ΙΝΑ Ν Ρ Α Ι Ρ Ο Ε Τ Ε Α Τ Ι Α ΡΕ Ρ Ι Ε ΑΣ Α ΜΕΛ Ε Ε Λ Τ Ε Η Τ Σ ΜΙΚΡΟ Ρ ΒΙ Β ΟΛ Ο Ο Λ ΓΙ Γ ΚΗΣ Π ΟΙΟΤΗ Τ ΤΑ Τ Σ Α Υ Υ Α Τ Α Ω Τ Ν

Transcript

1 ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΕΤΑΙΡΕΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Υ ΑΤΩΝ 9-11 ΝΟΕΜΒΡΙΟΥ 2009, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ, ΡΙΟ «ΧΡΗΣΗ ΧΡΩΜΟΓΟΝΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΝΕΡΟΥ» ρ. ΓΕΩΡΓΙΑ ΒΑΣΙΛΑΝΤΩΝΟΠΟΥΛΟΥ ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ 2009

2 Τι άλλο θα µπορούσε να ανιχνευθεί στο νερό;

3 Τι µπορεί να ανιχνευθεί σε µια σταγόνα νερού;

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗΣ ΣΕΜΙΝΑΡΙΟΥ Τι είναι τα χρωµογόνα και φθορογόνα υλικά;ποια είναι η ανάγκη χρησιµοποίησης τους; Ποιος είναι ο βιοχηµικός τους µηχανισµός; Ποιο είναι το πεδίο εφαρµογής τους; Ποια είναι τα πλεονεκτήµατα της χρήσης χρωµογόνων / φθορογόνων υλικών; Παρουσίαση χρωµογόνων / φθορογόνων υλικών και µικροοργανισµών, για την ανίχνευση των οποίων χρησιµοποιούνται. Φύση δειγµάτων που αναλύονται µε χρωµογόνα / φθορογόνα υλικά. Βασικές αρχές ανάλυσης µικροβιολογικών παραµέτρων µε χρωµογόνα / φθορογόνα υλικά. Ιδιαιτερότητες χρήσης χρωµογόνων / φθορογόνων υλικών. Πληροφορίες από την βιβλιογραφία για τον τρόπο χρήσης και την απόδοση των χρωµογόνων / φθορογόνων υλικών. Χρήση των χρωµογόνων / φθορογόνων υλικών για την ανίχνευση ολικών κολοβακτηριοειδών και στελεχών Escherichia coli, στελεχών Salmonella, στελεχών Clostridium perfringens στο µικροβιολογικό εργαστήριο της Υπηρεσίας Ελέγχου Ποιότητας Ύδατος της Ε.Υ.Α.Π.

5 Η µικροβιολογική ανάλυση της ποιότητας του νερού βασίζεται στην καλλιέργεια βακτηρίων σε θρεπτικά υποστρώµατα

6 ΧΡΩΜΟΓΟΝΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Ολικά κολοβακτηριοειδήκαι και στελέχη Escherichia coli: o- phenyl-β-d-galactopyranoside (ONPG) p-nitro-phenyl-β-d-galactopyranoside (PNPG) 4- methylumbelliferyl-β-d-galactopyranoside (MUGal) 5-bromo-4 chloro- 3 indoxyl-β-d-galactopyranoside (X-Gal) 4- methylumbelliferyl-β-d-glucuronide (MUG) indoxyl-β-d-glucuronide (IBDG) 5-bromo-4 chloro- 3 indoxyl-β-d-glucuronide (X-Glu) Στελέχη Salmonella: 4- methylumbelliferyl-caprylate (MUCAP) 3,4 cyclohexenoesculetin-β-d-galactoside 5-bromo-4 chloro- 3 indoxyl-β-d-galactopyranoside Ανίχνευση κόκκων: 5-bromo-4 chloro- 3 indoxyl-α-d-galactopyranoside 4- methylumbelliferyl-α-d-galactopyranoside

7 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΧΡΗΣΗΣ ΧΡΩΜΟΓΟΝΩΝ / ΦΘΟΡΟΓΟΝΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ Εξοικονόµηση χρόνου (ταχύτερη διεξαγωγή αποτελέσµατος) Μεγαλύτερη ευαισθησία (ευαίσθητες βιοχηµικές αντιδράσεις) Εξοικονόµηση υλικών και σκευών (ελαχιστοποίηση επιβεβαιωτικών ανακαλλιεργειών) Μεγάλη διακριτική ικανότητα από τους µη-στόχους µικροοργανισµούς Ευνοϊκή ανάπτυξη τραυµατισµένων µειωµένης ζωτικότητας µικροοργανισµών Μικρότερος κόπος αναλυτή

8 ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΡΑΣΗΣ Λακτόζη lac Z γονίδιο lac Y γονίδιο β-galactosidase β-galactosidase permease Γαλακτόζη + Γλυκόζη

9 ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΡΑΣΗΣ 4- methylumbelliferyl-β-d-glucuronide (MUG) (άχρωµο) Η 2 Ο + β-d-glucuronidase uid A γονίδιο Glucuronic acid 4-methylumbelliferon (άχρωµο) (φθορίζον)

10 ΑΛΛΕΣ ΜΕΘΟ ΟΙ ΧΡΗΣΗΣ ΧΡΩΜΟΓΟΝΩΝ / ΦΘΟΡΟΓΟΝΩΝ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΗΣ ΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ Προσθήκη σε καλλιεργητικά υλικά µικροβιολογικής ανάλυσης. PCR (ανίχνευση γονιδίων lac Zκαι lac Y και uida). ELISA (ανοσολογικά ταχέα tests). Solid phase cytometry Σπεκτροφθοροµετρία (GLUase assay, GALase assay). CHEMISCAN RDI. COLIFAST.

11 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ / ΧΡΩΜΟΓΟΝΑ ΦΘΟΡΟΓΟΝΑ ΥΛΙΚΑ Ολικά κολοβακτηριοειδή και στελέχη Escherichia coli: Colilert/18 (Indexx), Chromocult Coliform agar CCA (Merck), LMX (Merck), mx-gal medium, CCCFS (Merck), CHROMagar ECC, CHROMagar + pyruvate CECCP, ONPG-MUG test, Colisure test(indexx), m- Coliblue 24 test (Hach Co.), E* Colite TM test (Charm Sciences, Inc), Readycult Coliforms 100 P/A test (Merck), Harlequin TBGA (LabM), Harlequin E.coli/coliforms medium (LabM), m-lactose Glucuronide agar m-lga (Oxoid), TBX (Oxoid), MI agar, CHROMagar E.coli, Coli ID (Biomerieux), Fluorocult Brila broth (Merck), Fluorocult DEN lactose peptone broth (Merck), Fluorocult ECD agar (Merck), Fluorocult SB (Merck), Fluorocult MacConkey agar (Merck), Fluorocult VRB agar (Merck). Στελέχη Listeria: ΑLOA, RAPID L monocytogenes. Στελέχη Escherichia coli O157:H7 : MacConkey sorbitol agar+bcig, Rainbow agar O157, Fluorocult O157 agar (Merck). Στελέχη Salmonella: ABC Salmonella (Oxoid), CHROMagar Salmonella medium (BBL), Harlequin ABC Salmonella (labm), Chromogenic Salmonella Esterase CSE agar, Rambach agar, Salmonella Detection and Identification medium (Biomerieux), Hi-Chrome Salmonella medium (Fluka). Στελέχη Clostridium perfringens: TSC-supplement Fluorocult (Merck), m-cp medium + SR188 (Oxoid) Στελέχη Staphylococcus aureus: CHROMagar staph aureus (BBL) Παθογόνοι µικρ/ισµοί σε δείγµα ούρων: CPS ID2 (Biomerieux), CHROMagar orientation medium, Uriselect3 medium (Sanofi Diagnostics Pasteur), Rainbow agar UTImediun (Biolog), Chromogenic UTI medium (Oxoid).

12 ΠΕ ΙΟ ΧΡΗΣΗΣ ΧΡΩΜΟΓΟΝΩΝ ΦΘΟΡΟΓΟΝΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Έλεγχος ποιότητας πόσιµου νερού. Έλεγχος ποιότητας επιφανειακού νερού. Έλεγχος ποιότητας θαλάσσιου νερού. Έλεγχος ποιότητας εµφιαλωµένου νερού. Έλεγχος ποιότητας νερού από επεξεργασία λυµάτων. Έλεγχος ποιότητας γάλακτος και γαλακτοκοµικών. Έλεγχος ποιότητας κρέατος. Έλεγχος ποιότητας έτοιµου φαγητού. Έλεγχος µικροοργανισµών εδάφους. Έλεγχος παθογόνων µικροοργανισµών σε κόπρανα. Έλεγχος παθογόνων µικροοργανισµών σε ούρα.

13 ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΝΕΡΟΥ ΜΕ ΧΡΩMΟΓΟΝΑ-ΦΘΟΡΟΓΟΝΑ ΥΛΙΚΑ Παρά την εκλεκτικότητα των θρεπτικών υλικών, υφίστανται τα ψευδώς (+) για την ανίχνευση β-γαλακτοσιδάσης και β-γλυκουρονιδάσηςαποτελέσµατα Η Η επιλογή της βέλτιστης θερµοκρασίας επώασης του υλικού. Η Η επιλογή του βέλτιστου χρόνου επώασης του υλικού. Η Η εκτίµηση του χρωµατισµού αποικιών που αναπτύσσονται σε χρωµογόνα υλικά. Παρά την εκλεκτικότητα των θρεπτικών υλικών, υφίστανται τα ψευδώς (-) για την ανίχνευση β-γλυκουρονιδάσηςαποτελέσµατα σε φθορογόναυλικά. Ο Ο φυσικός φθορισµός των αποικιών Ψευδοµονάδας. Οι απαραίτητες επιβεβαιώσεις µε βιοχηµικά τεστ. Η Η ιδιαιτερότητα της φύσης του δείγµατος νερού, που αναλύουµε.

14 ΜΙΚΡΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΠΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΝΟΝΤΑΙ ΑΠΌ ΧΡΩΜΟΓΟΝΑ - ΦΘΟΡΟΓΟΝΑ ΥΛΙΚΑ ( β- GALACTOSIDASE ΘΕΤΙΚΑ) Aeromonas hydrophila/caviae Alcaligenes species Enterobacter clocae Enterobacter sakazakii Pantoea (enterobacter agglomerans) Erwinia nigrifluens Escherichia coli Escherichia vulneris Hafnia alvei Serratia liquefaciens Serratia plymuthica Serratia rubidaea Shewanella putreficiens Staphylococus species Tatumella ptyseos Vibrio fluvialis Stenotrophonomas maltophila Yersinia enterocolitica Yersinia frederiksenii Yersinia kristensenii Serratia fonticola Rahnella aquatilis Pseudomonas species Leclercia adecarboxylata

15 GRAM-ΑΡΝΗΤΙΚΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΜΕ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ β-d-glucuronidase ΕΙ ΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΓΙΑ β-gluase ΠΟΣΟΣΤΟ % Citrobacter 4/193 2 Edwardsiella 0/7 0 Enterobacter 1/ Escherichia 2252/ Hafnia 0/111 0 Klebsiella 3/ Proteus 0/854 0 Salmonella 277/ Arizona 29/69 42 Serratia 3/ Shigella 367/ Yersinia 6/ Pseudomonas 2/ Aeromonas 0/135 0 Vibrio 0/70 0 Erwinia 0/14 0 Alcaligenes 0/2 0 Acinetobacter 0/2 0 Moxarella 0/1 0

16 ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ESCHERICHIA COLI ΕΙ ΟΣ INDOLE ΠΟΣΟΣΤΑ ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΤΙ ΡΑΣΕΩΝ MR VP CITRATE LACTOSE GAS FROM LACTOSE H2S KCN β-gluase E.adecarboxylata >90 >90 0 <10 >90 >95 <10 >90 (-) E. blattae ? E. coli (+) E.coli ανενεργή (+) E. fergusonii (-) E. hermanii (-) E. vulneris (-)

17 Φωτογραφία ηλεκτρονικού µικροσκοπίου Escherichia coli

18 ΤΟ Υ ΡΕΥΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΗΣ ΑΘΗΝΑΣ

19 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΥΛΙΚΩΝ ΣΕ ΕΙΓΜΑΤΑ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΟΥ ΝΕΡΟΥ ΜΕΘΟ ΟΙ / ΥΛΙΚΑ ΟΛΙΚΑ ΚΟΛ/ΕΙ Η (n=120) Νo (%) ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΘΕΤΙΚΩΝ ΓΙΑ ΣΤΕΛΕΧΗ E.coli (n=120) LSB broth (35 o C/ 48hrs) 120 (100%) 96 (80%) Colilert (35 o C/ 48hrs) 100 (83.3%) 99 (82.5%) M-ENDO LES agar (35 o C/ 24hrs) 120 (100%) 95 (79%) Tergitol 7 agar (35 o C/ 24hrs) 120 (100%) 112 (93.7%) CCA agar (35 o C/ 24hrs) 120 (100%) 114 (95%) m-fc agar (35 o C/ 48hrs) 111 (92.5%)

20 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΥΛΙΚΩΝ ΣΕ ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ ΜΕΘΟ ΟΙ / ΥΛΙΚΑ ΟΛΙΚΑ ΚΟΛ/ΕΙ Η (n=120) Νo (%) ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΘΕΤΙΚΩΝ ΓΙΑ ΣΤΕΛΕΧΗ E.coli (n=120) LSB broth (35 o C/ 48hrs) 3 (2,2%) 3 (2,2%) Colilert (35 o C/ 48hrs) 21 (17,8%) 31 (26%) M-ENDO LES agar (35 o C/ 24hrs) 36 (30 30%) 30 (25 25%) Tergitol 7 agar (35 o C/ 24hrs) 60 (50%) 42 (35%) CCA agar (35 o C/ 24hrs) 79 (66%) 50 (42%) m-fc agar (35 o C/ 48hrs) 24 (20%)

21 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΥΛΙΚΩΝ ΣΕ ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ ΜΕΘΟ ΟΙ / ΥΛΙΚΑ ΟΛΙΚΑ ΚΟΛ/ΕΙ Η Νo ΑΠΟΙΚΙΩΝ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΘΕΤΙΚΩΝ ΓΙΑ ΣΤΕΛΕΧΗ E.coli µέση τιµή S.D. ελάχιστη τιµή µέγιστη τιµή µέση τιµή S.D. ελάχιστη τιµή µέγιστη τιµή LSB broth (35 o C/ 48hrs) Colilert (35 o C/ 48hrs) M-Endo Les agar (35 o C/ 24hrs) Tergitol 7 agar (35 o C/ 24hrs) CCA agar (35 o C/ 24hrs) m-fc agar (35 o C/ 48hrs)

22 Φωτογραφία από τρυβλίο petri µε αποικίες κολοβακτηριοειδώνµε CCA άγαρ

23 Φωτογραφία από τρυβλίο petriµε αποικίες κολοβακτηριοειδώνµε CCA άγαρ

24 Φωτογραφία από τρυβλίο petri µε αποικίες κολοβακτηριοειδώνµε CCA άγαρ

25 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΥΛΙΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΣΑΛΜΟΝΕΛΛΑΣ ΜΕΘΟ ΟΣ ΚΛΑΣΣΙΚΗ: Φιλτράρισµα σε µεµβράνες νιτρικής κυτταρίνης δείγµατος επιφανειακού νερού όγκου πέντε (5) λίτρων, επώαση στους 35 ο C/24 hrs σε Bacto peptone, µετεµβολιασµός σε Rappaport Vassiliadis broth και Selenite Cystine enrichment broth, επώαση στους 35 ο C/24 hrs, επίστρωση τρυβλίων µε Brilliant Green agar (modified) και S.S. agar (modified), επώαση στους 35 ο C/24 hrs, µετεµβολιασµός ύποπτων αποικιών σε Klinger Iron agar, ορολογική ταυτοποίηση µε αντιoρούς H και Ο, και βιοχηµικό τεστ ΑPI20E, ορολογική ταυτοποίηση µε αντιορούς από το Κέντρο Αναφοράς Σαλµονέλας Σιγκέλας (ΕΣ Υ). ΜΕΘΟ ΟΣ ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ HARLEQUIN SALMONELLA ABC MEDIUM: Φιλτράρισµα σε µεµβράνες νιτρικής κυτταρίνης δείγµατος επιφανειακού νερού όγκου πέντε (5) λίτρων, επώαση στους 35 ο C/24 hrs σε Bacto peptone, µετεµβολιασµός σε Rappaport Vassiliadis broth και Selenite Cystine enrichment broth, επώαση στους 35 ο C/24 hrs, επίστρωση τρυβλίων µε Harlequin Salmonella ABC medium (labm), επώαση στους 35 ο C/24 hrs, µετεµβολιασµός ύποπτων αποικιών σε Klinger Iron agar, ορολογική ταυτοποίηση µε αντιoρούς H και Ο, και βιοχηµικό τεστ ΑPI20E, ορολογική ταυτοποίηση µε αντιορούς από το Κέντρο Αναφοράς Σαλµονέλας Σιγκέλας (ΕΣ Υ). ΜΕΘΟ ΟΣ ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ ABC SALMONELLA : Φιλτράρισµα σε µεµβράνες νιτρικής κυτταρίνης δείγµατος επιφανειακού νερού όγκου πέντε (5) λίτρων, επώαση στους 35 ο C/24 hrs σε Bacto peptone, µετεµβολιασµός σε Rappaport Vassiliadis broth και Selenite Cystine enrichment broth, επώαση στους 35 ο C/24 hrs, επίστρωση τρυβλίων µε ABC Salmonella (Oxoid), επώαση στους 35 ο C/24 hrs, µετεµβολιασµός ύποπτων αποικιών σε Klinger Iron agar, ορολογική ταυτοποίηση µε αντιoρούς H και Ο, και βιοχηµικό τεστ ΑPI20E, ορολογική ταυτοποίηση µε αντιορούς από το Κέντρο Αναφοράς Σαλµονέλας Σιγκέλας (ΕΣ Υ). ΜΕΘΟ ΟΣ ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ HI-CHROME SALMONELLA MEDIUM: Φιλτράρισµα σε µεµβράνες νιτρικής κυτταρίνης δείγµατος επιφανειακού νερού όγκου πέντε (5) λίτρων, επώαση στους 35 ο C/24 hrs σε Bacto peptone, µετεµβολιασµός σε Rappaport Vassiliadis broth και Selenite Cystine enrichment broth, επώαση στους 35 ο C/24 hrs, επίστρωση τρυβλίων µεhi-chrome Salmonella medium (Fluka), επώαση στους 35 ο C/24 hrs, µετεµβολιασµός ύποπτων αποικιών σε Klinger Iron agar, ορολογική ταυτοποίηση µε αντιoρούς H και Ο, και βιοχηµικό τεστ ΑPI20E, ορολογική ταυτοποίηση µε αντιορούς από το Κέντρο Αναφοράς Σαλµονέλας Σιγκέλας (ΕΣ Υ).

26 Φωτογραφία τρυβλίου Petri µε αποικίες κολοβακτηριοειδών και Σαλµονέλας

27 Μικτή καλλιέργεια Σαλµονέλας/ κολοβακτηριοειδών σε τρυβλίο Harlequin Salmonella ABC agar (LabM)

28 Μικτή καλλιέργεια Σαλµονέλας κολοβακτηριοειδών σε τρυβλίο ABC Salmonella agar (Oxoid)

29 Μικτή καλλιέργεια Σαλµονέλας κολοβακτηριοειδών σε τρυβλίο Harlequin Salmonella ABC agar (LabM)

30 καλλιέργεια Σαλµονέλας σε τρυβλίο Hi-Chrome Salmonella agar (Fluka)

31 καλλιέργεια Σαλµονέλας σε τρυβλίο Hi-Chrome Salmonella agar (Fluka)

32 Μικτή καλλιέργεια Σαλµονέλας / κολοβακτηριοειδών σε τρυβλίο ABC Salmonella agar (Oxoid)

33 Μικτή καλλιέργεια Σαλµονέλας κολοβακτηριοειδών σε τρυβλίο Harlequin Salmonella ABC agar (LabM)

34 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΥΛΙΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ΜΕΘΟ ΟΣ ΚΛΑΣΣΙΚΗ: Φιλτράρισµα σε µεµβράνες νιτρικής κυτταρίνης δείγµατος νερού όγκου εκατό (100) µικρόλιτρων, επώαση στους 35 ο C/48 hrs σε TSC + SR088E, υπό αναερόβιες συνθήκες καταµέτρηση µαύρων αποικιών και βιοχηµικό τεστ ΑPI20Α. ΜΕΘΟ ΟΣ ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ m-cp AGAR + SR188: Φιλτράρισµα σε µεµβράνες νιτρικής κυτταρίνης δείγµατος νερού όγκου εκατό (100) µικρόλιτρων, επώαση στους 44 ο C/24 hrs σε m-cp agar + SR188, υπό αναερόβιες συνθήκες καταµέτρηση αποικιών και έκθεση σε ατµούς ΝΗ4ΟΗ, καταµέτρηση αποικιών µε ροζ/κόκκινη απόχρωση, και βιοχηµικό τεστ ΑPI20Α.

35 ιήθηση,επώαση και αρίθµηση ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Το m-clostridium Perfringens (m-cp) medium (CM992 & SR188) είναι ένα εκλεκτικό και χρωµογόνο θρεπτικό υλικό για την τυπική ταυτοποίηση του Clostridium perfringensσε δείγµατα νερού. Ηέλλειψη ενεργότητας β-d-γλυκοσιδάσης (ένα ένζυµο που συµµετέχει στη ζύµωση της γλυκόζης), η ζύµωση της σακχαρόζης και η παρουσία όξινης φωσφατάσης, χρησιµοποιούνται για τη διαφοροποίηση τυπικών αποικιών Cl. perfringensαπό άλλα είδη Clostridium. Η έλλειψη ενεργότητας της β-d-γαλακτοσιδάσης σηµαίνει, πως το Cl. perfringens δεν διασπά τοχρωµογόνο, το indoxyl-β-d-glucoside, στο θρεπτικό υλικό. Επιπλέον, καθώς οι οργανισµοί διασπούν τη σακχαρόζη στο θρεπτικό µέσο, µειώνοντας το ph, ο δείκτης ιώδες της βρωµοκρεσόλης (bromocresol purple) αλλάζει από ιώδες σε κίτρινο. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα, χαρακτηριστικές σκούρες κίτρινες αποικίες του Cl. perfringens. Η πλειοψηφία των υπολοίπων ειδών Clostridium εµφανίζονται είτε ωςµωβ αποικίες, λόγω της έλλειψης ζύµωσης της σακχαρόζης, είτε ως µπλε/ πράσινες αποικίες, όπου ο οργανισµός συνεχίζει να διασπά indoxyl-β-d-glucoside και σακχαρόζη.

36 Επιβεβαίωση Οι τυπικά θετικές αποικίες (ύποπτες) του Cl. perfringens µπορούν να εξεταστούν περαιτέρω για την ενεργότητα όξινης φωσφατάσης µε έκθεση σε ατµούς NH 4 OH (υδροξειδίουτου τουαµµωνίου) αµµωνίου)για δευτερόλεπτα. Οιαποικίες Cl. perfringens µετατρέπονται από κίτρινες σε κόκκινες, καθώς η διφωσφορική φαινολοφθαλεΐνη διασπάται από την όξινη φωσφατάση. Σε αποικίες, που δεν διαθέτουν όξινη φωσφατάση, δεν παρατηρείται καµία αλλαγή χρώµατος. Η διεξαγωγή αυτού του επιπλέον τεστ είναι σηµαντική, καθώς υπάρχει ένας πολύ µικρός αριθµός µη-cl. perfringens κλωστριδίων, πουπαράγουν κίτρινες αποικίες. Αυτές οι αποικίες, ωστόσο, παραµένουν κίτρινες µετά την έκθεση σε υδροξείδιο του αµµωνίου,καθώς είναι όξινηςφωσφατάσης-αρνητικές αρνητικές.

37 Χρησιµοποιούµενα αντιδραστήρια

38 ιαδικασία επιβεβαίωσης: έκθεση σε ατµούς υδροξειδίου του αµµωνίου για δευτερόλεπτα

39 Φωτογραφία αποικιών Clostridium perfringens µετά την επώαση

40 Φωτογραφία αποικιών Clostridium perfringens µετά την έκθεση σε ατµούς ΝΗ 4 ΟΗ

41 Φωτογραφία αποικιών Clostridium perfringens πριν και µετά την έκθεση σε ατµούς ΝΗ 4 ΟΗ