INSTRUMENTALNA FARMACEVTSKA ANALIZA

Transcript

1 INSTRUMENTALNA FARMACEVTSKA ANALIZA Vaje in seminarji Nace Zidar, Rok Frlan, Janez Mravljak, Simon Žakelj, Jurij Trontelj, Zoran Lavrič ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA

2

3 KAZALO 1. NMR-SPEKTROSKOPIJA... 1 Vaja: Uporaba NMR-spektroskopije za določanje struktur spojin IR-SPEKTROSKOPIJA Vaja: Uporaba IR-spektroskopije za določanje struktur spojin in za analizo fizikalnokemijskih lastnosti vzorcev EPR-SPEKTROSKOPIJA Vaja: Analiza izbranih radikalov s pomočjo EPR-spektroskopije MASNA SPEKTROMETRIJA Vaja: Uporaba masne spektrometrije za določanje struktur spojin POLARIMETRIJA Vaja: Določanje optične sučnosti izbranih vzorcev TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI Vaja: Dejavniki, ki vplivajo na HPLC-ločbo, in parametri, s katerimi jo opišemo TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI Vaja: Validacija analizne metode HPLC in kvantitativno določanje PLINSKA KROMATOGRAFIJA Vaja: Priprava biološkega vzorca in analiza s plinsko kromatografijo TERMIČNA ANALIZA Vaja: Določanje temperature tališč, polimorfizma in dehidracije z diferenčno dinamično kalorimetrijo (DSC)... 93

4

5 1. NMR-SPEKTROSKOPIJA Vaja: Uporaba NMR-spektroskopije za določanje struktur spojin CILJI VAJE Spoznati teoretične osnove tehnike jedrske magnetne resonance Naučiti se interpretacije NMR-spektrov S pomočjo NMR-spektrov določiti strukture izbranih organskih spojin Spoznati osnovne dele NMR-spektrometra Spoznati način priprave vzorcev in snemanje NMR-spektrov UVOD Jedrska magnetna resonanca (angl. nuclear magnetic resonance, NMR) je pojav, ki izkorišča magnetne lastnosti nekaterih atomskih jeder in temelji na dejstvu, da lahko ta jedra v močnem zunanjem magnetnem polju absorbirajo elektromagnetno valovanje. S pomočjo NMRspektroskopije lahko proučujemo fizikalne in kemijske lastnosti atomov in molekul. NMRspektroskopija je ena izmed najpomembnejših metod za proučevanje strukturnih in dinamičnih lastnosti spojin in je primerna tako za analizo manjših organskih molekul, kot za analizo večjih molekul kot so peptidi, proteini in nukleinske kisline. Atomska jedra imajo pozitivni naboj, nekatera jedra pa imajo poleg tega tudi lastnost imenovano spin, zaradi katere se vedejo kot da bi se vrtela okoli svoje osi. Ta lastnost je značilna za atomska jedra, ki imajo liho masno število, liho atomsko število ali liho masno in atomsko število, torej za jedra, katerih spinsko kvantno število, I, ni enako nič (I 0). Vsi vrteči se delci imajo vztrajnostni moment, ker imajo atomska jedra naboj pa se z vrtenjem ustvari tudi magnetni moment, µ, s čemer dobijo jedra magnetne lastnosti. Najpogostejša jedra, ki imajo spin in jih zato lahko proučujemo z NMR-spektroskopijo, so jedra 1 H, 2 H, 13 C, 14 N in 19 F. Za ta jedra je značilno, da obstajajo v več različnih spinskih stanjih. Število dovoljenih spinskih stanj, ki jih določeno jedro lahko zasede je kvantizirano in se izračuna po enačbi 2I + 1, kjer je I konstanta značilna za določeno jedro. V odsotnosti zunanjega magnetnega polja imajo vsa spinska stanja enako energijo (so degenerirana), če pa atomsko jedro postavimo v magnetno polje, zasedejo posamezna spinska stanja različne energijske nivoje. Jedro vodika ali proton s spinskim številom I = ½ lahko v magnetnem polju zasede dve energijski stanji stanje z nižjo 1

6 energijo (stanje s spinom +½, α stanje), kjer je magnetni moment jedra usmerjen v smeri zunanjega polja, ali stanje z višjo energijo (stanje s spinom -½, β stanje), kjer je magnetni moment jedra usmerjen nasproti smeri zunanjega polja. Obe stanji sta približno enako zasedeni približno 50 odstotkov jeder je v enem in 50 odstotkov drugem stanju z zelo majhnim presežkom jeder z nižjo energijo. Energijska razlika med stanjema je v področju energij radiofrekvenčnega elektromagnetnega valovanja. Pri NMR-spektroskopiji s pomočjo radiofrekvenčnega elektromagnetnega valovanja vzbujamo prehode med jedri v nižjem in jedri v višjem energijskem stanju, pri čemer vzorec absorbira del energije (Slika 1). Slika 1. Energijska razlika med dvema spinskima stanjema protona v magnetnem polju B 0. Z odebeljeno puščico je prikazana smer polja B 0. Točna energija, ki je potrebna za prehod jedra iz nižjega v višje energijsko stanje je odvisna od jakosti zunanjega magnetnega polja, B0, in od lastnosti opazovanega jedra ( 1 H, 13 C, 19 F, itd.) oz. njegovega giromagnetnaga razmerja, γ (Enačba 1). = =h Enačba 1. γ = giromagnetno razmerje jedra h = Planckova konstanta ( Js) π = krožna konstanta ( ) B0 = gostota (jakosta) magnetnega polja ν = frekvenca elektromagnetnega valovanja Pri sodobnih inštrumentih, t.i. NMR-spektrometrih s Fourierjevo transformacijo, vzorec v magnetnem polju obsevamo z močnim kratkim pulzom elektromagnetnega valovanja s katerim hkrati vzbudimo vsa jedra v vzorcu. Z detektorsko tuljavo nato zaznamo elektromagnetno valovanje, ki ga jedra izsevajo pri tem, ko se v procesu relaksacije vračajo v svoje osnovno spinsko stanje. Na ta način nastane signal imenovan signal proste precesije (angl. free induction decay, FID), ki vsebuje informacijo o intenziteti emitiranega elektromagnetnega valovanja vseh jeder v preiskovanem vzorcu v odvisnosti od časa. Računalnik NMR-spektrometra nato FID- 2

7 signal s Fourierovo transformacijo pretvori v običajen zapis NMR-spektra, ki prikazuje intenziteto emitiranega elektromagnetnega valovanja v odvisnosti od frekvence (Slika 2). a) b) Slika 2. a) Signal proste precesije (angl. free induction decay, FID); b) Primer 1 H NMR-spektra po računalniški obdelavi signala proste precesije. Mehanizem absorpcije elektromagnetnega valovanja si lahko razložimo s pomočjo analogije z vrtavko. Podobno kot začne vrtavka pod vplivom gravitacije precesirati okoli smeri gravitacijskega polja, začnejo magnetni momenti jeder, če jih postavimo v zunanje magnetno polje, precesirati okoli smeri magnetnega polja (Slika 3). Polovica jeder začne precesirati tako, da je njihov magnetni moment obrnjen v smer, polovica pa nasproti smeri polja B0. Frekvenco precesije imenujemo Larmorjeva frekvenca, njena hitrost pa je premo sorazmerna z jakostjo zunanjega magnetnega polja. Ker imajo jedra naboj, se s precesijo ustvarja oscilirajoče električno polje. Če apliciramo na precesirajoče jedro radiofrekvenčne valove z enako frekvenco kot je frekvenca precesije, pride do interakcije med oscilirajočim električnim poljem, ki ga ustvarja jedro, in električno komponento radiofrekvenčnega elektromagnetnega valovanja. Če imata obe valovanji enako frekvenco je izpolnjen resonančni pogoj in lahko pride do absorpcije energije in obrata spina iz paralelnega položaja (spin +½) v antiparalelni položaj (spin -½). Ko z obsevanjem prenehamo se ponovno vzpostavi osnovno ravnotežno stanje. 3

8 Slika 3. a) Precesija vrtavke okoli smeri gravitacijskega polja; b) Precesija vrtečega jedra pod vplivom zunanjega magnetnega polja B 0. Prirejeno po [1]. Senčenje in kemijski premik Pri NMR-spektroskopiji je ključno dejstvo, da vsa jedra (protoni) v molekuli nimajo enakih resonančnih frekvenc. Če bi vsi protoni v magnetnem polju absorbirali svetlobo enake valovne dolžine, s pomočjo NMR-spektroskopije ne bi dobili pomembnih informacij o strukturi molekule. Vzrok za razlike v resonančnih frekvencah protonov je različna elektronska gostota okrog protonov v različnih kemijskih okolicah. Protoni so v molekulah obdani z elektroni, ki jih ščitijo (senčijo) pred vplivom zunanjega magnetnega polja. Če vzorec postavimo v zunanje magnetno polje pride pod vplivom magnetnega polja do kroženja valenčnih elektronov, krožeči elektroni pa povzročijo nastanek induciranega magnetnega polja, ki je v področju jedra usmerjen nasproti smeri zunanjega magnetnega polja. Efektivno magnetno polje, ki ga zazna jedro, Beff, je zato manjše od zunanjega magnetnega polja B0 (Slika 4). Večja kot je elektronska gostota okrog jedra, večje je inducirano polje, ki nastane zaradi kroženja elektronov in s tem manjše efektivno polje, ki ga zazna jedro. To ima za posledico nižjo frekvenco precesije tega jedra in s tem nižjo frekvenco elektromagnetnega valovanja, ki ga jedro absorbira. Slika 4. Nastanek induciranega magnetnega polja, B ind, zaradi kroženja valenčnih elektronov pod vplivom zunanjega magnetnega polja B 0; B eff, efektivno magnetno polje, ki ga zazna jedro; σ, konstanta zasenčenja. 4

9 Razlike med resonančnimi frekvencami protonov v različnih kemijskih okolicah so v primerjavi z velikostjo osnovne resonančne frekvence protonov zelo majhne. Razlika med, npr., resonančnima frekvencama protonov metilne in metilenske skupine v molekuli etanola (CH3CH2OH) je, če spekter posnamemo na NMR-spektrometru z magnetnim poljem B0 = 9.4 Tesla, približno 1000 Hz. Glede na to, da je na tem spektrometru osnovna resonančna frekvenca protonov približno 400 MHz, predstavlja razlika v frekvencah metilne in metilenske skupine le odstotkov ali 2.5 milijonink (angl. part per million, ppm) osnovne frekvence. Iz tehničnih razlogov se pri NMR-meritvi ne meri absolutnih vrednosti resonančnih frekvenc posameznih protonov, ampak razlike med resonančnimi frekvencami protonov v vzorcu in resonančnimi frekvencami protonov referenčne spojine, ki je dodana raztopini vzorca. Kot referenčna spojina se v NMR-spektroskopiji uporablja tetrametilsilan, (CH3)4Si, imenovan tudi TMS. Razlog za izbor TMS-a kot referenčne spojine je elektropozitivnost silicija, zaradi česar so protoni v TMS-u bolj zasenčeni od protonov večine organskih spojin, njihov signal pa označuje skrajni rob oz. nič v NMR-spektru. Ker je razlika med resonančnimi frekvencami protonov v vzorcu odvisna od vrste NMR-spektrometra na katerem je bil spekter posnet, t.j. od velikosti magnetnega polja pri katerem NMR-spektrometer deluje, je bil z namenom lažje primerjave NMR-spektrov, kot enota na x-osi NMR-spektra uveden parameter imenovan kemijski premik, δ. Kemijski premik je neodvisen od velikosti zunanjega magnetnega polja in omogoča primerjavo med NMR-spektri posnetimi na spektrometrih, ki delujejo pri različnih osnovnih frekvencah. Kemijski premik predstavlja razliko med resonančno frekvenco opazovanega protona in resonančno frekvenco protonov v TMS-u, izraženo v milijoninkah osnovne frekvence spektrometra (Enačba 2). Podaja se v enotah»part per million«(ppm) ali milijontih deležih osnovne frekvence spektrometra. Po definiciji je kemijski premik protonov v TMS-u nič. = v v Enačba 2. δ = kemijski premik v ppm-ih νproton = resonančna frekvenca opazovanega protona v hercih νtms = resonančna frekvenca protonov v TMS-u v hercih ν0 = osnovna frekvenca NMR-spektrometra v megahercih 5

10 Dejavniki, ki vplivajo na kemijski premik Običajne vrednosti kemijskih premikov protonov v 1 H NMR-spektru so v območju med 0 in 15 ppm. Pri analizi NMR-spektrov je pomembno dejstvo, da imajo podobne vrste protonov, t.j. protoni v podobnih kemijskih okolicah, v 1 H NMR-spektru vedno signale s podobnimi kemijskimi premiki. Kemijski premiki protonov enostavnih alifatskih spojin so npr. v področju med 0 in 2 ppm, kemijski premiki protonov na aromatskih sistemih pa v področju okoli 7 in 8 ppm. Iz kemijskih premikov lahko torej sklepamo v kakšnem okolju so protoni in s tem kakšna je struktura preiskovane molekule. Pri analizi NMR-spektra si lahko pomagamo z vrednostmi kemijskih premikov, ki so podane v tabelah (Slika 5). Slika 5. Značilne vrednosti kemijskih premikov protonov v 1 H NMR-spektru. Prirejeno po [1]. Na velikost kemijskih premikov vpliva več dejavnikov. Eden izmed njih je elektronegativnost elementov ali skupin, ki so vezane v bližini opazovanega protona. Večja kot je elektronegativnost sosednjih skupin, manjša je elektronska gostota okrog opazovanega jedra, s tem pa je večji njegov kemijski premik. Kemijski premik protonov v molekuli metana (CH4, δ H = 0.23 ppm) je tako manjši od kemijskega premika protonov v molekuli klorometana (CH3Cl, δ H = 3.1 ppm), ta pa je zaradi večje elekronegativnosti fluora manjši od kemijskega premika protonov v fluorometanu (CH3F, δh = 4.3 ppm). Vpliv elektronegativnosti pada z oddaljenostjo; največji vpliv na kemijski premik imajo skupine, ki so vezane neposredno na opazovani proton in nato skupine, ki so s protonom povezane preko enega ogljikovega atoma. Drugi faktor, ki vpliva na velikost kemijskega premika je vrsta hibridizacije ogljikovega atoma na katerega je proton vezan. Protoni vezani na sp 3 hibridizirane ogljikove atome imajo navadno 6

11 nižji kemijski premik od protonov vezanih na sp 2 hibridizirane ogljikove atome, ti pa nižji kemijski premik od protonov vezanih na sp hibridizirane ogljike. Na kemijski premik protonov vpliva tudi t.i. magnetna anizotropija, ki jo opazimo pri spojinah ki vsebujejo π elektrone. Primer take molekule je molekula benzena. Spojine s π elektroni pod vplivom zunanjega magnetnega polja v svoji neposredni okolici ustvarjajo lastno magnetno polje. Ker nastalo magnetno polje predstavlja krajevno motnjo v sicer izotropnem zunanjem magnetnem polju ta pojav imenujemo magnetna anizotropija. V molekuli benzena pride pod vplivom zunanjega magnetnega polja do nastanka krožnega toka elektronov. Elektroni v p orbitalah začnejo krožiti nad in pod ravnino benzenovega obroča, s kroženjem elektronov pa v okolici benzenovega obroča nastane novo šibko magnetno polje. Ker je smer nastalega polja v področju protonov v benzenu enaka smeri zunanjega magnetnega polja, je efektivno polje ki ga zaznajo protoni večje, s tem pa je večji tudi njihov kemijski premik (Slika 6). Kemijski premik protonov v benzenu je tako približno 7 ppm. Pojav magnetne anizotropije opazimo tudi v alkenih, alkinih in spojinah ki vsebujejo karbonilne skupine. Slika 6. Magnetna anizotropija v benzenu. Nastanek dodatnega induciranega magnetnega polja zaradi kroženja π elektronov pod vplivom zunanjega magnetnega polja B 0. Magnetno polje, ki ga zaznajo protoni je zaradi induciranega polja rahlo večje kot polje B 0. Prirejeno po [1]. Kemijska ekvivalenca S pomočjo NMR-spektroskopije lahko ločimo med jedri, ki jih v molekuli najdemo v različnih kemijskih okolicah. Nasprotno so jedra v enakih kemijskih okolicah kemijsko ekvivalentna in imajo navadno enak kemijski premik. Vsi protoni v npr. TMS-u, acetonu ali kateri drugi spojini, kjer lahko protone s simetrijsko operacijo preslikamo enega v drugega, so kemijsko ekvivalentni in imajo navadno resonanco pri istem kemijskem premiku. Število različnih signalov v NMR-spektru nam torej pove število različnih vrst protonov v molekuli. 7

12 Integral Iz 1 H NMR-spektra lahko razberemo ne le katere vrste protonov so v molekuli, ampak tudi številčno razmerje med njimi. Površine pod krivuljo ali integrali posameznih vrhov v 1 H NMRspektru so sorazmerni s številom protonov, ki dajejo posamezen signal. Iz integralov lahko sklepamo na razmerje med različnimi vrstami protonov v molekuli, ne moremo pa določiti njihovega absolutnega števila. Sklopitve med protoni Pri pregledu 1 H NMR-spektrov ugotovimo, da signali za večino protonov nimajo le ene linije ampak so sestavljeni iz večjega števila vrhov. Signal protona CH skupine v 1,1,2-trikloroetanu (CHCl2CH2Cl) ima tako tri linije (triplet), signal protonov CH2 skupine pa dve liniji (dublet) (Slika 7). Razlog za razcep nekaterih signalov v NMR-spektru je v interakciji opazovanih jeder s sosednjimi jedri, ki imajo spin in zato magnetni moment. Pri protonih sta možni dve spinski stanji, stanje s spinom +½ in stanje s spinom -½, ki sta približno enako zasedeni. Protoni, ki so vezani na sosednjih ogljikovih atomih čutijo vpliv drug drugega, zato vrsta spinskega stanja v katerem je sosednje jedro vpliva na opazovano jedro. Pojavu, da jedra čutijo vpliv sosednjih jeder rečemo sklopitev. Točen kemijski premik protona je odvisen od tega ali je magnetni moment sosednjega jedra poravnan s smerjo ali nasproti smeri polja B0. Če je magnetni moment sosednjega protona usmerjen v smer zunanjega polja, se efektivno polje v področju opazovanega protona rahlo okrepi, zato je njegov kemijski premik rahlo večji. Obratno velja za primer, ko je magnetni moment sosednjega protona usmerjen nasproti smeri zunanjega polja. Signal za opazovani proton se zato razcepi v dva vrhova, pri čemer en vrh pripada protonom, kjer je spin sosednjega jedra +½, drugi vrh pa protonom, kjer je njegov spin -½. Ker je protonov v obeh spinskih stanjih približno 50 procentov, sta intenziteti obeh vrhov enaki (Slika 8). Na podoben način lahko razložimo tudi nastanek signalov s tremi (triplet), s štirimi (kvartet), s petimi (kvintet), s šestimi (sekstet) in z večjim številom linij (multiplet). Triplet v 1 H NMRspektru nastane zaradi sklopitve opazovanega protona z dvema protonoma vezanima na sosednji ogljikov atom. Primer tripleta je signal za CH skupino v 1,1,2-trikloroetanu. V tem primeru imamo tri možne populacije molekul: (i) molekule v katerih sta oba protona na sosednjem ogljiku v stanju s spinom +½, (ii) molekule v katerih je en proton v stanju s spinom +½ in drugi s spinom -½ ali obratno in (iii) molekule, kjer imata oba protona spin -½. Signal za opazovani proton je zato sestavljen iz treh linij. Ker je verjetnost za to, da ima en proton spin 8

13 +½ drugi pa spin -½ dvakrat večja od verjetnosti, da imata oba protona enak istosmeren spin, so intenzitete linij v tripletu v razmerju 1:2:1. Razmerje intenzitet posameznih linij v pogostih signalih v 1 H NMR-spektru lahko odčitamo iz Pascalovega trikotnika (Slika 9). Slika 7. 1 H NMR-spekter 1,1,2-trikloroetana (CHCl 2CH 2Cl). Signal za CH skupino ima tri linije (triplet) in ga vidimo pri večjem kemijskem premiku (δ = 5.77 ppm), signal za CH 2 skupino pa ima dve liniji (dublet) in ga vidimo pri manjšem kemijskem premiku (δ = 3.96 ppm). Slika 8. a) Molekuli v katerih je magnetni moment protona H B poravnan bodisi s smerjo ali nasproti smeri zunanjega polja B 0. H A, opazovani proton; H B, proton na sosednjem ogljikovem atomu od opazovanega protona; b) Shematski prikaz signala za proton H A v 1 H NMR-spektru. S prekinjeno črto je označen teoretičen kemijski premik signala za H A, če med protonoma H A in H B ne bi bilo sklopitve. Slika 9. Pascalov trikotnik iz katerega lahko odčitamo razmerje med intenzitetami linij pogostih signalov v 1 H NMR-spektru. 9

14 Poleg informacij o vrsti (kemijski premik) in številu (integral) protonov v molekuli, lahko iz števila linij v signalih v 1 H NMR-spektru torej ugotovimo tudi, koliko protonov je prisotnih na sosednjih ogljikovih atomih kar je pomemben podatek pri določanju strukture vzorca. Pri analizi 1 H NMR-spektra si lahko pomagamo s pravilom n + 1, ki pravi, da je število linij za določen signal za eno večje, kot je vsota protonov na sosednjih ogljikih. Pri tem je potrebno upoštevati protone, ki so vezani na vseh sosednjih ogljikih od ogljika na katerem je vezan opazovani proton. Signal protona CH skupine v 2-bromopropanu (CH3CHBrCH3) ima tako sedem linij, ker je vsota protonov na dveh sosednjih CH3 skupinah šest, po pravilu n + 1, pa je število linij n = 6 +1 = 7. Signal za metilni skupini v 2-bromopropanu ima dve liniji (1 + 1 = 2). Zavedati pa se moramo, da je pravilo n + 1 le poenostavitev in da ne velja v vseh primerih. Sklopitvena konstanta Sklopitvena konstanta, J, je merilo za moč interakcije med dvema jedroma. Izračunamo jo iz razdalje med linijami v signalih v NMR-spektru in jo podamo kot vrednost v hercih. Pri izračunu sklopitvene konstante moramo biti pozorni na to, na katerem spektrometru je bil spekter posnet, da lahko vrednosti razdalj v ppm pravilno pretvorimo v vrednosti v Hz. Velikost sklopitvene konstante navadno pada z oddaljenostjo med sklopljenima jedroma, odvisna pa je tudi od geometrije molekule. V 1 H NMR-spektru najpogosteje opazujemo sklopitve med protoni, ki so vezani na sosednjih ogljikovih atomih, torej med protoni, ki so med seboj oddaljeni za tri kemijske vezi. Takšnim sklopitvenim konstantam pravimo vicinalne sklopitvene konstante in jih označimo s 3 J. Običajne vrednosti vicinalnih sklopitvenih konstant med protoni so v območju med 5 in 10 Hz. Sklopitev med protoni, ki so oddaljeni za štiri ali več vezi navadno ne zaznamo. V 1 H NMR-spektru tudi ne zaznamo sklopitev med ekvivalentnimi protoni, torej med protoni ki imajo resonanco pri istem kemijskem premiku. Sklopitev med protoni, ki so vezani na isti ogljikov atom opazimo le, če sta protona magnetno neekvivalentna. 13 C NMR-SPEKTROSKOPIJA Medtem, ko dobimo s protonsko ali 1 H NMR-spektroskopijo informacije o vrsti in številu protonov v molekuli, lahko s 13 C NMR-spektroskopijo preučujemo strukturo ogljikovega skeleta. S 13 C NMR-spektroskopijo lahko določimo število in vrsto neekvivalentnih ogljikovih 10

15 atomov v molekuli. Ker ima najpogostejši izotop ogljika, ogljik-12, spinsko število nič, ga z NMR-spektroskopijo ne moremo opazovati. Z NMR-spektroskopijo lahko opazujemo le ogljik- 13, ki ima, tako kot proton, spinsko kvantno število ½. Težava pri 13 C NMR-spektroskopiji je njena 6000-krat manjša občutljivost od 1 H NMR-spektroskopije, ki je posledica dejstva, da je v naravi prisotnega le 1.08 odstotka izotopa ogljika 13 C, kar pomeni, da lahko zaznamo le približno vsako stoto jedro ogljika v molekuli. Drugi razlog za manjšo občutljivost 13 C NMRspektroskopije je 4-krat manjše giromagnetno razmerje jedra 13 C od jedra 1 H. Pomembni podatki, ki jih lahko razberemo iz 13 C NMR-spektra so število in kemijski premiki signalov. Iz kemijskega premika lahko sklepamo na to v kakšni okolici se nahaja določen ogljikov atom, pri tem pa si lahko pomagamo z vrednostmi, ki so podane v tabelah (Slika 10). Na vrednosti kemijskih premikov ogljikov vplivajo podobni faktorji kot na kemijske premike protonov v protonskem spektru; elektronegativnost sosednjih skupin, hibridizacija ogljikovega atoma in magnetna anizotropija. Slika 10. Značilne vrednosti kemijskih premikov ogljikov v 13 C NMR-spektru. Ker je verjetnost, da bi v isti molekuli našli dva izotopa 13 C na sosednjih mestih zelo majhna, s 13 C NMR-spektroskopijo ne zaznamo sklopitev med jedri 13 C- 13 C. V 13 C NMR-spektru lahko opazimo sklopitve med jedri 13 C in protoni vezanimi neposredno na te ogljike, ampak le pod pogojem, da je spekter posnet brez tehnike širokopasovne protonske razklopitve (glej spodaj). V tem primeru so, v skladu s pravilom n + 1, vsi ogljiki CH3 skupin v spektru vidni kot kvarteti (3 + 1 = 4), ogljiki CH2 skupin kot tripleti (2 + 1 = 3), ogljiki CH skupin kot dubleti (1 + 1 = 2), ogljiki brez vezanih protonov pa kot singleti (0 + 1 = 1). Sklopitev med jedri 13 C in protoni, ki so vezani za dve ali več vezi narazen navadno ne vidimo. 11

16 Širokopasovna protonska razklopitev Pri snemanju 13 C NMR-spektrov običajno uporabljamo tehniko imenovano širokopasovna protonska razklopitev (angl. broadband proton decoupling). Zaradi te tehnike v spektrih ne vidimo sklopitev med jedri ogljika-13 in protoni, signali za vse ogljike pa se poenostavijo v singlete. Širokopasovno protonsko razklopitev dosežemo tako, da med meritvijo vzorec dodatno obsevamo z elektromagnetnim valovanjem s frekvenco, s katero vzbujamo tudi protone v vzorcu. Z vzbujanjem protonov povzročimo njihovo hitro prehajanje med obema možnima spinskima stanjema, s tem pa jedra ogljika ne zaznajo več dveh različnih stanj protonov, ampak le njihovo»povprečje«. Ena izmed prednosti uporabe širokopasovne protonske razklopitve je, da se na ta način spektri poenostavijo. To je zlasti pomembno pri spojinah, ki vsebujejo veliko število C-atomov, pri katerih je interpretacija 13 C NMR-spektrov zaradi možnega prekrivanja signalov zahtevnejša. Druga prednost uporabe protonske razklopitve je, da se na ta način močno poveča intenziteta signalov, kar je zlasti pomembno zaradi majhne občutljivosti 13 C NMR-spektroskopije. Pomanjkljivost protonske razklopitve je, da se s poenostavitvijo signalov izgubi informacija o številu protonov vezanih na določen ogljik. Poleg tega površine pod signali v spektru ne odražajo več točnega razmerja med števili različnih vrst ogljikov v molekuli, zato s to tehniko posnetih 13 C NMR-spektrov običajno ne integriramo. VIRI 1. Pavia, D. L.; Lampman, G. M.; Kriz, G. S.; Vyvyan, J. A. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. V Introduction to Spectroscopy, 4. izdaja: Belmont, 2009; str Anderson, R. J.; Bendell, D. J.; Groundwater, P. W. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. V Organic Spectroscopic Analysis, Cambridge, 2004, str Hesse, M.; Meier, H.; Zeeh, B. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. V Spectroscopic Methods in Organic Chemistry, 2. izdaja: Zürich, 2007; str

17 EKSPERIMENTALNI DEL S pomočjo 1 H NMR-spektroskopije boste določili strukturo neznanega vzorca. Pri vaji boste spoznali vse stopnje snemanja NMR-spektrov; od priprave vzorca, postopka snemanja spektra, do računalniške obdelave signala. Meritev boste izvedli na 400 MHz NMR-spektrometru Bruker AVANCE III. Priprava vzorcev za snemanje NMR-spektrov Približno 5 mg spojine zatehtamo v plastično epruveto, raztopimo v 600 µl ustreznega topila (CDCl3, DMSO-d6), raztopino prenesemo v NMR-cevko in pokrijemo z zamaškom. Navodila za snemanje NMR-spektrov NMR-cevko z vzorcem vstavimo v plastični nastavek, t.i. spinner, in nato cevko z nastavkom vstavimo v eno izmed prostih mest na avtomatskem vzorčevalniku na vrhu NMR-spektrometra. V ukazno vrstico programa Topspin vpišemo ukaz sx xx, pri čemer je xx številka mesta na avtomatskem vzorčevalniku na katerega smo postavili naš vzorec, npr. sx 01, če smo vzorec postavili na položaj 1. Z uporabo ukaza edc se nam odpre okno, v katerega vpišemo osnovne podatke o našem vzorcu in vzorec poimenujemo. Z ukazom rpar odpremo tabelo, v kateri izberemo želeni eksperiment. Če želimo posneti 1 H NMR-spekter, v tabeli izberemo polje z imenom PROTON, za snemanje 13 C NMR-spektra pa polje z imenom C13-CPD. Z zaporedno izbiro ukazov ATMA in Topshim nato sprožimo avtomatsko preverjanje in uravnavanje ustreznosti magnetnega polja za izvedbo meritve. Po končani analizi magnetnega polja, z ukazom rga sprožimo avtomatsko preverjanje ustreznega nivoja ojačenja signala. Snemanje spektra sprožimo z ukazom zg. Ko je spekter posnet lahko z ukazoma ft (Fourier transform) in apk (automatic phase correction) dobljeni FID-signal pretvorimo v običajen zapis NMRspektra. Spekter lahko nato dodatno uredimo z ukaznimi ikonami programa Topspin (t.j. označimo kemijske premike signalov, integriramo posamezne vrhove, uravnamo bazno linijo, itd.), ali pa ga uredimo v katerem izmed drugih programov za urejanje NMR-spektrov. 13

18 REZULTATI IN RAZPRAVA 14

19 Datum: Pregledal: 15

20 2. IR-SPEKTROSKOPIJA Vaja: Uporaba IR-spektroskopije za določanje struktur spojin in za analizo fizikalno-kemijskih lastnosti vzorcev CILJI VAJE Spoznati osnove IR-spektroskopije in interpretacijo IR-spektrov Spoznati načine priprave vzorcev in snemanje IR-spektrov Na primerih prikazati uporabo različnih tehnik IR-spektroskopije Posneti IR-spektre izbranih vzorcev v srednjem IR-območju in na osnovi značilnih signalov določiti strukture neznanih vzorcev ter identificirati pomembnejše funkcionalne skupine Spoznati uporabo IR-spektroskopije za analizo fizikalno-kemijskih lastnosti vzorcev UVOD Infrardeče območje elektromagnetnega valovanja zajema svetlobo z valovnimi dolžinami od 0.78 do 1000 µm (valovnimi števili od do 10 cm -1 ). Z vidika uporabe in inštrumentov lahko infrardečo spektroskopijo razdelimo na bližnjo (NEAR), srednjo (MID) in daljno (FAR) IR-spektroskopijo (Slika1). Slika 1. Razdelitev IR-elektromagnetnega valovanja na bližnje (NEAR), srednje (MID) in daljne (FAR) območje in prikaz značilnih vrednosti valovnih dolžin (λ), frekvenc (ν) in valovnih števil ( ) za posamezno območje. Ko vzorec obsevamo z infrardečo svetlobo prihaja v molekulah do vzbujanja različnih vrst nihanj in rotacij. Kemijske vezi v molekulah si lahko poenostavljeno prestavljamo kot prožne 16

21 vzmeti, ki atomom omogočajo neprestano nihanje. Atomi v molekulah nihajo tudi brez dodatnega obsevanja z IR-svetlobo, z obsevanjem pa lahko ta nihanja vzbudimo iz osnovnih v višja vzbujena stanja. Za vsako kombinacijo vsaj dveh atomov in kemijske vezi med njima je značilna točno določena frekvenca nihanja. Če se naravna frekvenca nihanja določene skupine v molekuli ujema s frekvenco IR-svetlobe s katero obsevamo vzorec, pride do prenosa energije in absorpcije IR-svetlobe, kar povzroči spremembo v amplitudi nihanja. Absorbirajo se le tiste frekvence IR-valovanja, ki se ujemajo z naravnimi frekvencami nihanj funkcionalnih skupin v molekuli. Vse skupine v molekuli niso sposobne absorbirati IR-svetlobe. Pogoj za to, da neka snov absorbira IR-elektromagnetno valovanje je, da pri nihanju prihaja do spremembe dipolnega momenta. Le tako lahko elektromagnetno valovanje vstopi v interakcijo z molekulo in povzroči spremembo v amplitudi njenega nihanja. Pri nihanju simetričnih vezi, npr. v molekulah O2, N2 ali Cl2, ne prihaja do spremembe dipolnega momenta, zato jih v IR-spektru ne vidimo. Ločimo dve glavni vrsti molekulskih nihanj, (i) vzdolžna ali valenčna nihanja in (ii) prečna ali deformacijska nihanja (Slika 2): i.) Vzdolžna ali valenčna nihanja (angl. stretching vibrations) Vzdolžna ali valenčna nihanja so nihanja vzdolž vezi med atomi pri katerih prihaja do spreminjanja dolžine vezi med atomi. Pri vzdolžnih nihanjih v skupini vsaj treh atomov so nihanja lahko simetrična ali asimetrična. Do simetričnih in asimetričnih nihanj lahko pride npr. v primeru nitro skupine. ii.) Prečna ali deformacijska nihanja (angl. bending vibrations) Prečna ali deformacijska nihanja so nihanja, kjer prihaja do spreminjanja veznih kotov med atomi. Razdelimo jih lahko na nihanja v ravnini (npr. striženje, zibane) ali nihanja iz ravnine (npr. kolebanje, zvijanje). V splošnem je za spreminjanje dolžine vezi med atomi potrebno več energije kot za spreminjanje veznih kotov, zato najdemo vzdolžna nihanja v IR-spektru v območjih višjih energij (višjih valovnih števil) kot prečna nihanja. 17

22 Slika 2. Razdelitev molekulskih nihanj na vzdolžna ali valenčna nihanja (simetrična in asimetrična nihanja) in prečna ali deformacijska nihanja (nihanja v ravnini in iz ravnine). Ker je valovna dolžina absorbiranega elektromagnetnega valovanja značilna za posamezno kemijsko skupino, lahko iz položaja absorpcijskih trakov v IR-spektru določimo vrste funkcionalnih skupin, ki so prisotne v vzorcu. Položaj absorpcijskega traku v IR-spektru lahko podamo z valovno dolžino λ (µm) absorbirane svetlobe, bolj pogosto pa se uporablja recipročna vrednost valovne dolžine imenovana valovno število (cm -1 ). Valovno število je premo sorazmerno energiji in frekvenci elektromagnetnega valovanja. λ ν c = 1 = = h = valovno število (cm -1 ) = valovna dolžina (cm) = frekvenca (Hz) = svetlobna hitrost ( m/s) E = energija h = Planckova konstanta ( Js) 18

23 Valovno število nihanja v dvoatomni molekuli lahko izračunamo s pomočjo enačbe: = 1 2 = valovno število (cm -1 ) π = krožna konstanta ( ) k = konstanta vzmeti µ = reducirana masa V tej enačbi k predstavlja konstanto vzmeti, ki je čim večja tem močnejša je kemijska vez in čim težje jo raztegnemo. Simbol µ predstavlja reducirano maso, ki jo za dvoatomno molekulo izračunamo po enačbi =( )/( + ), kjer sta in masi nihajočih atomov. Večji sta masi nihajočih atomov, večja je reducirana masa µ. Iz zgornje enačbe lahko zaključimo: i) Skupine v katerih so atomi povezani z močnejšimi vezmi nihajo pri višjih valovnih številih: npr. skupine z enojnimi vezmi nihajo pri višjih valovnih številih kot skupine z dvojnimi ali trojnimi vezmi. ii) Skupine, ki jih sestavljajo težji atomi nihajo pri nižjih valovnih številih: npr. skupine, ki vsebujejo atome, kot so O, N, Cl, Br, nihajo pri nižjih valovnih številih kot skupine, ki vsebujejo atome, kot sta C in H. Pri analizi struktur organskih spojin se najpogosteje uporablja srednje (MID) IR-območje, ki obsega valovna števila od približno 4000 do 400 cm -1. Srednje območje IR-spektra lahko v grobem razdelimo na dva dela. Območje med približno 4000 in 1500 cm -1 imenujemo območje funkcionalnih skupin, ker lahko iz položaja (valovnega števila), oblike in intenzitete signalov v tem območju sklepamo na prisotnost določenih funkcionalnih skupin v vzorcu. Območje med približno 1500 in 400 cm -1 imenujemo območje prstnega odtisa (angl. fingerprint). Vrhovi, ki jih najdemo v tem območju IR-spektra ustrezajo pretežno deformacijskim nihanjem, ki so za interpretacijo težji. Ime območje prstnega odtisa izhaja iz tega, ker je spekter v tem delu sestavljen iz vzorca signalov, ki je značilen za vsako spojino posebej - podobno kot je prstni odtis značilen za ljudi - in lahko že majhne razlike v strukturi molekule povzročijo pomembne razlike v položaju, številu in intenziteti absorpcijskih trakov. Območje prstnega odtisa se lahko uporablja za potrjevanje istovetnosti spojin, tako da spekter vzorca v tem območju primerjamo 19

24 s spektrom standarda. Čeprav je večina signalov pomembnejših funkcionalnih skupin v območju cm -1, lahko nekatere najdemo tudi v območju prstnega odtisa, npr. valenčna nihanja C O C pri cm -1, valenčna nihanja C Cl pa pri cm -1. Slika 3. Značilne vrednosti valovnih števil pri katerih v IR-spektru najdemo nihanja nekaterih pomembnejših funkcionalnih skupin. Pri analizi vzorcev se v farmaciji poleg srednjega dela IR-spektra pogosto uporablja tudi bližnji ali NEAR IR-spekter. Bližnji del IR-spektra zajema višje energije od srednjega dela, zato v NEAR IR-spektru ne opazujemo osnovnih molekulskih nihanj, ampak njihova višja vzbujena stanja in kombinacije. Ta del spektra se navadno ne uporablja za analizo osnovnih molekulskih struktur, ampak se pogosto uporablja za razlikovanje med vzorci, ki se razlikujejo v fizikalnokemijskih lastnostih. NEAR IR-spektroskopijo tako uporabljamo za študij polimorfizma, določanja velikosti delcev, določanja vsebnosti vode v vzorcu ter razlikovanje med različnimi kristalnimi in amorfnimi oblikami vzorca. Srednje (MID) in bližnje (NEAR) IR-območje v farmaciji uporabljamo za: - Potrjevanje istovetnosti zdravilnih učinkovin, kar predpisuje tudi Evropska farmakopeja - Določanje vsebnosti zdravilnih učinkovin - Določanje prisotnosti in vsebnosti nečistot, kar pa je zaradi slabše občutljivosti omejeno na tiste nečistote, ki so prisotne v koncentraciji nad 1% - Študij stabilnosti zdravilnih učinkovin - Določanje struktur organskih spojin oz. funkcionalnih skupin v vzorcu - Razlikovanje med izomeri, polimorfnimi modifikacijami in različnimi sekundarnimi strukturami - Detekcijo spojin pri kromatografiji 20

25 - Identifikacijo in kontrolo kakovosti primarne ovojnine Bližnje IR-območje lahko uporabljamo tudi za: - Analizo materialov v stekleni ovojnini - Določanje vlage v učinkovinah - Analizo velikosti delcev - Preiskovanje mikrobiološke (ne)oporečnosti nekaterih sterilnih farmacevtskih oblik - Medprocesno preverjanje homogenosti prahov in granulatov - Vrednotenje trdnosti tablet Tehnike snemanja IR-spektrov Ločimo dve glavni skupini tehnik snemanja IR-spektrov, (i) transmisijske tehnike in (ii) refleksijske tehnike. i.) Transmisijske tehnike Transmisijske tehnike so najstarejše in tradicionalno najbolj uporabljane tehnika predvsem za določanje struktur organskih spojin. S transmisijskimi tehnikami merimo zmanjšanje intenzitete žarka IR-svetlobe po prehodu skozi vzorec. Za IR-spektroskopijo so primerni vzorci v vseh agregatnih stanjih: a) v plinskem stanju, b) v tekočini, c) v raztopini in d) v trdnem stanju. a) Spektre plinov in tekočin z nizkimi vrelišči posnamemo z uporabo posebnih celic, v katerih vzorec ekspandira. b) Spektre čistih tekočin običajno posnamemo tako, da zelo tanko plast vzorca nanesemo med dve ploščici iz natrijevega klorida (NaCl), ki ju povezuje kapilarna sila. Tako pripravljeni ploščici pred snemanjem vstavimo v IR-spektrometer. c) Spektre raztopin lahko, prav tako kot spektre čistih tekočin, posnamemo tako, da kapljico raztopine nanesemo med dve ploščici iz NaCl, ali pa tako, da uporabimo kiveto z okenci iz 21

26 NaCl. Za raztapljanje vzorcev se navadno uporabljajo nepolarna brezvodna topila, kot sta CCl4 in CHCl3. Topila morajo biti transparentna v čim širšem območju IR-spektra, da ne motijo meritve. Vodo in alkohole uporabljamo redko, ne samo zato ker v IR-območju močno absorbirajo, ampak tudi zato ker raztapljajo celice iz NaCl. Pri vodnih raztopinah moramo uporabiti celice, ki imajo okenca iz npr. kalcijevega fluorida (CaF2). d) Spektre trdnih vzorcev lahko posnamemo tako, da naredimo suspenzijo vzorca v parafinskem olju (Nujol) in del suspenzije nanesemo med dve ploščici iz NaCl, ali pa tako, da vzorec pomešamo s kalijevim bromidom (KBr) in nastalo zmes s stiskalnico stisnemo v tabletko. Ploščici iz NaCl ali tabletko pred meritvijo vstavimo v IR-spektrometer. Transmisijske tehnike imajo nekaj omejitev, saj niso najbolj primerne za kvantitativno delo. Poleg tega lahko sila, ki jo apliciramo na vzorec pri stiskanju v tabletko povzroči prehod kristalne oblike v amorfno ali prehod ene kristalne oblike v drugo. ii.) Refleksijske tehnike Pri bolj zahtevnih meritvah in predvsem pri kvantitativnih meritvah lahko namesto transmisijskih uporabljamo refleksijske tehnike snemanja IR-spektrov, kot sta tehnika oslabljene popolne odbojnosti (angl. attenuated total reflectance, ATR) in tehnika razpršene odbojnosti (angl, diffuse reflectance, DR). Skupna značilnost refleksijskih tehnik je, da pri njih ne merimo svetlobe, ki preide vzorec, ampak svetlobo, ki se od vzorca odbije. Ob stiku svetlobe z vzorcem se del svetlobe absorbira, zato odbiti žarek vsebuje informacijo o strukturi vzorca. a) Tehnika oslabljene popolne odbojnosti (ATR) Ključni sestavni del IR-spektrometra za merjenje oslabljene popolne odbojnosti je kristal, na katerega nanesemo vzorec. Ko na površino kristala nanesem vzorec, s spodnje strani pod ustreznim kotom na kristal posvetimo z IR-svetlobo. Ko žarek sevanja vstopa iz optično gostejšega (kristal) v optično redkejši medij (vzorec), pride na stiku dveh površin do popolnega odboja. Preden se žarek odbije, prepotuje majhno razdaljo - do nekaj desetink milimetra - v redkejši medij. Če pride v redkejšem mediju do absorpcije sevanja, je odbiti žarek oslabljen in nosi podatke o absorpcijskih lastnostih vzorca (Slika 4). Tehnika oslabljene popolne odbojnosti je nedestruktivna refleksijska tehnika, primerna za analizo površin preiskovanih snovi. Prednost tehnike ATR je, da lahko vzorec nanesemo na kristal v čisti obliki, zato predpriprava vzorca navadno ni potrebna. Uporabljamo jo za 22

27 netransparentne vzorce, vzorce, ki zelo močno absorbirajo ali pa so predebeli, da bi jih lahko analizirali s transmisijskimi tehnikami. Analiziramo lahko tudi biološke materiale, kot sta tkivo in koža. Pri snemanju je pomembno, da je vzorec v dobrem stiku s kristalom. Slika 4. Shema dela IR-spektrometra za merjenje oslabljene popolne odbojnosti (ATR). b) Tehnika razpršene odbojnosti (DR) Pri tehniki razpršene odbojnosti (DR) opazujemo sipanje svetlobe na vzorcu, zato mora imeti vzorec grobe oz. neenakomerne površine. Taki vzorci v vpadni smeri prepuščajo zelo malo svetlobe, večina svetlobe se razprši, tako da se od mejnih ploskev naključno odbije v vse smeri. Če usmerimo žarek IR-svetlobe na vzorec, bomo zaznali dve vrsti odbojnosti. Prva je pravilna ali zrcalna odbojnost (angl. specular reflectance) in druga razpršena odbojnost (angl. diffuse reflectance). Pravilna odbojnost je komponenta valovanja, ki se pravilno odbije od delcev na površini vzorca, torej del valovanja, pri katerem ne pride do absorpcije svetlobe. Razpršena odbojnost pa je del valovanja, ki do majhne globine - od nekaj desetink milimetra do 3 mm - prodre v vzorec in se nato od vzorca odbije v vse smeri. Ta del valovanje vsebuje informacije o absorpcijskih lastnostih vzorca. Sistem zrcal za vzorcem zbere odbito razpršeno svetlobo in jo usmeri do detektorja. Eksperimentalni pogoji pri tovrstnem načinu merjenja so prilagojeni tako, da se razpršena odbojnost ojači, pravilna odbojnost pa oslabi (Slika 5). Tehnika razpršene odbojnost je refleksijska tehnika, ki se uporablja za merjenje različnih vrst trdnih vzorcev; amorfnih snovi, kristaliničnih snovi, vlaken, suspenzij, vzorcev neenakomernih (grobih) površin ali polimernih premazov. Vzorčenje je hitro, ker je potrebna le minimalna predpriprava vzorca ali pa ta ni potrebna. Tehnika je nedestruktivna in zelo občutljiva. 23

28 Slika 5. Shema dela IR-spektrometra za merjenje razpršene odbojnosti (DR). VIRI 1. Pavia, D. L.; Lampman, G. M.; Kriz, G. S.; Vyvyan, J. A. Infrared Spectroscopy. V Introduction to Spectroscopy, 4. izdaja: Belmont, 2009; str Anderson, R. J.; Bendell, D. J.; Groundwater, P. W. Infrared Spectroscopy. V Organic Spectroscopic Analysis, Cambridge, 2004, str Hesse, M.; Meier, H.; Zeeh, B. Infrared and Raman Spectroscopy. V Spectroscopic Methods in Organic Chemistry, 2. izdaja: Zürich, 2007; str

29 EKSPERIMENTALNI DEL 1. DOLOČANJE STRUKTUR VZORCEV S pomočjo IR-spektroskopije določite strukture neznanih vzorcev. Meritve boste izvedli na spektrofotometru FT-IR Thermo Nicolet, modelu Nexus, s programsko opremo Omnic E.S.P. 5.2., v srednjem IR-območju. Uporabili boste dve različni tehniki snemanja IR-spektrov: transmisijsko tehniko in tehniko oslabljene popolne odbojnosti (ATR). Na razpolago imate šest neznanih vzorcev z oznakami A, B, C, D, E in F v 5 ml penicilinkah. Posnemite IR-spektre vseh vzorcev in na podlagi IR-spektrov povežite vzorce z njihovimi strukturami. Tabelo z možnimi strukturami boste dobili na vajah. Pri snemanju IR-spektrov uporabite tehnike snemanja predpisane v spodnji tabeli. Vzorec A Vzorec B Vzorec C Transmisijska in Transmisijska tehnika Refleksijska (ATR) tehnika Refleksijska (ATR) tehnika Vzorec D Vzorec E Vzorec F Transmisijska tehnika Refleksijska (ATR) tehnika Transmisijska tehnika Transmisijska tehnika Priprava vzorcev: Trdni vzorci: V ahatno terilnico stresemo mg KBr, ga narahlo zdrobimo in mu homogeno primešamo 1-2 mg spojine. Tako pripravljeno zmes prenesemo v pečat in s stiskalnico stisnemo v tabletko. Tabletko pred snemanjem vstavimo v nosilec IR-spektrometra. Tekoči vzorci: Kapljico vzorca nanesemo na ploščico iz NaCl in čez njo položimo drugo ploščico iz NaCl, da se med ploščicami naredi tanek film vzorca. Ploščici z vzorcem pred snemanjem vstavimo v nosilec IR-spektrometra. Snemanje IR-spektrov: Uporabimo nastavek za snemanje s transmisijsko IR-tehniko. Pred analizo vzorca najprej, na enak način kot snemamo spekter vzorca posnamemo spekter ozadja, vendar s praznim nosilcem 25

30 za vzorec. Spekter ozadja se po končani meritvi avtomatično odšteje od spektra vzorca s čemer zagotovimo, da vidimo v spektru vzorca le signale za preučevani vzorec. Pri snemanju ozadja v orodjarni programa Omnic E.S.P izberemo ikono Col Bkg (iz angl. collect sample), pri snemanju vzorca pa izberemo ikono Col Smp (iz angl. collect background). Posnet spekter obdelamo tako, da po potrebi uravnamo bazno linijo s pomočjo ikone Aut Bsl (iz angl. automatic baseline correction), označimo valovna števila posameznih vrhov z izbiro ukazne vrstice Analyze>FindPeaks, ali si pomagamo z drugimi ukaznimi ikonami v orodjarni programa. Po končani analizi spekter shranimo v izbrano datoteko ali ga natisnemo. ATR-tehnika Snemanje IR-spektrov: Uporabimo nastavek za snemanje s tehniko oslabljene popolne odbojnosti. Pri tej tehniki predpriprava vzorca ni potrebna. Nekaj miligramov vzorca nanesemo na diamantni kristal nastavka za snemanje z ATR-tehniko (Nicolet Smart DuraSampl IR ) - toliko, da je kristal prekrit z vzorcem - in vzorec pritisnemo ob kristal s posebnim vijakom. Najprej posnamemo spekter ozadja in nato še spekter vzorca. Pri snemanju ozadja v orodjarni programa Omnic E.S.P izberemo ikono Col Bkg (iz angl. collect sample), pri snemanju vzorca pa izberemo ikono Col Smp (iz angl. collect background). Posnet spekter obdelamo tako, da po potrebi uravnamo bazno linijo s pomočjo ikone Aut Bsl (iz angl. automatic baseline correction), označimo posamezne vrhove z izbiro ukazne vrstice Analyze>FindPeaks, ali si pomagamo z drugimi ukaznimi ikonami v orodjarni programa. Po končani analizi spekter shranimo v izbrano datoteko ali ga natisnemo. Med menjavo vzorcev in po končanem delu zgornji in spodnji del snemalne glave obvezno očistimo z etanolom in krpico. Za čiščenje kristala nikoli ne uporabljamo acetona. 2. RAZLIKOVANJE MED RAZLIČNIMI KRISTALNIMI OBLIKAMI VZORCA Opazovali boste, kakšen vpliv imajo različne kristalne oblike v katerih se lahko nahaja učinkovina sulfanilamida na njegov IR-spekter. Molekula sulfanilamida lahko pod različnimi pogoji kristalizira v več različnih kristalnih oblikah (alfa, beta, gama), ki se med seboj ločijo v položaju in intenziteti nekaterih vrhov v IR-spektru. 26

31 Struktura sulfanilamida: Na razpolago boste imeli več vzorcev: vzorec α-sulfanilamida, vzorec β-sulfanilamida in več vzorcev sulfanilamida z neznano kristalno strukturo. Z ATR-tehniko v srednjem IR-območju posnemite IR-spektra α- in β-sulfanilamida ter spekter vsaj enega neznanega vzorca in s primerjavo položajev (valovnih števil) in intenzitet posameznih vrhov v IR-spektrih določite kristalno strukturo sulfanilamida v neznanem vzorcu. Pri analizi spektrov bodite posebej pozorni na vrhove z valovnimi števili med 4000 in 3000 cm -1. REZULTATI IN RAZPRAVA 27

32 Datum: Pregledal: 28

33 3. EPR-SPEKTROSKOPIJA Vaja: Analiza izbranih radikalov s pomočjo EPR-spektroskopije CILJI VAJE Posneti EPR-spektre izbranih paramagnetnih snovi v topilih različne polarnosti (v etanolu, vodi in cikloheksanu) Na osnovi strukture paramagnetnih molekul pojasniti razcepljenost (multipliciteto) EPRsignala Oceniti vpliv topila na EPR-spekter (polarnost, vsebnost kisika) Analizirati dobljene EPR-spektre (določiti a N, g 0, širino črte di, višino črte hi in spektre integrirati). Izvoziti dobljene spektre v program Excel UVOD Elektronska paramagnetna (ali spinska) resonanca (EPR ali ESR) je spektroskopska tehnika, kjer v magnetnem polju najprej razcepimo sicer degenerirana spinska stanja nesparjenih elektronov v dve energijski stanji in nato s fotoni mikrovalov vzbujamo prehode med njimi. EPR-spektroskopija je uporabna za študij vseh paramagnetnih snovi, kot so radikali, elementi prehodnih kovin in defekti v kristalnih rešetkah. Radikali so lahko atomi, ioni, molekule ali kompleksi z vsaj enim nesparjenim elektronom. Nesparjeni elektroni imajo spin in magnetni moment, zato lahko vstopajo v interakcije z zunanjim magnetnim poljem, čemur pravimo Zeemanova interakcija. Nesparjeni elektroni lahko vstopajo v interakcije tudi med seboj in z nekaterimi atomskimi jedri, ki imajo spin, kar imenujemo hiperfina sklopitev. V zunanjem magnetnem polju se magnetni momenti elektronov s spinskim kvantnim številom +½ in -½ skoraj enakomerno porazdelijo v dva energijska nivoja. Ko je sistem v termičnem ravnovesju, jih je nekoliko več na energijskem nivoju z nižjo energijo, saj sledijo Boltzmannovi porazdelitvi. Magnetni momenti elektronov precesirajo okoli smeri zunanjega magnetnega polja ali pa v nasprotni smeri, kar imenujemo Larmorjeva precesija. Ko je energija vzbujevalnega elektromagnetnega valovanja enaka energijski razliki med populacijama nesparjenih elektronov (resonančni pogoj), lahko pride do prehoda iz paralelne v antiparalelno orientacijo spina oziroma do absorpcije elektromagnetnega valovanja, ki jo zaznamo z EPR- 29

34 spektrometrom. Energijsko razliko med elektronskima energijskima nivojema izrazimo z naslednjo enačbo: = =h razlika med elektronskima energijskima nivojema gostota (jakosta) magnetnega polja (T) Bohrov magneton ( = ħ =5, =9, ) sorazmernostni faktor ali Zeemanov sklopitveni faktor (za elektron je 2,00232) h frekvenca elektromagnetnega valovanja Planckova konstanta (h=6, Js) Večina EPR-spektrometrov deluje pri konstantni frekvenci elektromagnetnih valov (Razpredelnica 1), med meritvijo pa spreminjamo jakost magnetnega polja (t.i. "continuous wave" EPR-spektroskopija). Med spreminjanjem jakosti magnetnega polja (angl. sweep) prihajajo pri določenih vrednostih polja B elektronski spini v resonanco s frekvenco mikrovalov, s katerimi obsevamo paramagnetni vzorec. Vzorec zato absorbira energijo mikrovalov, kar vodi v EPR-prehod. Energija se kasneje, ko se vzbujeni elektroni vračajo na nižji energijski nivo v procesu imenovanem spin-lattice relaksacija, pretvori v toploto. EPRspekter je zapis prvega odvoda absorpcije energije mikrovalov v odvisnosti od jakosti zunanjega magnetnega polja. Razpredelnica 1. Območja mikrovalov in magnetnih polj, ki se najpogosteje uporabljajo pri EPRspektrometrih Pas mikrovalov Frekvenca [GHz] Bres [G] a L 1,1 392 S 3, X 9, Q 34, W 94, a Polje, pri katerem pride do resonance za =2. 30

35 Z metodo EPR lahko v vzorcih organskega ali anorganskega izvora, ki vsebujejo paramagnetne centre, spremljamo atome ali ione prehodnih kovin, elektronske defekte v kristalnih rešetkah, tripletna stanja molekul, oksido-redukcijske procese, nastajanje kratkoživih radikalov, nekatere encimske reakcije, metaloproteine itd. Kratkožive radikale lahko v vzorcu opazujemo tako, da vzorec ohladimo na nizko temperaturo, ali da radikale ujamemo s spinskimi pastmi (angl. spin traps) in jih tako pretvorimo v bolj stabilne radikale, ki jih lažje proučujemo. V vzorce, ki ne vsebujejo paramagnetnih centrov, lahko le te dodamo in jih tako spinsko označimo. Spinski označevalci (kovalentno vezani) in spinske probe ali sonde (nekovalentne interakcije z vzorcem), ki jih dodamo v preiskovani vzorec, nam dajo informacije o prostorsko omejenem delu svoje neposredne okolice. S primerno načrtovanimi spinskimi označevalci lahko proučujemo dinamične lastnosti (makro)molekul in njihovo urejenost, merimo koncentracijo kisika, polarnost, določamo porazdelitvene koeficiente itd. Stabilni nitroksidni radikali so kot spinski označevalci najpogosteje uporabljani paramagnetni centri v EPR-spektroskopiji. To so spojine, kjer je NO skupina, na kateri je nesparjen elektron, preko dušika kovalentno povezana z dvema skupinama najpogosteje v štiri-, pet-, šest-, ali sedem-členski obroč brez vodikovih atomov na obeh α-c atomih glede na N atom (Slika 1). Glede na heterociklični obroč so najpogostejši nitroksidni radikali pirolinskega, pirolidinskega, oksazolidinskega, imidazolidinskega in piperidinskega tipa (Slika 2). Slika 1. (a) Splošna struktura stabilnih nitroksidnih radikalov; R 2, R 3, R 5, R 6 so alkilne (najpogosteje metilne) skupine, R 1 in R 4 pa sta skupini, ki lahko tvorita različno velik heterociklični obroč z enim ali več heteroatomi; (b) Nitroksidna skupina v koordinatnem sistemu; π orbitala z nesparjenim elektronom je vzporedna osi z. 31

36 Slika 2. Najpogosteje zastopani nitroksidni radikali pirolinskega (a), pirolidinskega (b), oksazolidinskega (c), imidazolidinskega (d) in piperidinskega (e) tipa. Poleg interakcij nesparjenega elektrona z zunanjim magnetnim poljem je pri radikalih nitroksidnega tipa potrebno upoštevati še interakcijo z magnetnim momentom jedra dušikovega atoma, ki ima jedrski spin I( 14 N) = 1. Zaradi omenjene interakcije pride do (hiperfinega) razcepa signala, zato je EPR-spekter sestavljen iz treh absorpcijskih črt. Razlog za nastanek treh črt je, da se jedro dušika-14 lahko nahaja v treh različnih spinskih stanjih, ki jih označimo kot stanja s spinom +1, 0 in -1. Približno ⅓ jeder ima spin +1, ⅓ jeder spin 0 in ⅓ jeder spin -1, stanje v katerem je jedro dušika pa vpliva na opazovani elektron tako, da ta absorbira mikrovalove pri treh rahlo različnih vrednostih polja B (Slika 3). E a m I = +1 m I = 0 m I = -1 Ε =hν m S = +1/2 0 m S = -1/2 m I = -1 m I = 0 m I = +1 b B B Slika 3. (a) Diagram energijskih nivojev nesparjenega elektrona (s = ½) v nitroksidnem radikalu v naraščajočem magnetnem polju B in razcep energijskih nivojev elektrona zaradi sklopitve z dušikovim jedrom s spinskim številom I( 14 N) = 1; (b) Absorpcija energije vzbujevalnega elektromagnetnega valovanja v odvisnosti od zunanjega magnetnega polja B. 32

37 Iz spektra nitroksidnega radikala lahko dobimo podatke o polarnosti njegove neposredne okolice. Na polarnost okolice radikala lahko sklepamo iz vrednosti hiperfine sklopitvene konstante a N, ki predstavlja razdaljo med dvema sosednjima črtama v spektru in iz faktorja g 0, ki označuje lego srednje črte (Slika 4). Podatke o gibljivosti nitroksidne skupine podaja rotacijski korelacijski čas τc, ki je povezan s širino (d) in višino (h) črte ter obliko EPR-spektra (izotropen spekter tri črte enake intenzitete, anizotropen spekter črte niso enako intenzivne). Intenziteta signala v EPR-spektru (dvojni integral signala ali pod določenimi pogoji le višina prve črte) je sorazmerna s številom paramagnetnih centrov v vzorcu. d 1 d 0 d -1 h 1 h 0 h -1 a N g 0 Slika 4. EPR-spekter nitroksidnega radikala TEMPOL-a v vodi z označenimi najpomembnejšimi parametri: d 1, d 0 in d -1 ter h 1, h 0 in h -1, kjer so d širine posameznih črt, h višine črt; g 0 vrednost parametra g in a N hiperfina sklopitvena konstanta. VIRI 1. MiniScope Control 6.51 Instruction Manual, Magnettech GmbH, Analysis Instruction Manual, Magnettech GmbH, Multiplot Instruction Manual, Magnettech GmbH, Operation Hits for the MiniScope MS100-MS300, Magnettech GmbH, Eaton, G.R., Eaton, S.S., Barr, D.P., Weber, R.T.: Quantitative EPR, 1 st Edition.,

38 EKSPERIMENTALNI DEL Priprava vzorcev za snemanje V 5 ml penicilinko natehtamo približno natančno 5 mg vzorca. Pripravimo 10 mm osnovne raztopine vzorcev: prve štiri vzorce raztopimo v etanolu (pripravi jih tehnični sodelavec), zadnji vzorec (natrijev ditionit) pa v deionizirani vodi. Ker je natrijev ditionit v raztopini neobstojen, ga raztopimo tik pred snemanjem EPR-spektra. Za snemanje spektra natrijevega ditionita uporabimo raztopino s koncentracijo 10 mm. Prve štiri vzorce pred snemanjem 100 redčimo do koncentracije 100 µm, tako da v 5 ml penicilinko z avtomatsko pipeto odmerimo 1980 µl topila in dodamo 20 µl osnovne raztopine vzorca. Kot topilo za redčenje vzorcev uporabimo etanol, pri četrtem vzorcu (TEMPO) pa poleg tega pripravimo še raztopini v vodi in cikloheksanu. EPR-spektre snemamo v tankih kapilarah z notranjim premerom 1 mm (zeleni trak), ki jih napolnimo tako, da kapilaro potopimo za 3-4 mm v raztopino vzorca in jo nagnemo pod kotom 30, da posrkajo vzorec do približno ⅔ dolžine. Kapilaro dvignemo iz raztopine, v spodnji del kapilare spustimo 2-3 mm zraka in jo zamašimo s plastelinom (tako, da plastelin ni v stiku z raztopino vzorca). Zunanjo površino kapilare dobro obrišemo preden jo vstavimo v steklen nosilec v resonatorju EPR-instrumenta. Vzorci: 1. Benzil (2-((1-oksil-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il)amino)-2-oksoetil)karbamat (Cbz-Gly- SL) C19H28N3O4 (362,44 g/mol) 34

39 2. t-butil (1-((1-oksil-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il)amino)-1-okso-3-fenilpropan-2-il) karbamat (Boc-Phe-SL) C23H36N3O4 (418,55 g/mol) 3. Biradikal: 4,4'-azandiilbis(2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oksil) (BiR) C18H37N3O2 (327,51 g/mol) 4. (2,2,6,6-Tetrametil-piperidin-1-il)oksil (TEMPO) C9H18NO (156,25 g/mol) 5. Natrijev ditionit (Na-ditionit) Na2S2O4 (174,107 g/mol) 35

40 Snemanje EPR-spektrov i. Vklopimo računalnik ii. Vklopimo EPR-spektrometer MiniScope (vsaj 30 min pred prvo meritvijo) iii. Zaženemo program Miniscope Control 6.51 (Slika 5) iv. Prilagodimo parametre meritve (glej poglavje Parametri meritve) in pritisnemo gumb apply params v. Vstavimo kapilaro z vzorcem v stekleno cevko v resonatorju vi. vii. Poženemo avtomatsko sklopitev (gumb MW adjust ko je vzorec sklopljen, se v oklepaju v polju gumba izpiše ready, na istrumentu pa se prižge zelena lučka 1 ) Poženemo meritev (gumb start) Slika 5. Okno programa MiniScope Control Parametri meritve i. Središčna jakost magnetnega polja (B0-field): za vse vzorce G 1 Če avtomatska sklopitev ni končana v 4 minutah, vklopite kontrolno enoto manual tuning in pritisnite gumb reset MW. Nato izklopite kontrolno enoto manual tuning in ponovno poženite avtomatsko sklopitev. 36

41 ii. iii. iv. Obseg meritve (Sweep): 70 G Časovni obseg meritve (Sweep time): 20 s Število ponovitev (Number(pass)): 1 če v spektru ni preveč šuma, sicer do 4 da izboljšamo razmerje signal/šum (S/N). v. Modulacijska amplituda (Modulation): 1000 mg naj bo manjša od širine črte (d) vi. vii. Atenuacija mikrovalov (MW atten): 10 db Ojačanje (Gain): 1 E 2 spekter naj sega skoraj do roba, ne sme pa ga»odrezati«shranjevanje spektrov Posnete spektre shranite (File/Save as) na dogovorjeno lokacijo z naslednjim načinom tvorbe imena: Akronim spojine_topilo Na primer: Cbz-Gly-SL_EtOH Analiza spektrov i. Odčitajte parametre spektra prikazane na Sliki 4 s pomočjo kurzorja (rdeča črta). ii. iii. iv. V meniju View izberite funkcijo Spectrum line parameters, ki v posebnem oknu prikaže parametre izbranega (povečanega) dela spektra. Zaženite program Analysis in naložite spekter, ki ga želite analizirati. Spekter dvakrat integrirajte. Zaženite program Multiplot in na isti graf naložite tri spektre za TEMPO v vodi, etanolu in cikloheksanu. Primerjajte a N spektrov. Izvozite dobljene spektre v program Excel (»File/Export«v programu Multiplot, nato»podatki/pridobi zunanje podatke Iz drugih virov«v programu Excel). 37

42 REZULTATI IN RAZPRAVA 1. Kakšen vpliv ima polarnost topila na konstanto hiperfine sklopitve a N? 2. Kako ta vpliv pojasnimo na molekularnem nivoju? Narišite resonančni strukturi nitroksidnega radikala TEMPO. 3. Kako tripletni kisik vpliva na širino črte nitroksidnega radikala? 4. V katerih topilih je kisik bolje topen: polarnih (npr. voda) ali nepolarnih (npr. cikloheksan)? 5. Kako bi izvedli EPR-meritev brez prisotnosti kisika v vzorcu? 38

43 Datum: Pregledal: 39

44 4. MASNA SPEKTROMETRIJA Vaja: Uporaba masne spektrometrije za določanje struktur spojin CILJI VAJE Spoznati osnove masne spektrometrije Spoznati ionizacijske metode v masni spektrometriji Spoznati mehanizem nastanka fragmentov iz organskih spojin Naučiti se branja masnih spektrov z odčitavanjem osnovnih vrednosti (m/z, relativna intenziteta signala) UVOD Masna spektrometrija je analizna tehnika, ki jo uporabljamo za določanje relativne molske mase, elementne sestave ter strukturnih lastnosti spojin (največkrat organskih spojin, vključno z makromolekulami). Proces merjenja poteka tako, da vzorec ( mol) najprej pretvorimo v plinasto stanje in ga ioniziramo, nato pa merimo relativno zastopanost ionov z različnim razmerjem med maso in nabojem (m/z). Glavni sestavni deli masnega spektrometra so ionski izvor, masni analizator in detektor. V ionskem izvoru masnega spektrometra nastajajo ioni. Poznamo več različnih metod za tvorbo ionov, vsem pa je skupno to, da vzorec najprej pretvorimo v plinasto stanje pod znižanim tlakom in ga nato ioniziramo. V masnem analizatorju se ioni pod vplivom elektromagnetnega polja ločijo v visokem vakuumu ( bar), ionski detektor pa nato izmeri intenziteto ionskega toka pri posamezni vrednosti m/z (Slika 1). Dobljeni rezultat imenujemo masni spekter, ki prikazuje odvisnost relativne zastopanosti ionov (intenzitete) od njihovega razmerja m/z (Slika 2). 40

45 Vnos vzorca Ionizacija Ionizacija z elektroni (EI) Kemijska ionizacija (CI) Ionizacija s hitrimi atomi (FAB) Ionizacija z desorpcijo ionov iz trdnega matriksa s pomočjo laserske svetlobe (MALDI) Ionizacija z razprševanjem raztopin v električnem polju (ESI) Kemijska ionizacija pri atmosferskem tlaku (APCI) Razvrščanje ionov Magnetni sektorski analizator Kvadrupolni analizator Masni analizator na osnovi časa preleta ionov (TOF) Ionska past Analiza MS spektra Detekcija ionov Elektronski pomnoževalnik Faradayeva kletka Scintilator Slika 1. Shematski prikaz delov masnega spektrometra. Relativna intenziteta (%) Slika 2. Masni spekter nikotina, posnet z ionizacijo z elektroni. Vrh z največjo maso na enoto naboja (m/z = 162) ustreza molekulskemu ionu in predstavlja molsko maso spojine, bazni vrh pri m/z = 84 pa je najvišji signal z relativno intenziteto 100%. Povzeto po [6]. 41

46 1. Vnos vzorca Za MS-analizo so primerni plinasti, tekoči in trdni vzorci. Ker razvrščanje in detekcija ionov potekata v plinasti fazi, je potrebno tekoče in trdne molekule najprej pretvoriti v plin. V primeru slabe hlapnosti vzorca je potrebno le-tega najprej segreti, kar lahko povzroči neželene kemijske spremembe. Pri zelo slabo hlapnih vzorcih lahko vzorec vnesemo neposredno v ionski izvor na posebnem nosilcu, ki ga po potrebi segrejemo. 2. Ionizacija vzorca Obstaja več različnih metod pretvarjanja vzorca v plinasto stanje in njegove ionizacije. Primernost vsake od ionizacijskih metod je odvisna od molske mase in polarnosti vzorca. Poznamo več ionizacijskih tehnik: 2.1 Ionizacija z elektroni (EI, electron impact) 2.2 Kemijska ionizacija (CI, chemical ionisation) 2.3 Desorpcijske metode ionizacije Ionizacija s hitrimi atomi (FAB, fast atom bombardment) in masna spektrometrija s sekundarnimi ioni (SIMS, secundary ion mass spectrometry) Ionizacija z desorpcijo ionov iz trdnega nosilca s pomočjo laserske svetlobe (MALDI, matrix assisted laser desorption ionisation) 2.4 Metode ionizacije z razprševanjem Ionizacija z razprševanjem raztopin v električnem polju (ESI, electrospray ionisation) Kemijska ionizacija pod atmosferskim tlakom (APCI, atmospheric pressure chemical ionisation) 42

47 2.1 Ionizacija z elektroni (EI) Ionizacija z elektroni (EI, angl. electron impact) je zgodovinsko gledano najbolj osnoven način ionizacije. Pri tej tehniki ionizacije vzorec najprej uparimo s segrevanjem v vakuumu in ga nato obstreljujemo s tokom pospešenih elektronov. Elektroni, ki jih proizvajamo s pomočjo kovinske žice, segrete na več tisoč stopinj Celzija, dobijo v električnem polju z visoko električno napetostjo veliko hitrost in energijo (70 ev). Ob trčenju z molekulo v plinastem stanju zato curek elektronov iz molekule izbije elektron, tako da iz nje nastane molekulski ion (radikal kation M + ). M + e - M + + 2e - Največkrat pride do izbitja najšibkeje vezanega elektrona v HOMO orbitali z najvišjo potencialno energijo oziroma najnižjo energijo ionizacije. Verjetnost za izbitje elektronov pada v naslednjem vrstnem redu: Nevezni elektroni > Elektroni v dvojnih vezeh > Elektroni v enojnih vezeh Pozitivno nabita odbojna plošča nato usmeri nastale ione do ionskih leč (pospeševalnih plošč), ki zaradi naraščajočega negativnega naboja pospešijo in usmerijo tok ionov proti masnemu analizatorju (Slika 3). Ob trku s curkom elektronov sicer nastane tudi manjši delež negativno nabitih ionov, vendar se ti ujamejo na pozitivno nabiti odbojni plošči. Nekateri instrumenti omogočajo zamenjavo polaritet odbojnih in pospeševalnih plošč, kar omogoči spremljanje toka negativno nabitih ionov v MS-instrumentu. Ker je energija curka elektronov (70 ev) približno desetkrat višja od ionizacijske energije (pribl. 7 ev), presežna energija poveča vibracijsko energijo molekule, kar vodi v fragmentacijo molekulskega iona (cepitev molekule). Pri tem nastajajo radikali in fragmentni ioni F +, ki jih imenujemo tudi hčerinski ioni. M + R + F + Metoda EI je primerna za vse hlapne spojine z molsko maso majšo od 10 3 Da, ni pa primerna za velike nehlapne makromolekule in termolabilne spojine. Pozitivna lastnost metode je tudi njena ponovljivost, kar lahko izkoristimo za potrjevanje identitete vzorca, saj lahko dobljeni spekter primerjamo s podatki iz podatkovnih baz, kjer je zbranih tisoče MS spektrov različnih 43

48 spojin. (Pre)velika fragmentacija je lahko tudi pomanjkljivost, saj nekatere molekule prehitro fragmentirajo, zato včasih ne vidimo molekulskega iona in ne moremo določiti molekulske mase. Slika 3. Osnovna shema EI-ionizacijske komore. Povzeto po [1]. Kemijska ionizacija (CI) Pri kemijski ionizaciji (CI, angl. chemical ionization) s tokom elektronov najprej ioniziramo plinasti medij, ki nato deluje kot močna kislina in ionizira preiskovano molekulo. Kot plinasti medij lahko uporabimo številne pline, največkrat pa se uporabljajo metan, amonijak, izobutan in metanol. Ker je plinasti medij v prebitku glede na analizirano molekulo (razmerje 10 3 :1), curek elektronov ionizira samo molekule reagenčnega plina. 44

49 1. Stopnja: ionizacija plinastega medija 2. Stopnja: ionizacija analita Slika 4. Potek ionizacije reagenčnega plinastega medija in vzorca pri metodi CI. Kot vidimo na Sliki 4, je končni produkt kemijske ionizacije molekulski ion [M+H] + z relativno majhno dodatno energijo, zato je obseg fragmentacije manjši kot pri EI-metodi. Poleg molekulskega iona nastanejo v manjši meri tudi adukti s C2H5 +. Poleg pozitivno nabitih delcev lahko kot produkt ionizacije nastanejo tudi negativno nabiti molekulski ioni. Zaradi relativno velike koncentracije nosilnega plina so trki med elektroni in molekulami plina pogostejši, kar zniža hitrost elektronov in poveča verjetnost njihovega privzema v zunanjo orbitalo vzorca ali nosilnega plina. V primeru slednjega ta deluje kot baza in odcepi proton iz vzorca. Podobno kot pri EI, mora biti tudi pri CI vzorec lahko hlapen, kar pomeni, da metoda ni primerna za molekule z veliko molekulsko maso in za termolabilne spojine. CI je milejša metoda kot EI, zato jo uporabljamo takrat, kadar pri EI zaradi prevelike fragmentacije ne vidimo molekulskega iona. 2.2 Desorpcijske metode ionizacije Desorpcijske metode ionizacije (MALDI, FAB, SIMS) spadajo med t.i. mile metode ionizacije (soft ionization), saj je fragmentacija ob ionizaciji relativno majhna. V masnem spektru tako vidimo predvsem molekulski ion, manj intenzivno pa se pojavijo signali, ki so posledica fragmentacije molekule. Med desorpcijske metode ionizacije spadajo masna spektrometrija s sekundarnimi ioni (SIMS), ionizacija s hitrimi atomi (FAB) in ionizacija z desorpcijo ionov iz trdnega nosilca s pomočjo laserske svetlobe (MALDI). V nasprotju z EI in CI, za desorpcijske metode ionizacije ne potrebujemo hlapnega vzorca, kar je zelo dobrodošlo pri analizi bioloških makromolekul, ki so večinoma velike, občutljive, polarne in nehlapne spojine. Vzorec običajno raztopimo ali dispergiramo v nosilcu z nizkim tališčem (matriksu), ki pomaga pri ionizaciji in prehajanju vzorca v plinasto fazo. 45

50 2.2.1 Ionizacija s hitrimi atomi (FAB) in masna spektrometrija s sekundarnimi ioni (SIMS) Pri ionizaciji s hitrimi atomi (FAB, angl. fast atom bombardment) in masni spektrometriji s sekundarnimi ioni (SIMS, angl. secondary ion mass spectrometry) obstreljujemo disperzijo vzorca v nosilcu (največkrat glicerol, tioglicerol, 2-nitrobenzilmetanol, trietanolamin ali ditiotreitol, Slika 5) s hitrim tokom atomov (Ar ali Xe pri FAB) ali ionov (Ar + ali Cs + pri SIMS) z veliko energijo (6-9 kev). Ob tem pride do prenosa energije iz hitrih delcev v nosilec, kar povzroči cepitev intermolekularnih vezi, desorpcijo vzorca in njegov prehod v plinasto fazo. Pri obeh tehnikah lahko nastanejo tako pozitivno ([M+H] + ) kot negativno nabiti ioni ([M-H] - ), kar je odvisno od kislosti/bazičnosti vzorca in nosilca. Če je nosilec bolj kisel kot vzorec nastane večinoma [M+H] + ion, če je nosilec manj kisel od vzorca pa večinoma [M-H] - ion. V spektru lahko poleg tega vidimo tudi signale gradnikov nosilca, npr. ob uporabi propan-1,2,3-triola lahko vidimo več signalov za protonirane oligomere [(HOCH2CHOHCH2OH)nH] +. Metodi sta občutljivi na anorganske nečistote, tako da lahko poleg ali namesto molekulskega iona dobimo še signal za ion [M+Na] + ali [M+K] +. SIMS in FAB sta primerni za analizo velikih, nehlapnih molekul z relativno molsko maso do , kot so peptidi in oligonukleotidi. Slika 5. Strukture nosilcev, ki se uporabljajo pri tehnikah FAB in SIMS Ionizacija z desorpcijo ionov iz trdnega nosilca s pomočjo laserske svetlobe (MALDI) Osnovni princip ionizacije z desorpcijo ionov iz trdnega nosilca s pomočjo laserske svetlobe (MALDI, angl. matrix assisted laser desorption ionization) je podoben ionizaciji FAB in SIMS, le da pri MALDI kot vir energije uporabimo pulzni laserski žarek, s katerim obsevamo nosilec v katerem je dispergirana analizirana spojina (Slika 6). Kot nosilci (Slika 7) se največkrat uporabljajo aromatske in heteroaromatske karboksilne kisline z nizko molekulsko maso in visoko absorptivnostjo UV- ali IR-svetlobe (imajo kromofor). Nosilec absorbira energijo fotona laserskega žarka, kar povzroči segrevanje, ionizacijo in sublimacijo molekul nosilca, z njimi pa tudi prehod vmešanih molekul nehlapnega vzorca v plinsko fazo in njihovo ionizacijo. Pri tej metodi se tvorijo predvsem protonirani molekulski ioni [M+H] +, poleg tega pa lahko v MSspektru vidimo tudi signale nosilca. Metoda je primerna za molekule z zelo širokim razponom 46

51 molskih mas, od manjših polimerov do velikih nehlapnih oligosaharidov, oligonukleotidov, polipeptidov in protiteles do molskih mas 600 kda. Dobra lastnost MALDI metode je tudi to, da za analizo potrebuje samo nekaj femtomolov vzorca (1x10-15 mol). Slika 6. Osnovni princip tehnike MALDI. Povzeto po [5]. Slika 7. Strukture najpogostejših nosilcev, ki se uporabljajo pri metodi MALDI. 2.3 Metode ionizacije z razprševanjem Ionizacija z razprševanjem raztopin v električnem polju (ESI) Pri ionizaciji z razprševanjem raztopin v električnem polju (ESI, angl. electrospray ionization) vzorec raztopimo v zmesi organskih topil (običajno acetonitril ali metanol) in vode. Zraven dodamo modifikator ph (npr. mravljično ali ocetno kislino), ki zagotovi ionizacijo že v raztopini. ESI je edina metoda, pri kateri se vzorec ionizira še pred prehodom v plinasto fazo, zato v spektru večinoma opazimo le molekulski ion [M+H] + ali [M-H] - z zelo malo fragmentacije. Pri tej tehniki raztopljen vzorec s potisnim plinom dovajamo v ionski izvor skozi kovinsko kapilaro, ki ima visok pozitiven električni potencial (nekaj kv) glede na vhodno režo v masni analizator. Na konici kapilare se raztopina vzorca zaradi elektrostatske disperzije razprši v fine, pozitivno nabite kapljice (aerosol). V evakuiran in ogrevan prostor ionskega izvora vpihujemo inerten plin (N2) zaradi česar topilo odpareva, kapljice se manjšajo, kohezivne 47

52 sile topila izginejo, nazadnje pa ostanejo le nesolvatirani (goli) pozitivni ioni vzorca (Slika 8). Topila, ki jih uporabljamo pri ESI so združljiva z reverznofaznim HPLC, zato ta tip ionizacije pogosto uporabljamo v kombinaciji s tekočinsko kromatografijo (LC-MS). V primeru velikih bioloških molekul z več kislimi ali bazičnimi funkcionalnimi skupinami običajno dobimo večkratno nabit molekulski ion, kar je dodatna prednost tehnike ESI, saj zaradi nižjega razmerja m/z ne potrebujemo detektorja z velikim masnim razponom. Tehnika je zato primerna za analizo velikih biomolekul z relativno molsko maso večjo od 100 kda. Metoda je zelo občutljiva na primesi v topilih, še posebno na kovinske ione, v prisotnosti katerih dobimo signale, ki ustrezajo m/z [M+Na] + ali [M+NH4] +. ESI-MS ni omejen samo na velike makromolekule, temveč lahko s to metodo analiziramo tudi majhne molekule z relativno molsko maso nad 100. Slika 8. Osnovni princip delovanja ESI-ionizacije. Povzeto po [5] Kemijska ionizacija pri atmosferskem tlaku (APCI) Kemijska ionizacija pri atmosferskem tlaku (APCI, angl. atmospheric pressure chemical ionization) je zelo podobna tehniki CI, le da APCI poteka pri atmosferskem tlaku. Pri APCI s posebno elektrodo protoniramo molekule topila v plinastem stanju (voda, MeOH), ta pa nato deluje kot kislina (H3O +, MeOH2 + ) ali baza (OH -, MeO - ) pri ionizaciji vzorca. Raztopino vzorca nato razpršimo skozi ogrevano kapilaro in kot produkt dobimo molekulske ione v obliki [M+H] + ali [M-H] -. Ioni nato potujejo proti analizatorju pod vplivom električnega polja. Tudi APCI-način ionizacije je tako kot ESI združljiv s tekočinsko kromatografijo. 48

53 Preglednica 1. Povzetek ionizacijskih metod in njihovih lastnosti Ionizacijska Molekulski Lastnosti Vzorec Vnos vzorca Masa metoda ion metode EI M +, M - Majhne hlapne spojine Groba metoda, GC, tekoča pridobimo ali trdna 10 3 strukturne sonda informacije GC, tekoča CI [M+H] +, [M+X] + Majhne hlapne spojine ali trdna proba 10 3 Mila metoda APCI [M+H] +, LC ali [M+X] +, [M- Majhne hlapne spojine injekcija 2x10 3 Mila metoda H] - ESI Mila metoda, [M+nH] n+, Peptidi, nehlapne LC ali 2x10 5 večkratno nabiti [M-nX] n- spojine injekcija ioni FAB Ogljikovi hidrati, Mila, vendar bolj V [M+H] +, [M- organokovinske groba metoda viskoznem 6x10 3 H] - spojine, peptidi, kot ESI ali nosilcu nehlapne spojine MALDI MALDI Peptidi, nukleotidi, [M+H] +, Trdni majhne hlapne in [M+X] + nosilec nehlapne spojine 5x10 5 Mila metoda 3. Fragmentacija Pri ionizaciji spojine dobimo molekulski ion (M + ), iz katerega lahko po analizi masnega spektra razberemo molekulsko maso. Molekulski ion je pogosto v energijsko vzbujenem stanju s presežkom vibracijske energije, kar lahko vodi v fragmentacijo. Pri EI in CI je fragmentacija bolj obsežna kot pri nekaterih milejših tehnikah ionizacije, kot sta ESI in FAB. Molekulski ion lahko fragmentira na dva načina, kot je prikazano na Sliki 9. Ob tem lahko dobimo kation in radikal ali radikal kation in nevtralno spojino. Tako kation kot radikal kation lahko fragmentirata še naprej, kar vodi v nastanek ionov s še manjšo maso. 49

54 Slika 9. Dva možna načina fragmentacije molekulskega iona. Verjetnost cepitve določene vezi je odvisna od jakosti vezi in od stabilnosti fragmentov, ki pri tem nastanejo (Stevensonovo pravilo). Najbolj verjetna je fragmentacija, kjer ostane pozitivni naboj na fragmentu z najnižjo ionizacijsko energijo (na najbolj stabilnem fragmentu). Poznamo več vrst fragmentacij: Cepitev alifatskih vezi Benzilna cepitev Alfa-cepitev McLaffertyjeva premestitev Retro Diels-Alderjeva reakcija Druge vrste cepitev 3.1 Cepitev alifatskih vezi Pri fragmentaciji alkanov pride do izbitja elektrona iz σ-vezi, kot prikazuje Slika 10. Ker je izbitje elektrona mogoče tako v osrednjem kot v distalnem delu molekule, v spektru enostavnih alifatskih spojin navadno dobimo večje število signalov za hčerinske ione, ki se razlikujejo za m/z 14 (CH2 skupina). 50

55 Alkani z ravnimi verigami Slika 10. Možni načini fragmentacije n-heksana pri EI ionizaciji (zgoraj) in njegov masni spekter (spodaj). Povzeto po [1]. Alkani z razvejanimi verigami V primeru razvejanih verig se razpad začne na najbolj razvejanem ogljikovem atomu, kot je prikazano na Sliki 11. Slika 11. Najverjetnejši način fragmentacije v 3,3-dimetilpentanu, kot primeru razvejanega alkana. Pri razvejanih karbokationih je zaradi pozitivnega induktivnega efekta alkilnih skupin njihova stabilnost večja. Zaradi energetsko manj ugodne fragmentacije je relativna intenziteta molekulskega iona največja pri alkanih z ravnimi verigami in pada z razvejanostjo v naslednjem vrstnem redu:. ArCH2 +, CH2=CHCH2 > R3 + > R2CH + > RCH2 + > CH3 + Poleg tega intenziteta molekulskega signala v homologni seriji spojin pada tudi z daljšanjem alkilne verige. 51

56 Cikloalkani navadno tvorijo intenzivne molekulske ione, saj pride pri fragmentaciji do cepitve dveh vezi in odcepa npr. etena (M-28), kar je energetsko manj ugodno. V primeru substituiranih cikloalkanov je zato favorizirana cepitev stranske verige in nastanek karbokationa na cikloheksanskem obroču (Slika 12). Slika 12. Fragmentacija substituiranih cikloheksanov. 3.2 Benzilna cepitev Pri benzilnih derivatih pride do cepitve vezi med benzilnim fragmentom in sosednjo skupino, ki je lahko CH2 ali heteroatom. Ob premestitvi benzilne CH2 skupine karbokationa v benzenov obroč nastane tropilijev kation, ki je cikličen, planaren in ima šest π-elektronov v veznih π orbitalah ter je zato še posebno stabilen. (Slika 13). Do benzilne cepitve pride npr. v molekuli benzil bromida (Slika 14). Slika 13. Nastanek tropilijevega kationa Slika 14. EI masni spekter benzil bromida. V spektru je viden signal z m/z 91, ki ustreza tropiljijevemu kationu. Povzeto po [1]. Tropilijev kation lahko fragmentira naprej do acetilena in ciklopentadienilnega kationa, ta pa nato naprej do še ene molekule acetilena in ciklopropenilnega kationa. Kadar je benzenov obroč substituiran z alkilno verigo, lahko po omenjenem mehanizmu dobimo substituirane derivate (Slika 15). 52

57 Slika 15. Fragmentacija tropilijevega kationa. Če je na benzenovem obroču propilni substituent ali daljša alkilna veriga, lahko poleg benzilne cepitve pride tudi do McLaffertyjeve premestitve (glej McLaffertyjevo premestitev), pri kateri nastane fragment z m/z Alfa-cepitev Pri molekulah, ki vsebujejo heteroatome (npr. O, N, manj pogosto Cl, Br itd.) je zelo pogosta cepitev vezi med α- in β-atomom glede na heteroatom. Pri tem nastane karbokation, ki je stabiliziran z neveznim elektronskim parom heteroatoma (Slika 16). Alfa-cepitev ni zelo pogosta pri alkil halogenidih, pri katerih tvorba pozitivnega iona ni energetsko ugodna. Pri haloalkanih je najpogostejši način fragmentacije izguba halidnega radikala in tvorba fragmenta [M - X] + Slika 16. a) Mehanizem α-cepitve in b) prikaz dveh možnih α-cepitev v 4-hidroksiacetofenonu. Pri alkenih je favorizirana alilna α-cepitev (Slika 17) in odcep alilnega karbokationa (m/z 41). Nastali alilni kation je resonančno stabiliziran, zato je alilna α-cepitev energijsko favoriziran proces. 53

58 Slika 17. Alilna α-cepitev 3.4 McLaffertyjeva premestitev McLaffertyjeva premestitev je značilna za spojine z dvojno vezjo (estre, ketone, olefine, aromate, kisline, derivate kislin, oksime itd.), ki imajo na γ-ogljiku glede na dvojno vez vezan vodik. Pri reakciji pride do premestitve vodikovega atoma iz γ-ogljika na atom v dvojni vezi s hkratno premestitvijo dvojne vezi preko šestčlenskega prehodnega stanja (Slika 18). Slika 18. McLaffertyjeva premestitev v a) heptan-3-onu in b) butilbenzenu. 3.5 Retro Diels-Alderjeva premestitev Retro Diels-Alderjeva premestitev je pogosta pri šestcikličnih spojinah z dvojno vezjo, pri katerih lahko pride do odpiranja obroča. Molekula, ki lahko vsebuje enega ali več heteroatomov, ob tem fragmentira na en in dien, pri čemer ostane naboj na dienu, kar je prikazano na primeru benzo[c]pirana (Slika 19) Ker je reakcija premestitve po mehanizmu enaka obrnjeni Diels-Alderjevi reakciji jo imenujemo retro Diels-Alderjeva premestitev. 54

59 Slika 19. a) Splošna shema retro Diels-Alderjeve premestitve in b) Primer retro Diels-Alderjeve premestitve v benzo[c]piranu. Povzeto po [1]. 3.6 Druge vrste cepitev Pri fragmentacijah alkoholov, aminov, tiolov, karboksilnih kislin in kloridov se pogosto odcepijo majhne nevtralne molekule, kot so H2O, H2S, NH3, CO, CO2, nižji alkoholi in amini, HCl, ipd. 4. Masni analizatorji Po nastanku molekulskega iona in fragmentaciji je naslednja stopnja pri masni spektrometriji analiza ionov v masnem analizatorju. Masni analizator je del inštrumenta v katerem se nastali ioni ločijo po vrednosti m/z z uporabo električnega in magnetnega polja. 55

60 Poznamo več vrst masnih analizatorjev: Magnetni sektorski masni analizator Kvadrupolni masni analizator Masni analizator na osnovi časa preleta ionov Masni analizator z ionsko pastjo 4.1 Magnetni sektorski masni analizator (masni spektrometer z dvojnim fokusiranjem) Magnetni sektorski masni analizator je najstarejši tip masnega analizatorja, ki za analizo ionov uporablja magnetno polje. Ko linearno gibajoči se ion zapusti ionski izvor, se v električnem polju najprej pospeši in nato prileti v območje magnetnega polja, ki je pravokotno glede na smer njegovega gibanja. Njegova hitrost ostane konstantna, njegova pot pa se ukrivi v krožnico v ravnini, pravokotni na smer magnetnega polja. Odnos med radijem gibanja iona (r), jakostjo magnetnega polja (B), nabojem iona (z), maso iona (m) in električno napetostjo (V) opisuje enačba: = 2 Pri meritvi navadno električno napetost V, s katero pospešujemo ione pred vstopom v masni analizator, ohranjamo konstantno, zvezno pa spreminjamo polje B. Krožnica potovanja ionov je določena z geometrijo magneta, zato lahko pridejo skozi režo na kolektorju samo tisti ioni, ki imajo pri določeni gostoti magnetnega polja pravo vrednost m/z glede na zgornjo enačbo (Slika 20). Omenjeni analizator daje dobro ločbo ionov, ki se razlikujejo za vsaj eno masno enoto. Če magnetni analizator povežemo z elektrostatičnim analizatorjem, ki poskrbi, da imajo vsi delci, ki vstopijo v magnetni analizator, enako hitrost, potem lahko dosežemo določitev mase do približno 1 ppm natančno (masni spektrometer z dvojnim fokusiranjem). 56

61 Slika 20. Magnetni sektorski masni analizator. Povzeto po [1]. 4.2 Kvadrupolni masni analizator Kvadrupolni masni analizator je sestavljen iz dveh parov vzporednih elektrod v obliki palic z nasprotnimi polaritetami. Prva elektroda v obeh parih je priključena na enosmerno električno napetost (U), druga pa na radiofrekvenčno napetost (V) s 180 stopinjskim faznim zamikom med obema palicama. Taka razporeditev elektrod deluje kot ionski filter, na podoben način kot pri magnetnem sektorskem analizatorju, le da tu spreminjamo tako U kot V ob konstantnem razmerju U/V, kar vpliva na potovanje ionov z različnim razmerjem m/z. Ločitev ionov glede na vrednost m/z temelji na stabilnosti oscilirajoče poti ionov skozi kvadrupolno električno polje. Pri določenih pogojih napetosti na elektrodah lahko skozi ta filter prodre samo ion s točno določeno vrednostjo m/z, ostali ioni pa svojo pot končajo na elektrodah (Slika 21). Kvadrupolni masni analizator lahko najdemo v večini GC-MS in nekaterih LC-MS sistemih. V primerjavi z magnetnim sektorskim analizatorjem so kvadrupolni analizatorji cenejši in zasedejo manj prostora, vendar je ločljivost med ioni z zelo podobnimi masami slabša. 57

62 Stabilna pot (zaznamo ione) (za Detektor Nestabilna pot (ionov ne zazanamo) Ioni v plinasti fazi z različnimi vrednostmi m/z Elektrodne palice Slika 21. Kvadrupolni masni analizator. Povzeto po [1]. 4.3 Masni analizator na osnovi časa preleta ionov Masni analizator na osnovi časa preleta ionov (TOF, angl. time of flight) ločuje ione na podlagi razlike v hitrosti njihovega potovanja oziroma časa, ki ga porabijo, da dosežejo detektor. V nasprotju z ostalimi masnimi analizatorji poteka pri TOF analizatorjih ločba v prostoru, kjer ni elektromagnetnega polja. Pred vstopom v del TOF analizatorja, ki je namenjen potovanju ionov, ione pospešimo z znano električno napetostjo pri čemer vsi ioni z enakim nabojem dobijo enako kinetično energijo. Hitrost potovanja ionov (v) skozi analizator je obratno sorazmerna z maso ionov. Čas (t), ki je potreben, da ion preleti pot (L) od vstopa v merilno cev do detektorja, je določen z enačbo: = 2 TOF masni analizatorji so eni izmed najbolj občutljivih masnih analizatorjev, zato jih lahko uporabljamo pri analizi makromolekul. Slaba lastnost TOF analizatorjev je, da je njihova ločljivost majhna. Glavna prednost je hitrost analize in zelo nizka meja detekcije, zato se lahko uporablja pri analizi ostankov eksplozivov, strupenih plinov ali nedovoljenih drog na nadzornih postajah na letališčih in v vojski. Prav tako se uporablja za študij kratkoživih spojin, kar je uporabno predvsem pri kinetičnih študijah zelo hitrih kemijskih reakcij (npr. pri eksplozijah). 58

63 4.4 Masni analizator z ionsko pastjo Osnovni princip delovanja ionske pasti je podoben kvadrupolnemu analizatorju, le da tu kvadrupol nastane v tridimenzionalni celici pod vplivom obročnih elektrod, pri čemer ne pride do filtriranja ionov, temveč se ioni zadržijo v pasti in oscilirajo v koncentričnih krožnicah (trajektorijah). Po spremembi radiofrekvenčnega potenciala in pod vplivom kvadrupolnega radiofrekvenčnega električnega polja nato nadzorovano potujejo proti izhodu v odvisnosti od njihovega razmerja m/z. Vzorec lahko ionizira v sami pasti ali pa se ga injicira skozi odprtino v ionsko past. Glavne prednosti ionske pasti so kompaktnost, enostavno povezovanje s kromatografskimi tehnikami, visoka občutljivost in enostavnost, s katero lahko izvajamo MS- MS analize. Slabost je zelo zahtevna kvantifikacija. Preglednica 2. Masni analizatorji, njihove prednosti in omejitve. Masni analizator Prednosti Omejitve Dobra ponovljivost, Majhna občutljivost, visoka Magnetni sektorski primeren za kvantitativno cena, neprimernost za pulzne analizator analizo metode Kvadrupolni analizator Majhna ločljivost, Dobra ponovljivost, nizka neprimernost za pulzne cena, majhna velikost metode Masni analizator na osnovi Velika hitrost analize, časa preleta ionov primeren za pulzne metode, Majhna ločljivost največji masni razpon Ionska past Kompaktnost, enostavno povezovanje s kromatografskimi tehnikami, visoka občutljivost Zahtevna kvantifikacija, 59

64 VIRI 1. Anderson, R. J.; Bendell, D. J.; Groundwat, P. W. Mass spectroscopy. V Organic Spectroscopic Analysis, E W Abel, Ed: RSC publishing: Cambridge, 2004; str Uggerud, E.; Petrie, S.; Bohme, D. K.; Turecek, F.; Schröder, D.; Schwarz, H.; Plattner, D.; Wyttenbach, T.; Bowers, M. T.; Armentrout, P. B.; Truger, S. A.; Junker, T.; Suizdak, G.; Brönstrup, M. Modern Mass Spectroscopy. V Topics in Current Chemistry, Springer-Verlag, Berlin, 2003; str , Gauglitz, G.; Vo-Dinh, T. Handbook of Spectroscopy. G. Gauglitz, T Vo-Dinh, Eds, Wiley-VCH, Weinheim, 2003, str Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., Vyvyan, J. A. Introduction to Spectroscopy, 4th edition, Belmont, Brooks/Cole, 2009, str Mass spectrometry for drug discovery and drug development, Korfmacher, W. A. Ed., Wiley, 2013, str Berger, S.; Sicker, D. Classics in spectroscopy, Wiley, 2009, str

65 5. POLARIMETRIJA Vaja: Določanje optične sučnosti izbranih vzorcev CILJI VAJE Spoznati teoretične osnove polarimetrije Spoznati osnovne dele polarimetra Spoznati način priprave vzorcev in meritev optične sučnosti S pomočjo izmerjenih vrednosti optičnih sučnosti izračunati koncentracije neznanih vzorcev UVOD Polarimetrija je metoda, s katero merimo zasuk ravnine polarizacije linearno polarizirane svetlobe, ko ta preide skozi raztopino optično aktivne snovi. Optično aktivne so spojine, ki imajo v molekuli enega ali več asimetričnih centrov ali kakšen drug element asimetrije. Če je v vzorcu več optično aktivnih spojin, je optični zasuk vzorca enak vsoti optičnih zasukov posameznih komponent. Običajna svetloba je transverzalno elektromagnetno valovanje, pri katerem vektor električne poljske jakosti niha v vseh ravninah, ki so pravokotne na smer razširjanja žarka. Za merjenje optične sučnosti taka svetloba ni primerna in jo je potrebno predhodno polarizirati. Linearno polarizirano svetlobo dobimo s prehodom običajne svetlobe skozi npr. Nikolovo prizmo, Glanovo prizmo, polaroidne plasti ali drug primeren polarizator. Pri linearno polarizirani svetlobi vektor električne poljske jakosti niha samo v eni ravnini, ravnini polarizacije, ki je pravokotna na smer razširjanja žarka. Za razliko od običajne svetlobe, ki je sestavljena iz elektromagnetnih valovanj z različnimi valovnimi dolžinami, pri polarimetriji uporabljamo monokromatsko svetlobo, s točno določeno valovno dolžino. Polarimeter je aparatura, ki jo uporabljamo za merjenje kota zasuka optično aktivnih spojin. Kot izvora svetlobe se običajno uporabljata natrijeva ali živosrebrna žarnica. Za merjenje kota zasuka najpogosteje uporabljamo monokromatsko svetlobo z valovno dolžino D-linije natrijeve svetilke (λ = nm) ali eno od valovnih dolžin živosrebrne svetilke (λ = 578, 546, 436 in 365 nm), ki gre najprej skozi polarizator, po prehodu skozi raztopino optično aktivne snovi pa 61

66 s pomočjo analizatorja določimo kot zasuka. Detekcija svetlobe, ki preide skozi analizator poteka s pomočjo fotoelementov in sekundarnega elektronskega pomnoževalca. Na zaslonu dobimo izpis izmerjenega kota zasuka v kotnih stopinjah. Slika 1. Shematski prikaz polarimetra po Lippichu. Optično aktivne spojine lahko sučejo ravnino linearno polarizirane svetlobe: a) v desno, v smeri urinega kazalca, pozitivno; simbol: d ali (+) b) v levo, nasproti smeri urinega kazalca, negativno; simbol: l ali (-) Specifična sučnost je karakteristična konstanta optično aktivnih spojin in jo izrazimo z enačbo: = specifična sučnost raztopine izražena v o (kotnih stopinjah) ml dm 1 g 1, (vendar se v praksi podaja brez enot) pri valovni dolžini nm (natrijeva D-linija) in temperaturi 20 o C α izmerjeni kot zasuka v kotnih stopinjah ( o ) l c dolžina kivete, izražena v decimetrih koncentracija raztopine v g/ml Običajno izražamo koncentracijo v g/100 ml, zato se enačba spremeni v: = 100 Iz zgornje enačbe lahko ob poznavanju specifične sučnosti in izmerjenega kota zasuka izračunamo koncentracijo optično aktivne spojine v raztopini. 62

67 Ker je specifična sučnost odvisna od topila in včasih tudi od koncentracije optično aktivne spojine, je potrebno poleg njene vrednosti vedno navesti tudi ta dva podatka, tako da je običajen način podajanja specifične sučnosti npr. = (c 0.75, metanol), pri čemer je koncentracija podana v g/100 ml. Na izmerjeni kot zasuka vpliva več dejavnikov, ki jih moramo pri načrtovanju in izvedbi meritev upoštevati: Valovna dolžina polarizirane svetlobe. Ravnina polarizacije kratkovalovne modre svetlobe se običajno zasuče bolj kot ravnina dolgovalovne rdeče svetlobe. Temperatura. Ker na izmerjeni kot zasuka vpliva tudi temperatura, je potrebno pri večjih zahtevah natančnosti uporabiti kivete z vodnimi plašči. Temperaturo tekočine, ki teče skozi plašč lahko nadzorujemo s termostatom. Topilo. Menjava topila lahko povzroči spremembo velikosti kota zasuka in v izjemnih primerih tudi spremembo smeri zasuka (npr. kloramfenikol v etil acetatu je levosučen, v etanolu pa desnosučen). Število delcev v optični poti. Pri trdnih in tekočih vzorcih je optični zasuk odvisen od debeline plasti, pri raztopinah pa od dolžine kivete in koncentracije. Pri večini raztopin je v omejenem koncentracijskem območju specifični zasuk od koncentracije neodvisna konstanta, vendar pa poznamo tudi številne spojine, pri katerih je specifični zasuk odvisen od koncentracije raztopine (npr. vinska kislina) oz. lahko pride pri različnih koncentracijah celo do spremembe smeri zasuka (npr. jabolčna kislina). Pri merjenju kota zasuka tekočin uravnamo vrednost nič napram zraku (prazna kiveta), pri meritvah v raztopinah pa napram uporabljenemu topilu. Pri polnjenju kivete je pomembno, da uporabljamo le bistre raztopine brez zračnih mehurčkov. Močno obarvane raztopine lahko zaradi absorpcije svetlobe motijo meritev. Rezultat meritve je povprečna vrednost kota zasuka najmanj petih meritev. VIRI 1. Rücker, G.; Neugebauer, M.; Willems, G. G. Chiroptische Analysenmethoden. V Instrumentelle Pharmazeutische Analytik, 3. izdaja: Stuttgart, 2001; str

68 EKSPERIMENTALNI DEL 1. Mutarotacija D-glukoze in D-galaktoze Mutarotacija je sprememba specifične sučnosti sveže pripravljene raztopine optično aktivne spojine, kot posledica spontane asimetrične pretvorbe. Rezultat je konstantna končna vrednost specifične sučnosti, zaradi vzpostavitve ravnotežja med najmanj dvema različnima spojinama, npr. epimeroma. Slika 2. Predstavitev mutarotacijskega ravnotežja v primeru D-glukoze. S spremljanjem spremembe kota zasuka boste opazovali mutarotacijo dveh sladkorjev, D- glukoze in D-galaktoze. Na podlagi izmerjenega kota zasuka obeh sladkorjev v ravnotežju, ki se vzpostavi po približno 12 urah, in spodaj navedenih podatkov, boste določili sestavo zmesi D-glukoze in D-galaktoze. Eksperimentalni del: V 100 ml merilni bučki pripravimo vodne raztopine sladkorjev (Dglukoze in D-galaktoze) s koncentracijo 10 g/100 ml ali 2.5 g/100 ml. Vsem raztopinam določimo kot zasuka po vzpostavitvi ravnotežja, t.j. po približno 12 urah. 1. Iz rezultatov meritev in iz podatka, da ima čista α-d-galaktoza pod navedenimi pogoji specifično sučnost = , čista β-d-galaktoza pa = izračunajte sestavo zmesi raztopine galaktoze po vzpostavitvi ravnotežja. Rezultat podajte kot % α-dgalaktoze in % β-d-galaktoze. 2. Ravnotežna zmes glukoze je sestavljena iz 36.5% α-anomera in 63.5% β-anomera. Čisti α- anomer ima pod enakimi pogoji specifični zasuk = S pomočjo teh podatkov in rezultatov meritev mutarotacije izračunajte specifično sučnost β-d-glukoze. 3. Vzorec, ki ga boste dobili na vajah vsebuje zmes D-glukoze in D-galaktoze. Koncentracija vzorca je 10 g/100 ml. S pomočjo zgoraj dobljenih podatkov in merjenja kota zasuka po vzpostavitvi ravnotežja v vodni raztopini vzorca določite odstotno sestavo zmesi, ki vsebuje D-glukozo in D-galaktozo. 64

69 2. Določanje vsebnosti askorbinske kisline v vzorcu Dobili boste vzorec čiste askorbinske kisline in vzorec askorbinske kisline, ki vsebuje kot primes neznano količino optično neaktivne nečistote. Oba vzorca raztopite v vodi, tako da dobite koncentracijo raztopine 10 g/100 ml. Določite kot zasuka obeh raztopin in izračunajte vsebnost askorbinske kisline v vzorcu. Polarimeter Meritve boste izvajali na polarimetru proizvajalca Perkin Elmer, model 241MC. Sestavni deli: a) Izvor svetlobe Izbiramo lahko med dvema izvoroma svetlobe: natrijevo ali živosrebrno žarnico. Za merjenje kota zasuka najpogosteje uporabljamo monokromatsko svetlobo D-linije natrijeve svetilke (λ = 589 nm) ali eno od valovnih dolžin živosrebrne svetilke (λ = 578, 546, 436 ali 365 nm). b) Monokromator Kot monokromator uporabljamo uklonsko mrežico. Širino reže (od mm do 3 mm) uravnamo glede na izvor svetlobe. Podatke najdemo v navodilih zraven polarimetra. c) Polarizator, analizator Glanova optična prizma iz kalcita. d) Detektor 65

70 INSTRUMENTALNA FARMACEVTSKA ANALIZA: Vaje in seminarji Fotopomnoževalec. e) Kiveta Kiveta z dolžino 10 cm Gumb za izbiro širine reže (0.005 mm - 3 mm) 2. Gumb za nastavitev valovne dolžine svetlobe 3. Gumb za izbiro velikosti kivete (O standardna kiveta; mikro kiveta) 4. Gumb za izbiro žarnice (Na ali Hg) 5. Gumb za vklop živosrebrne žarnice 6. Gumb za vklop natrijeve žarnice 7. Glavno stikalo 8. Digitalni izpis kota zasuka v stopinjah 66

71 9. Integracijski čas (povprečenje signala v 1 s, 5 s, 20 s ali 50 s) 10. Gumb za nastavitev vrednosti kota zasuka na nič Izvedba meritev: 1. Prižgite polarimeter in izberite ustrezno žarnico. 2. Naravnajte valovno dolžino in režo glede na izbrano žarnico. žarnica λ (nm) reža (mm) Na Hg Naravnajte integracijski čas. 4. Kiveto napolnite s topilom. 5. Pritisnite tipko ZERO. 6. Kiveto napolnite z vzorcem. 7. Obrišite okenca kivete. 8. Preverite, da v kiveti ni mehurčkov in trdnih delcev. 9. Kiveto vstavite v aparat. 10. Na ekranu se izpišejo vrednosti kota zasuka. Zapišite si 5-10 zaporednih odčitkov in izračunajte njihovo povprečno vrednost. 67

72 REZULTATI IN RAZPRAVA 68

73 Datum: Pregledal: 69

74 6. TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI Vaja: Dejavniki, ki vplivajo na HPLC-ločbo, in parametri, s katerimi jo opišemo CILJI VAJE Spoznati osnove tehnike tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) Naučiti se branja kromatogramov z odčitavanjem osnovnih vrednosti (višine, širine, retencijski časi vrhov itn.) Spoznati osnovne parametre s katerimi opišemo kromatografsko ločbo in postopek njihovega izračuna Spoznati nekatere dejavnike, ki vplivajo na ločbo z reverzno fazno HPLC UVOD Za vse kromatografske metode velja, da je ločevanje spojin posledica različnega zadrževanja le-teh na/v stacionarni fazi. Glede na mehanizem zadrževanja spojin ločimo kromatografije s tekočo mobilno fazo na: ionsko izmenjevalno, adsorpcijsko, gelsko izključitveno, kiralno, afinitetno in porazdelitveno, ki jo nadalje delimo na normalno fazno in reverzno fazno. Prav slednja (reverzno fazna) porazdelitvena kromatografija je daleč najpogostejša in obsega približno 90 odstotkov vseh aplikacij HPLC. Različne sestavine iz vzorca se porazdeljujejo med nepolarno stacionarno fazo (C18, C8, C6-fenil...) in polarno tekočo mobilno fazo iz vode ali pufrov in organskega modifikatorja (metanol, acetonitril, THF, izopropanol...). Čas zadrževanja posamezne spojine iz vzorca v nepolarni stacionarni fazi ob enakih parametrih ločbe je odvisen le od fizikalno kemijskih lastnosti te spojine. Različno polarne oz. nepolarne spojine se ločijo v koloni in eluirajo ob različnih, zanje značilnih retencijskih časih. Namen HPLC-analize je fizično ločiti posamezne komponente vzorca, da jih lahko identificiramo in določimo njihovo koncentracijo v vzorcu. Gre torej za separacijsko metodo, ki omogoča pridobivanje kvalitativnih in kvantitativnih podatkov o vzorcu. Nekateri izrazi in formule HPLC: angl. High Performance Liquid Chromatography tekočinska kromatografija visoke ločljivosti Retencijski čas (zadrževalni čas; tr) je čas potovanja spojine od injektorja do detektorja. 70

75 Mrtvi čas (t0) je čas potovanja mobilne faze in spojin, ki se na/v stacionarni fazi ne zadržijo, od injektorja do detektorja. Faktor ločljivosti (resolution factor; Rs) je parameter, s katerim opisujemo kakovost ločbe ločljivost. Za dobro ločljivost dveh simetričnih, enako visokih in širokih vrhov velja, da mora biti vrednost Rs vsaj 1,5. Osnovni dejavniki, ki vplivajo na kromatografsko ločbo, so učinkovitost kolone (N), zadrževanje preiskovanih spojin oz. povprečen retencijski faktor (k') in selektivnost stacionarne faze (α) za preiskovani spojini. Njihov vpliv na resolucijski faktor prikazuje enačba 2: Enačba 1: R S = 2( ta tb) WA + WB N k' α 1 in enačba 2: R s = 4 1+ k' α Retencijski faktor (k ) Slika: Enačba 4: k ' B = t B t t 0 0 t B t A Selektivnost (α) Enačba 5: α = k k ' A ' B t = t A B t t (Pogoj: α 1 oz. k'a k'b ) 0 0 t 0 Čas potovanja vsake spojine z mobilno fazo t B t 0 Čas zadrževanja spojine B v stacionarni fazi t A t 0 Čas zadrževanja spojine A v stac. fazi Število teoretskih podov (N) uporabljamo za kvantitativno izražanje učinkovitosti kolone. Predstavljalo naj bi število prehodov topljenca med stacionarno in mobilno fazo. Enačba 3: N 2 16 t 5,54 r tr = = w wh 2 Nesimetričnost vrhov (T), pogosto imenovana tudi tailing. Enačba 6: Slika: a + b T = 2a 71

76 h a b 5% h EKSPERIMENTALNI DEL Razvili bomo HPLC-metodo, s katero bomo ločili dve sorodni spojini (učinkovini nordiazepam in diazepam). Dobljeno kromatografsko ločbo bomo opisali z ustreznimi izračunanimi parametri. Za to vajo uporabimo HPLC-sistem brez računalniškega nadzora, ki je sestavljen le iz najosnovnejših komponent: črpalka, injektor, kromatografska kolona, UV-VIS-detektor in rekorder. 1. Vklopimo vse komponente HPLC-sistema. 2. Nastavimo oz. preverimo in zapišemo osnovne parametre analize. Začetna sestava mobilne faze (MF) je 90 % metanola in 10 % vode. MF je že razplinjena. Pretok MF je 1,3 ml/min. Volumen zanke je 20 µl. Uporabljamo kolono dimenzij z reverzno fazno stacionarno fazo na 5 µm delcih. Valovna dolžina detekcije za diazepam in nordiazepam je 228 nm. Hitrost papirja na rekorderju je 30 mm/min. 3. Pripravimo prvo raztopino za injiciranje. V eno epruvetko z avtomatsko pipeto odmerimo po 100 µl osnovnih raztopin nordiazepama in diazepama ter označevalca topila (kalijev jodid). Dodamo 700 µl topila (50-odstotni metanol). Torej smo vse tri spojine, ki jih bo zaznal detektor redčili 10-krat. Predpostavimo lahko aditivnost volumnov, ker so tudi osnovne raztopine pripravljene v 50-odstotnem metanolu. 4. Posnamemo kromatogram. 72

77 5. Zamenjamo prvotno mobilno fazo z naslednjo (60-odstotni metanol). 6. Ponovno posnamemo kromatogram. 7. Ocenimo kakovost ločbe v prvih dveh kromatogramih s pregledom kromatogramov, z izračunom Rs in povprečnega k. Za te in vse ostale izračune uporabimo program MS Excel. 8. V preglednico (spodaj) za vsako uporabljeno mobilno fazo vpišemo meritve in izračune, ki so potrebni za opis kromatografske ločbe. 9. Sami izberemo sestavo naslednje mobilne faze, posnamemo kromatogram in ga ovrednotimo. Ta korak ponavljamo, dokler ločitev ni ustrezna, kar potrdimo tudi z izračuni. Izbrana (ustrezna) mobilna faza za ločitev sorodnih spojin nordiazepama in diazepama je:. 10. Ko je ločitev ustrezna, izračunamo še povprečni vrednosti N in T za oba vrhova ter ju vpišemo v preglednico. 11. Selektivnost (α) izračunamo vsaj za tri različne MF. α (90-odstotni metanol) = α (Izbrana MF) = α (60-odstotni metanol) = Kako sestava MF vpliva na selektivnost? 12. Z izbrano MF posnamemo še kromatogram samega nordiazepama. Pri tem pazimo na redčitev, ki naj bo vsaj približno tolikšna kot pri prvi raztopini za injiciranje. Tako lahko identificiramo tri vrhove v prejšnjih kromatogramih: t0 = 73

78 tnor = tdia = 13. Eksperimentalno preverimo vpliv različnih parametrov na retencijo, ločbo in odzive v kromatogramu: Pretok MF vpliva na: Vrsta močnega topila v MF zamenjava metanola z acetonitrilom. Kako vpliva na retencijske čase, resolucijski faktor, selektivnost stacionarne faze pri ločevanju naših dveh spojin? Vpliv valovne dolžine detekcije. Zakaj je pomembna, kako jo izberemo? 74

79 Preglednica za vnos nekaterih izračunov: MF Pritisk (bar) k'povpr Rs α Npovp Tpovp Komentar 90% MeOH 60% MeOH 65% CH3CN 75

80 REZULTATI IN RAZPRAVA Zagovarjamo opravljeno delo in razložimo rezultate. V razpravi razložimo še ostale dejavnike, ki lahko vplivajo na kromatografsko ločbo: ph mobilne faze Kako vpliva na zadrževanje šibkih kislin in baz? Volumen injiciranja Na katere parametre kromatografske ločbe vpliva in kako? Dolžina kolone, velikost delcev v koloni Kako vpliva na retencijske čase, resolucijski faktor, delovni pritisk, čas analize...? Vrsta detektorja Katerega smo uporabili, katere še poznamo, specifičnost, občutljivost...? 76

81 Datum: Pregledal: 77

82 7. TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI Vaja: Validacija analizne metode HPLC in kvantitativno določanje CILJI VAJE Spoznati osnove upravljanja sodobnega HPLC-sistema Spoznati nekatere parametre za validacijo kromatografske analizne metode in osnove validacijskega postopka Spoznati kvantitativno določitev po metodi eksternega standarda in po metodi internega standarda UVOD Z validacijo analizne metode želimo potrditi zanesljivost metode ter zagotoviti sebi in drugim uporabnikom ustrezno kakovost meritev. V okviru validacije kromatografske analizne metode po navadi opredelimo njeno selektivnost, ponovljivost, pravilnost, linearnost, meje zaznave in določljivosti ter robustnost metode. Validiramo metodo, za katero smo že določili vse pogoje analize. Na podlagi priporočil, smernic, našega poznavanja sposobnosti analizne metode ter na podlagi potreb, ki izhajajo iz namena analize, določimo kritične vrednosti za vsak parameter, glede na katerega bomo validirali analizno metodo. Po izvedbi sklopa meritev in izračunu parametrov ocenimo, ali analizna metoda ustreza postavljenim kriterijem. Osnova kvantitativnega določanja s HPLC je linearno sorazmerje med površino, včasih pa tudi višino kromatografskega vrha in koncentracijo spojine v injicirani raztopini. Za kvantitativno določanje morajo biti vrhovi posameznih spojin dobro ločeni. Odziv vzorca načeloma lahko primerjamo le z odzivom enega standarda, po navadi pa uporabimo umeritveno premico. Tak način kvantitativnega določanja imenujemo tudi metoda eksternega standarda. Metodo z internim standardom uporabimo, kadar obstaja možnost, da se odziv pri enaki koncentraciji v vzorcu med posameznimi meritvami nekoliko spreminja. To je lahko posledica napak, do katerih pride med pripravo vzorca, nestabilnega odziva detektorja ali pa motenj detekcije zaradi prisotnosti drugih sestavin v vzorcu. Zato moramo v postopku priprave vzorcem in standardom dodati znano koncentracijo spojine, ki se kromatografsko dobro loči od preiskovane spojine, vseeno pa ima podoben retencijski čas. Pri izračunu koncentracije preiskovane spojine v 78

83 vzorcih morebitne napake izničimo s površinami vrhov internega standarda v kromatogramih vzorcev in standardov. Med osnovne pristope za določanje koncentracije preiskovane spojine v neznanem vzorcu spada še metoda standardnega dodatka, ki jo uporabimo, če želimo na primer zmanjšati vpliv ostalih sestavin vzorca na meritev preiskovane spojine. Nekateri izrazi in formule Validacija je dokumentiran postopek preizkušanja in potrjevanja, da kateri koli material, proces, postopek, aktivnost, sistem, oprema ali mehanizem, uporabljen pri razvoju, proizvodnji, kontroli in distribuciji, lahko dosega, dosega in bo dosegal predpisane rezultate. Specifičnost ali selektivnost (angl. specificity ali selectivity) je sposobnost metode, da loči preiskovano spojino od ostalih sestavin vzorca in jo pravilno izmeri. Za potrditev selektivnosti je potrebna kombinacija separacijske in spektroskopske metode, npr. HPLC-DAD ali LC-MS ali LC-MS-MS.»Ponovljivost«(natančnost, angl. precision) je ujemanje med rezultati neodvisnih meritev. Določi jo en analitik (na vaji ena skupina) na enem sistemu v relativno kratkem času. Potrebnih je 5 ali 6 meritev pri dveh ali treh različnih koncentracijah v treh vzorcih z različnim»ozadjem«(matrico, angl. matrix). Slednje je pomembno predvsem pri bioloških vzorcih, ki se lahko zaradi ozadja razlikujejo, na vaji pa to ni potrebno.»pravilnost«(angl. accuracy) je ujemanje posamezne ali povprečne vrednosti meritev s pravo vrednostjo. Izmerimo jo s kvantitativnim določanjem dobro poznanega vzorca standarda ali s primerjavo rezultata naše meritve z referenčno metodo. Izmerjeno vrednost primerjamo z znano pravo vrednostjo in podamo rezultat (pravilnost) v obliki odstopanja. Območje linearnosti. Analizna metoda je»linearna«, če je odziv linearno odvisen od koncentracije vzorca. Linearnost preverimo z večkratnim (od 3- do 6-krat, na vajah le enkrat) injiciranjem serije standardov, ki obsegajo koncentracijsko območje vsaj % predvidenih koncentracij vzorcev. Poleg dovolj visoke vrednosti Pearsonovega koeficienta korelacije (r) je nujno tudi, da odsek regresijske premice na ordinati ni bistveno različen od vrednosti 0 (nič). Regresijsko premico tudi narišemo. 79

84 Meja zaznave LOD (angl. Limit Of Detection), tudi LLOD (angl. Lower Limit Of Detection) je najmanjša koncentracija analita v vzorcu, ki ga analizna metoda še lahko zazna. V kromatografiji se pogosto določi kot tista koncentracija, pri kateri je višina vrha trikrat večja od šuma bazne linije. Meja določljivosti LOQ (angl. Limit Of Quantitation) je najmanjša koncentracija analita v vzorcu, ki ga analizna metoda še lahko ponovljivo izmeri. V kromatografiji je to običajno tista injicirana koncentracija, pri kateri je višina vrha od 10- do 20-krat večja od šuma bazne linije. Pri tej koncentraciji naj bi imele meritve RSD < %. Robustnost je odpornost metode na manjše spremembe osnovnih dejavnikov. Metoda eksternega standarda enačba za izračun koncentracije preiskovane spojine v vzorcu (c) na podlagi ene meritve vzorca (Avz), ene meritve preiskovane spojine v standardni raztopini (AESt) in znane koncentracije raztopine standarda (Cst). Enačba 1: c = A A vz ESt c St Metoda internega standarda enačba za izračun koncentracije preiskovane spojine v vzorcu (c) na podlagi ene meritve vzorca (Avz), ene meritve preiskovane spojine v standardni raztopini (ASt), znane koncentracije raztopine standarda (Cst) ter meritev odzivov internega standarda po analizi standardne raztopine (AISst) in po analizi raztopine vzorca (AISvz). Enačba 2: c = A A vz St A A ISst ISvz c St 80

85 EKSPERIMENTALNI DEL Analizno metodo HPLC, zelo podobno tisti, ki jo študenti razvijejo v okviru vaje Dejavniki, ki vplivajo na HPLC-ločbo, in parametri, s katerimi jo opišemo, bomo validirali in uporabili za kvantitativno določitev vsebnosti nordiazepama (NOR) v vzorcu. Za to vajo uporabimo HPLC-sistem, ki ga upravljamo z računalnikom in ustreznim programom, s katerim tudi shranjujemo in obdelujemo meritve. Komponente, ki sestavljajo ta sistem, so vakuumski razplinjevalec, binarna črpalka, avtomatski vzorčevalnik z injektorjem, termostat kolone in kromatografska kolona ter UV-VIS-detektor z nizom diod. 1. Preverimo seznam parametrov za validacijo in kriterije za posamezne parametre na vajo pripravljeni študenti imajo ta seznam že izdelan (z znanjem s predavanj ter iz navodil za to vajo). 2. Vklopimo vse komponente HPLC-sistema oz. preverimo nastavitve metode: MF: H2O = 35 %; MeOH = 65 % Pretok = 1,8 ml/min Volumen injiciranja = 5 µl Temperatura kolone = 45 C Kolona: Eurospher 125 4,0 mm; 5 µm; C8 Detekcija pri 228 nm; snemanje celotnega spektra od 205 do 400 nm 3. Začnemo z injiciranjem že pripravljenih raztopin za konstrukcijo umeritvene premice in ene raztopine, ki vsebuje le NOR. Te raztopine vsebujejo standarde NOR naraščajočih koncentracij 5, 10, 20, 30, 40, 50 mg/l in osnovno raztopino internega standarda (IS) diazepama (DIA). Vse je redčeno 10-krat, torej enako kot raztopine za injiciranje vzorcev in standarda, ki jih pozneje pripravijo študenti. Meritve sproti vpisujemo v Excelov dokument, ki ga odpremo za ta namen. Vse izračune izvedemo v tem dokumentu. 4. Narišemo dva grafa z umeritvenima premicama z in brez IS. 81

86 IS uporabimo tako, da vsak odziv preiskovane spojine delimo z odzivom IS v istem kromatogramu. Za konstrukcijo umeritvene premice uporabimo dobljene kvociente. Z metodo linearne regresije izračunamo enačbi obeh umeritvenih premic. Enačba premice na osnovi površin NOR: A = kc + n A je površina pod kromatografskim vrhom, c je koncentracija preiskovane spojine, k je naklon premice, n pa je odsek na ordinati. Pozorni moramo biti na enote. k = n = r = Enačba premice na osnovi površin NOR korigiranih s površino IS (y = ANOR/AIS): y = kisc + nis kis = nis = ris = 5. S separacijsko (retencijski čas) in spektroskopsko (UV-spekter) tehniko preverimo identiteto preiskovane spojine. Ker uporabljamo sklopljeno tehniko (reverzno fazna HPLC z detektorjem na»niz diod«), je tako preverjanje specifičnosti metode zelo preprosto. 6. Z avtomatskimi pipetami v epruvetkah pripravimo raztopine za injiciranje vzorcev in standarda skupaj z IS. Končna redčitev naj bo 10-kratna. Predpostavimo aditivnost volumnov. Raztopine prenesemo v viale ali mikrotitrsko ploščico glede na uporabljeni vzorčevalnik. Vsa dodatna injiciranja, ki jih mora izvesti avtomatski vzorčevalnik, vnesemo v tabelo programa za upravljanje HPLC-sistema (angl. sequence table). 82

87 7. Izračunamo koncentracijo NOR v treh vzorcih in v standardu s koncentracijo 25 mg/l brez in z IS. Standard Vzorec 1 Vzorec 2 Vzorec 3 izmerjena odstopanje koncentracija + ali [%] c [mg/l] c (IS) [mg/l] 8. Izvedemo večkratno injiciranje (5- ali 6-krat) in izračunamo ponovljivosti. Za ta namen iz že pripravljenih raztopin za umeritveno premico izberemo najmanjšo in največjo koncentracijo. Ponovljivost izrazimo kot RSD: po metodi ES po metodi IS RSD(nizki) = RSD(visoki) = 9. Pripravimo raztopine za primerjavo s šumom bazne linije (določitev LOD in LOQ). Na kromatogramu standardne raztopine z najmanjšo koncentracijo odčitamo višino šuma bazne linije ter predvidimo vrednosti LOD in LOQ na podlagi prej določenih kriterijev. Študenti sami izračunajo potrebno redčitev osnovne (standardne) raztopine, pripravijo postopek redčitve in ga tudi izvedejo. 10. Vsako od teh raztopin injiciramo vsaj 2-krat. Če višine dobljenih vrhov približno ustrezajo definicijama LOD in LOQ, zapišemo vrednosti oz. izračunamo prave vrednosti po sklepnem računu. V primeru velikega odstopanja pripravimo novi raztopini pravih koncentracij. LOD = mg/l 83

88 LOQ = mg/l REZULTATI IN RAZPRAVA Zagovarjamo opravljeno delo in ugotovimo, ali je bila validacija metode uspešna. Komentiramo vsak kriterij posebej. Metodi primerjamo po metodi eksternega standarda in po metodi internega standarda. Razpravljamo o smiselnosti uporabe internega standarda. 84

89 Datum: Pregledal: 85

90 8. PLINSKA KROMATOGRAFIJA Vaja: Priprava biološkega vzorca in analiza s plinsko kromatografijo CILJI VAJE Spoznati osnove plinske kromatografije Spoznati pripravo vzorca z ekstrakcijo tekoče-tekoče Naučiti se določanja izkoristka in ponovljivosti ekstrakcije Naučiti se določanje koncentracije preiskovanih spojin v vzorcu s plinsko kromatografijo UVOD Da omogočimo kvantitativno vrednotenje posamezne snovi v zmesi, uporabljamo naslednje pristope oz. njihove kombinacije:»priprava vzorca«, separiranje (kromatografija) in specifična kvantitativna detekcija. Večina bioloških vzorcev, kot so kri, krvna plazma, serum, seč..., ni primerna za neposredno analizo s kromatografskimi metodami. Potrebna je predhodna priprava, pri čemer so pogosti homogeniziranje, obarjanje proteinov, centrifugiranje, filtriranje, ekstrakcija na trdni fazi (SPE), ekstrakcija tekoče-tekoče, sušenje in rekonstituiranje v različnih kombinacijah. Z navedenimi postopki običajno ne moremo zagotoviti kvantitativnega prenosa vse preiskovane spojine iz vzorca v končno»pripravljeno«raztopino za injiciranje. To pomeni, da izkoristek priprave vzorca ni 100-odstoten. Da lahko na podlagi meritev pripravljene raztopine izračunamo koncentracijo v neznanem vzorcu, moramo izkoristek priprave vzorca poznati. Biti mora čim višji, in kar je še pomembneje, ponovljiv. Poleg izkoristka na koncentracijo preiskovane spojine v raztopini za injiciranje vpliva še redčenje ali koncentriranje med postopkom priprave, na kar moramo biti dodatno pozorni. Na izkoristek priprave vzorcev in na njegovo ponovljivost vplivajo številni dejavniki, ki jih moramo poznati in razumeti njihovo delovanje. Vsekakor moramo z ekstrakcijo zagotoviti ravnotežno stanje, ki ga dosežemo šele po dovolj dolgem času stresanja. V tem stanju sta koncentraciji preiskovane spojine v razmerju, kot ga definira porazdelitveni koeficient. Naslednji pomembni dejavnik, ki lahko zelo vpliva na izkoristek in njegovo ponovljivost, je ph vodne faze med ekstrakcijo, paziti pa moramo tudi na temperaturo, razmerje volumnov vodne in organske faze itn. 86

91 Pri plinski kromatografiji uparjeni vzorec potuje s tokom inertnega plina (mobilne faze) skozi kolono, ki vsebuje stacionarno fazo. Stacionarna faza je lahko podobno kot pri tekočinski kromatografiji trdna ali tekoča, razlikuje pa se tudi glede na kemizem. Pomembna omejitev pri uporabi kolone, izbrane za to vajo, je, da v vzorcih in v mobilni fazi ne sme biti vode. Za analizne namene običajno uporabljamo kapilarne kolone z zelo velikim številom teoretskih podov in nizko kapaciteto. Zato so volumni vzorca, ki jih injiciramo, zelo majhni npr. 1 µl pri tej vaji. Tudi po uparitvi injiciranega vzorca le majhen del tega vodimo na kolono, večino pa s sistemom ventilov zavržemo t. i. split način injiciranja. Ločene sestavine vzorca iz kolone vodimo na detektor. Poznamo nekaj različnih tipov detektorjev. Pri tej vaji uporabljamo sistem z detektorjem FID (angl. flame ionization detector), ki je primer splošnega (nespecifičnega) detektorja. Ta detektor po sežigu vseh snovi v nosilnem plinu zazna ione CHO + v plamenu, njihova količina pa je sorazmerna količini organskih snovi v nosilnem plinu. Kakovost ločbe ocenimo z enakimi kriteriji kot pri tekočinski kromatografiji. Nekateri izrazi in formule GC (angl. Gas Chromatography plinska kromatografija) Izkoristek priprave vzorca je kvocient množine, ki jo dobimo po pripravi, in množine preiskovane snovi v samem vzorcu. Za primer ekstrakcije tekoče-tekoče je izkoristek: Enačba 1: η = n n r v Pri tem je η izkoristek, nr pridobljena (recovered) množina, nv pa množina v vodni fazi pred ekstrakcijo. Izraz ekstrakcija tekoče-tekoče (angl. liquid-liquid extraction) običajno uporabljamo za ekstrakcijo tekočih bioloških vzorcev z nepolarnim organskim topilom. 87

92 EKSPERIMENTALNI DEL Vajo začnemo s pripravljenim GC-sistemom: Nosilni plin (MF): N2 Pretok (skozi kolono): 2,5 ml/min T uparjevalne komore = 280 ºC Volumen injiciranja: 1 µl Purge time ON: 0,1 min; Split: 10 ml/min Kolona ULTRA2 SF: (5%-fenil)-metilpolisiloksan) 25 m 0,25 mm 0,32 µm Temperaturni program: začetek 1 min pri 200 C, nato 6 K/min do 250 C, na koncu še 1 min pri 250 ºC Detektor: FID (angl. Flame Ionisation Detector) T detektorja = 280 ºC Plamen: Make up N2 30 ml/min; H2 33 ml/min; sintetični zrak (brez CO2) 185 ml/min 1. Najprej prenesemo po 150 µl standardov kofeina (0,666 mm) in karbamazepina (0,25 mm) oba pripravljena v etilacetatu v viali z insertom, in ju injiciramo na GC. Zapišemo izmerjeni površini vrhov in retencijska časa. Akof = tkof = Akarb = tkarb = 2. Priprava standardov v biološkem matriksu. V 5-mL plastični epruveti zmešamo 25 µl osnovne raztopine kofeina s koncentracijo 40 mm, 25 µl osnovne raztopine karbamazepina s koncentracijo 15 mm in dodamo 1,45 ml medija (skupaj 1,5 ml). Osnovni raztopini sta pripravljeni v koncentriranem EtOH in se z vodnimi raztopinami (večina bioloških vzorcev) dobro mešata. Postopek ponovimo trikrat. Izračunajte koncentraciji kofeina in karbamazepina v pripravljenih raztopinah. S katerima koncentracijama se ujemata? 88

93 3. Tem trem raztopinam dodamo po 1,5 ml EtAc ter ekstrahiramo na»vorteksu«1 minuto. Vodno in organsko fazo pred ekstrakcijo shranjujemo na ledu. 4. Po ločitvi organske in vodne faze prenesemo po 150 µl organske faze iz vsake od ekstrakcij v vialo z insertom in jo injiciramo na GC. Zapišemo enačbo, po kateri bomo v našem postopku lahko izračunali izkoristek ekstrakcije. Izračunamo izkoristek vsake ekstrakcije za obe spojini, povprečni izkoristek treh ekstrakcij ter ponovljivost izkoristka, ki jo izrazimo z RSD. Za vse izračune uporabimo MS Excel. Kofein Karbamazepin η1 [%] η2 [%] η3 [%] 89

94 ηpovp RSDη![%]! 5. Ekstrahiramo neznan vzorec in posnamemo kromatogram. 6. Izračunamo koncentraciji preiskovanih spojin v vzorcu. ckof = ckarb= 7. Ekstrahiramo prazen vzorec (blank,»slepi«) in posnamemo kromatogram. S tem preverimo morebitno prisotnost endogenih snovi iz biološkega vzorca, ki bi lahko motile našo analizo. Komentar: 90

95 REZULTATI IN RAZPRAVA Razprava o metodah, rezultatih, težavah pri delu... Zakaj bi analizirali ti dve spojini v plazmi pacienta? Ali je ponovljivost priprave vzorcev dovolj dobra glede na namen tovrstnih analiz? Ali bi lahko po enaki pripravi vzorcev (ekstrakcija z etilacetatom) ekstrakte neposredno analizirali z reverzno fazno HPLC? Zakaj? Katere lastnosti mora imeti topilo za ekstrakcijo vzorcev? Razprava o dejavnikih, ki vplivajo na pripravo vzorca (izkoristek in njegovo ponovljivost). 91

96 Datum: Pregledal: 92

97 9. TERMIČNA ANALIZA Vaja: Določanje temperature tališč, polimorfizma in dehidracije z diferenčno dinamično kalorimetrijo (DSC) CILJI VAJE Spoznati osnove diferenčne dinamična kalorimetrije (DSC) Spoznati dejavnike, ki vplivajo na merjenje toplotnih tokov v vzorcu Spoznati načrtovanje temperaturnih programov Spoznati pripravo vzorcev in vpliv, ki ga to ima na DSC-meritve Naučiti se branja in tolmačenja termogramov UVOD Z besedno zvezo "termična analiza" opisujemo skupino analiznih tehnik, s katerimi merimo fizikalne in/ali kemijske lastnosti snovi kot funkcijo temperature. Vzorec je pri tem podvržen temperaturnemu programu, ki je sestavljen iz serije izbranih segmentov, znotraj katerih vzorec segrevamo ali ohlajamo pri neki konstantni hitrosti, ali pa ga ohranjamo pri enaki temperaturi. Pri tem je pomembna atmosfera, v kateri se nahaja vzorec, za kar uporabljamo prepihavanje z različnimi plini, ki se razlikujejo v inertnosti ali oksidativnosti. Za veliko večino meritev se kot plin uporablja dušik, če želimo oksidatvne pogoje pa uporabimo čisti kisik. Različne tehnike termične analize: diferenčna dinamična kalorimetrija (differential scanning calorimetry - DSC) termogravimetrična analiza (thermogravimetric analysis - TGA) termomehanična analiza (thermomechanical analysis - TMA) dinamična mehanična analiza (dynamical mechanical analysis - DMA) termooptična analiza (thermooptical analysis - TOA) Poleg tega obstajajo še izpeljanke osnovnih tehnik, npr. TGA-EGA. Bistvo izpeljank je, da omogočajo opazovanje dodatnih fizikalnih lastnosti z namestitvijo ustreznih dodatkov in/ali nadaljnjo sklopitvijo z drugimi analiznimi instrumenti. Pri TGA-EGA tako poleg spremembe 93

98 mase v odvisnosti od temperature spremljamo še sestavo nastalih plinov s sklopitvijo s FT-IR in/ali MS spektrometri. Potencialne aplikacije v farmacevtski industriji so zaradi različnih fizikalno-kemijskih vidikov raziskav številne. Lastnosti in pojavi v farmacevtskih vzorcih, ki jih lahko proučujemo s termično analizo so: temperatura tališča, talilni interval, obnašanje pri taljenju, delež staljene snovi, toplota taljenja, čistost, polimorfizem, solvati, fazni diagrami, izhlapevanje, desorpcija, uparevanje, steklasti prehodi, interakcije, kompatibilnost, termična stabilnost, oksidativna stabilnost, kinetika razgradnje, sestava. 1. DSC Diferenčni dinamični kalorimeter meri razliko toplotnih tokov vzorčnega in referenčnega lončka, ki sta podvržena enakemu temperaturnemu programu. Toplotni tok ustreza moči in se meri v vatih (W) ali milivatih (mw). Če izmerjeni toplotni tok integriramo z ozirom na čas dobimo enoto prenesene energije izražene v mj (= mws). Če pri tem vzorec prejme energijo, je zaznana sprememba endotermna. Seveda sledi, da če vzorec odda energijo, gre za eksotermen proces. Rezultati DSC-meritev nam podajo informacijo o termičnih dogodkih, ki so karakterizirani s spremembo entalpije v nekem intervalu temperature. Ker pri tem merimo tudi specifično toplotno kapaciteto, lahko določamo tudi steklaste prehode, za katere je značilna sprememba toplotne kapacitete. 94

99 DSC-kalorimetri so dveh tipov. Razlikujejo se po načinu določanja toplotnega toka. Pri "power compenstaion" DSC-kalorimetrih (DPSC) imamo za vzorec in referenco ločena grelca, pri čemer je temperaturna razlika med vzorcem in referenco med celotnim eksperimentom enaka nič. To dosežemo tako, da sproti prilagajamo velikost toplotnega toka za vzorec glede na različne endotermne ali eksotermne procese, ki potekajo. Toplotni tok, ki gre na račun termičnih procesov je pri tem tipu DSC-kalorimetrov enak razliki toplotnih tokov med vzorcem in referenco, tako da toplotni tok merimo neposredno. Pri "heat flux" DSC-kalorimetrih (DTSC) pa imamo en grelec, ki greje tako vzorec kot referenco. Pri tem merimo razliko v temperaturi med obema lončkoma, ki se pojavi med segrevanjem. Toplotni tok na račun procesov v vzorčnem lončku nato posredno računsko določimo ob upoštevanju izmerjenih temperaturnih razlik in poznavanjem toplotnih kapacitet in prevodnosti uporabljenih lončkov, senzorja in grelca. Slednji tip naj bi imel nekoliko višjo občutljivost, saj kalorimeter tipa DPSC pri faznih prehodih težje ohranja temperaturno razliko nič zaradi koračne narave faznih sprememb, saj so le-te hipne, katastrofične (torej nezvezne). 1.1 Vpliv priprave vzorca in parametrov temperaturnega programa na meritve Položaj ter velikost povečanih toplotnih tokov, ki jih lahko razberemo iz termograma, so odvisni od hitrosti segrevanja. Povečanje hitrosti segrevanja poveča izmerjeni toplotni tok (večji vrhovi) ter poveča občutljivost, vendar na račun zmanjšanja ločljivosti. Vzorci imajo namreč določeno toplotno prevodnost, kar pomeni, da se odziv vzorca ne zgodi v trenutku, temveč z nekim časovnim zamikom. Pri povečani hitrosti segrevanja se zato odzivi termičnih dogodkov začenjajo prekrivati. Tudi senzor ima zaradi svoje toplotne prevodnosti in strukture določen časovni zamik. Vse to vodi k zgoraj omenjeni izgubi ločljivosti. Seveda zmanjšanje hitrosti segrevanja pripelje do povečane ločljivosti, saj po eni strani zmanjšamo vpliv zamikov na račun toplotnih prevodnosti in odzivnosti senzorja ter tudi kinetičnih komponent procesov. Vendar pa po drugi strani z zmanjšanjem hitrosti segrevanja izgubimo na občutljivosti. DSCmeritve so navadno kompromis med ločljivostjo in občutljivostjo glede na naravo procesov, ki jih želimo opazovati. Povečanje mase vzorca poveča občutljivost podobno kot povečanje hitrosti segrevanja, a pripelje do enakih omejitev. Povečanje mase vzorca poveča njegovo toplotno kapaciteto ter poslabša prevodnost, kar podaljša odzive vzorca ter poslabša ločljivost. Poleg mase ter hitrosti segrevanja je pomembna tudi gostota nasute mase in velikost delcev. Manjša gostota v lonček nasute mase pomeni večjo poroznost (večji delež zraka, ki deluje kot izolator) in ponovno 95

100 poslabšanje ločljivosti. Pri veliki razliki v velikosti delcev lahko pride do razcepljenih vrhov v termogramu, ker se manjši delci hitreje stalijo kot večji. Manjši delci imajo namreč bolj ugodno razmerje med površino in volumnom ter se hitreje segrevajo kot večji. 1.2 Plini Plin s katerim prepihujemo celico ima dve vlogi. Odnaša produkte, ki bi nastali pri segrevanju in vzorcu zagotavlja ustrezne bodisi inertne bodisi oksidativne pogoje. 1.3 Lončki za DSC Lončki za DSC so lahko različnih volumnov (20 µl µl). Lahko so odprti, hermetično zaprti s pokrovčkom ali pa zaprti s preluknjanim pokrovčkom. Slednje naj bi zagotavljalo lastno atmosfero pri običajnem tlaku, kar navadno pripelje do ožjih vrhov. Narejeni so iz različnih materialov: Al Pt Au Cu C (grafit) Jeklo njihova uporaba pa je odvisna od pogojev načrtovanega eksperimenta. Aluminijasti lončki se uporabljajo za veliko večino meritev, vendar le do temperature 650 C, kjer ima aluminij tališče. Za višje temperature je potrebno uporabiti druge snovi, kot so npr. platina (Pt), zlato (Au) ali grafit (C), pri čemer lahko v primeru grafita uporabljamo le inertni plin. Baker (Cu) se navadno uporablja za specifične teste oksidativne stabilnosti. Jeklo pa se navadno uporablja pri zaprtih lončkih, ko pričakujemo in hočemo, da lonček zdrži večji nadtlak. 96

101 1.4 Kalorimeter Meritve boste izvajali na kalorimetru proizvajalca MettlerToledo, model DSC1. Slika 1. Kalorimeter Mettler Toledo DSC 1. METTLER TOLEDO DSC1 (kalorimeter tipa "heat flux") Kalorimeter - glavni komponenti sta grelec ter senzor temperature. Hladilni sistem - omogoča nadzorovano ohlajanje z določeno hitrostjo. Sistem za prepihovanje - omogoča prepihovanje z inertnim ali oksidativnim plinom Nadzorni sistem - računalnik z nadzornim programom. Sistem za vrednotenje rezultatov - del nadzornega programa. 97