθμοζδ. Σα πνμβνάιιαηα έηθμοζδξ είκαζ ζδιακηζηά υηακ πναβιαημπμζείηαζ ακάθοζδ ζφκεεηςκ ιζβιάηςκ πμθθχκ ζοζηαηζηχκ ηαζ ιπμνμφκ κα δζανημφκ απυ θζβυηενμ απυ 10 θεπηά ηαζ πενζζζυηενμ απυ 60 θεπηά, ιε ιέζμ υνμ θεπηά κα είκαζ ημ πζμ ημζκυ, ακάθμβα ιε ημ πνυαθδια ηαζ ημο ααειμφ ηάθορδξ ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο απαζημφκηαζ. Οζ ζοκεήηεξ έκανλδξ ηαζ ηενιαηζζιμφ ηςκ πνμβναιιάηςκ έηθμοζδξ ελανηχκηαζ απυ ημ είδμξ ημο δείβιαημξ ηαζ ηδξ πνςιαημβναθίαξ [42]. Γζα ηδκ εφνεζδ ημο ηαηάθθδθμο εηθμοζηζημφ ζοζηήιαημξ, έβζκακ πμθθέξ δμηζιέξ, μζ ζδιακηζηυηενεξ απυ ηζξ μπμίεξ θαίκμκηαζ ζημκ πίκαηα 7.5 Γζα ημκ πνςιαημβναθζηυ έθεβπμ υθςκ ηςκ εκχζεςκ πνδζζιπμζήεδηε έκα mix ηαζ ηςκ 86 εκχζεςκ ζε ζοβηέκηνςζδ πενίπμο 10mg/L. 76

92 Πίκαηαξ 7.5: Γμηζιέξ ααειςηήξ έηθμοζδξ. Υξόλνο (min) Κηλεηή Α (95%MeCN- 5%H 2 O) Κηλεηή Β (30%MeCN 70%H 2 O) Ρνή (ml/min) Παξαηεξήζεηο Μδ ζηακμπμζδηζηυξ Υξόλνο (min) Κηλεηή Α (95%MeCN- 5%H 2 O) Κηλεηή Β (30%MeCN 70%H 2 O) Ρνή (ml/min) δζαπςνζζιυξ ιεηαλφ ηςκ ζζμαανχκ εκχζεςκ. Παξαηεξήζεηο Μδ ζηακμπμζδηζηυξ Υξόλνο (min) Κηλεηή Α (95%MeCN- 5%H 2 O) Κηλεηή Β (30%MeCN 70%H 2 O) Ρνή (ml/min) δζαπςνζζιυξ ιεηαλφ ηςκ ζζμαανχκ εκχζεςκ. Φαζκυιεκμ cross-talk ζε πμθθέξ εκχζεζξ. Παξαηεξήζεηο Μδ ζηακμπμζδηζηυξ δζαπςνζζιυξ ιεηαλφ ηςκ ζζμαανχκ εκχζεςκ Μείςζδ ηδξ έκηαζδξ ηςκ ημνοθχκ ηάπμζςκ εχζεςκ Υξόλνο Κηλεηή Α Κηλεηή Β (min) (95%MeCN- (30%MeCN Ρνή Παξαηεξήζεηο (ml/min) 5%H 2 O) 70%H 2 O) πεηζηά ζηακμπμζδηζηυξ δζαπςνζζιυξ. Καθή ιμνθή ημνοθχκ Υξόλνο (min) Κηλεηή Α (95%MeCN- 5%H 2 O) Κηλεηή Β (30%MeCN 70%H 2 O) Ρνή (ml/min) Παξαηεξήζεηο πεηζηά ζηακμπμζδηζηυξ δζαπςνζζιυξ Μέηνζα ιμνθή ημνοθχκ

93 7.4 ΒΔΛΣΗΣΟΠΟΗΖΖ ΠΑΡΑΜΔΣΡΧΝ LC-MS Υξσκαηνγξαθηθέο πλζήθεο Ο αέθηζζημξ δζαπςνζζιυξ, επζηεφπεδηε πνδζζιμπμζχκηαξ ηζκδηή θάζδ πμο απμηεθμφηακ απυ ημ ζφζηδια Α 95%MeCN-5%H2O ιε 15ιΜ HCOONH 4 ηαζ ph 6.5 ςξ αζεεκή δζαθφηδ έηθμοζδξ, ηαζ απυ ημ ζφζηδια Β 30%MeCN-70%H2O ιε 15ιΜ HCOONH 4 ηαζ ph 5.1 ςξ ζζπονυ δζαθφηδ έηθμοζδξ. Σμ πνυβναιια ααειςηήξ έηθμοζδξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια 7.8. Σρήκα 7.8: Πξόγξακκα βαζκσηήο έθινπζεο πνπ επηιέρηεθε. Πανυθμ πμο μ δζαπςνζζιυξ ηςκ εκχζεςκ ήηακ ζηακμπμζδηζηυξ ηαζ ζηα 18 θεπηά ημο πνμβνάιιαημξ, δζαπζζηχεδηε υηζ ζηα 21 θεπηά δ ζηήθδ ελζζζμνμπμφζε ηαθφηενα ηαζ ημ ζπήια ηςκ ημνοθχκ πμο έαβαζκακ πμθφ κςνίξ ή πμθφ ανβά ζημ πνυκμ, δδθαδή ζηδκ ανπή ηαζ ζημ ζημ ηέθμξ ημο πνμβνάιιαημξ, ήηακ πμθφ ηαθφηενμ. ημ πανάνηδια I (ζεθ 113) παναηίεεκηαζ ηα πνςιαημβναθήιαηα ηςκ πνμζδζμνζγυιεκςκ εκχζεςκ ηαζ οπάνπμοκ μζ παναηδνήζεζξ ζπεηζηά ιε ηζξ ημνοθέξ ηςκ εκχζεςκ. Κάπμζεξ ζζμαανείξ εκχζεζξ ζοκεηθμφμκηακ (ιακκζηυθδ ηαζ ζμναζηυθδ, ζζμθεοηίκδ ηαζ θεοηίκδ) μπυηε ηαζ εα ζοκοπμθμβίγμκηαζ ζηα πμζμηζηά απμηεθεζιαηα. Καεχξ μζ πνμζδζμνζγυιεκμζ ιεηααμθίηεξ ήηακ πμθζημί, δ ακαθοηζηή ζηήθδ δ μπμία πνδζζιμπμζήεδηε ήηακ δ HILIC BEH Amide Waters Acquity stationary phase (1.7 ιm, 2.1 x 150mm, ζηαηζηή θάζδ αιζδίμο). Ζ πίεζδ ηδξ ζηήθδξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ακάθοζδξ ηοιαζκυηακ ιεηαλφ psi, εκχ δ νμή πμο πνδζζιμπμζήεδηε ήηακ 400 ιl/min. Ζ εενιμηναζία ηδξ ζηήθδξ ήηακ 50 o C ηαζ Θενιμηναζία εζςηενζημφ 78

94 πχνμο ημο αοηυιαημο δεζβιαημθήπηδ: 4 μ C. Ο υβημξ έβποζδξ ήηακ 5 ιl Παξάκεηξνη Φαζκαηόκεηξνπ Μάδαο Αθμφ έβζκε επζθμβή ηςκ αέθηζζηςκ ζοκεδηχκ ηζκδηήξ θάζδξ πναβιαημπμζήεδηε αεθηζζημπμίδζδ ημο πνμκζημφ εφνμοξ θήρεςξ MRM (t R window), ζημ μπμίμ ακαιεκυηακ δ έηθμοζδ ηδξ ηάεε έκςζδξ. Ζ αεθηζζημπμίδζδ αοηή αολάκεζ ηδκ εοαζζεδζία ακίπκεοζδξ ηδξ έκςζδξ, εκζζπφεηαζ ημ ζήια ηδξ ηάεε ημνοθήξ ηαζ απμθεφβμκηαζ θαζκυιεκα cross-talk. Ο πνυκμξ παναιμκήξ ακά ζάνςζδ MRM (t dwell ) δζαηδνήεδηε ζηαεενυξ ζηα 0,1 sec βζα υθεξ ηζξ εκχζεζξ. Οζ ηζιέξ ηςκ δφμ αοηχκ παναβυκηςκ θαίκμκηαζ ζημκ πίκαηα υπμο ανίζημκηαζ υθεξ μζ παναηηδνζζηζηέξ πανάιεηνμζ ημο θαζιαημιεηνμο ιάγαξ βζα ηδκ ηάεε έκςζδ. Σέθμξ, ηαηαζηεοάζηδηε ιζα αάζδ δεδμιέκςκ δ μπμία πενζέπεζ υθεξ ηζξ πνμξ ακάθοζδ εκχζεζξ ιαγί ιε ηζξ αεθηζζημπμζδιέκεξ παναιέηνμοξ (Πίκαηαξ 7.6). Καηά ηδ δζάνηεζα ηδξ αεθηζζημπμίδζδξ ηδξ ιεευδμο, δφμ εκχζεζξ πμο ανπζηά είπακ επζθεβεί κα ζοκπενζθδθεμφκ ζηδ ιέεμδμ, ηεθζηά απμννίθεδηακ (μλαθζηυ μλφ ηαζ ηνεαηίκδ), ηαεχξ δεκ εηθμφςκηακ ιε ηζξ επζθεβιέκεξ πνςιαημβναθζηέξ ζοκεήηεξ. οκμθζηά, αεθηζζημπμζήεδηακ ηα ζήιαηα MRM βζα 86 ιεηααμθίηεξ ηαζ έκα ιμκαδζηυ πανάεονμ δδιζμονβήεδηε βζα ηάεε έκςζδ. Πίκαηαξ 7.6: Υαναηηδνζζηζηέξ πανάιεηνμζ θαζιαηυιεηνμο ιάγαξ βζα ηάεε πνμζδζμνζγυιεκδ έκςζδ. Ολνκαζία Μνξηαθόο Σύπνο Μνλνηζνηνπηθή Μάδα Μεηξηθό Ηόλ Θπγαηξηθό Ηόλ C.V (kv) C.E (kv) ESI t R window Bεκγμσηυ μλφ C 7 H 6 O Νζημηζκαιίδζμ C 6 H 6 N 2 O Πονζδμλίκδ C 8 H 11 NO Βζμηίκδ C 10 H 16 N 2 O 3 S Τπμλακείκδ C 5 H 4 N 4 O Κνεαηζκίκδ C 4 H 7 N 3 O Αηεηοθμηανκζηίκδ Γθοημονμκζηυ μλφ C 9 H 17 NO C 6 H 10 O Ξακείκδ C 5 H 4 N 4 O

95 Κοημζίκδ C 4 H 5 N 3 O Σνζιεεοθαιίκδ C 3 H 9 N Πακημεεκζηυ μλφ C 9 H 17 NO Αδζπζηυ μλφ C 6 H 10 O Γμοακίκδ C 5 H 5 N 5 O Κοηζδίκδ C 9 H 13 N 3 O Ηζηαιίκδ C 5 H 9 N Θεζαιίκδ C 12 H 17 N 4 OS Ολείδζμ ηδξ ηνζιεεοθαιίκδξ β- αιζκμαμοηονζηυ μλφ C 3 H 9 NO C 4 H 9 NO Καδααενίκδ C 5 H 14 N Φμθζηυ μλφ C 19 H 19 N 7 O Θεμανςιίκδ C 7 H 8 N 4 O Οοναηίθδ C 4 H 4 N 2 O Θοιίκδ C 5 H 6 N 2 O Μεεεζμκίκδ C 5 H 11 NO 2 S Θοιζδίκδ C 10 H 14 N 2 O δεμλομονζδίκδ C 9 H 12 N 2 O Πονμοαζηυ μλφ C 3 H 4 O Ρζαμθθααίκδ C 17 H 20 N 4 O Πζημθζκζηυ μλφ C 6 H 5 NO Γζιεεοθαιίκδ C 2 H 7 N Πονμβθμοηαιζηυ μλφ C 5 H 7 NO Τπμηαονίκδ C 2 H 7 NO 2 S Φμοιανζηυ μλφ C 4 H 4 O Βζηαιίκδ Β12 C 63 H 89 CoN 14 O 14 P

96 α- ηεημβθμοηανζηυ μλφ C 5 H 6 O ανημζίκδ C 3 H 7 NO μοαενζηυ μλφ C 8 H 14 O Αδεκίκδ C 5 H 5 N Οονζδίκδ C 9 H 12 N 2 O Αδεκμζίκδ C 10 H 13 N 5 O Ηκμζίκδ C 10 H 12 N 4 O ` Υμθίκδ C 5 H 14 NO Νζημηζκζηυ μλφ C 6 H 5 NO Μακκζηυθδ C 6 H 14 O μναζηυθδ C 6 H 14 O Bεηαΐκδ C 5 H 11 NO Ηζμθεοηίκδ C 6 H 13 NO Λεοηίκδ C 6 H 13 NO Βαθίκδ C 5 H 11 NO Σονμζίκδ C 9 H 11 NO Αθακίκδ C 3 H 7 NO Οιμζενίκδ C 4 H 9 NO Θνεμκίκδ C 4 H 9 NO Γθοηίκδ C 2 H 5 NO Γθμοηαιίκδ C 5 H 10 N 2 O ενίκδ C 3 H 7 NO Αζπαναβίκδ C 4 H 8 N 2 O Γθμοηαιζηυ μλφ C 5 H 9 NO Αζπανηζηυ μλφ C 4 H 7 NO Πμοηνεζηίκδ C 4 H 12 N Ανβζκίκδ C 6 H 14 N 4 O Σαονίκδ C 2 H 7 NO 3 S

97 Ονκζείκδ C 5 H 12 N 2 O Μδθζηυ μλφ C 4 H 6 O Κζηνζηυ μλφ C 6 H 8 O Κζκζηυ μλφ C 7 H 12 O πενιίκδ C 10 H 26 N πενιζδίκδ C 7 H 19 N Ηζηζδίκδ C 6 H 9 N 3 O Σνοπημθάκδ C 11 H 12 N 2 O Ηκμζζηυθδ C 6 H 12 O Αζημναζηυ μλφ C 6 H 8 O Ρζαυγδ C 5 H 10 O Φαζκοθαθα-κίκδ C 9 H 11 NO Πνμθίκδ C 5 H 9 NO Μεθεγζηυγδ C 18 H 32 O Σνεαθυγδ C 12 H 22 O Λοζίκδ C 6 H 14 N 2 O Κοζηίκδ C 6 H 12 N 2 O 4 S Γαθαηημονμκζηυ μλφ C 6 H 10 O Κεθθμαζυγδ C 12 H 22 O Γμοακμζίκδ C 10 H 13 N 5 O Ραθζκυγδ C 18 H 32 O Μεθζαζυγδ C 12 H 22 O Γθοημκζηυ μλφ C 6 H 12 O

98 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 8 Ο : ΔΠΗΚΤΡΧΖ ΜΔΘΟΓΟΤ 8.1 ΚΑΜΠΤΛΔ ΑΝΑΦΟΡΑ ΠΡΟΣΤΠΩΝ ΓΗΑΛΤΜΑΣΩΝ Ζ επζθμβή ημο επζπέδμο ηαεχξ ηαζ ημο εφνμοξ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ πνυηοπςκ δζαθοιάηςκ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ υπςξ ακαθένεδηε ζηδκ εκυηδηα 7.1, έβζκε θαιαάκμκηαξ οπυρδ ηα επίπεδα ζοβηέκηνςζδξ ηςκ ακαθοηχκ πμο οπήνπακ ζημ οπυζηνςια. Οζ εκχζεζξ πςνίζηδηακ ζε ηνεζξ μιάδεξ, ακάθμβα ιε ηα παναπάκς ηνζηήνζα, Α,Β ηαζ C, ιε ηδκ ηάεε μιάδα κα πενζθαιαάκεζ ζοβηεηνζιέκεξ ζοβηεκηνχζεζξ πνυηοπςκ δζαθοιάηςκ. Πναβιαημπμζήεδηακ δμηζιέξ χζηε μζ επζθεβιέκεξ ζοβηεκηνχζεζξ κα πενζθαιαάκμοκ, ζημ ααειυ πμο αοηυ ήηακ δοκαηυ, ημ υνζμ πμζμηζημπμίδζδξ ηδξ ηάεε έκςζδξ. Ζ παναζηεοή δζαθοιάηςκ βζα πμθοδφκαιεξ ιεευδμοξ (multi-analyte methods) ακάθοζδξ είκαζ ιζα ζδζαίηενα δφζημθδ δζαδζηαζία ιζαξ ηαζ πνέπεζ ζε ηάεε πνυηοπμ κα οπάνπμοκ υθεξ μζ πνμξ ακάθοζδ εκχζεζξ ηαζ ιάθζζηα ζε δζαθμνεηζηά εφνδ ζοβηεκηνχζεςκ. ηδ ζοβηεηνζιέκδ πενίπηςζδ μ δζαθφηδξ αναίςζδξ μ μπμίμξ πνδζζιμπμζήεδηε ήηακ μ ίδζμξ ιε ηδκ ηζκδηήξ θάζδξ, 95%MeCN:5%H2O, δίπςξ ηδκ πνμζεήηδ άθαημξ. Σα πνυηοπα δζαθφιαηα βζα ηδ πάναλδ ηςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ παναζηεοάζηδηακ ιε αναίςζδ ηςκ ποηκχκ stock δζαθοιάηςκ, ακάιζλδ ηςκ εκχζεςκ ηαζ αναίςζδ ζε 8 δζαθμνεηζηά επίπεδα ζοβηεκηνχζεςκ (πίκαηαξ 8.1). Ανπζηά παναζηεοάζηδηε ημ πζμ ποηκυ δζάθοια (std8) ηαζ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα έβζκακ δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ απυ ημ ποηκυηενμ. Πίκαηαξ 8.1: οβηεκηνχζεζξ πνυηοπςκ δζαθοιάηςκ, ηα μπμία πνδζζιμπμζήεδηακ ηαηά ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ ηδξ ιεευδμο. κg/ml Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 5 Std 6 Std 7 Std 8 Οκάδα Α Οκάδα Β Οκάδα Γ Γζα ηάεε ζοβηέκηνςζδ εθήθεδζακ ηνεζξ ιεηνήζεζξ. Ζ πμζμηζηή απμηίιδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ έβζκε ςξ ελήξ. Έβζκε μθμηθήνςζδ ηςκ ειααδχκ βζα ηάεε έκςζδ ζε ηάεε επίπεδμ ζοβηέκηνςζδξ ηαζ ηα δεδμιέκα ιεηαθένεδηακ ζημ Excel υπμο έβζεκε ηαζ δ επελενβαζία. Ζ βναθζηή πανάζηαζδ βζα ηάεε έκςζδ ήηακ ηδξ ελήξ ιμνθήξ: ημκ άλμκα ημο y είπαιε ηδκ ιέζδ ηαζ ζημκ άλμκα ηςκ x είπαιε ηδκ ζοβηέκηνςζδ. Με ημκ ηνυπμ αοηυ ηαηαζηεοάζηδηακ μζ ηαιπφθεξ ακαθμνάξ ηαζ οπμθμβίζηδηακ μζ ελζζχζεζξ ηςκ εοεεζχκ ηςκ εθαπίζηςκ ηεηναβχκςκ ιε ηδ αμήεεζα ηδξ ιεευδμο παθζκδνυιδζδξ βζα ζηάειδ ειπζζημζφκδξ 95%. Οζ ελζζχζεζξ πμο πνμέηορακ είκαζ ημο ηφπμο y=ax + b, υπμο y o ιέζμξ υνμξ (ηνζχκ ιεηνήζεςκ) ηςκ ειααδχκ ηδξ εηάζημηε έκςζδξ βζα ηάεε επίπεδμ ζοβηέκηνςζδξ, x δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ζε ιg/ml, a δ ηθίζδ ηδξ εοεείαξ ηαζ b δ ηεηαβιέκδ επί ηδκ ανπή (ζπήια 8.1). Οζ ηζιέξ ηςκ ιεβεεχκ αοηχκ ηαεχξ ηαζ ηςκ ζοκηεθεζηχκ βναιιζηήξ ζοζπέηζζδξ (r 2 ) δίκμκηαζ ζημκ 83

99 πίκαηα 8.2. Σρήκα 8.1: Δλδεηθηηθή θακπύιε αλαθνξάο θξεαηηλίλεο. 8.2 ΟΡΗΑ ΑΝΗΥΝΔΤΖ ΚΑΗ ΠΟΟΣΗΚΖ ΑΠΟΣΗΜΖΖ Σμ υνζμ ακίπκεοζδξ (Limit of Detection, LOD) ηαζ ημ υνζμ πμζμηζηήξ απμηίιδζδξ (Limit of Quantitation, LOQ) μνίγμκηαζ ςξ δ ιζηνυηενδ ζοβηέκηνςζδ ιζαξ έκςζδξ πμο ιπμνεί κα ακζπκεοεεί ηαζ κα πνμζδζμνζζηεί πμζμηζηά ακηίζημζπα ιε αεααζυηδηα 95%. ε πμθθέξ πενζπηχζεζξ ημ υνζμ ακίπκεοζδξ εεςνείηαζ υηζ είκαζ ίζμ µε 3 x (θυβμξ ζήµαημξ/εμνφαμο) ηαζ ημ υνζμ πμζμηζημπμίδζδξ ιπμνεί κα οπμθμβζζηεί ακηίζημζπα ίζμ ιε 10 x (θυβμξ ζήιαημξ/ εμνφαμο). Κάηζ ηέημζμ δεκ ιπμνμφζε κα εθανιμζηεί ζηδ δζηή ιαξ πενίπηςζδ ηαεχξ μζ ιεηααμθίηεξ είκαζ εκδμβεκείξ εκχζεζξ ηαζ δεκ ήηακ δοκαηή δ πνήζδ blank δζαθφιαημξ.έβζκε ιζα δμηζιή κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ blank δζάθοια ιεεακυθδξ άθθα δεκ οπήνπε ηάπμζμ ζήια ζημοξ ακαιεκυιεκμοξ πνυκμοξ έηθμοζδξ ηςκ εκχζεςκ [94]. Σα υνζα ακίπκεοζδξ ηαζ πμζμηζημπμίζδξ ιπμνμφκ κα οπμθμβζζημφκ ηαζ απυ ηζξ ηαιπφθεξ ακαθμνάξ απυ ημοξ ηφπμοξ: Όπμο ζ:ηοπζηή απυηθζζδ ηςκ ιεηνήζεςκ. Καζ S: δ ηθίζδ ηδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ ηαζ Δθανιυγμκηαξ ημοξ ζοβηεηνζιέκμοξ ηφπμοξ, ημ πνυαθδια πμο ακηζιεηςπίζαιε ήηακ υηζ μζ ηζιέξ ηςκ LOD πνμέηοπηακ ανηεηά ορδθυηενεξ απυ ηδ ζοβηέκηνςζδ ημο δζαθφιαημξ ιε ηδ παιδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ (std1) ηαζ ιενζηέξ θμνέξ ηαζ ορδθυηενεξ ηαζ απυ ηδ ζοβηέκηνςζδ ημο std2. 84

100 οκεπχξ ηαζ μζ ηζιέξ ηςκ LOQ ήηακ ανηεηά ορδθυηενεξ. Κάηζ ηέημζμ απυ ιαεδιαηζηήξ άπμρδξ είκαζ ζςζηυ ηαεχξ ημ ηοπζηυ ζθάθια ημο intercept ειπενζέπεζ υθα ηα ζδιεία ηδξ ηαιπφθδξ, ηαζ ηα εφνδ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ ήηακ ανηεηά ιεβάθα πανυθμ πμο οπήνπακ μηηχ ζδιεία. Απυ ακαθοηζηή άπμρδ υιςξ ήηακ ιδ θμβζηυ δζυηζ πανυθμ πμο μζ ηζιέξ ηςκ LOD ήηακ ιεβαθφηενεξ ηςκ std1 ή std2, απυ ηα πνςιαημβναθήιαηα είπαιε λεηάεανεξ ημνοθέξ ζηα δφμ αοηά standards. Απμννίπηςκηαξ έηζζ ημκ ηνυπμ αοηυ ηαζ ιε αάζδ ηδκ αζαθζμβναθία οζμεεηήεδηε μ ελήξ ηνυπμξ οπμθμβζζιμφ: Δθυζμκ απμδείπηδηε δ βναιιζηυηδηα βζα ζοβηεηνζιέκα εφνδ ζοβηέκηνςζδξ ζε ηάεε έκςζδ, οπμθμβζγυηακ ιζα ηαζκμφνζα ηαιπφθδ βζα ηάεε έκςζδ δ μπμία ζοιπενζεθάιαακε βζα ηάεε έκςζδ ηα 3 παιδθυηενα standards (ηα μπμία ήηακ ζηδκ ηαιπφθδ). Απυ ηα ζημζπεία ηδξ ηαιπφθδξ ηςκ 3 παιδθυηενςκ stds ηδξ εηάζημηε έκςζδξ οπμθμβίζηδηακ ηα LOD ηαζ LOQ απυ ημοξ ηφπμοξ LOD a = LOD b = LOD total = average (LOD a, LOD b ) υπμο S(y/x): ημ ηοπζηυ ζθάθια ηδξ παθζκδνυιδζδξ Sb: ημ ηοπζηυ ζθάθια ηδξ ηεηαβιέκδξ a: δ ηθίζδ ηδξ εοεείαξ Με ηζξ ελήξ απαζηήζεζξ: 1) LOD total < C min ημο εηάζημηε παιδθυηενμο std 2) LOD total >10*C min Καζ ζηδ ζοκέπεζα LOQ=3LOD [95,96]. Οζ ηζιέξ ηςκ υνζςκ ακίπκεοζδξ ηαζ πμζμηζηήξ απμηίιδζδξ ηςκ ελεηαγυιεκςκ εκχζεςκ δίκμκηαζ ζημκ πίκαηα

101 Πίκαηαξ 8.2: Δλζζχζεζξ ηαιποθχκ ακαθμνάξ, ζοκηεθεζηέξ βναιιζηήξ ζοζπέηζζδξ υνζα ακίπκεοζδξ ηαζ πμζμηζημπμίδζδξ, ακαθοηζηά ζημζπεία ηςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ. Έλσζε Γξακκηθή Πεξηνρή (mg kg -1) Δμίζσζε R 2 LOD (mg kg -1) LOQ (mg kg -1) Πηθνιηληθό νμύ y= x Νηθνηηλακίδην y= x Θενβξσκίλε y=305296x Bελδντθό νμύ y=16045x Γιπθνπξνληθό νμύ y=70924x Θπκηδίλε y=48340x Οπξαθίιε y=23145x δενμπνπξηδίλε y=131236x Ππξηδνμίλε y= x Αδελίλε y=191182x νπβεξηθό νμύ y=557756x Ρηβόδε y=6501.3x Αδελνζίλε y=984290x Οπξηδίλε y=566404x Τπνμαλζίλε y= x Κξεαηηλίλε y= x Βηνηίλε y= x Ξαλζίλε y=253153x Κπηνζίλε y= x Ρηβνθιαβίλε y=113812x Σξηκεζπιακίλε y=326883x Υνιίλε y=971434x Ηλνζίλε y= x Γνπαλίλε y=267333x Κπηηδίλε y= x Παληνζεληθό νμύ y= x

102 Νηθνηηληθό νμύ y=39738x Bεηαΐλε y= x Μαλληηόιε y=34706x νξβηηόιε y=32172x Ηζνιεπθίλε y= x Λεπθίλε y= x Φαηλπιαιαλίλε y=422041x Σξππηνθάλε y=8508.7x Θεηακίλε y= x Σαπξίλε y=46421x Μεζεηνλίλε y=186323x Πξνιίλε y=147017x Αθεηπινθαξληηίλε y= x Βαιίλε y= x Ηζηακίλε y= x Σπξνζίλε y=276396x Ομείδην ηεο ηξηκεζπιακίλεο y= x αξθνζίλε y=402967x Αιαλίλε y=190776x γ-ακηλνβνπηπξηθό νμύ y= x Γιπθίλε y=754.8x Κηληθό νμύ y=110810x Οκνζεξίλε y=735322x Θξενλίλε y= x Σξεαιόδε y=3841.6x Γινπηακίλε y=549345x εξίλε y=240181x Αζπαξαγίλε y=332060x Βηηακίλε B y= x Γαιαθηνπξνληθό νμύ y=21358x

103 Μειεδηηόδε y=5327.8x Γινπηακηθό νμύ y=10842x Ραθηλόδε y=3817.3x Καδαβεξίλε y=598831x Αζπαξηηθό νμπ y=11646x Λπζίλε y=832444x Πνπηξεζθίλε y=764303x Αξγηλίλε y= x Κηηξηθό νμύ y=43959x Γιπθνληθό νμύ y=29487x Κπζηίλε y=107997x Ηζηηδίλε y= x Μειηθό νμύ y=147553x Οξληζίλε y= x Οζ εκχζεζξ ζκμζζηυθδ, βμοακμζίκδ, πονμοαζηυ μλφ, εοιίκδ, ζπενιζδίκδ, ζπενιίκδ, αδζπζηυ μλφ, δζιεεοθαιίκδ, πονμβθμοηαιζκζηυ μλφ, οπμηαονίκδ, α-ηεημβθμοηανζηυ μλφ, ιεθζαζυγδ, ηεθθμαζυγδ, θμοιανζηυ μλφ, θμθζηυ μλφ ηαζ αζημναζηυ μλφ δε ζοιπενζθαιαάκμκηαζ ζηζξ εκχζεζξ πμο δφκαηαζ κα πμζμηζημπμζδεμφκ απυ ηδκ ιέεμδμ ηαζ αθαζνέεδηακ ηαεχξ είηε δ ηαιπφθδ ακαθμνάξ είπε ιδ απμδεηηή βναιιζηυηδηα είηε δεκ ήηακ δοκαηυκ κα πμζμηζημπμζδεμφκ ζημ εφνμξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ πνυηοπςκ δζαθοιάηςκ πμο παναζηεοάζηδηακ. Πανυθα αοηά μζ ιεηααάζεζξ MRM πενζθαιαάκμκηαζ ζημκ πίκαηα, ιζαξ ηαζ μζ εκχζεζξ ήηακ δοκαηυ κα ακζπκεοημφκ. Σμ 93% ηςκ εκχζεςκ πανμοζίαζε ζοκηεθεζηή βναιιζηήξ ζοζπέηζζδξ πάκς απυ Σμ 23% ηςκ εκχζεςκ είπε υνζμ πμζμηζημπμίδζδξ ημ 0.08 ιg/ml. Σμ 43% ηςκ εκχζεςκ είπε υνζμ ακίζπκεοζδξ ηάης ημο 0.1 ιg/ml ηαζ υνζμ πμζμηζημπμίδζδξ ηάης ημο 1ιg/mL υπςξ θαίκεηαζ ηαζ ζημ ζπήια 8.2. Μυκμ 3 εκχζεζξ είπακ ζδζαίηενα ορδθή ηζιή μνίμο πμζμηζημπμίδζδξ δ πνμθίκδ, δ ηνεαθυγδ ηαζ δ ηοζηίκδ. 88

104 Σρήκα 8.2:Πνζνζηηαία θαηαλνκή ησλ ελώζεσλ ζύκθσλα κε ηηο ηηκέο ησλ LOQ ΠΗΣΟΣΖΣΑ ΜΔΘΟΓΟΤ Ζ πζζηυηδηα (precision) ιζαξ ιεευδμο εηθνάγεηαζ ιε ηδκ επακαθδρζιυηδηα (repeatability) ηαζ ηδκ ακαπαναβςβζιυηδηα (reproducibility). Ζ αηνίαεζα ηδξ ιεευδμο, εηθνάγεζ ηαηά πυζμ ημκηά ανίζηεηαζ δ πεζναιαηζηά θαιαακυιεκδ ηζιή ζηδκ πναβιαηζηή ηζιή. Ζ επακαθδρζιυηδηα ιαγί ιε ηδκ αηνίαεζα, απμηεθμφκ ηζξ ζδιακηζηυηενμοξ παναιέηνμοξ πμο ηαεμνίγμοκ ηδκ αλζμπζζηία ιζαξ ιεευδμο. Πνμηεζµέκμο κα δζαπζζηςεεί δ αηνίαεζα ηαζ δ επακαθδρζµυηδηα ηδξ µεευδμο, έβζκακ ηνεζξ ιεηνήζεζξ 8 πνμηφπςκ δζαθοιάηςκ ηδκ ίδζα ιένα (intra-day precision). Γζα ηάεε επίπεδμ ζοβηέκηνςζδξ οπμθμβίζηδηε δ ιέζδ ηζιή, δ ηοπζηή απυηθζζδ ηαζ δ ζπεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ. Ζ ηοπζηή απυηθζζδ (s) ηαζ δ ζπεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ (s r ) οπμθμβίγμκηαζ απυ ηζξ ζπέζεζξ: 2 ( ) ( i ) / 1 s x x n sr s / x Όπμο x: δ ιέζδ εονεεείζα ηζιή ιζαξ ζεζνάξ ιεηνήζεςκ n: μ ανζειυξ ηςκ ιεηνήζεςκ Ζ επακαθδρζιυηδηα εηθνάζηδηε ςξ δ ζπεηζηή απυηθζζδ % ή αθθζχξ χξ ζοκηεθεζηήξ ιεηααθδηυηδηαξ (coefficient of variation, CV), πμο εηθνάγεηαζ ζε πμζμζηυ ηαζ οπμθμβίγεηαζ απυ ηδ ζπέζδ: RSD%= CV% = SD / x 100. Ο ζοκηεθεζηήξ ιεηααθδηυηδηαξ δίκεζ ημ ιέηνμ ηδξ ακαθοηζηήξ δζαηφιακζδξ ηςκ ιεηνήζεςκ, δδθαδή ηδ ζηαεενή απυηθζζδ πνμξ ηδ ιέζδ ηζιή ηςκ ιεηνήζεςκ, επί ηδξ εηαηυ υπςξ θαίκεηαζ ζημ ζπήια

105 Ζ αηνίαεζα ηδξ ιεευδμο οπμθμβίζηδηε απυ ημκ ηφπμ βζα ηδκ οπμθμβζγυιεκδ ζοβηέκηνςζδ (ζπήια 8.4). Σρήκα 8.3: Intra day επαλαιεςηκόηεηα ηεο κεζόδνπ. Ζ επακαθδρζιυηδηα ηδξ ιεευδμο απμδείπηδηε ζηακμπμζδηζηή ηαεχξ μζ πενζζζυηενεξ εκχζεζξ είπακ RSD < 20%. Οζ εκχζεζξ μζ μπμίεξ πανμοζίαζακ RSD ακχηενμ ημο 20% είκαζ : δ νζαυγδ, ημ βθοημονμκζηυ μλφ, δ λακείκδ, δ νζαμθθααίκδ, δ εεζαιίκδ ηαζ δ ζζηαιίκδ. πήια 8.4: Πμζμζηυ εκχζεςκ ιε αηνίαεζα ιεηαλφ 80%-120% ζοβηεκηνχζεςκ. ζηα 8 επίπεδα 90

106 Παναηδνείηαζ υηζ ζηα πνχηα ηνία stds δ αηνίαεζα δεκ είκαζ ηαθή, εκχ ανπίγεζ κα ζηαεενμπμζείηαζ απυ ημ std5 ηαζ ιεηά. Κάηζ ηέημζμ ίζςξ εα πνεζαγυηακ πεναζηένς ιεθέηδ. Γζα ημκ έθεβπμ ηδξ ακαπαναβςβζιυηδηαξ έβζκε ιέηνδζδ ημο std5, ημ μπμίμ είπε μφηε πμθφ ορδθέξ μφηε πμθφ παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ υθςκ ηςκ ακαθοηχκ, ηνεζξ θμνέξ ζε ηνεζξ δζαδμπζηέξ ιένεξ. Ζ ακαπαναβςβζιυηδηα (inter day precision) εηθναζηδηε ςξ δ ζπεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ % υπςξ ηαζ ζηδκ intra day (ζπήια 8.5) Σρήκα 8.5: Inter day, αλαπαξαγσγηκόηεηα ηεο κεζόδνπ. Ζ ακαπαναβςβζιυηδηα ηδξ ιεευδμο είκαζ επίζδξ ζε ζηακμπμζδηζηά υνζα, ακ ηαζ ημ πμζμζηυ ηςκ εκχζεςκ πμο έπμοκ RSD ιεβαθφηενμ ημο 20% είκαζ ορδθυηενμ. Δκχζεζξ πμο είπακ ζδζαίηενα ορδθέξ ηζιέξ ήηακ ημ βθοημονμκζηυ, δ ζζηαιίκδ, δ βμοακίκδ, δ νζαμθθααίκδ ηαζ δ εοιζδίκδ. 91

107 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 9 Ο : ΔΦΑΡΜΟΓΖ ΜΔΘΟΓΟΤ Μεηά απυ ηδκ ακάπηολδ ηδξ ιεευδμο βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ πμθζηχκ ιεηααμθζηχκ πμο ακαθένεδηακ, έβζκε πνμζπάεεζα βζα ηδκ εθανιμβή ηδξ ζε δείβιαηα εοιανίζζςκ ιεθζχκ, ηα μπμία παναπςνήεδηακ απυ ημ ενβαζηήνζμ Μεθζζζμημιίαξ Α.Π.Θ. 9.1 ΠΡΟΚΑΣΔΡΓΑΗΑ ΓΔΗΓΜΑΣΧΝ Όπςξ πνμτπμεέημοκ υιςξ μζ πενζζζυηενεξ ηεπκζηέξ ακάθοζδξ είκαζ απαναίηδηδ δ ηαηάθθδθδ πνμηαηενβαζία ηςκ δεζβιάηςκ, χζηε κα ιπμνέζμοκ αοηά ζηδ ζοκέπεζα κα εζζαπεμφκ ζημ πνςιαημβναθζηυ ζφζηδια. ηζξ ιεηααμθζιζηέξ ακαθφζεζξ, ηαηά ηδκ πνμηαηενβαζία ημο δείβιαημξ εα πνέπεζ κα απμθεφβεηαζ υζμ ημ δοκαηυκ πενζζζυηενμ δ αθθαβή ηδξ ζφκεεζδξ ηςκ ιεηααμθζηχκ πμο οπάνπμοκ ζημ δείβια. Καηά ημκ πνμβναιιαηζζιυ ιζαξ ακάθοζδξ ιε ζηυπμ ηδκ εφνεζδ ημο ιεηααμθζημφ πνμθίθ ιε LC-MS πνέπεζ κα θδθεμφκ οπυρδ ζδιακηζηέξ πανάιεηνμζ: 1) δ απυδμζδ ημο ζοζηήιαημξ LC εα πνέπεζ κα δζαηδνδεεί ορδθή ηαζ βζ αοηυ πνέπεζ κα βίκεζ αθαίνεζδ ζςιαηζδίςκ / ιαηνμιμνίςκ απυ ημ δείβια βζα πνμζηαζία ημο ζοζηήιαημξ. 2) δ πδβή ζυκηςκ (MS) εα πνέπεζ κα δζαηδνείηαζ ζε θεζημονβία εκηυξ ηςκ ηαεμνζζιέκςκ μνίςκ απυδμζδξ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο ηφηθμο ακάθοζδξ, χζηε κα απμθεοπεεί ιζα ιδ επζεοιδηή ιείςζδ ή αφλδζδ ηυζμ ζημ ζοκμθζηυ ζήια, υζμ ηαζ ζηα ζήιαηα βζα ηα ιειμκςιέκα ζοζηαηζηά ημο δείβιαημξ, 3) μζ πανειπμδίζεζξ ημο οπμζηνχιαημξ πμο ιπμνμφκ κα μδδβήζμοκ ζε ηαηαζημθή / εκίζποζδ ζυκηςκ εα πνέπεζ κα παναημθμοεμφκηαζ [42]. Ακελάνηδηα απυ ηδ πνδζζµμπμζμφµεκδ ακαθοηζηή ηεπκζηή, δ πνμηαηενβαζία ημο δείβµαημξ απμηεθεί ακαµθίαμθα ημ πθέμκ μοζζαζηζηυ ηαζ πνμκμαυνμ ζηάδζμ ηδξ ακαθοηζηήξ δζαδζηαζίαξ (ζπήια 9.1). Σρήκα 9.1: Πνζνζηηαία θαηαλνµή ρξόλνπ ζηελ αλαιπηηθή δηαδηθαζία. (1.Πξνθαηεξγαζία δείγµαηνο, 2.Αλάιπζε, 3.Σπιινγή δείγµαηνο, 4.Δπεμεξγαζία δεδνµέλσλ). 92