Молекуларна и фенотипска карактеризација НС инбред линија кукуруза

Transcript

1 УНИВЕРЗИТЕТ У БЕОГРАДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Сања З. Микић Молекуларна и фенотипска карактеризација НС инбред линија кукуруза докторска дисертација Београд, 2014.

2 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE Sanja Z. Mikić Molecular and phenotypic characterisation of NS maize inbred lines Doctoral Dissertation Belgrade, 2014.

3 МЕНТОР: др Гордана Шурлан Момировић, редовни професор, Универзитет у Београду, Пољопривредни факултет ЧЛАНОВИ КОМИСИЈЕ: др Славен Продановић, редовни професор, Универзитет у Београду, Пољопривредни факултет др Анкица Кондић Шпика, виши научни сарадник, Институт за ратарство и повртарство, Нови Сад др Томислав Живановић, редовни професор, Универзитет у Београду, Пољопривредни факултет др Александра Настасић, виши научни сарадник, Институт за ратарство и повртарство, Нови Сад Датум одбране:

4 Истраживања обухваћена овом докторском дисертацијом спроведена су у Институту за ратарство и повртарство у Новом Саду. Резултати ове докторске дисерације део су резултата националног пројекта Министарства просвете, науке и технолошког развоја (ТР-31073) и билатералног програма Павле Савић између Србије и Француске (DIVERZEATY). Од срца се захваљујем својој менторки из Института за ратарство и повртарство, др Анкици Кондић Шпики, на разумевању, подршци и корисним саветима у свим фазама израде докторске дисертације. Искрено се захваљујем својој менторки са Пољопривредног факултета у Земуну, проф. др Гордани Шурлан Момировић, на великој помоћи и предусетљивости, не само приликом писања рада, већ и током читавих студија. Велику захвалност желим да упутим проф. др Славену Продановићу, Пољопривредног факултета у Земуну, на стеченом знању и подстреху током студија и израде дисертације. Захвалност дугујем проф. др Милету Ивановићу, др Милисаву Стојаковићу, др Горану Бекавцу и др Ђорђу Јоцковићу на биљном материјалу и помоћи приликом извођења огледа. Желим да се захвалим својим драгим колегама Љиљани Брбаклић и Душану Станисављевићу на несебичној помоћи када је била најпотребнија. Посебну захвалност дугујем свом супругу, родитељима и брату на подршци и љубави.

5 Молекуларна и фенотипска карактеризација НС инбред линија кукуруза Резиме: Кукуруз је биљна врста која испољава велику фенотипску и генетичку варијабилност. У овом раду извршена је фенотипска и молекуларна карактеризација дивергентних инбред линија кукуруза које се користе у оплемењивачким програмима и које представљају могући извор алела са позитивним утицајем на агромонски важне особине. Такође, идентификовани су алели карактеристични за одређене хетеротичне групе и утврђене су потенцијално значајне везе између маркера и агрономски важних својстава применом асоцијативне анализе, са циљем даље примене у маркер асистираној селекцији. Анализирани материјал састојао се од 96 инбред линија из четири хетеротичне групе. Тридесет шест микросателитских маркера коришћено је за израчунавање параметара диверзитета генских локуса. Примењене су три кластер анализе на подацима добијеним молекуларном анализом. Пољски огледи су постављени у току две године, по потпуно случајном блок систему са три понављања. Дескриптивна статистика, анализа варијансе, линеарне корелације и анализа главних компоненти израчунате су за 13 особина. Везе између маркера и особина утврђене су применом општег и мешовитог линеарног модела. Просечан број алела износио је 8,3, просечна полиморфност појединачних локуса износила је 0,64, а проценат ретких алела 8,5% по локусу. Уочен је већи генетички диверзитет код BSSS него код Lancaster линија. Више од трећине алела било је карактеристично за само једну групу. Резултати кластер анализа су у великој мери били у међусобној сагласности. Анализа варијансе указала је на постојање статистички значајних разлика особина међу инбред линијама, годинама и локалитетима. Резултати кластер анализе фенотипских података били су у мањој мери сагласни са педигреима линија, него резулати анализе молекуларних података. Анализа главних компоненти издвојила је линије према хетеротичним групама и истакла њихове опште карактеристике. Велики број утврђених алела маркера са стабилним позитивним ефектима на принос указује на могући значај ових маркера у оплемењивању кукуруза. Кључне речи: кукуруз, генетички диверзитет, микросателити, асоцијативна анализа НАУЧНА ОБЛАСТ: Биотехничке науке УЖА НАУЧНА ОБЛАСТ: Генетика и оплемењивање УДК број: :575.21(043.3)

6 Molecular and phenotypic characterisation of NS maize inbred lines Summary: Maize has great phenotypic and genotypic variability. In this study a diverse set of maize inbred lines used in breeding programmes as a potential source of alleles with positive effects on important agronomic traits, was characterised at phenotypic and molecular level. Furthermore, alleles specific to heterotic groups were identified and potentially significant associations between markers and important agronomic traits which could be employed in marker assisted selection were determined. Ninety eight inbred lines from four heterotic groups were analysed. Thirty six microsatellite markers were used to obtain parameters for genetic diversity and three claster analyses were employed based on molecular data. The field trials were set in randomised block design with three replications during two years to acquire phenotypic data. Descriptive statistics, analysis of variance, linear correlations and principal component analysis were performed for 13 traits. The associations between markers and traits were identified by the application of general and mixed linear model. The average number of alleles was 8,3, the average value of polymorphism information content was 0,64, whereas the percentage of rare alleles was 8,5%. Greater genetic diversity of BSSS inbred lines compared to the lines from Lancaster group were observed. More than one third of alleles were specific to only one of these two groups. The results of cluster analyses were to a large extent in agreement with each other. Analysis of variance indicated statistically significant differences in traits among inbred lines, years and locations. Cluster analysis based on phenotypic data was in less consistent with pedigrees of the inbred lines than the cluster analysis based on molecular data. Principal component analysis grouped inbreds into heterotic groups and indicated their general characteristics. A large number of identified marker alleles with stable positive effects on grain yield suggested the potential importance of these markers in maize breeding. Key words: maize, genetic diversity, microsatellites, association analysis SCIENTIFIC FIELD: Biotechnical Sciences SPECIAL TOPIC: Genetics and Breeding UDK number: :575.21(043.3)

7 САДРЖАЈ 1. УВОД Значај кукуруза Систематика кукуруза Порекло и еволуција кукуруза Ширење кукуруза из центра порекла у Европу и Балкан Диверзитет кукуруза ЦИЉ ИСТРАЖИВАЊА ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ Значај и примена варијабилности кукуруза Геном кукуруза Доместикација и селекција кукуруза Значај карактеризацијегермплазме кукуруза Фенотипска карактеризација кукуруза Молекуларна карактеризација кукуруза Селекција помоћу маркера Мапирање Гаметска неравнотежа (Linkage disequilibrium) Структура популације Асоцијативна анализа РАДНА ХИПОТЕЗА МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ РАДА Биљни материјал План огледа Агроеколошки услови на испитиваним локалитетима Фенотипска оцена инбред линија кукуруза Молекуларна карактеризација инбред линија кукуруза Екстракција и одређивање концентрације ДНК кукуруза Микросателитски маркери кукуруза Ланчана реакција полимеразе Капиларна електрофореза Статистичка обрада молекуларних података кукуруза... 37

8 5.7 Статистичка обрада фенотипских података кукуруза Асоцијативна анализа инбред линија кукуруза РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА Генетичка варијабилност микросателитских маркера кукуруза Анализа структуре популације кукуруза заснована на параметријском моделу Анализа структуре популације кукуруза заснована на генетичким растојањима Анализа структуре популације кукуруза заснована на анализи главних координата Поређење фреквенција алела две групе инбред линија кукуруза Гаметскa неравнотежa између SSR маркера кукуруза Дескриптивна статистика фенотипских података кукуруза Кластер анализа фенотипских података кукуруза применом UPGMA Анализа главних компоненти фенотипских података кукуруза Анализа варијансе фенотипских података кукуруза Корелације између мерених особина кукуруза Асоцијативна анализа генотипова кукуруза ЗАКЉУЧАК ЛИТЕРАТУРА ПРИЛОГ

9 1. УВОД 1.1 Значај кукуруза Захваљујући својој веома широкој употреби у исхрани људи и домаћих животиња, кукуруз (Zea mays L.) је, поред пшенице (Triticum aestivum L.) и пиринча (Oryza sativa L.), најзначајнија и најзаступљенија житарица у свету. Кукуруз има велики значај и као сировина y прехрамбеној, прерађивачкој, фармацеутској индустрији и за добијање великог броја производа попут: биоетанолa, пластике, лепка, боја, адхезива, пестицида, експлозива, скроба, уља, алкохолних пића, заслађивача, текстилних влакана, сапуна и других. Додатна вредност ове биљне врсте огледа се и у благотворним здравственим својствима биоактивних једињења која се добијају из кукуруза. Светска производња кукуруза износи око 1 милијарде тона зрна годишње и одвија се на око 184 милиона хектара, са просечним приносом од 5,5 t/ha. У Србији, кукуруз се гаји на око 1,19 милиона хектара, са просечним приносом од 4,9 t/ha и укупном производњом од преко 5,9 милиона тона меркантилног и око 36 хиљада тона семенског кукуруза (FAOSTAT 2013). 1.2 Систематика кукуруза Кукуруз је једногодишња, странооплодна и моноецијска биљка са раздвојеним мушким и женским цвастима на биљци. Национални центар за биотехнолошке информације (National Center for Biotechnology Information, NCBI) и Информациона мрежа генетичких ресурса (Germplasm Resources Information Network, USDA, ARS, GRIN) предлажу следећу класификацију кукуруза: Надцарство: Eukaryota Царство: Plantae - биљке Подцарство: Tracheobionta - васкуларне биљке Надраздео: Spermatophyta семенице Раздeo: Magnoliophyta цветнице Класа: Liliopsida монокотиле Поткласа: Commelinidae 1

10 Ред: Poales/Cyperales Фамилија: Poaceae - траве Потфамилија: Panicoideae Племе: Andropogoneae Род: Zea Врста: Zea mays L. - кукуруз Род Zea има пет врста: Z. diploperennis H. H. Iltis et al. (вишегодишња диплоидна теозинта), Z. perennis (Hitchc.) Reeves & Mangelsd. (вишегодишња тетраплоидна теозинта), Z. nicaraguensis H. H. Iltis & B. F. Benz (једногодишња теозинта), Z. luxurians (Durieu & Asch.) R. M. Bird (једногодишња теозинта) и Z. mays L. (једногодишња диплоидна врста која обухвата кукуруз и друге теозинте). У оквиру врсте Z. mays L., описане су четири подврсте: Z. mays L. subsp. mays (кукуруз), Z. mays L. subsp. huehuetenangensis (H. H. Iltis & Doebley) Doebley, Z. mays L. subsp. mexicana (Schrad.) H. H. Iltis и Z. mays L. subsp. parviglumis H. H. Iltis & Doebley. Ранија подела кукуруза на велики број подврста указује на велику разноликост форми ове биљне врсте. Латински називи ових подврста описују боју, хемијски састав семена, облик зрна или присуство плевица: Z. curagua Molina, Z. indentata Sturtev., Z. indurata Sturtev., Z. japonica Van Houtte, Z. mays var. alba Alef., Z. mays var. flavorubra Körn., Z. mays var. indentata (Sturtev.) L. H. Bailey, Z. mays var. indurata (Sturtev.) L. H. Bailey, Z. mays var. japonica (Van Houtte) Alph. Wood, Z. mays var. leucodon Alef., Z. mays var. saccharata (Sturtev.) L. H. Bailey, Z. mays var. tunicata Larrañaga ex A. St.-Hil., Z. mays var. vulgata Körn. & H. Werner и Z. saccharata Sturtev. Данас се ови називи сматрају синонимима назива Z. mays subsp. mays. 1.3 Порекло и еволуција кукуруза Сматра се да је кукуруз пореклом из Мексика и да је настао одомаћивањем једногодишње теозинте (Z. mays ssp. parviglumis) пре 7 до 10 хиљада година (van Heerwaarden еt al. 2011). Пре 5-12 милиона година, дошло је до тетраплоидије, односно удвостручавања генома, и стварања два подгенома алотетраплоидијом. Даљом еволуцијом кукуруза дошло је до неједнаког губитка неких удвостручених гена (Schnable et al. 2009, 2011). На ову појаву указује присуство великог броја 2

11 удвостручених гена и генских сегмената са колинеарним редоследом у геному кукуруза (Wang et al. 1999, Matsuoka et al. 2002). 1.4 Ширење кукуруза из центра порекла у Европу и Балкан Кукуруз има широк ареал гајења, од 58 северне географске ширине до 40 јужне географске ширине и до преко 4000 m надморске висине. У претколумбовском периоду, кукуруз се из центра порекла, Мексика, проширио на Северну и Јужну Америку. Убрзо након првог Колумбовог доласка на амерички континент, године, кукуруз је са Кариба пренет у Европу преко Шпаније и раширен у медитеранске земље. Након прве интродукције, уследило је друго преношење кукуруза тврдунца из умереног климата ceвероисточне Америке у северну Европу почев од прве половине 16. и током 17. века (Rebourg et al. 2003). Кукуруз је на Балкан донет преко Турске, Грчке и Италије (Венеције) у 16. веку (Тrifunović 1978). Ти први тврдунци карипског порекла су се на нашим просторима укрштали са касније интродукованим тврдунцима из Мексика и Анда, а затим и из Северне Америке, и били су прилагођени гајењу у брдским крајевима. Уношењем кукуруза зубана из тзв. кукурузног појаса САД, крајем 19. века, и укрштањем са постојећим тврдунцима створене су високопродуктивне сорте тзв. европског кукурузног појаса. Ове одомаћене сорте гајиле су се све док нису биле потиснуте из производње увођењем хибрида, шездесетих година 20. века (Радовић и Јеловац 1995). 1.5 Диверзитет кукуруза Кукуруз, будући странооплодна биљна врста, испољава велику фенотипску и генетичку варијабилност. Велика разноликост услова гајења кукуруза допринела је стварању дивергентних популација прилагођених различитим земљишним, климатским и биолошким чиниоцима. Адаптације на специфичне локалне агроеколошке услове гајења довеле су до стварања различитих форми кукуруза, које се разликују не само по морфолошким (боја, висина, облик и хабитус, развијеност кореновог система), већ и по физиолошким (раностасност, отпорност на болести и шеточине), биохемијским (садржај уља, аминокиселина, протеина, скроба), агрономским (продуктивност, садржај влаге, чврстина стабла) и генетичким одликама (разлике на нивоу ДНК). 3

12 2. ЦИЉ ИСТРАЖИВАЊА Основни циљеви истраживања су: - фенотипска оцена агрономски значајних особина и појединих особина инбред линија кукуруза према UPOV дескриптору, - молекуларна анализа инбред линија применом микросателитских маркера који су, према литературним подацима, повезани с приносом, компонентама приноса и другим важним агрономским особинама кукуруза, - класификација генотипова кукуруза према резултатима фенотипске оцене и молекуларне анализе, - процена генетичке сличности и односа инбред линија кукуруза на основу утврђене алелне дивергентности и идентификација алела карактеристичних за одређене генотипове или хетеротичне групе, - процена и утврђивање сагласности генетичке структуре са подацима о педигреима линија кластер анализом и - утврђивање потенцијално значајних веза између маркера и агрономски важних особина применом асоцијативне анализе, са циљем даље примене селекцији помоћу маркера. 4

13 3. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 3.1 Значај и примена варијабилности кукуруза Кукуруз се одликује великим алелним диверзитетом и фенотипском варијабилношћу. Од његове доместикације, пре 10 хиљада година (van Heerwaarden еt al. 2011), диверзитет гена и алела кукуруза се повећавао под утицајем великог броја чинилаца. Проток гена између теозинте и популација кукуруза, странооплодна природа кукуруза, природна и вештачка селекција, адаптација на нове гајења, рекомбинације гена, генетички дрифт (помак), мутације, транспозони и други чиниоци допринели су настанку све већег диверзитета постојеће гермплазме кукуруза (Walbot 2009). У раним фазама гајења кукуруза, ова разноликост кукуруза првобитно је служила као извор варијабилности земљорадницима приликом одабира бољих биљака из локалних популација, а данас је од великог значаја за оплемењивање приликом стварања хибрида и генетику при анализи значајних особина. Савремено оплемењивање кукуруза подразумева истовремену селекцију више особина, тестирања у различитим фазама развића биљака и циклуса селекције и евалуацију великог броја потомства из укрштања. Циљеви оплемењивања кукуруза су: висок и стабилан принос зрна, прилагодљивост на различите еколошке услове (различите дужине вегетације, тип земљишта, абиотички стрес), могућност механизоване бербе (чврсто стабло и корен, брзо отпуштање влаге), пожељан хемијски састав зрна или силаже и отпорност на преовлађујуће болести и штеточине. Једна од савремених генетичких метода за утврђивање гена који одређују сложене и агрономски значајне особине је асоцијативна анализа (Yan et al. 2011). Предуслов за изналажење веза између генетичких чинилаца и фенотипске варијабилности асоцијативном анализом је стварање панела гермплазме који обухвата велики део укупне варијабилности испитиване особине, односно генотипове са многобројним комбинацијама алела већег броја локуса, познатих и као хаплотипови (Zhu et al. 2008). 5

14 3.2 Геном кукуруза Кукуруз има n=10 хаплоидних хромозома, за разлику од већине припадника племена Andropogoneae код којих је основни број хромозома n=5, што указује на дупликацију генома и тетраплоидно порекло кукуруза. Око 72% генома кукуруза је удвостручено у два подгенома. Међутим, због делимичне дупликације и значајних структурних промена у току еволуције генома, кукуруз нема хомеологне хромозоме (Schnable et al. 2009, 2011). Услед бројних трансклокација, инсерција, делеција, инверзија и дупликација, дошло је до нарушавања микроколинеарности, односно редоследа удвостручених гена кукуруза (Fu and Dooner 2002, Song and Messing 2003). Дуплирани гени, паралози, који се међусобно могу знaтно разликовати или бити скоро идентични, омогућују експресију више од два алела једног гена. Ова појава доприноси већој стабилности генотипа у различитим условима средине, већој фенотипској варијабилности и могућности позитивне селекције и преношење на потомство неког ретког алела са позитивним ефектом на пожељну особину (Emrich et al. 2007). Процењује се да се укупан број функционалних кодирајућих гена кукуруза креће од (Schnable et al. 2009) до (Messing et al. 2004). Смештени у збијене генске кластере, раздвојени дугим интергенским регионима, гени кукуруза чине само око 5%-7,5% генома кукуруза (Meyers еt al. 2001, Messing et al. 2004), док већину генома чине понављајуће секвенце. Haberer et al. (2005) су израчунали да је просечан ген кукуруза величине 4 kb и да се састоји од пет егзона, док најдужи утврђени ген има 59 kb и 31 егзон. У истом истраживању израчуната је и учесталост појаве гена од 0,5 до 10,7 гена на сваких 100 kb и величина генома кукуруза од 2,4 Gb са 66% понављајућих елемената. Каснија истраживања утврдила су нешто већи садржај понављајуће секвенце у геному кукуруза, од 85% (Zhou еt al. 2009). Проточном цитометријом утврђено је варирање величинe генома различитих линија кукуруза од 2,3 Gb до 2,5 Gb (Bennetzen et al. 2005). Када би дошло до експресије свих гена који чине хаплоидни геном кукуруза, величина укупног транскрипта, односно ефективна величина генома, износила би 97 Mb (Hansey еt al. 2012). Садржај GC база износи око 50% (Hake and Walbot 1980) и присутнији је у егзонима него у интронима (Haberer еt al. 2005). 6

15 Највећи део генома кукуруза чине ретроелементи или транспозони. То су фрагменти ДНК који имају способност кретања по геному посредством РНК уз помоћ реверзне транскриптазе. Покретни елементи имају значајну улогу у стварању алелног диверзитета, тако што исецају део ДНК, који може обухватити цео ген или његов фрагмент и уграђују га у други део генома, често у други ген (Brunner et al. 2005). Понекад се може десити транскрипција делова премештених гена преко хелитрона, врсте покретних елемената, при чему се ствара химерни транскрипт од дела премештеног гена и гена у који се други део гена уградио (Barbaglia et al. 2012). Процењено је да су од укупног броја транскрипта у геному кукуруза, чак 25% нови и настали активношћу хелитрона, који сами чине 2% генома кукуруза (Du et al. 2009, Yang and Bennetzen 2009). Висок степен варијабилности алела кукуруза утврђен је поређењем секвенци у оквиру врсте. Процењује се да на сваких 100 базних парова постоји један полиморфизам између две насумично изабране инбред линије (Tenaillon et al. 2001, Ching et al. 2002). Тако се, на пример, индел (ИНсерције - ДЕЛеције) полиморфизми између линија B73 и Мо17 појављују на сваких 309 bp, док су једнонуклеотидни полиморфизми (Single Nucleotide Polymorphism; SNP) уочени на сваких 79 bp (Vroh Bi et al. 2005). Утврђено је да разлике у садржају производа транскрипције између линија B73 и Мо17 не морају бити последица само разлика у генима између ове две линије, већ и експресије гена, која настаје услед cis или trans делујућих варијабилности у регулаторним секвенцама или транскрипционим факторима. Извори диверзитета могу бити и варијабилност у sense-antisense транскрипцији, алелна варијабилност код различитих образаца ДНК метилација и алелна варијабилност хроматина (Springer and Stupar 2007). Сматра се да мaње проучене епигенетичке појаве који мењају експресију гена без промена ДНК секвенци, попут генетичког импринтинга, парамутација, утишавање гена (енгл. gene-silencing), могу имати важну улогу у еволуцији, развојним фазама и фенотипској варијабилности кукуруза (Li et al. 2010a, Eichten et al. 2013, Lauria et al. 2014). 7

16 3.3 Доместикација и селекција кукуруза Доместикација кукуруза из теозинте настала је вештачком селекцијом и фиксирањем алела оних гена који су омогућили гајење кукуруза, појаву клипа и голог семена без плева (Dorweiler еt al. 1993, Gallavotti еt al. 2004, Wang еt al. 2005) и утицале на побољшање агрономских особина усева. Последица доместикације била је појава тзв. уског грла, односно, смањеног диверзитета око 1200 гена који су били под непосредним селекционим притиском (Tenaillon еt al. 2004, Wright et al. 2005). Даљом селекцијом тзв. пожељни алели који контролишу морфолошке особине и квалитет зрна су се најраније фиксирали у популацији (Jaenicke-Despres еt al. 2003). Нешто касније, вештачком селекцијом стваране су инбред линије погодне за производњу високоприносних и квалитетних хибрида у датим условима средине. У току селекције, долазило је до губитака једних и фиксирања других алела који су омогућили бољу адаптацију на дате еколошке услове. Генотипови у мањој мери прилагођени одређеним агроеколошким условима у односу на локалне популације сматрају се егзотичном гермплазмом у смислу њихове генетичке конституције и интеракције генотипа и спољашње средине (Živanović et al. 2007). Прелазак са гајења популација на гајење хибрида кукуруза одредило је откриће хетерозиса почетком 20. века (Shull 1908, East 1908). Инбред линије се на основу комбинационих способности сврставају у хетеротичне групе, а при укрштању линија из различитих хетеротичних група тежи се постизању хибридног вигора или хетерозиса. Хетеротични шаблони представљају комбинације укрштања хетеротичних група за које се предвиђа постизање високог нивоа хетерозиса. Три најзначајније хетеротичне групе чине Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS), Lancaster и Iodent. Сви комерцијални хибриди крајем осамдесетих година прошлог века потицали су од само шест инбред линија, од чега три Lancaster типа, C103, Mo17 и Oh43, и три BSSS линије, B37, B73 и A632 (Goodman 1990). Комбинација алелних варијабилности и интеракције које стварају хибридни фенотип и даље су непознаница. 3.4 Значај карактеризације гермплазме кукуруза Карактеризација инбред линија кукуруза које се користе у оплемењивачким програмима као могући извор алела са позитивним утицајем на агромонски важне 8

17 особине, од великог је значаја. Идентификација нових или ретких алела са позитивним ефектом на експресију одређене особине, уношење таквих алела прво у инбред линије, а затим у хибриде, захтева претходни опис, карактеризацију и класификацију генетичког материјала и утврђивање генетичких односа између инбред линија неког оплемењивачког програма (Liu et al. 2003). За такву евалуацију генотипова могу се користити морфолошки, биохемијски и молекуларни маркери. Mорфолошки маркери сe утврђују визуелно, без примене молекуларних или биохемијских техника. Најчешћи морфолошки маркери су боја или облик неког дела биљке. Биохемијски маркери се утврђују анализом биохемијских производа одређеног генског локуса, као што су изозими, алозими, терпени или полифеноли. Молекуларни маркери су секвенце ДНК унутар гена или у његовој близини које указују на алелни облик гена који контролише експресију неке особине. Они су веома полиморфни, једноставни за примену и независни од чинилаца спољашње средине и фазе раста и развића биљака. За карактеризацију инбред линија кукуруза користе се дескриптори Међународне уније за заштиту нових биљних сорти (The International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV), Meђународног центра за унапређење пшенице и кукуруза (International Maize and Wheat Improvement Center, CIMMYT) и института Bioversity International, под покровитељством Организације за храну и пољопривреду (Food and Agriculture Organization, FAO) Уједињених Нација, Информационе мреже генетичких ресурса Министарства пољопривреде САД (USDA, ARS-GRIN) и Базе података Европске Уније о популацијама кукуруза (The European Union Maize Landrace Database, EUMLDB) који обухватају морфолошке (квалитативне и квантитативне особине) и биoхемијске маркере. Карактеризација инбред линија може се извршити класификацијом у хетеротичне групе на основу њихових комбинационих способности. При укрштању инбред линија из различитих хетеротичних група долази до појаве хетерозиса приноса. Да би се утврдило којој хетеротичној групи нека линија припада, спроводе се укрштања те линије са линијама познатих хетеротичних група, анализира се њен педигре или се користе резултати молекуларне анализе. Опис и карактеризација инбред линија предуслов је за планирање укрштања, придруживање инбред линија хетеротичним групама, идентификацију генетичког материјала, избор тестера којим ће се испитати комбинационе способности инбред 9

18 линије непознатог порекла или добијене из више линија различитих хетеротичних група, заштиту оплемењивачких права и селекцију помоћу маркера (Reif at al. 2003a, Reif at al. 2003b). С обзиром на то да је генетички диверзитет елитних инбред линија мањи у поређењу са диверзитетом кукуруза као врсте, Tarter (2004) истиче важност егзотичне гермплазме као носиоца алела одсутних у елитном материјалу и, нарочито, као извор отпорности на биотички и абиотички стрес. 3.5 Фенотипска карактеризација кукуруза Међународна унија за заштиту нових биљних сорти утврдила је критерујуме за спровођење теста за различитост, униформност и стабилност (Distinctness, Uniformity and Stability, DUS) и дефинисала фенотипске дескрипторе, односно, морфолошке особине, који се користе за опис и карактеризацију линија, хибрида и популација кукуруза (UPOV 2009). Приручници за карактеризацију кукуруза UPOV, CIMMYT, Bioversity International, ARS-GRIN и EUMLDB дају опис битних карактеристика које се оцењују, са препорученим процедурама за постављање огледа и статистичку анализу. У њима је, такође, одређено које особине се оцењују визуелно, а које мере, у зависности од тога да ли су квалитативне или квантитативне природе. Иако се истиче да је предност фенотипских маркера њихова једноставност за оцену и економичност, често је број ових маркера недовољно велики за карактеризацију свих генотипова. Међу другим недостацима, истиче се непоузданост података због утицаја фактора спољашње средине на њихову експресију, субјективност визуелне оцене и непогодност дисконтинуираних података за статистичку анализу. Mоћ дискриминације генотипова варира у зависности од карактеристика које се користе као дескриптори. Висина биљке, дужина корена, интензитет зелене боје листова, положај листова на биљци су особине које имају малу моћ дискриминације (Lootens et al. 2013). Без обзира на ове недостатке, морфолошке особине се у великој мери користе као конвенционални дескриптори и имају велики значај у пољопривредним истраживањима (Babić et al. 2011). Babić et al. (2011) су визуелном оценом фенотипских особина сврстали инбред линије у групе хомогене по сродности, утврдивши сагласност класификација према фенотипским особинама са подацима о 10

19 пореклу инбред линија. Резултати њиховог истраживања упућују на могућност одабира добрих тестера на основу просечне морфолошке удаљености инбред линија. Ortiz et al. (2008) су груписали осам перуанских популација кукуруза примењијићи класификациони метод Ward-Modified Location и користећи шест морфолошких особина: висину биљке, висину биљке до примарног клипа, број листова, број листова изнад примарног клипа, дужину и ширину листа. Ови аутори сматрају да је употреба вегетативних особина за класификацију гермплазме кукуруза могућа уколико се примене одговарајући статистички методи и уколико особине имају довољно велику генетичку варијабилност и херитабилност. Као резултат интензивних молекуларних истраживања генома кукуруза, развоја нових метода и програма за анализу добијених података, настала је несразмера између огромне количине генотипских података добијених применом молекуларних маркера и анализама ДНК секвенци, с једне, и количине и квалитета података добијених класичном морфолошком карактеризацијом, фенотипском оценом и мерењем квалитативних и квантитативних особина, с друге стране. Потреба за прецизним фенотипским подацима великог броја биљака који би допринели бољем разумевању односа између фенотипа и генотипа, довела је до нових технолошких решења и развоја нове биолошке области која се односи на мерење морфолошких и биохемијских особина, феномике. Створене платформе за фенотипизацију, роботизовани и аутоматизовани системи користе се за фотографисање, мерење и анализу великог броја морфолошких, биохемијских и физиолошких особина биљака недеструктивним методама, као сто су фотосинтетички процеси (Chaerle et al. 2007), пораст и фенолошке фазе (Sozzani et al. 2014), особине корена (Grift et al. 2011, Clark et al. 2013), отпорност на сушу (Berger et al. 2010), архитектура биљке (Winterhalter et al. 2013), температурни стрес (Araus and Cairns 2014) и режим усвајања хранљивих елемената (Simons et al. 2014). Велика варијабилност и комплексна генетичка основа приноса и других квантитативних особина отежава разумевање специфичних метаболичких путева, који леже у основи експресије ових својстава, а тиме и селекцију помоћу маркера (Collins et al. 2008). Процена генотипских корелација линија per se и потомства укрштања је од великог значаја за предвиђање учинка хибрида на основу претходно утврђених вредности родитељских инбред линија. Код особина велике херитабилности и са малим хетерозисом, попут дужине клипа, врема цветања, висине 11

20 биљке или садржаја влаге зрна, корелације линија per se и хибрида су средње или велике, док су код особина мале херитабилности и већим хетеротичним ефектом, као што је принос, ове корелације мале (Smith 1986, Hallauer and Miranda 1988, Austin et al. 2000, Bekavac et al. 2008). Сматра се да је разлог томе маскирајући ефекат пожељних доминантних алела тестера над алелима линија које се тестирају (Smith 1986), епистаза и негативни ефекти рецесивних гена у хомозиготним линијама (Mihaljevic 2005). Стога је селекција заснована на вредностима линија per se могућа само код особина са великом херитабилношћу, док се селекција линија које ће дати приносне хибриде заснива на њиховим општим и комбинационим способностима утврђеним у огледима након укрштања са одговарајућим тестерима. Међутим, иако је принос инбред линија per se у малој кoрелацији са приносом потомстава у укрштањима и не може се користити за поуздано предвиђање приноса хибрида, вредност приноса инбред линија per se има велики значај у семенарству кукуруза. Мали принос инбред линија које служе као родитељске компоненте може бити узрок мале продуктивности и неисплативости семенске проиводње. Хибриди који су скупи за производњу имају ограничени комерцијални потенцијал без обзира на њихову родност. С тога је оцена приноса и компоненти приноса инбред линија per se начин процене исплативости семенске производње хибридног кукуруза (Pinnisch et al. 2012). 3.6 Молекуларна карактеризација кукуруза Молекуларни маркери Молекуларни маркери омогућују идентификацију локуса који утичу на генетичку варијабилност квалитативних и квантитативних особина и селекцију супериорних генотипове за дате локусе. У односу на фенотипске маркере, молекуларни маркери се могу детектовати у свим биљним ткивима независно од фазе раста и развоја, утицаја фактора спољашње средине, плејотропних и епистатичких ефеката. За анализу биљног генома развијен је и примењује се велики број различитих типова молекуларних маркерa. Молекуларни маркери се могу класификовати према: методу који се користи за утврђивање ДНК полиморфизма (хибридизација, ланчана реакција полимеразе), врсти полиморфизма који детектују (тачкасте мутације, инсерције, делеције, инверзије, дупликације), типу наслеђивања 12

21 (доминантно, кодоминантно) и ћелијској органели у којој се налазе (нуклеарни, митохондријални, хлороплазматични). Врсте маркера, њихове особености и разлике детаљније су описане у више прегледних радова (Gupta аnd Rustgi 2004, Schulman 2007, Agarwal et al. 2008, Poczai et al. 2013, Khan et al. 2014). Микросателити Микросателити или SSR (Simple Sequence Repeats) су кратке нуклеотидне секвенце које се састоје од 1 до 6 нуклеотидних базних парова који се у тандему понављају у датој секвенци. Полиморфизам амплификованих геномских секвенци настаје услед разлика у броју тандемских поновака који се налазе између прајмера. Велики број алела, односно разлика у броју поновака, којима се одликују ови маркери сматрају се последицом неједнаког кросинговера у процесу мејозе, активности ретротранспозона или грешака у току репликације ДНК која садржи понављајуће елементе при чему полимераза прескочи или умножи већи број тандемских поновака од броја на изворној ДНК матрици (Kalia et al. 2011). Микросателити су присутни у једарној, митохондријалној и хлоропластној ДНК, као и изван и унутар гена: у интронима, егзонима и нетранслаторним завршним секвенцама (5' и 3' UTR, untranslated regions). Микросателити унутар гена су мање полиморфни у односу на микросателите изван гена, јер су кодирајући ДНК региони много конзервативнији и мање подложни мутацијама. Ипак, с обзиром на то да се налазе унутар самог гена, ови микросателити имају већи значај у истраживањима функција гена и утврђивању везе између маркера и анализиране особине (мапирању), као и у упоредним, компаративним истраживањима сродних врста (Guichoux et al. 2011). База генетичких и геномичких података о кукурузу, Maize Genetics and Genomics Database ( садржи 2584 мапираних SSR од којих су 184 унутар гена. Иако улога SSR у геному биљних врста није потпуно разјашњена, утврђено је да тандемски поновци имају улогу у стварању фенотипског диверзитета врсте и утицај на транскрипцију, транслацију и експресију гена (инактивацију и утишавање гена) (Li et al. 2004a). Dresselhaus et al. (1999) су открили да је микросателитски поновак CCG у 5' нетранслаторној завршној секвенци рибозомалног гена укључен у процесе оплодње кукуруза. Веза између великог броја тринуклеотидних поновака у егзонима гена и неколико дегенеративних неуролошких болести добро је проучена 13

22 код људи, али до сада није утврђена у биљном свету. Varѕhney et al. (2005) сматрају да штетан утицај варирања броја поновака код гајених биљака није примећен због одбацивања јединки са непожељним мутацијама у процесу селекције, док се штетне мутације у људској популацији дуже одржавају и теже искорењују. У кодирајућим деловима генома главних гајених врста, најзаступљенији су тринуклеотидни поновци, а затим ди- и тетрануклеотидни поновци (Morgante et al. 2002, Gao et al. 2003). Ово је резултат одбрамбеног механизма - негативне селекције према мутацијама које могу да промене редослед нуклеотида у кодирајућој секвенци, што може довести до промена у транслацији и стварања дегенеративног протеина или изостанак његовог стварања (Metzgar et al. 2000). Фреквенција мутације микросателита код кукуруза износи и зависи од просечне дужине алела, дужине поновка и нуклеотида који чине поновак. Алели са великим бројем поновака и динуклеотидни поновци имају већу стопу мутације (Vigouroux et al. 2002). Предност SSR маркера у односу на друге молекуларне маркере је у њиховој значајној заступљености у геному, великом алелном диверзитету, кодоминантном наслеђивању, великој информативности, поновљивости добијених резултата, приступачној цени, једноставности за рад (Agarwal et al. 2008). Усавршавањем метода истовременог умножавања различитих ДНК сегмената са више прајмера у једној PCR реакцији (вишеструкa, мултиплекс PCR) и обележавање алела чије се величине не поклапају са истим флуоресцентим бојама, а алела са сличним или истим величинама са различитим бојама приликом анализе умножених продуката капиларном електрофорезом омогућена је обрада великог броја узорака и повећан потенцијал микросателита (Guichoux et al. 2011). Микросателити имају широку примену у интер и интраспециес анализи диверзитета, карактеризацији колекција гермплазме, утврђивању генетичких дистанци између различитих генотипова, анализи педигреа, мапирању гена и локуса за квантитативне особине (Quantitative Trait Loci, QTL), селекцији помоћу маркера, таксонимији, компаративној генетици, студијама еволутивних процеса, функционалној геномици, популационој генетици, идентификацији сорти (фингерпринтинг), заштити оплемењивачких права и анализи чистоће семенског материјала (Warburton and Hoisington 2001). 14

23 3.7 Селекција помоћу маркера Селекција помоћу маркера или маркер асистирана селекција (МАС) подразумева примену молекуларних маркера у оплемењивању биљака у циљу повећања ефикасности селекције на својства од агрономског и економског интереса, нарочито квантитативних особина које су под утицајем већег броја гена и чинилаца спољашње средине. Користи се приликом преношења гена из једног или више генотипова у други, избора родитеља за хибридне комбинације у раним фазама селекције, утврђивања корелације између својства и маркера и проналажења гена који контролишу неку агрономску особину. Селекција помоћу маркера је комплементарна класичној, фенотипској селекцији и од великог је значаја код анализе оних агрономских особина чија су мерења и оцене компликоване (нпр. квалитет, биохемијске карактеристике) или скупе (нпр. мултилокацијски огледи за оцену приноса). Применом МАС може се скратити циклус селекције код оних особина које захтевају фенотипску оцену у физиолошкој зрелости усева (нрп. отпорност на сушу, квалитет, принос), јер је омогућен ранији одабир биљака већ у фази клијанаца на основу резутата ДНК аланизе (Bouchez et al. 2002). Употребом маркера, олакшано је и убрзано преношење алела из генома донора у рекурентни генотип повратним укрштањима и смањена или уклоњена појава сегмената генома донора који носе непожељне алеле, а налазе се у близини гена који се преноси (енгл. linkage drag). Ефикасност МАС зависи од херитабилности својства, величине мапирајуће популације, генетске основе својства, релативних трошкова МАС у односу на фенотипску селекцију. Dekkers and Hospital (2002) наводе два приступа приликом примене селекције помоћу маркера у процесу оплемењивања. Први подразумева коришћење маркера за стварање тзв. идеалног генотипа на тај начин што се већи број пожељних гена оба родитеља користе за конструкцију новог генотипа. Овај приступ карактеристичан је за уношење једног или више гена повратним укрштањима. После четири генерације повратног укрштања уз помоћ макрера, Ribaut and Ragot (2007) су пренели пет хромозомских сегмената из линије отпорне на сушу у осетљиву елитну линију, задржавши 86% генома рекурентног родитеља. Примери успешне селекције применом маркера представљени су у истраживањима: на отпорност према инсектима (Willcox et al. 2002), болестима (Abalo et al. 2009, Asea et al. 2012), суши 15

24 (Tuberosa and Salvi 2006) на раностасност (Bouchez et al. 2002) и квалитет (Yang et al. 2013, Sureshkumar et al. 2014). Други приступ посматра маркере као секундарне особине на које се примењује селекција, при чему се за сваки маркер израчунавају селекциони индекси, пондери који се користe у рекурентној селекцији и за стварање инбред линија. Eathington et al. (2007) су користећи селекционе индексе маркера за више особина утврдили двоструку већу ефикасност селекције применом маркера у односу на фенотипску селекцију. Да би примена селекције помоћи маркера била ефикасна и економски оправдана потребно је утврдити постојање генетичке везе између молекуларних маркера и гена или QТL под чијом је контролом особина од интереса и обезбедити рутинску аутоматизовану анализу великог броја узорака (Collard et al. 2005). Маркер асиситирана селекција је заправо последњи корак у процесу оплемењивања који обухвата неколико фаза: фенотипску и молекуларну карактеризацију оплемењивачког материјала и других генетичких ресурса у циљу проналажења пожељних алела (предоплемењивање), одабир полиморфних маркера, утврђивање корелација између варијабилности алела маркера и жељене особине, идентификацију и одређивања ефеката QTL (мапирање), проверу стабилности QTL у више агроеколошких средина и на различитом генетичком материјалу (валидација или потврда) и примену маркера везаних за QTL у оплемењивању. 3.8 Мапирање Мапирање је поступак којим се одређује корелација између фенотипских варијабилности неке особине и генотипских варијабилности, алела, који контролишу ту особину у некој експериментлној популацији. Фенотипске варијабилности анализиране особине се одређују директно, визуелном оценом или мерењем, док се облик алела гена или QTL одређује посредно, помоћу молекуларних маркера. Ако су алели маркера који се налазе у јединкама експерименталне популације одређеног фенотипа (нпр. више биљке) чешћи него у јединкама са супротним фенотипом (нпр. ниже биљке) и ако се ова корелација статистички потврди, онда је ген или QTL, којег маркер представља, генетички чинилац који контролише варирање дате особине (висине биљке). Да би алели маркера били поуздани показатељи алела гена или QTL, потребно је да се маркер и ген налазе 16

25 близу једно другог или да маркер буде унутар гена. Маркер и ген који су близу једно другог (<1cM) се заједно наслеђују и сматрају се генетички везаним. Што су маркер и ген удаљенији, већа је вероватноћа рекомбинације између њих у мејози и губитка везе, чинећи мапирање непрецизним и непоузданим. Циљ мапирања је проналажење маркера који су генетички везани са геном или QTL који контролише неку особину. Мапирање обухвата неколико корака: стварање, фенотипску оцену и генетичку анализу експерименталне популације, груписање генотипова са истим алелима, тестирање значајности разлика фенотипских средина за дату особину између група генотипова и утврђивање веза између QTL и особине. У последње две деценије објављен је велики број радова о QTL мапирању различитих особина кукуруза добијених анализом молекуларним маркерима. Међутим, постоји значајна несразмера у броју радова о откривеним QTL за агромонски важне особине и радова о њиховој практичној примени у оплемењивању. Разлог тога је што су мапирани QTL често непостојани, односно не могу се идентификовати, или имају различите ефекте у различитим срединама и експерименталним популацијама (Almeida et al. 2013). Локуси за квантитативна својства који су стабилни у више мапирајућих популација, на различитим локалитетима и годинама огледа, могу имати велики практични значај, након провере веза маркер-особина на оплемењивачком материјалу. Преглед микросателитских маркера коришћених за мапирање QTL за принос, компоненте приноса, садржај влаге, висину биљке, време цветања, квалитет и друге особине и који су идентификовани и постојани у већем броју истраживања, на различитом генетичком материјалу и срединама дат је у прилогу 10 (таб. 50). У зависности од тога да ли се експериментална популација која се корисити за мапирање састоји од сродних или несродних јединки, мапирање се дели на QTL мапирање (класично мапирање, анализа везе, енгл. linkage mapping) и асоцијативну анализу (асоцијативно мапирање, мапирање гаметске неравнотеже, енгл. linkage diseqilibrium mapping). QTL мапирање користи популације настале укрштањем два фенотипски различита родитеља (нпр. F 2 популације, популације створене повратним укрштањима, дихаплоидне популације, рекомбинантне инбред линије), док асоцијативно мапирање користи популације које се састоје од великог броја дивергентних генотипова (нпр. инбред линија) различите генетичке основе. За успех асоцијативне анализе и правилну интерпретацију резултата од великог значаја су 17

26 подаци о гаметској неравнотежи између локуса генома и структури популације која се анализира. 3.9 Гаметска неравнотежа (Linkage disequilibrium) Гаметска неравнотежа је појава везаности алела неколико генских локуса услед смањене рекомбинације при чему се алели локуса у гаметској неравнотежи чешће наслеђују заједно. Резултат тога је чешћа појава неких алелних комбинација у популацији од очекиване на основу фреквенција алела (Jannink and Walsh 2002). На гаметску неравнотежу утиче степен рекомбинације и удаљеност између два локуса. Гаметска неравнотежа опада брже код странооплодних биљака у односу на самооплодне и код популација шире генетичке основе у односу на популације уже генетичке основе због смањења рекомбинације са повећањем хомозиготности. Из тог разлога, гаметска неравнотежа код популација кукуруза опада већ у оквиру 1 kb (Remington et al. 2001, Tenaillon et al. 2001, Gore et al. 2009), 2 kb код разноврсних инбред линија (Yan et al. 2009), док код комерцијалних елитних инбред линија гаметска неравнотежа може захватити и 500 kb (Rafalski 2002, Jung 2004). Она, такође, зависи и од гена и генских региона, који испољавају различити степен смањења гаметске неравнотеже током генерација рекомбинације услед различитог селекционог притиска (Yu аnd Buckler 2006). Величина ДНК сегмента у којем постоји гаметска неравнотежа одређује број маркера који је потребан за асоцијативну анализу и резолуцију откривених веза маркер-својство. Уколико гаметска неравнотежа опада брзо са порастом физичког растојања дуж генома, потребан је већи број маркера за асоцијативну анализу (Thornsberry et al. 2001). Велики распон гаметске неравнотеже утиче на мању резолуцију, односно статистички значајна веза маркер-својство може се утврдити и када је маркер знатно удаљен од генског локуса који контролише својство. Tакви маркери имају мали оплемењивачки значај, јер не могу да послуже за утврђивање веза са испитиваним особинама на другом генетичком материјалу где гаметска неравнотежа није постојана. Утицај селекције на стварање гаметске неравнотеже у току оплемењивања огледа се у повећању фреквенција пожељних алела и стварању коваријансе између алела различитих локуса, што отежава оцену фенотипског ефекта појединачног локуса (Myles et al. 2009). Епистаза, такође, може довести до повећања гаметске 18

27 неравнотеже уколико одређене комбинације алела имају већи фитнес и селекција фаворизује такве комбинације, а инверзије и транслокације унутар којих је смањена фреквенција рекомбинације одржавају те комбинације (Gupta et al. 2005) Структура популације Дуг период гајења, различити путеви ширења, адаптација на различите агроеколошке услове и интензивни процеси селекције у току оплемењивања кукуруза утицали су на стварање дивергентних популација са неједнаком расподелом и особеним комбинацијама алела и ограниченим протоком гена, односно ограничене могућности међусобног укрштања (Camus-Kulandaivelu et al. 2006). Створена стратификација популација кукуруза, тзв. структура популације, може утицати на откривање лажно позитивних веза између маркера и особина приликом асоцијативног мапирања. Лажно позитивне везе настају због гаметске неравнотеже између маркера и локуса који контролише фенотипску варијабилност, те се они заједно наслеђују иако нису физички везани, нпр. налазе се на различитим хромозомима (Pritchard and Rosenberg 1999, Andersen et al. 2005). Утврђено је да се чак 33 до 35% фенотипске варијабилности времена цветања може објаснити постојањем структуре популације у дивергентној популацији генотипова кукуруза (Flint-Garcia et al. 2005). Pritchard et al. (2000) су развили метод којим се процењује структура популације и сродности између индивидуа и уградили га у статистичке тестове софтверског пакета STRUCTURE смањујући појаву лажно позитивних веза до 80%. Информације о припадности генотипова потпопулацијама и сродности добија се молекуларном анализом Асоцијативна анализа Асоцијативна анализа утврђује корелацију између фенотипских и генотипских података већег броја дивергентних несродних индивидуа, на основу гаметске неравнотеже. Она користи велики број генерација рекомбинација које су се одвиле у току дугог периода еволуције, доместикације и селекције гајене врсте. Рекомбинације током већег броја генерација утичу на губитак везе између гена и 19

28 маркера који нису у физичкој близини (лажне везе) и омогућавају откривања асоцијација само оних гена и маркера који су међусобно веома близу, чиме се повећава резолуција мапирања. Само маркери који су тесно везани за испитивани локус и/или који се налазе унутар гаметске неравнотеже показују значајне везе (Zondervan and Cardon 2004). Предност асоцијативне анализе огледа се у могућности анализе више особина одједном и откривању великог броја алела у мапирајућој популацији, за разлику од QTL мапирања код којег је могуће утврдити заступљеност само два алела и анализирати једну особину. Такође, за асоцијативну анализу није потребно стварање експерименталне популације које изискује доста времена и значајне трошкове, већ се може применити непосредно на оплемењивачком материјалу, што је од великог практичног значаја. Док је део фенотипске варијабилности објашњен молекуларним маркерима далеко већи него код QTL мапирања, статистичка моћ откривања ретких алела у асоцијативној анализи је мала, чак и код оних алела са великим ефектом (Visscher 2008). Један од првих метода откривања пожељних алела под чијом су контролом сложене, квалитативне особине је асоцијативно мапирања кандидат гена. Оно обухвата анализу само сегмента ДНК мањим бројем маркера везаних за ген или секвенцирање гена за који се претпоставља да је одговоран за фенотипску варијабилност испитиване особине на основу резултата ранијих истраживања. Прва асоцијативна анализа кандидат гена потврдила је везу између времена цветања кукуруза и dwarf8 гена, указала на утицај селекције овог локуса на стварање раностаснијих генотипова и проценила ефекат делеција две амино киселине на раније цветање (Thornsberry et al. 2001). Занимљиво је истаћи да аутори нису пронашли везу између времена цветања кукуруза и teosinte branched 1 гена, који је удаљен само 1 cm од dwarf8 указујућу на брзо опадање гаметске неравнотеже дуж генома кукуруза. Асоцијативном анализом кандидат гена, такође је одређена улога sugary1 (su1) гена у стварању сахарозе кукуруза и откривена мутација једног нуклеотида su1 гена одговорна за фенотипску варијабилности (Whitt et al. 2002). Последње деценије, технолошки развој омогућио је испитивање читавог генома са огромним бројем маркера на ДНК микрочипу без претходног знања о положају претпостављеног гена на мапи или његовој вези са фенотипском варијабилношћу (Ziegler et al. 2008). Асоцијативном анализом читавог генома могу се 20

29 проценити ефекти великог броја маркера у циљу предвиђања и селекције индивидуа са највећом оплемењивачком вредношћу (Meuwissen 2001). Новији приступ асоцијативном мапирању кукуруза, тзв угњеждено асоцијативно мапирање (енгл. Nested Association Mapping), обједињује асоцијативну анализу и мапирање засновано на познатим педигреима у циљу повећања статистичке моћи и резолуције мапирања веза између маркера и својстава (McMullen et al. 2009). Популација створена укршањем 25 генетички различитих инбред линијама са референтном линијом B73 послужила је за прецизно мапирање цветања (Buckler et al. 2009), архитектуре листа (Tian et al. 2010), отпорности на болести (Kump et al. 2011) и састава зрна (Cook et al. 2012). Здружено QTL и асоцијативно мапирање користи резултате QTL мапирања као прелиминарне податке за асоцијативно мапирање у којој се траже везе само унутар оних локуса где су већ утврђене везе маркер - својство QTL мапирањем. На тај начин се смањују трошкови генотипске анализе, број маркера и јединки за генотипизацију и повећава вероватноћа проналажења веза, нарочито за QTL са малим ефектима. Chardon et al. (2004) су примењујући мета анализу објединили резултате већег броја QTL мапирања и открили шест QTL за цветање кукуруза који су стабилни у већем броју различитих мапирајућих популација. На основу њихових резултата здруженим QTL и асоцијативном анализом четири популације умерене тропске генетичке основе, Coles et al. (2010) су издвојили на истим генским регионима четири QTL са већим ефектом на фотопериод. С обзиром на комплексну природу агрономски значајних особина, резултати мапирања, независно од изабраног метода, могу се применити само ако се утврди подобност маркера за селекцију, тј. потврде ефекти QTL са којима су маркери у вези у различитим срединама и оплемењивачком материјалу. 21

30 4. РАДНА ХИПОТЕЗА У овој докторској дисертацији се полази од претпоставке да је изабрани сет инбред линија кукуруза довољно дивергентан да обухвати велики број алела на већем броју локуса. Такође се претпоставља да су фенотипски и микросателитски маркери довољно полиморфни за дискриминацију линија по изабраним особинама. Очекује се висок ниво полиморфности у анализираним локусима, као и сагласност груписaња испитиваних генотипова кукуруза кластер анализом са њиховим пореклом и педигреима. Очекује се да ће се применом асоцијативне анализе утврдити статистички значајнe везe између микросателитских локуса и изабраних агрономских особина проучаваног материјала. 22

31 5. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ РАДА 5.1 Биљни материјал Биљни материјал који се користиo за истраживање састојао се од 96 инбред линија сврстаних у четири хетеротичне групе (таб. 1). Целокупни биљни материјал део је колекције Института за ратарство и повртарство у Новом Саду и потиче из три оплемењивачке групе (НС инбред линије). Анализирани генотипови кукуруза изабрани су тако да буду прилагођени умереном климату и генетички дивергенти, а чине их линије које потичу од историјски значајних инбред линија, елитних линија које се користе у комерцијалне сврхе и новостворених инбред линија које сe налазе у процесу селекције и тестирања. Већа заступљеност Lancaster (41) и BSSS инбред линија (41) у односу на Iodent (7) линије и инбред линије које припадају независном генетичком материјалу (7) последица је њихове веће употребе и значаја у оплемењивачким програмима Института за ратарство и повртарство. Табела 1. Инбред линије кукуруза коришћене за фенотипску и молекуларну карактеризацију Линија Хетеротична група Опл. Линија изведена из или у група типу линије G1 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G2 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G3 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G4 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G5 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G6 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G7 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G8 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G9 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G10 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G11 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G12 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G13 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G14 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G15 Lancaster Sure Crop 1 Mo17 G16 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G17 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G18 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G19 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G20 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G21 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 23

32 G22 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G23 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G24 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G25 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G26 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G27 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G28 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G29 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G30 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G31 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G32 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 1 B73 G33 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G34 Lancaster Sure Crop 2 Mo17, Oh43 G35 Lancaster Sure Crop 3 Mo17 G36 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B14, B73 G37 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G38 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G39 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B14, B73 G40 Lancaster Sure Crop 3 Mo17, C103 G41 Lancaster Sure Crop 3 Mo17, C103 G42 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B14, B37 G43 Iоdent 2 Iodent G44 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G45 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G46 Iodent 3 PH207 G47 Lancaster Sure Crop 3 Mo17 G48 Lancaster Sure Crop 3 Mo17 G49 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G50 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 2 BSSS Synthetic G51 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 2 BSSS Synthetic G52 Lancaster Sure Crop 3 Mo17, Iodent G53 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B14 G54 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 2 B73 G55 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 2 B73 G56 Независна група 3 егзотичне гермплазме G57 Независна група 3 егзотичне гермплазме G58 Lancaster Sure Crop 3 егзотичне гермплазме G59 Независна група 3 егзотичне гермплазме G60 Lancaster Sure Crop 2 Oh43 G61 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 2 BSSS Synthetic G62 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G63 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B84 G64 Lancaster Sure Crop 2 Iowa Corn Borer Synthetic G65 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 2 BSSS Synthetic G66 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 2 BSSS Synthetic G67 Lancaster Sure Crop 2 C103 G68 Независна група, европски тврдунци 2 F7 G69 Iodent 2 Iоdent G70 Независна група, европски тврдунци 2 F2 24

33 G71 Lancaster Sure Crop 3 C103 G72 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G73 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G74 Iоdent 2 Iоdent G75 Независна група 2 непознато G76 Lancaster - Независна група 2 непознато G77 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G78 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G79 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G80 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G81 Lancaster Sure Crop 2 Mo17 G82 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B14 G83 Независна група 2 ND250 G84 Lancaster Sure Crop 2 непознато G85 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G86 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G87 Lancaster Sure Crop 3 Mo17 G88 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G89 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B37 G90 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G91 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G92 Lancaster Sure Crop 3 Mo17 G93 Iоdent 3 Iоdent G94 Iоdent -Lancaster 3 Iodent - Oh43 G95 Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) 3 B73 G96 Iоdent 2 Iodent 5.2 План огледа Оглед је постављен у току две године, и 2012., по потпуно случајном блок систему са три понављања. Прве године оглед је посејан на три локалитета: Римски Шанчеви, Србобран и Сомбор, док је друге године оглед постављен на Римским Шанчевима и у Србобрану (сл. 1). Сваки генотип је посејан у два реда, 4 метара дужине, са растојањем од 75 cm између редова и сa 22 cm између биљака. Густина сетве износила је биљака по хектару, а дубина 5 сm. Огледи су посејани 21. априла у Сомбору, 26. априла на Римским Шанчевима и 7. маја у Србобрану године, док је године сетва обављена 27. априла на Римским Шанчевима и 1. маја у Србобрану. Око огледа посејан је заштитни појас инбред линијe B73 да би први и последњи рубни редови били у истим условима компетиције као и редови унутар огледа. У току обе године спроводене су редовне агротехничке мере. Берба у физиолошкој зрелости обавила се ручно, на свакој 25

34 парцели на свим локалитетима, након чега су клипови сушени до садржаја влаге од 14%. Слика 1. Линије кукуруза посејанe на локалитету Римски Шанчеви године 5.3 Агроеколошки услови на испитиваним локалитетима Подаци Хидрометеоролошког завода Србије за локалитете Римски Шанчеви (45 20 N, Е, 84 m), Сомбор (19 09 Е, N, 88 m) и Србобран (45 33 N, E, 79 m) у току и године указали су на појаву суше. На Римским Шанчевима у току вегетационог периода од априла до октобра просечне месечне температуре ваздуха биле су више од вишегодишњег просека, изузев у мају и октобру године, и то у просеку за 5% током и за 11% током године. У Србобрану су просечне месечне температуре ваздуха за дати период биле више од вишегодишњег просека за 9% у и 14% у 2012., а у Сомбору за 10% у години. Током године у периоду од априла до октобра на Римским Шанчевима и у Сомбору забележено је 44 дана са просечном дневном температуром изнад 30 С, што је за 13 дана више од вишегодишњег просека, док је током године у истом периоду на Римским Шанчевима забележен 71 дан са просечном дневном 26

35 температуром изнад 30 С, односно за 40 дана више од вишегодишњег просека. Сличне вредности утврђене су и за локалитет Србобран, са 13 дана са температурама преко 30 С више од вишегодишњег просека у и 41 дан у години. Укупна количина падавина за наведени период измерена и на свим локалитетима била је знатно мања у односу на вишегодишњи просек за више од 50%. Просечна релативна влажност ваздуха у јуну, јулу и августу била је нижа од вишегодишњег просека током обе године. Најнеповољнији метеоролошки услови за формирање приноса били су у периоду формирања мушких и женских цвасти, опрашивања, оплодње, наливања и сазревања зрна кукуруза у јуну, јулу и августу (граф. 1, 2 и 3). 27

36 Графикон 1. Просечне вредности месечних температура, број дана са температурама преко 30 С, количина падавина и релативна влажност ваздуха од априла до октобра током 2011., године и за вишегодишњи просек на локалитету Римски Шанчеви 28

37 Графикон 2. Просечне вредности месечних температура, број дана са температурама преко 30 С, количина падавина и релативна влажност ваздуха од априла до октобра током 2011., године и за вишегодишњи просек на локалитету Србобран 29

38 Графикон 3. Просечне вредности месечних температура, број дана са температурама преко 30 С, количина падавина и релативна влажност ваздуха од априла до октобра током 2011., године и за вишегодишњи просек на локалитету Сомбор 30

39 5.4 Фенотипска оцена инбред линија кукуруза Фенотипска оцена инбред линија кукуруза урађена је према UPOV и CIMMYT /ICPGR дескрипторима за следеће особине: време цветања мушке цвасти (метличење), време цветања женске цвасти (свилање), висина биљке, дужина клипа, пречник клипа, број редова зрна, као и за агрономски значајне особине: период између цветања мушке и женске цвасти, висину биљке до клипа, број листова изнад примарног клипа, укупан број листова, масу 1000 зрна и принос по биљци. Време цветања мушке цвасти је одређено бројем дана од сетве до појаве прашника на метлицама 50% биљака (UPOV 2009). Време цветања женске цвасти је одређено бројем дана од сетве до појаве тучка (свиле дужине око 2 cm) на 50% биљака (UPOV 2009) (сл.2). Период између цветања мушке и женске цвасти (Anthesis Silk Interval, ASI) изражен је у данима од појаве полена на 50% метлица до појаве свиле дужине око 2 cm на 50% клипова. Слика 2. Појава метлица са антерама и свиле на клипу кукуруза 31

40 Висина биљке се мерила од нивоа земље до основе метлице на десет биљака, искључујући биљке на почетку и крају реда, након престанка раста биљака, од фазе млечне зрелости (UPOV 2009). Висина клипа се мерила од нивоа земље до коленца који носи највиши клип (тзв. примарни клип) на десет биљака, искључујући биљке на почетку и крају реда, након престанка раста биљака, од фазе млечне зрелости (IBPGR 1991, CIMMYT 2009). Број листова изнад примарног клипа укључујући и лист код клипа избројан је на десет репрезентативних биљака (IBPGR 1991, CIMMYT 2009). Укупан број листова на десет биљака након цветања, искључујући биљке на почетку и крају реда избројан је на десет репрезентативних биљака (IBPGR 1991, CIMMYT 2009). Број редова зрна на клипу, број зрна у реду, дужина клипа и пречник централног дела клипа одређен је након бербе на десет примарних клипова биљака (UPOV 2009). Маса 1000 зрна за сваки генотип је мерена након сушења до 14% влаге (IBPGR 1991, CIMMYT 2009). Принос по биљци измерен је на десет репрезентативних биљака и изражен средњoм вредношћу у g (сл.3). Слика 3. Берба 10 репрезентативних биљака сваког генотипа кукуруза 32

41 5.5 Молекуларна карактеризација инбред линија кукуруза Екстракција и одређивање концентрације ДНК кукуруза Геномска ДНК екстрахована је према CTAB протоколу, модификованој методи Doyle and Doyle (1990). Од сваког генотипа узет је групни узорак од 10 клијанаца, 7 до 10 дана након постављања на влажну филтер хартију и наклијавања у мраку. Око 2 g ткива клијанаца је мацерирано у течном азоту до финог праха, а затим је у епрувете са биљним материјалом додато 500 µl CTAB екстрационог пуфера (2% CTAB, 1.4 M NaCl, DTT 0.2%, 20 mm EDTA, 100 mm Tris-HCl, ph=8.0) претходно загрејаног у воденом купатилу на 65 C. Узорци су инкубирани у воденом купатилу на истој температури 30 минута уз повремено благо мешање инверзијом сваких 10 минута. Након инкубације, смеши је додато 500 µl хлороформ:изоамилалкохол у односу 24:1 и узорци су центрифугирани 10 минута на обртаја у минуту. Горња водена фаза пренета је у нове епрувете и додато је 350 µl леденог изопропанола. Епрувете су мешане лаганим окретањем до појаве кончастих нити ДНК и затим центрифугиране 5 минута на обртаја у минуту. Након одливања супернатанта, додато је 200 µl пуфера за испирање (76% етанол, 10 mm NaOAc), у епрувете са ДНК која је остала на дну. Узорци су стављени у центрифугу на обртаја у минуту у трајању од 3 минута, горња фаза је уклоњена, а епривете са ДНК су стављене у термоблок на сушење. После 1 сата, додато је 50 µl 0.1xТЕ пуфера (Tris-HCl mm EDTA) и растворена ДНК је остављена неколико дана на 4 C до одређивања концентрације. Узорци ДНК се дугорочно до употребе чувају на -20 C. Концентрација и квалитет изоловане ДНК одређен је спектрометријском методом на МBА 2000 (Perkin-Elmer) спектрофотометру мерењем апсорбанција на таласним дужинама 230, 260 и 280 nm. Концентрација ДНК се израчунава на основу вредности апсорбанције на таласној дужини 260 nm према формули: X (μg/μl) = А 260 xrx50/1000) где је: А највећа вредност апсорбције UV светлости двоструког ланца ДНК на таласној дужини од 260 nm; R - фактор разблажења узорка ДНК при очитавању апсорбанце; 50 - концетрација 50 μg/μl апсорбанца 1. 33

42 Чистоћа узорка се одређује на основу односа А 260 :А 280 и А 260 :А 230. На таласној дужини од 280 nm највећа је апсорбција протеина, док је на 230 nm највећа апсорбција фенола и соли, попут EDTA. Вредности односа А 260 :А 280 већи од 1,8 и А 260 :А 230 већи од 1,9 означавају да је изолована ДНК слободна од протеина и да се у узорку не налазе друга једињења попут фенола, угљених хидрата и других контаминената Микросателитски маркери кукуруза Од почетних 40 микросателитских маркера који су испитани, за даљу молекуларну анализу изабрано је 36 полиморфних маркера. Четири маркера су изузети из даље анализе због мономорфности и потешкоћа у оптимизацији PCR реакције. Изабрани сет од 36 микросателитских маркера који су према литературним подацима (прилог 10, таб. 50) доведени у везу са важнијим агрономским особинама коришћен је за молекуларну карактеризацију. Парови прајмера 36 микросателитских маркера дати су у табели 2. Табела 2. SSR маркери кукуруза, хромозоми на којима се налазе, секвенце њихових прајмера, темпратура везивања прајмера за ДНК и поновци маркера Маркер Хр. Секвенца левог и десног прајмера Темп. вез. Поновак dupssr26 1 GTCGGAGCACTCCAAGAC 53 C (GA)23 CTTCTCGCTCATCAGCTTAAA bnlg ACCGACCTAAGCTATGGGCT 53 C AG(18) CCGGTTATAAACACAGCCGT umc CTGGCATGATCACGCTATGTATG 58 C (CT)19 TAACATCAGCAGGTTTGCTCATTC umc CACAACTCCATCAGAGGACAGAGA 58 C (CGT)7 CTGCTACGACATACGCAAGGC bnlg TCCTCTTGCTCTCCATGTCC 53 C AG(22) ACAGCTGCGTAGCTTCTTCC phi083 2 CAAACATCAGCCAGAGACAAGGAC 56 C AGCT ATTCATCGACGCGTCACAGTCTACT bnlg125 2 GGGACAAAAGAAGAAGCAGAG 53 C - GAAATGGGACAGAGACAGACAAT umc GCTCCACTTCCACCCTGATATG 56 C (CT)11 CGCTAATGTCCCCATTGATGAT 34

43 bnlg GAGCACAGCTAGGCAAAAGG 53 C AG(17) CTCGCACGCTCTCTCTTCTT dupssr23 3 TGATCATCATAAGCACACCG 56 C (GA)2TA(GA)19 CCAATGTGAAGCAAGAGAGAA phi053 3 CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC 53 C ATAC AACCCAACGTACTCCGGCAG umc ATAGATCTTTGTCGCGTGTTCTGC 58 C (TGC)4 CTCAAGAACACCACCAGACGAGTT bnlg CCTCTCGATGTTCTGAAGCC 53 C AG(17) GTCATAACCTTGCCTCCCAA umc GCAACACAGGACCAAATCATCTCT 56 C (ACG)4 GTTCGGTCCGTAGAAGAACTCTCA umc AACAAGTTTTGTTTGACAAGCCG 53 C (CA)9 ATGATCACCCCGTCAGCG phi093 4 AGTGCGTCAGCTTCATCGCCTACAAG 58 C AG AGGCCATGCATGCTTGCAACAATGG dupssr10 5 AGAAAATGGTGAGGCAGG 53 C (AC)22 TATGAAATCTGCATCTAGAAATTG umc CATGGGACAGCAAGAGACACAG 58 C (CGG)5 ACCTTCATCACCTGCAACTACGAC bnlg TGGCGCGATTTTCTTCATAT 58 C AG(29) AAAGAGCAACCTTCAACGGA umc GCAACAGCAACTGGCAACAG 56 C (CT)7 AAACAGGCACAAAGCATGGATAG bnlg238 6 CTTATTGCTTTCGTCATACACACACATTCA 58 C - GAGCATGAGCTTGCATATTTCTTGTGG umc CTTTCCTCTCTGGAGCGTGTATTG 56 C (GA)16 ATATGTTGCAGAACCATCCAGGTC umc GAAAGTCGATCGAGAGACCCTG 58 C (GA)12 CCCTCTCTTCACCCCTTCCTT phi034 7 TAGCGACAGGATGGCCTCTTCT 58 C CCT GGGGAGCACGCCTTCGTTCT umc GAAGAAGGATCGCACACATGG 56 C - AGACTGTCGCGCTGTACTATACCC bnlg GGGAATGAATAAGCCAAGA 58 C AG(16) GCGCTCCTTCACCTTCTTTA umc GAGAGATGACAGACACATCCTTGG 56 C (ATTGC)5 ACATTTATGATACCGGGAGTTGGA bnlg162 8 ACTAGCAGCAGTAAAACCTAATAAAGGGA 56 C - CAAGTAGCTAGCAGTCATTTGCAGTGT 35

44 bnlg666 8 AAAAGGCAAGTAGCTAGCATGCATTTGCA 58 C - GGCTCACGTCCGTATCCAAACCAACA umc GCTAGTTGAGTTCGACACCAGGTT 56 C (ACA)4 TGACTGTGACTGTGACTATGACCG bnlg430 9 CTTACTGAGCATCTTCCTTCTCTCC 58 C - TCCGGTGATGCTCCAGCGAC bnlg AGGAATTGCGAGTCTTCCAA 56 C AG(25) CAACCCCCAAAATGAACAAA bnlg GTCCCGGGCAGAATAATACC 53 C AG(12) TTCCTCCTTGAAGTGCTCGT phi027 9 CACAGCACGTTGCGGATTTCTCT 58 C GCGCT GCGTACGTACGACGAAGACAC umc CTCATCGGTTAGCAGCAGCAG 58 C - GTTCTTAATCGGCACTCCTCGTC phi AAGCTAATTAAGGCCGGTCATCCC 58 C ACC TCCGTGTACTCGGCGGACTC Ланчана реакција полимеразе Ланчаном реакцијом полимеразе амплификоване су микросателитске секвенце помоћу флуоресцентно обележених прајмера. Укупна смеша за PCR реакцију од 10 µl састојала се од 2,5 µl 25 ηg геномске ДНК, 1 µl 0,2 mm dntp, 1 µl 1x Taq pufera sa КCl, 0,8 µl 2 mm MgCl 2, 0,2 µl 1U Taq полимеразе, po 0,5 µl 0,5 pmol оба прајмера и 3,5 µl стерилне воде. PCR програм састојао се из следећих циклуса: 1. почетна денатурација двоструког ланца ДНК на 94 ºC у трајању од 5 минута 2. денатурација на 94ºC у трајању од 30 секунди 3. везивање прајмера за комплементарне циљне секвенце ДНК на температурама специфичним за сваки пар прајмера у трајању од 45 секунди 4. елонгација, везивање нуклеотида за крајеве оба прајмера на основу комплементарности са секвенцом геномске ДНК која служи као образац на 72 ºC у трајању од 45 секунди 5. завршна фаза екстензије 72 ºC у трајању од 7 минута 6. хлађење реакционе смеше на 4ºC Кораци су поновљени у 38 циклуса. 36

45 5.5.4 Капиларна електрофореза Анализа продуката PCR урађена је капиларном електрофорезом помоћу аутоматског секвенцера Applied Biosystems - ABI Prism 3130 (сл. 4). Запремина узорка износила је укупно 10 µl и садржала је смешу од по 2 µl четири PCR производа обележена различитим флоуресцентним бојама, 7,8 µl Hi-Di Formamide (Applied Biosystems), 0,2 µl Size Standard 500 LIZ (Applied Biosystems). Непосредно пре капиларне анализе, узорци су денатурисани на 94 ºC у трајању од 5 минута. За обраду података коришћен је програм Data Collection Software Version 3.0 (Applied Biosystems), а за одређивање дужине амплификованих ДНК секвенци коришћен је програм GeneMapper Software Version 4.0 (Applied Biosystems). Слика 4. Капиларна електрофореза на аутоматском секвенцеру Applied Biosystems - ABI Prism Статистичка обрада молекуларних података кукуруза Статистика за диверзитет генских локуса израчуната је помоћу програмских пакета PowerMarker (Liu 2002), Genalex (Peakall and Smouse 2012) и Arlequin (Excoffier and Lischer 2010) и описана помоћу следећих показатеља диверзитета: 37

46 Диверзитет алела се изражава као просечни број алела по локусу. Ефективни број алела (Ne) је теоријски број алела са једнаким фреквенцијама који би дао исту вредност очекиване хетерозиготности која је израчуната на основу измерених фреквенција алела за дати локус. Ефективни број алела се рачуна према формули (Kimura and Crow 1964): 2 Ne = 1/ p i и може бити једнак или маљи од утврђеног броја алела. Уколико су ефективни број алела и утврђени број алела исти, сви алели датог локуса имају исте фреквенције. Број ретких алела се односи на алеле чија је фреквенција мања од 5% (Hirschhorn and Daly 2005). Шенонов индекс се корисити за изражавање диверзитета алела једног локуса. Индекс узима у обзир не само број алела, већ и њихову процентуалну заступљеност у локусу. Одређује се за сваки локус према формули: H = - p i lnp i (i = 1 до Na) где је pi фреквенција i-тог алела, а Na укупан број алела датог локуса (Shannon and Weaver 1949). Диверзитет гена или очекивана хетерозиготност се дефинише као вероватноћа да су два насумично изабрана алела неког гена различити, односно да је индивидуа хетерозиготна за дати локус. Означава удео хетерозиготних јединки који се очекује за дати локус у популацији и оцењује се за сваки локус према формули јапанског популационог генетичара Неи Масатошија (Nei and Roychoudhury 1974): He = n(1 p 2 i )/(n-1) где је n величина узорка, а p i фреквенција i-тог алела. С обзиром да очекивана хетерозиготност показује удео хетерозигота под претпоставком Харди-Вајнбергове равнотеже, за популација које се не налазе у слободној оплодњи, као што су инбред линије користи се њен непристрасни оценитељ uhe (Weir 1989) које се добија дељењем He са 1-(1+F/n), где је F коефицијент инбридинга, а n број јединки. Запажена хетерозиготност локуса (Hо) одређује се дељењем броја хетерозигота за дати локус са укупним бројем хетерозигота и хомозигота. Полиморфност појединачних локуса (Polymorphism Information Content; PIC) показује моћ неког маркера да детектује полиморфизам у популацији. Зависи од броја утврђених алела и дистрибуције њихових фреквенција, а рачуна се према формули (Botstein et al. 1980): 38

47 2 PICj=1- p i где су p i фреквенције i-тог алела j-тог маркера; и узима вредности од 1 до укупног броја алела (Nа), а ј узима вредност од 1 од укупног броја маркера (n). Коефицијент инбридинга или индекс фиксације F изражава вероватноћу да су два алела једног локуса идендични по свом пореклу. Када је F вредност једнака 1, алели једног локуса су идентични, односно наслеђени су од заједничког претка. Вредност коефицијента инбридинга 0 указује на хетерозиготност локуса и непостојање инбридинга. Коефицијент Fst показује удео укупне генетичке варијансе која је садржана у потпопулацији (групи) и има вредности од 0 до 1. Велике вредности тог коефицијента указују на значајну диференцијацију између потпопулација. Коефицијент Fis показује пропорцију варијансе потпопулације коју садрже јединке те потпопулације, а његове велике вредности указују на велики проценат инбридинга (Wright 1978). Кластер анализа генотипова кукуруза Три независне кластер анализе су примењене на генотипским подацима кукуруза добијене применом молекуларних маркера: кластер анализа заснована на параметријском моделу, UPGMA модел и анализа главних координата. Структура популације инбред линија кукуруза применом параметријског модела За утврђивање популационе структуре одабраних генотипова коришћен је програм STRUCTURE (Pritchard et al. 2000) који се заснива на параметријском моделу дистрибуције фреквенција непознатог броја популација. Овај програм примењује Бајесов алгоритам за одређивање броја кластера или група, придруживање генотипова групама и утврђивање оних генотипова који се могу распоредити у више група. Алгоритам (Markov Chain Monte Carlo; MCMC) придружује инбред линије групама који имају карактеристични скуп фреквенција алела за сваки локус, при чему локуси теже Харди-Вајнберговој и гаметској равнотежи. Груписање генотипова је урађено на основу независних фреквенција алела 36 невезаних микросателитских маркера. Примењен је мешовити модел који подразумева да један генотип може припадати једној групи или више њих, уколико делови генома потичу из више изворних популација (Falush et al. 2003). Постављени параметри дужине анализе и 39

48 број понављања процеса за тачну процену параметара износили су x понављања. Ламбда, параметар Дирихлеове дистрибуције фреквенција алела, постављен је на почетну вредност 1, означавајућу да генотипови могу потицати из више популација. Очекивани број група задат је у распону од 1 до 6 и за сваку очекивану групу урађенo je пет независних анализа, понављања. Број група је процењен на основу вредности логаритма вероватноће података (фреквенције алела) L(K) за сваку групу. L(K) представља средњу вредност логаритма вероватноће података за сваки корак MCMC алгоритма умањена за половину своје варијансе. Број група одређен је помоћу два метода. Први метод захтева уношење у координатни систем очекивани број група К на апциси и логаритам вероватноће на ординати. Број група одговара броју К при којем је вредност логаритма вероватноће достигла плато или се незнатно повећала. Други метод одређивања броја група урађен је према Evanno et al. (2005) на основу промене вероватноће другог реда (ΔК) са променaмa yзастопних К, где је ΔК: ΔК= avg [L(K+1)] - 2 x avg [L(K)] + avg [L(K-1)] / sd [L(K)] avg означава средњу вредност, sd стандардну девијацију, K број група. Број група једнак је оном броју очекиваних група К за који је вредности ΔК највећа. Резултат анализе је представљен Q матрицом за одређени број група (највећу вредност ΔК), која се састоји од процењених коефицијената припатности сваке инбред линије свакој групи. Добијена Q матрица је послужила за утврђивање веза агрономских својстава и микросателитских локуса у програму TASSEL (Thornsberry et al. 2001, Bradbury et al. 2007). UPGMA модел анализe генотипова кукуруза Други приступ за одређивање популационе структуре заснован је на Еуклидовим одстојањима и урађен је у програму PowerMarker v3.25 применом непондерисанoг методa груписањa парова са аритметичком средином (Unweighted Pair- Group Method with Arithmetic mean; UPGMA, Sokal and Michener 1958). UPGMA алгоритам проналази најмање одстојање између два објекта и групише их у кластер, а затим рачуна одстојање новог кластера у односу на остале, повезујући их у већи кластер и тако даље формирајући тзв. кладограм. Еуклидско одстојање рачуна се према формули: 40

49 где су p ij и q ij фреквенције i-тог алела j-тог локуса, док је ај број алела ј-тог локуса, a m је број анализираних локуса. Овај хијерархијски метод израчунава одстојање између објеката при чему сви парови имају једнак допринос - нису пондерисани, формира групе које се састоје од само два објекта, а одстојање између билo која два кластера представља аритметичку средину одстојања између свих парова објеката из два кластера. Одстојања су заснована на фреквенцијама алела између инбред линија кукуруза представљена су кладограмом који је добијен у програму Dendoscope (Huson et al. 2007). Анализа главних координата генотипова кукуруза Анализа главних кооридината (Principal Coordinate Analysis; PCoA) је примењена у програму XLSTAT 2010 (Addinsof, New York, USA; како би се пронашли и представили односи између инбред линија, односно елемената матрице одстојања, на основу главних координата. Почетна матрица различитости између сваког пара инбред линија анализирана је тако да се свакој n инбред линији додели n-1 координата које га представљају у вишедимензионалном n-1 простору (Gower 1966). Координате су eigen вектори матице одстојања, а eigen вредности пропорција обухваћене варијансе. Положај инбред линија у дводимензионалном простору одређен је тако да се што мање изгуби изворних информација и да геометријска растојања између линија буду еквивалентна генетичким растојањима. 5.7 Статистичка обрада фенотипских података кукуруза Дистрибуције фреквенција фенотипских особина инбред линија кукуруза поређене су са нормалном дистрибуцијом у статистичком програму StatSoft, Inc. (2013) STATISTICA v. 12. Код дистрибуција фреквенција које су одступале од нормалне дистрибуције урађене су одговарајуће трансформације (log 10, x 2, x) у зависности од типа података, како би следиле нормалну дистрибуцију, и након анализе трансформисаних података, добијени резултати су повратном, обрнутом трансформацијом приказани у изворном облику. 41

50 Дескриптивна статистика израчуната је за сва анализирана фенотипска својства и обухватала је: средњу, минималну и максималну вредност, разлику између минималне и максималне вредности (опсег), страндардну грешку аритметичке средине, варијансу и коефицијент варијације. Анализа варијансе je примењена да испита значајност разлика варијанси испитиваних особина између генотипова, локалитета и година применом програма XLSTAT 2010 (Addinsof, New York, USA; Линеарне корелације између мерених квантитативних особина утврђене су помоћу Пирсоновог коефицијента корелације (Snedecor and Cochran 1967). Усвојена је Евансова подела корелације између особина по интензутету на основу вредности Пирсоновог коефицијента r 2 при чему је: r 2 = 0,00-0,19 - веома слаба, r 2 = 0,20-0,39 слаба, r 2 = 0,40-0,59 средња јака, r 2 = 0,60-0,79 јака и r 2 = 0,80-1,00 веома јака корелација (Evans 1996). Кластер анализа генотипова кукуруза на основу фенотипских података урађена је у програму STATISTICA 12 применом непондерисанoг методa груписањa парова са аритметичком средином и заснована је на Еуклидском растојању. Мултиваријациона анализа главних компоненти примењена је у циљу смањивања већег броја почетних променљивих, најчешће у корелацији, на мањи број некорелисаних промењливих тзв. главних компоненти, задржавајући највећу могућу варијабилност. Смањујући број промењљивих на главне компоненте олакшан је визуелни приказ и тумачење података. Подаци су представљени дводимензонално двема главним компонентама које су садржала највећи део варијансе почетног скупа променљивих. Због разлика у варијансама промењивих и осетљивости метода на различиту дисперзију, мерне скале и јединице променљивих, анализа главних компонената примењена је на фенотипску корелациону матрицу у програму GeneAlex (Peakall and Smouse 2012). 42

51 5.8 Асоцијативна анализа инбред линија кукуруза Анализа гаметске неравнотеже урађена је у програму TASSEL 2.1. применом Фишеровог егзактног теста и представљена преко следећих параметара: D стандардизовани коефицијент неравнотеже који мери неслучајне везе тј., наслеђивање алела различитих локуса, и не зависи од фреквенција алела, r 2 квадрат вредности коефицијента корелације између алелних фреквенција два локуса p - вредност вероватноћа гаметске неравнотеже за Фишеров егзактни тест за сваки микросателитски пар одређена са 1000 пермутација (Weir 1996). Везе између маркера и особина утврђене су применом општег линеарног модела (General Linear Model; GLM) и мешовитог линеарног модела (Mixed Linear Model; MLM) у програму TASSEL 2.1 (Bradbury et al. 2007). Општим линеарним моделом одређене су везе између маркера и средњих фенотипских вредности применом процењених вредности припадности популацијама (Q) као коваријабли којима се контролише структура популације, не узимајући у обзир сродство као могући узрок веза између генотипа и фенотипа. За сваку комбинацију маркер-особина у општем линеарном модела коришћен је метод најмањих сума квадрата према Searle (1987). Мешовити линеарни модел у асоцијативну анализу поред структуре популације укључује и сродство, смањујући тиме грешку првог реда. Матрица сродности (К) добијена је на основу молекуларних података о пропорцији заједничких алела насумично изабраних маркера дуж целог генома који дели сваки пар генотипова. Код мешовитог линераног модела, матрица сродности добијена је у програму TASSEL и коришћена је са матрицом процењених коефицијената припадности популацији из програма STRUCTURE за поправку структуре фамилија и популације. Модел је третирао маркере и структуру популације као фиксне ефекте, док су позадински QTL, који нису били везани за маркере, били посматрани као случајни ефекти. Везе између маркера и особина које су применом F теста имале вредност мању од 0,05 и 0,01 биле су статистички значајне на нивоу значајности 95% и 99%. Тест пермутације је примењен да генерише p вредности које не зависе од дистрибуције с обзиром да тест значајности за F диструбуцију подразумева да грешка остатка има нормалну дистрибуцију. Добијени ефекти маркера нису рашчлањени на 43

52 адитивне и доминантне ефекте већ су тестирани на укупну значајност (Bradbury et al 2007). Коефицијент детерминације R 2 је рачунат да покаже удео фенотипске варијабилности који објашњавају молекуларни маркери. Ефекат алела на фенотип је оцењен поређењем просечне фенотипске вредности генотипова који носе одређени алел и просечне фенотипске вредности свих генотипова: ai= xij/ni- Nk/nk где је: ai - фенотипски ефекат i-тог алела; xij - фенотипска вредност ј-тог генотипа са i тим алелом; ni - број генотипова са i тим алелом; Nk - фенотипска вредност свих генотипова; nk - број генотипова. Када је вредност ai>0, алел има позитиван ефекат на посматрано својство, док су вредности ai<0 указују на негативан ефекат алела (Breseghello and Sorrells 2006, Zhang et al. 2013). 44

53 6. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 6.1 Генетичка варијабилност микросателитских маркера кукуруза Од почетних 40 испитаних микросателитских маркера, четири маркера су изузети из даље анализе због мономорфности и потешкоћа у оптимизацији PCR реакције. Маркер umc1019 је код свих генотипова кукуруза умножио производе дужине 93 базних парова, док су umc1019, nc005, bnlg1451 и bnlg1067 дали неспецифичне производе при различитим параметрима PCR реакције у више понављања. За даљу молекуларну анализу изабрано је 36 полиморфних маркера. Основни показатељи генетичке варијабилности микросателитских маркера кукуруза представљени су у табели 3. Тридесет и шест парова прајмера амплификовало је укупно 297 алела, просечно осам алела по локусу. Након издвајања алела са фреквенцијом мањом од 5%, сваки локус је у просеку имао четири алела. За 0,4% узорака нису одређени алели због непостојаности дужине производа и неправилних пикова. Такође је утврђено 0,2% нултих алела код којих није дошло до везивања прајмера за ДНК ланац. Просечни број ефектних алела био је 3,6. Највећи број алела имао је маркер umc1035, док су маркери phi083, umc1109, umc1075, phi093, phi027, phi059 и umc1360 имали најмањи број алела. Ретки алели са фреквенцијом мањом од 5% били су заступљену у просеку 8,5% по локусу. Највећи проценат ретких алела имао је маркер umc1035, трећину својих алела, док маркери phi083, phi093 и umc1360 нису имали ретке алеле. Већина алела је имала мале фреквенције (граф. 4). Већина маркера се показала као веома полиморфна. Трећина испитиваних локуса имала је осам и више алела, више од четири ефективних алела, очекивану хетерозиготност преко 0,75 и PIC вредност изнад 0,72. Шест маркера је имало PIC вредност испод 0,5. Маркери са динуклеотидним поновцима су у просеку имали већу полиморфност (PIC 0,67), од маркера са три-, четворо-, и петонуклеотидним поновцима (PIC 0,57, 0,58 и 0,53, редом). Просечна вредност непристрасне очекиване хетерозиготности износила је 0,69, док је уоченa хетерозиготност била 0,0009. Четири локуса нису била хомозиготна код свих испитиваних линија кукуруза, те просечни коефицијент инбридинга за све локусе био је 0,

54 Графикон 4. Дистрибуција фреквенције алела инбред линија кукуруза Диверзитет локуса изражен Шеноновим индексом износио је у просеку 1,5, а кретао се од 0,899 до 2,457. Вредности Шенонов индекс изнад 2 биле су особене за локусе велике полиморфности са бројем алела 12, док су вредности индекса испод 1 указале на присуство мањег броја алела или већег броја ретких алела. Тако је, на пример, маркер umc1022, код којег је утврђено шест алела, имао вредност Шеноновог индекса мању од маркера са мањим бројем алела, због неуједначене расподеле фреквенција алела. Само 3 алела овог маркера имали су фреквенције веће од 5%, од којих један чак 70%. Маркери umc1360, phi093 и phi083, са равномерно заступљена четири алела, имали су већи Шенонов индекс од маркера са истим бројем алела (phi027 и phi059), али неједнаким фреквенцијама. Четири маркера (umc1035, bnlg666, dupssr10 и bnlg162) имала су алеле који су били јединствени за више од 10% инбред линија. 46

55 Taбела 3. Параметри генетичког диверзитета 36 микросателитских локуса кукуруза Locus N Na Ne H Ho He uhe F PIC Nra %ra dupssr ,281 1,049 0,000 0,562 0,565 1,000 0,51 3 3,0 bnlg ,862 1,296 0,000 0,651 0,654 1,000 0, ,4 phi ,593 1,129 0,000 0,614 0,618 1,000 0,56 4 0,0 bnlg ,143 1,877 0,000 0,806 0,810 1,000 0,78 6 7,3 dupssr ,024 2,271 0,000 0,834 0,838 1,000 0, ,8 bnlg ,434 1,610 0,000 0,709 0,712 1,000 0, ,7 bnlg ,014 1,706 0,000 0,751 0,755 1,000 0, ,5 bnlg ,333 1,921 0,000 0,813 0,817 1,000 0, ,6 umc ,463 1,028 0,000 0,594 0,597 1,000 0,53 3 1,0 umc ,966 1,129 0,010 0,663 0,666 0,984 0,59 3 1,0 umc ,571 1,711 0,000 0,781 0,785 1,000 0,75 5 8,3 bnlg ,923 1,117 0,000 0,480 0,483 1,000 0, ,5 dupssr ,640 1,605 0,000 0,725 0,729 1,000 0, ,6 bnlg ,278 2,007 0,000 0,811 0,815 1,000 0, ,6 umc ,704 1,242 0,000 0,630 0,634 1,000 0,58 3 7,2 umc ,805 1,727 0,000 0,792 0,796 1,000 0,76 5 7,3 umc ,517 1,109 0,000 0,603 0,606 1,000 0,54 3 5,2 umc ,481 2,457 0,000 0,866 0,871 1,000 0, ,4 bnlg ,169 1,382 0,000 0,684 0,688 1,000 0,63 3 9,4 umc ,060 1,240 0,000 0,673 0,677 1,000 0,61 3 4,3 bnlg ,321 1,099 0,000 0,569 0,572 1,000 0,53 4 1,0 phi ,974 1,198 0,000 0,664 0,667 1,000 0,60 4 0,0 bnlg ,297 1,012 0,000 0,565 0,568 1,000 0,47 2 7,3 phi ,122 1,304 0,000 0,680 0,683 1,000 0,62 3 6,2 phi ,326 0,990 0,010 0,570 0,573 0,982 0,48 3 3,1 umc ,954 1,953 0,021 0,832 0,837 0,974 0, ,0 phi ,257 0,926 0,000 0,557 0,560 1,000 0,46 2 6,5 phi ,216 0,899 0,000 0,549 0,552 1,000 0,45 2 5,4 bnlg ,504 1,968 0,000 0,778 0,782 1,000 0, ,5 bnlg ,961 2,042 0,000 0,832 0,837 1,000 0,81 8 5,2 bnlg ,018 1,558 0,000 0,669 0,672 1,000 0, ,1 umc ,107 1,641 0,000 0,757 0,760 1,000 0,73 5 5,2 umc ,771 1,158 0,000 0,639 0,642 1,000 0,58 4 0,0 umc ,393 1,390 0,000 0,705 0,709 1,000 0, ,0 umc ,892 0,974 0,010 0,472 0,474 0,978 0,40 3 4,4 umc ,866 1,602 0,000 0,741 0,746 1,000 0, ,5 N-величина узорка, Nа-број алела, Nе-број ефективних алела, H-Шенонов индекс, Hoзапажена хетерозиготност, He-очекивана хетерозиготност, uhe- непристрасна очекивана хетерозиготност, F- индекс фиксације, PIC- показатељ полиморфности, Nra-број ретких алела чије су фреквенције веће или једнаке 5%, %ra - сума фреквенција ретких алела по локусу 47

56 Релативно велики број детектованих алела са мањим бројем маркера указује на велику полиморфност изабраних SSR маркера и на велики диверзитет испитаних инбред линија. Просечан број алела одређен са 36 микросателита у 96 инбред линија износио је 8,3. Dubreuil et al. (1999) су у узорку од 116 инбред линија пронашли мањи број алела по локусу (5,9 алела), док су Rebourg et al. (1999) утврдили 6,6 алела по локусу у узорку од 65 популација применом 34 RFLP маркера. Мањи број откривених алела у већем узорку инбред линија и популацијама кукуруза може бити резултат мање дивергентности изабраних генотипова или мање полиморфности RFLP маркера у односу на SSR маркере. Значај величине и дивергентости узорка као и броја и полиморфности маркера потврђују истрaживања Liu et al. (2003), који су анализом 260 инбред линија из тропског, суптропског и умереног климата установили просечно 21,7 aлела помоћу 96 SSR маркера, Yang et al. (2011) који су утврдили просечно 8,2 алела у 154 инбред линије и van Inghelandt et al. (2010), који су детектовали просечно 14,6 алела међу 1537 инбред линија кукуруза. Просечан број од 6,3 алела по локусу утврдили су Li et al. (2006) међу 46 инбред линија са 64 SSR маркера. Lu and Bernardo (2001) су са 83 микросателита пронашли просечно 4,9 алела у 40 инбред линија, објашњавајућу мали број алела уском генетичком основом анализираних генотипова који потичу од свега осам родитељских линија и у мањој мери малом величином узорка. С обзиром на то да је у овом раду утврђен релативно велики број алела у поређењу са бројем анализираних генотипова, можемо закључити да су коришћене инбред линије значајан извор генетичог диверзитета. Велики број алела резултат је и великог удела динуклеотидних маркера, око две трећине изабраних маркера. Динуклеотидни маркери имају наjвећу фреквенцију мутације и самим тим су полиморфнији од тро-, четворо- и петонуклеотидних маркера (Vigouroux et al. 2005). У овом истраживању, маркери са динуклеотидним поновцима су у испитиваним линијама кукуруза просечно имали већу PIC вредности од маркера са три-, четворо-, и петонуклеотидним поновцима што је у сагласности са резултатима Li et al. (2006) и Enoki et al. (2002). Објашњење за ову појаву дали су Chambers and MacAvoy (2000) који су утврдили да приликом PCR реакције може доћи до склизавања полимеразе низ ДНК ланац и прескакања репликације једног или више поновака доводећи до амплификације краћих производа од нормално умноженог ДНК сегмента. Овакве грешке, према Edwards et al. (1991), чешће су код SSR маркера са два поновка и често отежавају правилну идентификацију алела. Да би 48

57 се избегло прецењивање броја алела, односно утврђивања већег броја алела од постојећих због грешака у репликацији, PCR реакције су понављане, нарочито код узорака где су утврђени ретки алели. На тачну процену фреквенција алела, може да утиче и појава нултих алела и већи проценат неуспелих PCR реакција због чега подаци о алелима за такве локусе недостају (Dubreuil et al. 2006). Изузев маркера umc1083 код којег је утврђено 11% нултих алела и алела који се нису могли детектовати, фреквенција нултих алела код осталих шест маркера (umc2003, phi093, umc1122, phi027, phi059 и umc1944) кретала се од 1 до 4% и није била довољно велика да утиче на коначну расподелу фреквенција алела. Велики број детектованих алела је, такође, резултат веће резолуције и моћи детекције коришћене капиларне електрофорезе у односу на агарозни или полиакриламидни гел, што је навише изражено код алела који се разликују у малом броју нуклеотида (2-5). Просечна PIC вредност, показатеља полиморфности маркера, износила је 0,64 и није знатно одступала од PIC вредности у другим истраживањима, указујући на информативност изабраних маркера. Reid et al. (2011) су утврдили PIC вредност 0,68 за 105 микросателита код 129 инбред линија, Li et al. (2006) 0,66 за 64 маркера и 46 инбред линија, а Smith et al. (1997) су код 62 генотипа анализираних са 131 маркером израчунали PIC вредност 0,62. Само шест маркера је имало PIC вредност испод 0,5 вредности која се сматра граничном да би маркер био довољно информативан за генотипску анализу (Suteu et al. 2014). Полиморфност коришћених маркера одређена је и знатним бројем ретких алела (8,5% по локусу). На неуједначене расподеле фреквенција алела услед присуства ретких алела указују и ниже вредности Шеноновог индекса код локуса који су имали већи број алела од просечног, попут маркера bnlg1523 и bnlg125. На ову појаву указује и број ефективних алела који је за локусе који имају велики проценат ретких алела знатно мањи од утврђеног броја алела. Просечна вредност уочене хетерозиготности била је ниска, док је просечни коефицијент инбридинга за све локусе био близу највећe теоријскe вредности 1, што је очекивано, с обзиром на хомозиготну природу инбред линија. Велика полиморфност коришћених маркера указује на њихов велики значај за утврђивање диверзитета почетног генетичког материјала као полазне основе за оплемењивање, фингерпринтинг елитних инбред линија и заштиту интелектуалне својине, на 49

58 погодност маркера за дискриминацију генотипова кукуруза и генотипизацију, тј. молекуларну евалуацију. 6.2 Анализа структуре популације кукуруза заснована на параметријском моделу Структура популације кукуруза је утврђена за сет од 96 инбред линија у програму STRUCTURE за претпостављени број кластера (група) од 1 до 6 и са пет понављања за сваки кластер. Процењени коефицијенти припадности генотипова свакој групи израчунати су за сваку задату претпостављену групу (од К=2 до К=6). Свака инбред линија је представљена вертикалном линијом која је се састоји од 1 до К обојена сегмента. Дужина сваког обојеног сегмента је пропорционална уделу К група у геному дате инбред линије (граф. 5). С озбиром на то да програм STRUCTURE не одређује сâм стваран број група, број група је одређен помоћу метода највеће вероватноће и Евановог модела. 50

59 Графикон 5. Хистограми процењених коефицијената припадности генотипова кукуруза за две, три, четири, пет и шест група К 51

60 Метод највеће вероватноће процењује број група на основу вредности логаритма вероватноће фреквенције алела L(K) за сваки кластер. Број кластера одређен је уношењем у координатни систем очекивани број кластера К на апциси и логаритам вероватноће на ординати. Највећи пораст логаритма вероватноће достигнут је при вредности К=2 (таб. 4), док је са повећавањем броја кластера, логаритам вероватноће тек благо растао што указује на постојање две групе у датом сету генотипова (граф. 6). Табела 4. Стандардна девијација и средња вредност логаритма вероватноће клaстера К, L(K) и ΔK K SdL(K) L(K) L'(K) L''(K) L''(K) ΔK K1 0, , ,00 K2 2, ,1 1421,7-955,9 955,9 407,46 K3 1, ,3 465,8-307,3 307,3 165,36 K4 15, ,8 158,5-52,3 52,3 3,31 K5 54, ,6 106,2 26,9 26,9 0,49 K6 16, ,6 133,1-133,1 133,1 8,10 L(K) је просечна вредност логаритма вероватноће К, L (K) = L(K) n L(K) n-1,l (K) = L (K) n L (K) n-1; ΔK = [L (K)]/Sd Применом Евановог модела за одређивање броја кластера у структури популације анализираних инбред линија издвојене су, такође, две групе. Број група једнак је оном броју очекиваних кластера К за који је вредности разлике другог реда ΔК највећа. Највећа вредност ΔК добијена је код поделе на две групе К и графички је представљена пиком (граф. 6.) 52

61 Графикон 6. Логаритам вероватноће за очекивани број кластера К (лево) и вредности разлике другог реда ΔК за очекивани број кластера К према Евану (десно) 53

62 Ови резултати одговарају подели инбред линија на BSSS хетеротичну групу и остале (non-bsss) групе и представљена је првим хистограмом на графикону 5. са моделом који претпоставља постојање две групе (К=2), графички приказане зеленим и црвеним стубићима. С обзиром на то да су резултати Евановог метода и метода највеће вероватноће указали на диференцијацију на две групе, у програму STRUCTURE избрана је Q матрица за два кластера која се састојала од процењених коефицијената припадности сваке инбред линије за сваки кластер. Инбред линије кукуруза са коефицијентом припадности већим или једнаким вредности 0,75 су прикључене датом кластеру, док су линије код којих је вероватноћа припадности кластеру мања од 0,75 сврстане у мешовиту групу. Тако је првом кластеру придружено 51, другом 37, а мешовитом 8 инбред линија (таб. 5, 6 и 7). Највећи број линија првог кластера припадају Lancaster хетеротичној групи (39 линија са педигреима у којима је значајан део гермплазме линија С103, Mo17 и Oh43), пет Iodent линија и шест линија са независним педигреима, егзотичног или европског порекла које не припадају наведеним хетеротичним групама. У други кластер стврстано је 37 BSSS инбред линија. Трећи мешовити кластер састојао се од четири BSSS, две Lancaster, једне Iodent и једне инбред линијe независне хетеротичне групе. Табела 5. Инбред линије кукуруза сврстане у групу 1 на основу вероватноће припадности овој групи Q1 Линија Хетеротична група У типу Q1 G1 Lancaster Mo17 0,9975 G2 Lancaster Mo17 0,9598 G5 Lancaster Mo17 0,8689 G6 Lancaster Mo17 0,9963 G7 Lancaster Mo17 0,9973 G8 Lancaster Mo17 0,9952 G9 Lancaster Mo17 0,9956 G10 Lancaster Mo17 0,9796 G12 Lancaster Mo17 0,7689 G13 Lancaster Mo17 0,8884 G14 Lancaster Mo17 0,9843 G15 Lancaster Mo17 0,8835 G33 Lancaster Mo17 0,9974 G34 Lancaster Mo17, Oh43 0,9935 G35 Lancaster Mo17 0,9965 G40 Lancaster Mo17, C103 0,9971 G41 Lancaster Mo17, C103 0,9961 G43 Iodent Iodent 0,

63 G44 Lancaster Mo17 0,9977 G45 Lancaster Mo17 0,9962 G47 Lancaster Mo17 0,9972 G48 Lancaster Mo17 0,9962 G49 Lancaster Mo17 0,8379 G52 Lancaster Mo17, Iodent 0,8366 G56 Независна Eгзотична гермплазма 0,9799 G57 Независна Eгзотична гермплазма 0,7718 G58 Lancaster Eгзотична гермплазма 0,9606 G59 Независна Eгзотична гермплазма 0,9265 G60 Lancaster Oh43 0,9287 G64 Lancaster Iowa Corn Borer Synthetic 0,8244 G67 Lancaster C103 0,7766 G68 Независна F7 0,9150 G69 Iodent -BSSS Hепознато 0,7557 G70 Независна F2 0,7906 G71 Lancaster C103 0,996 G72 Lancaster Mo17 0,9963 G73 Lancaster Mo17 0,9946 G74 Iodent Iоdent 0,8687 G75 Независна Hепознато 0,9958 G76 Lancaster - Независна Hепознато 0,7900 G77 Lancaster Mo17 0,9964 G78 Lancaster Mo17 0,9974 G79 Lancaster Mo17 0,9959 G80 Lancaster Mo17 0,9907 G81 Lancaster Mo17 0,9928 G84 Lancaster Hепознато 0,9936 G87 Lancaster Mo17 0,9966 G92 Lancaster Mo17 0,9966 G93 Iodent Iоdent 0,9427 G94 Iodent - Lancaster Iodent - Oh43 0,9885 G96 Iodent Iodent 0,9664 Табела 6. Инбред линије кукуруза сврстане у групу 2 на основу вероватноће припадности другој групи Q2 Линија Хетеротична група У типу Q2 G3 BSSS B73 0,9938 G16 BSSS B73 0,9974 G17 BSSS B73 0,9953 G18 BSSS B73 0,9949 G19 BSSS B73 0,9955 G20 BSSS B73 0,9734 G21 BSSS B73 0,9975 G22 BSSS B73 0,9973 G23 BSSS B73 0,

64 G26 BSSS B73 0,9971 G27 BSSS B73 0,9772 G28 BSSS B73 0,9910 G30 BSSS B73 0,9972 G31 BSSS B73 0,8531 G32 BSSS B73 0,9968 G36 BSSS B14, B73 0,9951 G37 BSSS B73 0,9968 G38 BSSS B73 0,9938 G39 BSSS B14, B73 0,9207 G42 BSSS B14, B37 0,9389 G50 BSSS BSSS Synthetic 0,9890 G51 BSSS BSSS Synthetic 0,9948 G53 BSSS B14 0,9838 G54 BSSS B73 0,9961 G55 BSSS B73 0,9961 G61 BSSS BSSS Synthetic 0,9959 G62 BSSS B73 0,9953 G63 BSSS B84 0,9781 G66 BSSS BSSS Synthetic 0,8940 G82 BSSS B14 0,9959 G85 BSSS B73 0,9974 G86 BSSS B73 0,9976 G88 BSSS B73 0,9954 G89 BSSS B37 0,8743 G90 BSSS B73 0,9919 G91 BSSS B73 0,9928 G95 BSSS B73 0,9641 Табела 7. Инбред линије кукуруза сврстане у мешовиту групу на основу вероватноће припадности генотипова групама 1 и 2 (Q1, Q2) Линија Хетеротична група У типу Q1 Q2 G4 Lancaster Mo17 0,4338 0,5662 G11 Lancaster Mo17 0,5843 0,4157 G24 BSSS B73 0,4127 0,5873 G25 BSSS B73 0,3548 0,6452 G29 BSSS B73 0,3885 0,6115 G46 Iodent PH207 0,3899 0,6101 G65 BSSS BSSS Synthetic 0,3211 0,6789 G83 Независна ND250 0,4895 0,5105 С обзиром на то да је Еванов модел дао највиши ниво хијерархијске структуре у датом сету поделивши популацију кукуруза на две групе, да би се утврдило како се генотипови групишу у оквиру сваке од њих, анализом обе групе понаособ у програму 56

65 STRUCTURE утврђено je даљe структуирање. На основу дистрибуција фреквенција алела, прва група подељена је на две подгрупе у којима су из Lancaster хетеротичне групе (28 инбред линија) издвојене независне и Iodent линије (16 инбред линија). Седам инбред линија није уврштено ни у једну групу, јер је имало вредности вероватноће припадности оба кластера мање од 0,75. У другој групи, линије су се груписале у B73 тип (22 инбред линија) и остале (11 инбред линија), док четири инбред линије нису сврстане ни у једну подгрупу (граф. 7). 57

66 Графикон 7. Хистограм процењених коефицијената припадности популацијaма кукуруза. Зеленом је означена BSSS популација, која је подељена на групу са линијама насталим из B73 (љубичаста) и групу линија које воде порeкло од B14, B37, B73 и B84 (плава). Друга популација (црвена) подељена је на Lancaster линије (наранџаста) и групу линија Lancaster, Iodent и линије независне хетеротичне групе (жута). 58

67 Параметријски модел дистрибуције фреквенција примењен у програму STRUCTURE придружио је 96 инбред линија кукуруза унапред задатом броју кластера (група) према карактеристичном сeту фреквенција алела за све локусе, док су метод највеће вероватноће и Еванов метод утврдили постојање две групе. Подела инбред линија на две групе у сагласности је са поделом инбред линија на BSSS хетеротичну групу и остале (non-bsss) групе (Hallauer and Miranda 1988, Rasmussen and Hallauer 2006). Литературни подаци указују на непостојање јединственог начина утврђивања броја кластера и препоручују примену метода највеће вероватноће и Евановог модела, као и да број изабраних кластера буде објашњив са биолошког становишта (Pritchard et al. 2000, Pritchard et al. 2007, Coulon et al. 2008). Најчешћу поделу на две групе која се добија применом Евановог метода потврђује истраживање Vigouroux et al. (2008) који су применом овог метода груписали 310 популација кукуруза у кластер који је обухватио популације кукуруза са Анда и други кластер који се састојао од популација кукуруза које нису пореклом са Анда. Ову појаву Vigouroux et al. (2008) објашњавају малим вредностима вероватноће да вредност К буде 1, односно да je мала вероватноћа да не постоји структуирање у испитиваним генотиповима, услед чега је разлика вероватноће (ΔК) да постоје два кластера и вероватноће да постоји једнан кластер, већа од разлике вероватноћа да постоје три кластера и два кластера, разлика вероватноћа четири кластера и три кластера, итд. Примењујући Еванов модел, Semagn еt al. (2012) су поделили 450 инбред линија кукуруза у два кластера, али су након поређења педигреа утврдили да подела на три кластера више одговара расподели инбред линија према пореклу. Yang et al. (2010) су приметили да подела популације 155 испитиваних инбред линија у два кластера није у потпуности у сагланости са подацима о педигреима, па су поделу инбред линија унутар сваког кластера извршили укључујући њихове педигрее. Suteu et al. (2014) су анализом популације од 90 инбред линија кукуруза са 80 микросателитских маркера утврдили поделу инбред линија у два велика кластера, које су анализирајући сваки кластер посебно у програму STRUCTURE даље поделили у два, односно пет подкластера. Програм STRUCTURE није издвојио у посебне кластере Iodent линије, као ни инбред линија које воде порекло из европских тврдунаца или из Јужне Америке. На овакву поделу вероватно је утицао несразмеран удео Iodent линија и линија независног порекла у укупном броју инбред линија и њихова слаба диференцијација, 59

68 те су оне груписане у један од два највећа кластера, Lancaster кластер. Узимајући другу највећу вредност разлике другог реда ΔК и другу највећу просечну вредност логаритма вероватноће као показатеље броја група, 96 инбред линија је груписано у три кластера: Lancaster, BSSS кластер и трећи који се састојао од: Iodent линија, инбред линија пореклом из европских тврдунаца и из Јужне Америке, заједно. Избором четири и пет очекивана кластера, расподела генотипова ни у једном случају није била у сагласности са њиховим педигреима и хетеротичним групама. Честа подела генотипова кукуруза на два кластера (Vigouroux et al. 2008) се може објаснити постојањем хијерархијске структуре. Еванов метод проналази највиши ниво структуре у датом сету података, што је у истраживању 96 инбред линија кукуруза обухваћених овом дисертацијом потврђено анализом оба кластера понаособ и утврђивањем даљег структуирања унутар сваког кластера. Сваки кластер STRUCTURE је поделио на две групе, издвојивши у великој мери линије у типу B73 oд осталих у оквиру BSSS кластера и инбред линије Lancaster хетеротичне групе од линија независне хетеротичне групе и Iodent линија. Mањи број линија у типу B73 није сврстан у B73 подкластер BSSS, као што је и део Lancaster инбред линија остао изван Lancaster подкластера non-bsss кластера. Ово може бити последица утицаја других генотипова који су учествовали у стварању ових инбред линија, као што су предачке линије или популације из којих су инбред линије настале. Liu еt al. (2003) разлике у генетичкој конституцији линија сличног порекла објашњавају селекцијом и генетичким дрифтом у процесу инбридинга приликом стварања инбред линија доводећи до одступања између њихових педигреа и генетичких дистанци. Свакако да би доступност потпунијим подацима о педигреима коришћених инбред линија омогућило боље сагледавање њихових међусобних односа и оцену подударања њихових педигреа са методама кластер анализе. 6.3 Анализа структуре популације кукуруза заснована на генетичким растојањима Кластер анализом, применом UPGMA методa, сви генотипови кукуруза су сврстани у пет група. Генетичка одстојања између инбред линија визуелно су представљена дендрограмом са дихотомим гранањем - из сваке тачке рачвања раздвајају се увек два кластера, све до појединачних генотипова (граф. 8). 60

69 Две највеће групе чине линије BSSS и Lancaster хетеротичне групе. Линије G68 и G70, које у својим педигреима имају француске линије F7 и F2, односно потичу из популације европских тврдунаца и чине независну хетеротичну групу, груписане су у посебан кластер. Три линије G56, G57 и G59, егзотичне гермплазме, преклом у Јужне Америке, посебне хетеротичне групе, чине четврти кластер. У пети кластер издвојене су две инбред линије, G65 и G83. Прва линија је настала из синтетичке популације BSSS, док је друга независног генетичког материјала. На основу генетичких удаљености, UPGMA метод је ове две линије груписао најближе линијама BSSS кластера. Линија G66 која, као и линија G65, потиче из синтетичке популације BSSS, груписана је на самом крају BSSS кластера, генетички је најудаљенија од осталих BSSS линија, а најближа линијама петог кластера. Све Iodent линије (G43, G46, G69, G74, G93, G94 и G96) налазе се у једном кластеру у оквиру већег Lancaster кластера. Три инбред линије, G75, G76 и G84, чији педигреи нису познати, груписали су се у Lancaster кластер. Линија генетички најближа линији G75, непознатог порекла, је линија G60 у типу Oh43 и налази се између Мо17 и Iodent калстера. Линија G76 је генетички најсроднија G52 линији, која у свом педигреу има Мо17 и Iodent гермплазму, и сврстана је у Мо17 кластер. Линија G84 се груписала око линија G77, G87 и G82 које су и типу линије Мо17. Линије Lancaster хетеротичне групе које у својим педигреима имају гермплазму линије C103, груписане су једна до друге у оквиру Мо17 кластера, осим линије G67 која је генетички најудаљенија од осталих. G34, која потиче из Мо17 и Oh43, сврстана је у кластер са линијама у типу Мо17, док су линије G64, настала из популације Iowa Corn Borer Synthetic, и линије G60, која је у типу Oh43, релативно блиске. Међу линијама BSSS хетеротичне групе, G39 и G42, које су настале из линија B14 и B73, груписане су заједно са линијом G63, B84 основе, док је линија G36, која, такође, садржи генетички материјал линија B14 и B73, генетички ближа G82, B14 основе. Линије настале из BSSS синтетичке популације, G50, G51, G61, G65 и G66, нису се груписале заједно. Две BSSS линије, G24 и G29, налазе се у Lancaster кластеру, једна Lancaster, G4, и једна Iodent линија, G46, налазе се у BSSS кластеру. 61

70 Графикон 8. Дендрограм инбред линија кукуруза добијен кластер анализом применом непондерисанoг методa груписањa парова са аритметичком средином Прва издвојена група из испитиваних генотипова били су европски тврдунци. van Inghelandt et al. (2010) су, такође, издвојили генетички најудаљеније северне тврдунце од BSSS, Lancaster и Iodent групе анализом структуре популације 1537 инбред линија са 359 SSR и 8244 SNP маркера на основу модификованих Роџерових растојања. Ови резултати су очекивани с обзиром на историју оплемењивања и уношење кукуруза различитог порекла у различитим временским периодима у Европу. Европски тврдунци су настали укрштањем тврдунаца са Кариба и тврдунаца из североисточног дела Америке донетих у Европу у првој половини 16. века, где су развили способност адаптације на нове специфичне услове спољашње средине 62

71 (Rebourg et al. 2003, Dubreuil et al. 2006). Четири стотине година њихове адаптације и еволуције која је трајала до увођења америчких зубана кукурузног појаса САД крајем XIX и почетком XX века (Leng et al. 1962, Trifunović 1978) утицала је на велику генетичку удаљеност између овде две групе. С тога је издвајање инбред линија које воде порекло од европских тврдунаца од осталих инбред линија UPGMA методом у складу са историјом увођења кукуруза у Европу, његовом адаптацијом на поједине еколошке услове и стварањем генетичких специфичности у односу на касније интродуковане зубане. Након издвајања европских тврдунаца, преостали генотипови су се поделили на две групе. Прву групу чине линије Lancaster и Iodent хетеротичне групе и инбред линије које воде порекло из Аргентине. Другу групу чине BSSS линије и две линије, BSSS основе, али генетички удањеније од осталих. У оквиру Lancaster групе прво се издвојила група Iodent линија, а затим линије у типу Оh43 и линије у типу Mo17. Добијени резултати који указују да су Iodent линије ближе Lancaster линијама, разликују се од резултата истраживања Тroyer (1999) који наводи да групе кукуруза Iodent и Stiff Stalk Synthetic (BSSS) потичу из заједничке популације Reid Yellow Dent. van Inghelandt et al. (2010) су установили да је просечно растојање између Iodent и BSSS групе мање него између осталих група. Ову генетичку сличност аутори објашњавају пореклом анализираних Iodent линија напомињући да су испитиване Iodent линије добијене из укрштања Stiff Stalk и изворних Iodent генотипова. Мikel and Dudley (2006) наводе да се линије из подгрупе Stiff Stalk x Iodent користе за укрштања са Oh43 линијама за добијања хибрида, као и да су Iodent и BSSS групе довољно генетички удаљене да дају хибридна потомства. С обзиром на то да су разлике између хетеротичних група у много већој мери исход оплемењивања, односно селекције усмерене ка стварању линија које ће међусобним укрштањем дати хетерозис, него диференцијације генетички различитих оснивачких популација (van Heerwaarden et al. 2012), вероватно је селекција и стварање Iodent линија у Институт за ратарство и повртарсво било усмерено ка стварању линија које ће дати хибридно потомство пре са BSSS линијама, него са линијама Lancaster хетеротичне групе, чинећи Iodent генетички удаљенијим од BSSS линија. Груписање линија Oh43, Mo17 и C103, родитељ Mo17, у оквиру Lancaster кластера у складу је са њиховим педигреима. Све три линије воде порекло из Lancaster Surecrop популације кукуруза (Gerdes and Tracy 1993, Lee and Tracy 2009). 63

72 Унутар BSSS кластера није примећено груписање генотипова према линијама од којих воде порекло. Генетичка сличност између анализираних BSSS линија, на основу генетичких дистанци, била је већа у односу на линије Lancaster групе указујући на ужу генетичку основу BSSS линија које се користе у оплемењивачком програму или на укрштања и проширивање генетичког диверзитета Lancaster групе са гермплазмом другог порекла. Две BSSS линије сврстане су у Lancaster кластер, док су се једна Lancaster и једна Iodent линија нашле у BSSS кластеру. Неподударност између молекуларних података и педигреа инбред линија примећена је и у другим истраживањима (Gethi et al. 2002, Li et al. 2002, Labate et al. 2003). Применивши UPGMA метод за кластер анализу инбред линија на основу молекуларних података, Barata and Carena (2006) су утврдили да се неколико BSSS линијa груписало у Lancaster кластер. Ово неслагање они објашњавају појавом алела идентичних по облику (енгл. identical by state), али који нису идентични по пореклу (енгл. identical by decent), односно не воде порекло од заједничког претка. Како молекуларни маркери не могу да разликују алеле који су идентични по пореклу од алела који потичу од заједничког претка, линије које носе алеле који имају исте облике, али различито порекло могу бити погрешно груписане заједно. Истраживања Warburton et al. (2002) и Yu et al. (2001) показала су да инбред линије које су створене из исте популације не морају увек да буду генетички блиске и да се групишу заједно. Услед генетичког дрифта, мутација и селекције у оквиру малих популација, нарочито оних насталих укрштањем више родитеља, често у оплемењивачким програмима кукуруза може доћи до одступања између података о педигреима и молекуларних података (Romero-Severson et al. 2001). Такође, грешке приликом екстракције ДНК, ланчане реакције полимеразе, очитавања резултата или обележавања узорака могу довести до неочекиваних резултата. С друге стране, молекуларни маркери могу разјаснити подигрее и повећати тачност и прецизност приликом процена односа између линија и структуре популације, нарочито у случајевима када подаци o педигреимa нису увек доступни, јасни и потпуни (Bernardo 1994). 64

73 6.4 Анализа структуре популације кукуруза заснована на анализи главних координата Анализа главних координата је примењена да просторно прикаже релативна генетичка одстојања између 96 инбред линија на основу молекуларних података и утврди да ли постоји сагласност груписања генотипова овим методом са параметријским моделом, кластер анализом заснованом на генетичким растојањима и хетеротичним групама и педигреима (граф. 9). Прва координата објаснила је 17,38%, друга 5,47%, а трећа 4,48% укупне варијабилности. Прве три координате заједно су објасниле 27,32% укупне генетичке варијабилности. Прва коодината раздвојила је инбред линије које припадају Iodent и независној хетеротичној групи од Lancaster и BSSS хетеротичне групе, док је друга координата раздвојила последње две групе: Lancaster и BSSS хетеротичну групу. BSSS хетеротична група хомогенија је од Lancaster групе, чији су генотипови у већој мери расути на дијаграму анализе главних коодината. Iodent инбред линије и линије независне хетеротичне групе груписале су се ближе Lancaster, него BSSS генотиповима. Прва коодината раздвојила је инбред линије BSSS линије на оне које које су у типу B73, у доњу половину дијаграма, и остале, у горњу половину. Изузетак су инбред линије G31 и G25, B73 основе, линије G53, G63, које су на самој апсциси, и G89 и G36, које су веома близу прве координате. На дијаграму добијеном анализом главних коодината није утврђено груписање Lancaster линија према линијама из којих су изведене. Распоред инбред линија кукуруза на дијаграму добијеном анализом главних коодината углавном је у сагласности са кладограмом инбред линија добијених кластер анализом применом непондерисанoг методa груписањa парова са аритметичком средином, параметријским моделом примењеним у програму STRUCTURE и познатим подацима о припадности хетеротичним групама и педигреима за већину генотипова. Неподударности су примећене код неколико генотипова. Линија G4 Lancaster хетеротичне групе, уврштена је у BSSS кластер UPGMA методом. Анализа главних координата просторно је представила ову инбред линију близу BSSS генотипова, док ју је програм STRUCTURE са 57% вероватноће уврстио у BSSS групу. Линије G24 и G29, BSSS хетеротичне групе, распоређене су кластер анализом са Lancaster инбред линијама. 65

74 Графикон 9. Дводимензионални приказ груписања 96 инбред линија кукуруза применом анализе главних коодината са 36 микросателитских маркера. Плава- BSSS хетеротична група; црвена- Lancaster хетеротична група; зелена- независна хетеротична група и жута: Iodent хетеротична група 66

75 Анализом главних координата ове линије су груписане са BSSS линијама, недалеко од Lancaster групе, док их је програм STRUCTURE сврстао у мешовиту групу са вероватноћама припадности BSSS групи 59% и 61%, редом. Iodent линија G46, придружена је BSSS групи применом UPGMA метода, мешовитoj групи применом STRUCTURE са 61% вероватноће припадности BSSS, док је анализом главних координата груписана са Iodent линијама, али за разлику од осталих налази се са леве стране друге координате, ближе BSSS линијама. Линија G11 којa je у програму STRUCTURE уврштена у мешовиту групу, на графикону анализе главних коодината приказана је на самој граници између BSSS и Lancaster групе, док је на основу педигреа и UPGMA метода груписана међу Lancaster линије. Резултати анализе главних координата су у великој мери били у сагласности са резултатима добијеним у програму STRUCTURE, UPGMA методом и хетеротичним групама. Сви методи јасно су издвојили BSSS и non-bsss групе. Iodent линије груписане су у засебан кластер у оквиру Lancaster групе и анализом главних координата и UPGMA методом, док су инбред линије које су припале мешовитој групи применом STRUCTURE, распоређене близу прве координате анализом главних координата указујући на њихово мешовито порекло. Ипак, анализа главних координата није издвојила европске тврдунце у посебну групу, као ни STRUCTURE, за разлику од UPGMA метода, што упућује на закључак да комбинација више метода кластер анализа може дати поузданију слику структуре популација инбред линија, односно њихових међусобних односа. Сагласност груписања линија у програму STRUCTURE, анализом главних координата и према хетеротичним групама потврдили су van Inghelandt et al. (2010) и Maurer et al. (2006) закључујући да хетеротичне групе могу са великом поузданошћу указати на структуру испитиване популације и служити као основа за истраживања диверзитета кукуруза. Ипак, придруживања генотипова непознатог или мешовитог порекла хетеротичним групама, на основу молекуларних података, требало би потврдити пољским огледима, утврђивањем комбинационих способности са тестерима различитих хетеротичних група (Melchinger 1999, Barata аnd Carena 2006). 67

76 6.5 Поређење фреквенција алела две групе инбред линија кукуруза Тестирањем разлика фреквенција утврђених алела инбред линија (z-test, XLSTAT software) које припадају двема највећим хетеротичним групама, а уједно и групама издвојених кластер анализом, утврђено је 17 алела 12 маркера чије се фреквенције статистички значајно разликују на нивоу значајности од 5%: bnlg2291 (алел 154 bp), bnlg162 (алели 238 bp и 248 bp), umc1025 (алел 117 bp), bnlg1523 (алел 189 bp), umc1035 (алел 140 bp), dupssr23 (алел 103 bp), phi093 (алели 280 bp, 282 bp и 286 bp), phi027 (алели 146 bp и 156 bp), bnlg238 (алел 149 bp), umc1221 (алел 77 bp), umc1083 (алел 104 bp) и umc1022 (алели 91 bp и 95 bp) (граф ). Ових 17 алела чине 5,7% укупног броја утврђених алела и припадају трећини коришћених маркера. Статистички значајна разлика на нивоу значајности од 1% израчуната је за фреквенције алела локуса 189 bp - bnlg1523 и 77 bp - umc1221 линија које припадају BSSS и Lancaster популацијама. Локуси dupssr23 (алел 103 bp), bnlg162 (алел 248 bp), phi093 (алел 282 bp), bnlg238 (алел 149 bp) и umc1221 (алел 77 bp) имали су најмање двоструко већу фреквенцију алела код Lancaster популације у односу на BSSS, док су локуси bnlg1523 (алел 189 bp), phi027 (алели 146) и umc1083 (алел 104 bp) имали за 30%, 22% и 23% већу фреквенцију алела у Lancaster линијама. BSSS линије су у локусима bnlg162 (алел 238 bp), umc1025 (алел 117 bp), umc1035 (алели 140 bp), phi027 (алели 156 bp) и umc1022 (алели 91 bp) имале најмање двоструко већу фреквенцију алела него Lancaster линије и за 25% и 20% већу фреквенцију у локусима bnlg2291 (алел 154 bp) и phi093 (алел 280 bp). 68

77 Графикон 10. Фреквенција алела инбред линија кукуруза Lancaster (А) и BSSS (B) хетеротичне групе, * и **- статистички значајне разлике у фреквенцијама на нивоу значајности од 5% и 1% 69

78 * * Графикон 11. Фреквенција алела инбред линија кукуруза Lancaster (А) и BSSS (B) хетеротичне групе, * и **- статистички значајне разлике у фреквенцијама на нивоу значајности од 5% и 1% 70

79 Графикон 12. Фреквенција алела инбред линија кукуруза Lancaster (А) и BSSS (B) хетеротичне групе, * и **- статистички значајне разлике у фреквенцијама на нивоу значајности од 5% и 1% 71

80 Графикон 13. Фреквенција алела инбред линија кукуруза Lancaster (А) и BSSS (B) хетеротичне групе, * и **- статистички значајне разлике у фреквенцијама на нивоу значајности од 5% и 1% 72

81 * * Графикон 14. Фреквенција алела инбред линија кукуруза Lancaster (А) и BSSS (B) хетеротичне групе, * и **- статистички значајне разлике у фреквенцијама на нивоу значајности од 5% и 1% 73

82 Графикон 15. Фреквенција алела инбред линија кукуруза Lancaster (А) и BSSS (B) хетеротичне групе, * и **- статистички значајне разлике у фреквенцијама на нивоу значајности од 5% и 1% 74

83 Од укупно 297 алела, 38% утврђено је само код једне групе. BSSS група је имала двоструко више алела који су били својствени само BSSS групи (24%) него Lancaster (14%). Већина алела својствених само једној групи имали су ниске фреквенције. Само 2,5% алела карактеристичких за Lancaster групу и 3% алела присутних само код BSSS групе имали су фреквенцију изнад 5%. Око 76% инбред линија имало је најмање један алел јединствен за ту линију, просечно 2,5 јединствених алела по линији. Тридесет седам линија које су сврстане у Lancaster популацију (72,5%) имало је од 1 до 6 јединствених алела, просечно 1,97 алела по линији, док је 36 линија BSSS групе (97,3%) имало од 1 до 11 јединствених алела, просечно 3,08 алела по линији Популација BSSS имала је већи просечан број алела, број ефективних алела, Шенонов индекс, запажену и очекивану хетерозиготност указујући на већу дивергентност испитиваних инбред линије BSSS групе у односу на инбред линије Lancaster хетеротичне групе (тaб. 8). Табела 8. Просечан број алела (Na), број ефективних алела (Ne), Шенонов индекс (I), запажена (Ho), очекивана (He) и непристрасна очекивана хетерозиготност (uhe), коефицијент инбридинга (F) две групе инбред линија кукуруза Популација Na Ne I Ho He uhe F Lancaster 6,278 3,252 1,315 0,001 0,652 0,659 0,999 BSSS 7,167 3,755 1,473 0,002 0,697 0,705 0,996 Резултати анализе молекуларне варијансе показали су да је унутарпопулациона варијабилност много већа од варијабилности између популација. Само 1% укупне варијансе објашњено је варијабилношћу између инбред линија које припадају двема групама, док је 99% варијансе резултат варијансе у оквиру сваке популације понаособ (таб. 9). Генетичко растојање између две популације према Неи износило је 0,59. Taбела 9. Молекуларне анализа варијансе (AMOVA) Извор варијације Степен слободе Сума квадрата Средина квадрата Процењена варијанса Између популација 1 33,259 33,259 0,087 1% Између јединки ,653 24,901 12,437 99% Унутар јединки 96 2,500 0,026 0,026 0% Укупно ,411 12,442 12, % % објашњене варијансе 75

84 Вредности коефицијента инбридинга (Fis) јединке у односу на потпопулацију (групу) 0,998 и фиксационог индекса (Fst) 0,07, добијени из процењених варијанси између популација, унутар индивидуа, између индивидуа и укупне варијансе, указују да је диференцијација између група мала, односно да је варијабилност између инбред линије много већа него између група које оне формирају. Већи укупан број детектованих алела и просечан број алела по локусу, очекивана хетерозиготност, PIC вредност, већи број специфичних алела код BSSS линија у односу на Lancaster групу указују на велики диверзитет ове BSSS групе, као и њихов значај у оплемењивачким програмима. Велики диверзитет BSSS хетеротичне групе, односно Reid Yellow Dent популације из које је BSSS група настала, описан је раније (Smith at al. 1985). Lu and Bernardo (2001) су испитивајући 32 историјски најзначајније инбред линије са 83 SSR маркера утврдили да је диверзитет BSSS линија (B14, B37, B73 и B84) мањи него код линија које нису BSSS основе (Mo17, C103, Oh43 и H99). Више од трећине утврђених алела било је карактеристично за само једну групу, BSSS или Lancaster. Сматра се да су се у процесу селекције на принос фреквенције алела великог броја локуса две најзначајније хетеротичне групе мењале у супротном смеру, при чему се повећавала генетичка дистанца између њих (Cooper et al. 2009). Yang et al. (2010) су утврдили 30% алела само код једне од две групе линија добијених применом STRUCTURE, док је чак 21% алела утврђено код појединачних линија. Aутори сматрају да алели специфични за линије настају услед вештачке селекције и генетичког дрифта и могу бити извор пожељних гена и генетичке варијабилности потребне за даље оплемењивање кукуруза и анализу квантитативних особина. Сличан закључак наводе и Feng et al. (2006) сматрајући да су хетеротичне групе са јединственим комбинацијама алела веће фреквенције последица селекције. Emrich et al. (2007) су утврдили велики број тандем дупликација у геному кукуруза укључујући и неке које су присутне само у појединим инбред линијама, док су резултати другог истраживања показали да је 11% свих генских фрагмената јединствено за сваку инбред линију (Morgante et al. 2005). Buckler et al. (2006) наводе да је чак више од једне трећине гена или фрагмената гена специфично за појединачну инбред линију. Занимљиво је истаћи да је већина анализираних алела која је била својствена само једној групи имала ниске фреквенције. Значај ретких алела са великим ефектом 76

85 у процесу селекције кукуруза истакнут је у недавном истраживању (van Haarwaarden еt аl. 2012). Већа варијабилност између самих инбред линија него између група које оне формирају указује да је генетички диверзитет већи на нивоу гена, него на нивоу популације испитиваних инбред линија, као и да је генетички диверзитет већи унутар хетеротичних група, него између њих. На овакву расподелу варијансе утицао је испитивани генетички материјал, који је изабран тако да обухвати што већи број генетички дивергентних линија из различитих оплемењивачких програма. Резултати су у сагласности са истраживањем Yang et al. (2010), који су утврдили да је у оквиру мапирајућег панела од 155 фенотипских и генотипских дивергентних инбред линија само 6% укупне генетичке варијансе објашњено варијабилношћу између група. 6.6 Гаметска неравнотежа између SSR маркера кукуруза Постојање гаметске неравнотеже између парова микросателитиских маркера је испитано међу свим линијама и двема групама. Статистички значајна разлика на нивоу 0,01 утврђена је између 60,3% свих парова маркера. Од укупног броја свих парова маркера на истом хромозому просечно 70,2% било је у гаметској неравнотежи (тaб. 10). У оквиру Lancaster групе утврђено је 120 парова маркера (19%) који су били у гаметској неравнотежи, a oд укупног броја свих парова маркера на истим хромозомима просечно 39,2% је било у гаметској неравнотежи. У односу на Lancaster групу, код BSSS групе је установљен мањи број (56) парова маркера који су били у гаметској неравнотежи на нивоу значајности 0,01, око 9% свих анализираних парова. Просечно 22% парова SSR маркера на истим хромозомима у BSSS групи је било у гаметској неравнотежи. Проценат везаних парова маркера у гаметској неравнотежи у односу на укупан број везаних гена, варирао је међу хромозомима и групама кукуруза. У Lancaster групи већи проценат везаних гена је утицао на гаметску неравнотежу, него у BSSS групи. 77

86 Табела 10. Проценат везаних микросателитских парова у гаметској неравнотежи (<0.01) у укупном узорку и групама кукуруза Хромозом Укупно Lancaster BSSS 1 83,3 66,7 16, ,0 66,7 33,3 3 75,0 75,0 50,0 4 60,0 0,0 20,0 5 83,3 33,3 16,7 6 66,7 33,3 33,3 7 33,3 33,3 33,3 8 66,7 66,7 16,7 9 33,3 16,7 0, ,0 0,0 0,0 Просек 70,2 39,2 22,0 Параметри гаметске неравнотеже, коефицијент гаметске неравнотеже D, коефицијент корелације r 2 и вероватноћа гаметске неравнотеже p представљени су топлотним картама за свих 36 маркера, граф 16. и.17. Коефицијенти корелације између парова алела полиморфних локуса су мали код већине маркера (r 2 =0,0-0,4). Највећи коефицијенти корелације утврђени су код парова: bnlg1209 и bnlg125, bnlg1729 и bnlg1237, bnlg1792 и phi034, bnlg1237 и phi034, са вредностима од 0,3 до 0,4 (граф. 16) Од ових парова, само се маркери bnlg1792 и phi034 налазе на истом хромозому, указујући на утицај епистазе и селекције на заједничко преношење одређених комбинација алела локуса на различитим хромозомима у наредне генерације, односно стварање гаметске неравнотеже. 78

87 Графикон 16. Toплотна карта корелација алелних фреквенција између два локуса - r 2 (изнад дијагонале) и значајности веза ових корелација - p вредност (испод дијагонале) Коефицијент гаметске неравнотеже између парова полиморфних локуса кретао се од 0,18 до 0,89. Више од половине парова маркера имало је вредност коефицијента преко 0,5, тј. 50% од највеће теоријске вредности гаметске неравнотеже. Највећи коефицијенти гаметске неравнотеже утврђени су код парова: bnlg1792 и phi034, bnlg1209 и bnlg125, и bnlg666 и bnlg162, са преко 80% од теоријски највеће вредности гаметске неравнотеже (граф. 17). Маркери bnlg1792 и phi034 су везани и налазе се заједно на хромозому 7, bnlg666 и bnlg162 на хромозому 8, док се bnlg1209 и bnlg125 налазе на различити хромозомима, 9 и 2, редом. 79

88 Графикон 17. Toплотна карта стандардизованих коефицијената неравнотеже између два локуса - D' (изнад дијагонале) и p - вредности вероватноћа гаметске неравнотеже (испод дијагонале) У табели 11. издвојен je 31 пар SSR маркера који се налазе на истом хромозому и у гаметској неравнотежи за ниво значајности p<0,01. Вредности стандардизованих коефицијената неравнотеже кретале су се од 0,40 до 0,89, док је корелација између фреквенција алела код већине парова маркера била мања од 0,1, oсим код парова маркера: bnlg125 и bnlg1520, umc1221 и bnlg1237, phi034 и bnlg1792, bnlg666 и bnlg162, phi059 и umc2003 код којих је утврђен нешто већи ниво гаметске неравнотеже. Коефицијент корелације између фреквенција парова алела кретао се од 0,0185 дo 0,