1 ALKOHOLNA FERMENTACIJA

1 ALKOHOLNA FERMENTACIJA Alkoholna fermentacija ili kako se često naziva alkoholno vrenje biokemijski je proces transformacije monosaharida (glukoza, fruktoza) u alkohol i ugljični dioksid posredstvom kvasaca i uz sudjelovanje cijelog niza enzima. Prvu formulu kemijskog procesa alkoholne fermentacije postavio je Gay-Lussac, 1815. godine: C 6 H 12 O 6 = 2 CH 3 CH 2 OH + CO 2 Liebig 1845. godine postavlja kemijsku teoriju prema kojoj je fermentacija čisto kemijski proces, «aktivnost kvasca nije rezultat njegovog života, već naprotiv njegovog raspadanja». L. Paster- postavlja biološku teoriju - smatra da proces alkoholne fermentacije nije rezultat raspadanja kvasca, već naprotiv rezultat života i razmnožavanja kvasaca «bez života nema fermentacije». Djelujući preko raznih enzima, koje je 1895. godine otkrio Buchner, kvasac je stvarni nosilac svih reakcija, koje predstavljaju manifestaciju njegovih životnih funkcija pod određenim aerobnim i anaerobnim uvjetima. Danas znamo da se alkoholna fermentacija odvija u kvašćevoj stanici, posredstvom grupe enzima zajedničkog naziva zimaza. Budući da su kvasci obrađeni u kolegiju Mikrobiologija mošta i vina, ovdje ćemo samo podsjetiti da su za fermentaciju značajni kvasci iz grupe Saccharomyces sensu stricto (S. cerevisiae, S. paradoxus, S. bayanus i S. pastorianus). Najznačajniji među njima je svakako S. cerevisiae koji se smatra glavnim vinskim kvascem. Pod aerobnim uvjetima transformacija šećera ide do kraja, tj. stvara se ugljični dioksid i voda i oslobađa velika količina energije. To je s energetskog gledišta vrlo ekonomičan proces jer malom pretvorbom šećera, kvasac osigurava veliku količinu energije za svoj razvoj. C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 = 6 CO 2 + 6 H 2 O + 688 kcal 1

Alkoholna fermentacija s druge strane predstavlja biokemijski proces razgradnje šećera u anaerobnim uvjetima tj. bez prisutnosti kisika, koji se odigrava u živoj stanici kvasca. Krajnji produkti ovih reakcija je etanol i ugljični dioksid. Pod anaerobnim uvjetima transformacija šećera ne ide do kraja već samo do formiranja alkohola (etanola) i ugljičnog dioksida, a pri tome se oslobađa samo 56 kcal/mol. S energetskog stanovišta taj proces nije tako ekonomičan, kao disanje i ne daje dovoljno energije za razmnožavanje kvasca. Zato da bi osigurao potrebnu energiju kvasac mora fermentirati veliku količinu šećera, što je od velikog praktičnog značaja. C 6 H 12 O 6 = 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 + 56 kcal Alkoholnoj fermentaciji podliježu monosaharidi s 6 atoma ugljika (glukoza, fruktoza, manoza). Većina kvasaca podjednako fermentira glukozu i fruktozu, dok manozu teže fermentiraju i to tek nakon prethodna dva šećera. Disaharidi (saharoza, maltoza, laktozai dr.) u pravilu ne fermentiraju osim u slučaju kada su kvasci u stanju sintetizirati odgovarajuće hidrolitičke enzime (saharazu i invertazu i dr.), a isti je slučaj i s trisaharidima (rafinoza). Međutim pentoze (ksiloza i arabinoza) nije u stanju fermentirati niti jedan kvasac. Biokemijski proces alkoholne fermentacije ili vrenja nije tako jednostavan kako je prikazan u formuli Gay-Lussac-a. Ovaj složeni biokemijski proces možemo podijeliti na dvije faze: prvo ide razgradnja glukoze do pirogrožđane kiseline (piruvata), a taj skup reakcija zovemo glikoliza, zatim slijedi alkoholna fermentacija. Glikoliza (slika 1) je skup reakcija koje kataliziraju mnogobrojni enzimi: važan korak je produkcija gliceraldehid-3-fosfata i to je endergoni proces, jer troši energiju u obliku 2 molekule ATP. Slijed reakcija nakon toga dovodi do produkcije pirogrožđane kiseline koji je egzergoni proces jer daje energiju u obliku 4 molekule ATP. Kad je završen proces stvaranja pirogrožđane kiseline, tj. glikoliza, do tog je stupnja, anaerobna razgradnja šećera, jednaka aerobnoj razgradnji (disanju). U aerobnim uvjetima zatim dolazi do dekarboksilacije piruvata i stvaranja acetila koji se, vezan na koenzimom A, dalje razgrađuje u ciklusu limunske kiseline (Krebs-ovim ciklusom) i oksidativnoj fosforilaciji. Konačni rezultat ovih oksidacijskih reakcija je stvaranje CO 2, H 2 O i 38 ATP. 2

Trošenje i stvaranje ATP u glikolizi Reakcija Promjena ATP po glukozi Glukoza glukoza -6- fosfat - 1 Fruktoza -6 - fosfat fruktoza - 1,6- difosfat - 1 21,3 difosfoglicerat 2,3 fosfoglicerat + 2 2- fosfoenolpiruvat 2- piruvata + 2 neto + 2 Slika 1: Glikoliza. 3

Tek kad se glikolizom stvori veća količina pirogrožđane kiseline započinje prava alkoholna fermentacija. Ona dakle kreće od pirogrožđane kiseline i to tako da najprije dođe do dekarboksilacije pirogrožđane kiseline u acetaldehid, a zatim redukcijom stvorenog acetaldehida nastaje alkohol etanol, uz istovremenu oksidaciju NADH 2 u NAD, kako je niže prikazano. Pirogrožđana kiselina acetaldehid + CO 2 Acetaldehid + NADH 2 etanol + NAD + Reakcija alkoholnog vrenja (slika 2), kvascu u stvari služi za oksidaciju NADH 2 u NAD +, tj. za obnavljanje ovog posljednjeg sastojka, kako bi se nesmetano mogla odvijati glikoliza. Naime, NAD + je akceptor vodika u transformaciji gliceraldehid-3-fosfata u 1,3 difosfoglicerat i daljnje reakcije glikolize ne teku ako se pojavi manjak ovog koenzima. Etanol predstavlja zapravo krajnji nusproizvod vrenja i kao takav ne sudjeluje u daljnjem metabolizmu. Obnavljanje NAD + moguće je i preko alternativnog puta, redukcijom dihidroksiaceton-fosfata i 1,3 difosfoglicerata. Slika 2: Alkoholna fermentacija Drugi oblik fermentacije se pojavljuje kada nema dovoljno na raspolaganju acetaldehida za obnavljanje NAD +. To može biti posljedica endogenih i egzogenih faktora: npr.so 2 koji se veže s dijelom acetaldehida i na taj način se reducira, odnosno sprečava 4

daljnje reakcije acetaldehida. U tom slučaju obnavljanje NAD je moguće reakcijama prikazanim u lijevom dijelu slike br. 3, a konačni produkt je u tom slučaju glicerol. Ako se SO 2 nalazi u velikoj količini, proizvodnja etanola je potpuno blokirana i proizvodi fermentacije su jedino glicerol, acetaldehid i CO 2. SO 2 može biti također proizveden, u većoj ili manjoj količini ali sa istim efektima, pomoću kvasaca redukcijom sulfata. Ovo su mehanizmi kojima se proizvodi acetaldehid (kao i glicerol) u vinu. Veća količina acetaldehida vinu daje određenu notu oksidiranosti odnosno izvjetrenosti. Glukoza Glukoza-6-fosfat Fruktoza-6-fosfat Fruktoza-1,6-difosfat Dihiroksiacetonfosfat Gliceraldehid-3-fosfat NADH 2 NAD NAD NADH 2 Glicerol-fosfat Glicerol 1,3 difosfoglicerat 3-fosfoglicerat CO 2 2-fosfoglicerat Fosfoenolpiruvat Acetaldehid Piruvat Slika 3: Drugi oblik alkoholne fermentacije: formiranje glicerola i acetaldehida. Treći oblik fermentacije prikazuje slika 4, a predstavlja shemu formiranja etanola, octene kiseline, glicerola i CO 2. Biološka interpretacija ovog procesa je objašnjena prisustvom jedne dehidrogenaze koja skreće transformaciju acetaldehida od njegovog normalnog puta u alkoholnoj fermentaciji, izazivajući stvaranje etanola i octene kiseline. 5

Glukoza Glukoza-6-fosfat Fruktoza-6-fosfat Fruktoza-1,6-difosfat Dihiroksiacetonfosfat Gliceraldehid-3-fosfat NADH 2 NAD NAD NADH 2 Glicerol-fosfat Glicerol Etanol octena kiselina CO 2 NAD NADH 2 1,3 difosfoglicerat 3-fosfoglicerat 2-fosfoglicerat Fosfoenolpiruvat kiselina Acetaldehid Pirogrožđana Slika 4.: Treći oblik alkoholne fermentacije: formiranje glicerola i octene kiseline Slika 5: Četvrti oblik alkoholne fermentacije: formiranje glicerola i piruvata. 6

Četvrti oblik fermentacije (gliceropiruvatno vrenje) prikazuje produkciju glicerola i pirogrožđane kiseline. Do ove forme alkoholne fermentacije dolazi kada u sredini nema dovoljno dušika (pomanjkanje dušika) ili kada se iz nekog razloga blokira piruvična dekarboksilaza, koja katalizira pretposljednju reakciju. Do ovog oblika alkoholne fermentacije obično dolazi na početku fermetacije, kada još nema dovoljne kolkičine pirogrožđane kiseline. U tom slučaju pirogrožđana kiselina predstavlja ishodišni materijal za formiranje sekundarnih sastojaka alkoholne fermentacije, kako je i prikazano na slici 5.. 1.1 SEKUNDARNI PROIZVODI ALKOHOLNE FERMENTACIJE Tijekom trajanja fermentacije kvasac producira osim etanola i CO 2, (primarni proizvodi) u malim količinama i druge sastojke koje nazivamo sekundarni proizvodi. Fermentacijom 100 g glukoze nastaje: Etanol CO 2 Glicerin Jantarna kis. Suhi kvasac Octena kiselina Acetaldehid Piruvična kiselina Aceton Butandiol - 48,4 g - 46,6 g - 3,3 g - 0,6 g - 1,2 g Glavni sastojak među sekundarnim sastojcima je glicerol, tako da količina ovog viševalentnog alkohola odgovara količini svih ostalih sekundarnih sastojaka, kako je i prikazano sljedećim odnosom: 7

A- octena kiselina 2A + B + 2M + H + S = = G B- butilenglikol M- aceton H- acetaldehid S- jantarna kiselina G- glicerol Sekundarni produkti (slika 6) koji se javljaju kao posljedica gore navedenih reakcija služe kao ishodište brojnih drugih spojeva koji također u manjoj mjeri nastaju tijekom alkoholnog vrenja. Jantarna kiselina nastaje oksidacijom glutaminske kiseline, preko α-keto glutaminske kiseline kao intermedijarnim spojem. U anaerobnim uvjetima može nastati iz dvije molekule octene kiseline, ili redukcijom pirogrožđane kiseline preko oksaloctene, jabučne i fumarne kiseline. 8

Slika 6: Shema formiranja sekundarnih sastojaka. 9

1.2 OSTALI SASTOJCI Ostali sastojci, među koje spadaju i viši alkoholi, nisu pravi proizvodi fermentacije jer ne nastaju direktno od glukoze, već transformacijom različitih sastojaka u metabolizmu kvasaca. Formiraju se i drugi sastojci u malim količinama koji su produkt metaboličke aktivnosti kvasaca, a ne kemijske transformacije sastojaka u moštu. Količina ovih sastojaka jako je važna i značajno utječe na senzoriku vina, u prvom redu na miris vina. Radi toga stvaraju se posebni sojevi selekcioniranih kvasaca koji proizvode veće količine ovih sastojaka. Razvojem analitičkih metoda moguće je determinirati ove spojeve i tako istraživanja usmjeriti prema njihovoj većoj produkciji. Među najznačajnije sastojke spadaju viši alkoholi, hlapljivi esteri i više masne kiseline. Viši alkoholi Među tzv. ostalim sastojcima, viši alkoholi predstavljaju kvantitativno najzastupljeniju grupu sastojaka. Nastaju aktivnošću kvasaca i to procesima deaminacije i dekarboksilacije, iz aminokiselina u moštu - katabolički, kao i iz aminokiselina sintetiziranih od strane kvasaca (anabolički). Imaju značajnu ulogu u formiranju arome vina, a količinski se kreću u rasponu od 200 do 400 mg/l. Preko ove granice mogu stvarati nepoželjne karakteristike vina. Katabolički Anabolički Aminokiseline Šećeri Transaminacija Ferm. i biosinteza Ketokiseline Aminokiseline Dekarboksilacija i redukcija Viši alkoholi 10

1.3 FAKTORI O KOJI UTJEČU NA ALKOHOLNU FERMENTACIJU Kvasac Kvasci su posebno obrađeni u kolegiju Mikrobiologija mošta i vina, a ovdje ćemo pripomenut samo značaj pojedinih sojeva Saccharomyces koji imaju širok raspon sposobnosti da svladavaju teške uvjete fermentacije (ekstremne temperature koje mogu biti od 5 do 35 C), visoke alkohole, niske ph vrijednosti, i dr.. O sojevima kvasaca u mnogome ovisi aromatski profil i kvaliteta vina, pa izborom kvasca određujemo tijek alkoholne fermentacije i konačnu kvalitetu vina. Alkoholna fermentacija je glavna aktivnost kroz koju kvasci pozitivno doprinose aromi vina. Oni to čine raznim mehanizmima: korištenjem sastojaka iz mošta, proizvodnjom etanola i drugih otapala koji doprinose ekstrakciji aroma iz krutih dijelova grožđa, proizvodnjom enzima koji transformiraju neutralne sastojke iz grožđa u mirisne sastojke, proizvodnjom više stotina aromatskih sastojaka (alkoholi, esteri i dr.), i autolizom mrtvih stanica kvasca (Cole i sur., 1997; Lambrechts i sur., 2000). U vinima je do sada identificirano više od 1 000 hlapljivih spojeva, a više od 400 tih spojeva produkt je aktivnosti kvasca u fermentaciji (Nykänen, 1986). Mnogobrojna su istraživanja koja se odnose na ulogu različitih sojeva Saccharomyces cerevisiae i utjecaja na varijabilnost proizvodnje sekundarnih sastojaka. Karakteristike sojeva su različita produkcija estera, viših alkohola, acetona, acetaldehida, sumpornog dioksida i sumporovodika (Fleet, 1993). Među najznačajnije sastojke koji su direktno produkt alkoholne fermentacije, a vrlo su bitni u formiranju senzornih karakteristika vina, prema Usseglio Tomasset (1992), spadaju viši alkoholi, hlapljivi esteri i masne kiseline kratkog lanca C 6 do C 10. Temperatura Temperatura je od velikog utjecaja na tijek, dinamiku i kemijske procese alkoholne fermentacije. Previsoka, kao i preniska temperatura može biti jedan od razloga zastoja 11

fermentacije. Postoji sinergistički efekt između visoke temperature fermentacije i sadržaja alkohola: slaba otpornost stanica na etanol vodi ka visokom mortalitetu. Mnogi sojevi kvasaca Saccharomyces cerevisiae mogu fermentirati relativno dobro do l2 C, ali niže temperature sprječavaju pravilno vođenje alkoholne fermentacije, jer je metabolička aktivnost kvasaca usporena nižim temperaturama (Rosi, 2000). Poznato je da se pri višim temperaturama fermentacije formiraju veće količine viših alkohola, koji su glavni predstavnici tzv. sekundarnih aroma vina. Smatra se da količina do 400 mg/l pozitivno utječe na aromu, dok iznad te količine mogu ispoljavati i negativne karakteristike vina (miris na petrolej). S druge strane pri nižim temperaturama fermentacije (vidi Vinarstvo I i III) stvaraju se finije aromatske karakteristike vina i formira veća količina hlapljivih estera i viših masnih kiselina. Kisik Kisik ima važnu ulogu u alkoholnoj fermentaciji. Potreban je za pravilan razvoj kvasaca i za održavanje dobre životnosti (viabilnosti) stanice, a što je preduvjet da se fermentacija provede do kraja. Kisik je uključen u sintezu lipida, kao što su steroli i nezasićene masne kiseline, od kojih je izgrađena stanična membrana kvasaca i koji joj osiguravaju bolju otpornost na alkohol (Kirsop, 1978). Koncentracija sterola mora biti optimalna kako bi se osigurala cjelovitost membrane i aktivnost transmembranskih enzima kao što su permeaze. Ako ove permeaze ne funkcioniraju dolazi do acidifikacije i stanice ugibaju (graf 1). Graf 1: Funkcija stanične membrane kao omotača i regulatora intracelularnog ph. Minimalne potrebe za O 2 u cilju optimalnog provođenja fermentacije su između 5-10 mg /L (Sablayrolles i sur., 1986). Na početku fermentacije, kisik se vrlo brzo potroši od 12

strane enzima (polifenoksidaza i ako je prisutna plijesan od lakaza ) i oksidativnih kvasaca. Kvasci se također dosta razlikuju u pogledu potreba prema kisiku, i studije su pokazale njihovu različitost u sposobnosti fermentiranja u nedostatku kisika. Njihove razlike se iskazuju u: - pogledu maksimalnog fermentativnog dijela, koji se direktno reflektira u sposobnosti razvoja kvasaca u uvjetima ekstremnog nedostatka kisika. - pogledu efekta dodavanja manje količine O 2, nakon jedne trećine fermentacije, za vrijeme trajanja fermentacije. Sljedeći grafovi pokazuju efekt dodavanja kisika u mošt, za dva različita soja u pogledu njihovog maksimalnog fermentativnog dijela i efektivnosti dodavanja: Graf 2: Kontrola fermentacije bez dodavanja O 2 (S 2 - produžena fermentacija) Fermentacijska stopa (g/l.h) Graf 3: Dodan 1 mg/l kisika. Vrijeme (h) 13

Fermentacijska stopa (g/l.h) Vrijeme (h) Graf 4: Dodano 7 mg/l kisika Dodatkom čak i manje količine kisika, kako vidimo iz grafa 3, poboljšana je fermentacija za više od 10 % te se na taj način može spriječiti predugačka, otegnuta fermentacija (Graf 2). Dodavanje 7 mg/l kisika, kako pokazuje graf 4 daje još učinkovitije rezultate. Ako je dodatak O 2 pažljivo kontroliran, u smislu dodavanja u pravo vrijeme i u optimalnoj količini, može se spriječiti produžena - predugačka fermentacija ili čak i zastoj vrenja, neovisno o izboru soja kvasca. Idealno vrijeme dodavanja kisika je u sredini fermentacije ili općenito kada je specifična gustoća 1.050. To je faza kada je kvasac došao do kraja svoje faze razmnožavanja i fermentativna aktivnost je najviša. Rizik od oksidacije mošta je minimalan i korištenje kisika od strane enzima je zanemarivo. U ovom slučaju kvasac profitira jer se u potpunosti snabdijeva s kisikom u usporedbi sa dodavanjem na početku. U pogledu količine kisika, dodatak od 5 do 10 mg/l je dovoljan, za sve potrebe kvasca. Da bi dodali oko 6 mg/l kisika, treba mošt pretakati 1,5 2 volumena fermentacijskog tanka. Ova metoda dodavanja je jednostavna, ali se precizno ne može regulirati dodavanje kisika jer ovisi o protočnosti pumpe, veličini tanka, vremenu zadržavanja mošta u tanku u 14

koji se prepumpava i o visini sa koje mošt pada u tank (Sablayrolles et al., 1998). Precizniji način je dodavanjem O 2 pomoću difuzera. SO 2 Moderna proizvodnja vina zahtjeva primjenu određene količine SO 2, međutim to ne predstavlja neki posebni problem u fermentaciji mošta, budući da su sojevi Saccharomyces cerevisiae relativno otporni na SO 2 (naravno ovisi o sojevima). Djelotvornost SO 2 vezana je za ph: viši ph, slabija aktivnost i obratno. Znači kod višeg ph, mošt je pogodniji za kontaminaciju i razvoj štetnih sojeva. U tom slučaju doze SO 2 moraju biti prilagođene pojedinačnim slučajevima i zajedno sa kontroliranjem temperature, preventivno treba sprječavati razvoj divlje mikrof1ore. Međutim ne treba niti pretjerivati s dozama SO 2, budući da, kako smo vidjeli u drugom obliku fermentacije, SO 2 može utjecati na akumulaciju veće količine acetaldehida u vinu. Dušik Asimilacioni, pristupačni dušik, sastoji se od amonijačnog oblika dušika i α.-amino dušika (slobodne amino kiseline, osim prolina kojeg kvasci u fermentaciji mošta ne asimiliraju) i predstavlja hranu za kvasac, koja ima najveći utjecaj na brzinu alkoholne fermentacije. (Agenbach, 1977; Bezenger i sur., 1987). Dušik je esencijalni element potreban za sintezu proteina, pogotovo onih koje su odgovorni za transport šećera. 100 200 300 400 500 Asimilacioni dušik (mg/l) Graf 5: Maximum fermentacijskog tempa izražen kao (dco2/ dt) max, u odnosu na početni sadržaj dušika u moštu (Lalemand). 15

Nedostatak dušika u moštu limitira razmnožavanje kvasaca i time brzinu fermentacije (graf 5) (Bely i sur., 1990). Zbog niže koncentracije dušika u moštu, veći je rizik od usporene fermentacije. Općenito, moštevi sadrže između 80 i 400 mg/l, a granica kada je dušik u nedostatku je između 150-180 mg/l (Henschke i sur.,1993). Nedostatak dušika u moštu također zaustavlja sintezu proteina koju provodi kvasac. Ova inaktivacija rezultira smanjenom aktivnošću u transportu šećera, što povećava rizik od zastoja fermentacije (Basturia i sur., 1986). Nedostatak dušika u moštu može, kako je prikazano na sljedećoj slici, voditi u pojačanu tvorbu H 2 S-a, od strane kvasca. Slika 7: Formiranje H 2 S (Lallemand). Novija istraživanja pokazuju da su različiti sojevi kvasaca, testirani u moštevima u kojima je nedostajalo dušika (100 mg/l asimilacijskog dušika) imali signifikantno različite potrebe za dušikom (Jiranek et al.. 1991; Manginot et al.. 1998; Julien et al.. 2000). Radi toga je važno odrediti koncentraciju asimilacijskog dušika, prije izbora soja za inokulaciju. Formalin titracija je brza i točna metoda koja se može koristiti u podrumima (potreban je samo ph-metar). Preporučljiva prosječna količina dušika kreće se oko 30 g/hl asimilacijskog dušika, a količina koja se dodaje ovisna je o početnoj koncentraciji dušika u moštu. Mikrohranjiva Riječ "mikrohranjiva" u enologiji podrazumijeva sve one tvari koje koriste mikroorganizmi mošta i vina kao hranu, a prisutne su u manjim količinama. Medu njima najvažniji su mineralna hranjiva i vitamini. Njihova uloga često je indirektna: za razliku od 16

dušika, ugljika, sumpora i fosfora koji su uključeni u strukturalne funkcije, mineralni elementi i vitamini često djeluju kao ko-enzimi, čineći mogućim aktivnost proteina ili imaju aktivnu ulogu u transportnom sistemu kroz membrane. Saznanja o stvarnoj bioaktivnosti ovih elemenata za sada su nedovoljno istražena: ovi elementi često su vezani na ostale spojeve u moštu, tako da ih mikroorganizmi ne mogu asimilirati. Vitamini Neki vitamini imaju posebno važnu ulogu u procesu alkoholne fermentacije. Biotin - potiče stvaranje estera i viših alkohola i poboljšava životnost stanica pri kraju fermentacije. Njegov nedostatak signifikantno smanjuje prirast stanica. Pantotenat sudjeluje u metabolizmu lipida, ima pozitivan efekt na organoleptička svojstva smanjujući rizik od proizvodnje H 2 S-a i hlapivih kiselina. Tiamin - čija je uloga bila predmetom mnogih studija, ima važnu ulogu i njegov nedostatak može voditi zastoju vrenja. Njegov nedostatak često može biti uzrokovan lošijim pred-fermentativnim tretmanom kao što su dodavanje SO 2 i temperaturna kontrola (Peynaud i sur., 1957; Oumac i sur., 1970). Tiamin ima svojstvo brzog vezanja sa SO 2, poslije kojeg više nije dostupan kvascima. Dokazano je da kvasci u normalnim koncentracijama u moštu (10 6 stanica), mogu u roku 2-3 sata potrošiti sav tiamin, jer ga mogu akumulirati u većim količinama. Osim toga, divlji ne-saccharomyces kvasci, ponekad iskoriste ovaj vitamin prije nego sami Saccharomyces cerevisiae kvasci. Anorganske soli Ostala hranjiva kao što su magnezij, cink i kalij imaju isto vrlo važnu ulogu u ishrani kvasaca. Magnezij - ima specifičnu ulogu i od naročite je važnosti u kontroliranju rasta stanica i u metabolizmu kvasaca. On daje bolju otpornost na temperaturu i otpornost na viši 17

osmotski pritisak. Uključen je u održavanje stanične cjelovitosti stabilizirajući nukleinske kiseline, polisaharide, lipide i proteine (Walker, 1994). Magnezij dodatno povećava proizvodnju etanola (Qombek, 1986). Magnezij ima središnju ulogu u metabolizmu fermentacije: on aktivira brojne encime glikolize (npr. piruvat karboksilazu, fosfat transferazu i neke dekarboksilaze), stimulira sintezu masnih kiselina, regulira asimilaciju drugih iona, aktivira ATP membrane koje su odgovorne za aktivni transportni sistem (Jones i sur., 1984). U uvjetima nedostatka magnezija, kvasac stvara više octene kiseline i manju količinu alkohola (slabija iskoristivost kvalitete grožđa). Pored toga magnezij je uključen u regulaciju funkcije membrane, u održavanju integriteta i permeabilnosti membrane, regulirajući transport drugih kationa (K + /H + i Na + /H + transportni sistem). Magnezij ima glavnu ulogu u kontroli rasta stanica, kao i u mehanizmu pupanja kvasca. Kvasac ima veliku potrebu za magnezijem (10 x više nego za natrijem) i količina magnezija u plazmi membrane je 20 x veća nego sadržaj kalcija. Magnezij za svoju normalnu funkcionalnost treba mangan. Optimalna količina magnezija za kvasce je 50-100 mg/l, dok je minimalna količina 40 mg/l. Studije su pokazale da se sadržaj Mg ++ u moštu kreće od 40 do 160 mg/i, prosječno 90 mg/l (Cabanis i sur., 1999). Previsoke količine magnezija mogu imati i inhibirajući efekt. Viši sadržaj magnezija osigurava sojevima Saccharomyces cerevisiae veću otpornost na alkohol i na više temperature, povećava životnost (viabilnosti) za 20 pa do čak 60 i više %, kod eventualnih stresnih situacija (npr. visoki sadržaj alkohola). Nije značajan samo ukupni sadržaj Mg ++, jako važan i postojeći odnos između magnezija i ostalih kationa antagonista. Asimilacija magnezija smanjuje se sa povećanjem koncentracije kalija, pa i manje količine K + (manje od 800 mg/i) imaju inhibirajući efekt. Pored toga značajna je i količina Ca ++, čija koncentracija u groždanom - moštu varira od 30 do 200 ppm. Oni mogu reducirati dostupnost magnezija i na taj način utjecati na njegovu biološku funkciju. Cink - je isto vrlo važan, jer je koenzim mnogih enzima (alkohol dehidrogenaze i dr.) i ko-faktor emzima glikolize. Njegov nedostatak nepovoljno djeluje na rast stanica, kao i na fermentativnu aktivnost. Ima pozitivan utjecaj na sintezu riboflavina, na aktivaciju fosfata i 18

sintezu proteina. Daje kvascima bolju otpornost na alkohol i ima važnu ulogu u formiranju estera.u nedostatku Mn ++ čak i mala količina Zn ++ je toksična za kvasce. Kalij ne spada u mikroelemente, jer mošt sadrži daleko veću količinu K + od ostalih elemenata, ali ima ključnu ulogu u protoku ostalih iona. Koncentracije kalija kreću se u rasponu od 550 do 2 800 mg/l. Kod nižih ph vrijednosti, kvasci trebaju koncentraciju kalija veću od 300 mg/l (Bison, 1998). Mangan ima važnu ulogu u metabolizmu kvasca: kada ga ima dovoljno, sinteza proteina ide nesmetano, sintetizira se tiamin i to rezultira povećanjem biomase. Uz dovoljnu količinu pristupačnog Mn ++, kvasac proizvodi enzim alkohol dehidrogenazu. Asimilacija Mn ++ ovisi o prisutnosti kalija i bakra u moštu. Istraživanja su pokazala da je za razmnožavanje kvasaca najbola koncentracija Mn ++ od 0.11 do 0.22 mg/l. Ovi bivalentni kationi mogu se vezati i na različite spojeve u moštu, kao što su proteini i polifenoli i tada ne mogu biti iskorišteni od strane kvasaca. Rezidui pesticida Isto imaju utjecaja na fermentativne probleme. Metholachlor i propanil su komponente koje su se pokazale kao glavnim inhibitorima kvasaca, (Boscariol et al.. 1991). Neki pesticidi kao što je dichlof1uanide mogu produžiti latentnu fazu, i samim time odgoditi početak fermentacije (Palacios et al., 2000). Rezidui pesticida mogu djelovati direktno (e.g. fungicidi), ili indirektno, no kvasci moraju detoksicirati fermentativni medij, prije nego što mogu početi fermentaciju. 19

2 MALOLAKTIČNA FERMENTACIJA Nekad nazivana i «sekundarna fermentacija», a danas «biološko odkiseljavanje» predstavlja razgradnju jabučne kiseline putem mliječnih bakterija. Ranije kada upotreba SO 2 nije bila toliko raširena malolaktična fermentacija bila je česta ili gotovo redovita pojava. Mensio i sur. (1914) navode da se «malolaktična fermentacija javlja u svim vinima različitog inteziteta sa korisnim ili lošim posljedicama, ovisno o sastavu vina. Može se govoriti o dvije fermentacije, alkoholnoj i malolaktičnoj». Malolaktična fermentacija je vezana uz zonu sa umjerenom klimom kod koje dolazi do nakupljanja veće količine jabučne kiseline i gdje se proizvode «velika vina» pa je ovaj proces pozitivan npr. za Bordeaux, Borgogna-u, Piemonte, Valtelina i dr. Štetna je nasuprot tome u toplim zonama gdje je mošt siromašan na kiselinama, zatim u proizvodnji pjenušavih i frizante vina, koji moraju ostati mladi dugo vremena. Štetna je, isto tako, ako se javi kao posljedica bolesti, ili u već buteljiranim vinima. Garvie, (1967) je publicirao fundamentalni rad, koji je predstavljao zaokret u poimanju malolaktične fermentacije. Determinirao je soj, forme koki, koji fermentiraju jabučnu kiselinu u sredini ispod ph 5, kao soj Leuoconostoc oenos. Kasnijim klasifikacijama je Leuconostoc oenos nazvan Oenococcus oeni. Florenzo i Balloni, (1981) uspoređuju značaj otkrića ovih bakterija sa značajem otkrića kvasaca Saccharomyces cerevisiae kod alkoholne fermentacije. Oenococcus oeni je najznačajnija ali ne i jedina bakterija u malolaktičnoj ferementaciji. Sposobne su fermentirati i druge vrste kao: - Lactobacillus plantarum, - Lactobacillus trichodes, - Lactobacillus trevis i dr.. Ove bakterije se nalaze pojedinačno ili u skupini u vinu u kojem traje malolaktična fermentacija. Lafon Lafourcade, (1983), navode koje su bakterije prisutne u grožđu i moštu: - Lactobacillus plantarum, - Lactobacillus higlardi, - Lactobacillus cosei i - Oenococcus oeni (rjeđe od drugih). 20

Tijekom malolaktične fermentacije njihov broj se postepeno smanjuje i na kraju ostaje samo Oenococcus oeni. Ova vrsta je jedino odgovorna za spontanu fermentaciju jer ove druge nemaju tako važnu ulogu (moguće i zbog slabije tolerance na alkohol). Malolaktične bakterije detaljnije su obrađene u kolegiju Mikrobiologija mošta i vina. 2.1 BIOKEMIZAM MALOLAKTIČNE FERMENTACIJE Biokemizam malolaktične fermentacije je prikazan u sljedećoj formuli. Iz molekule jabučne kiseline, aktivnošću malolaktičnih bakterija, nastaje molekula mliječne kiseline i ugljičnog dioksida. COOH CH 2 CHOH COOH CH 3 CHOH COOH + CO 2 Sam proces malolaktične fermentacije odvija se u dvije etape. Najprije malatni enzim katalizira reakciju između jabučne i pirogrožđane kiseline, a zatim iz pirogrožđane kiseline posredstvom enzima laktat dehidrogenaze nastaje mliječna kiselina. Malatni enzim COOH CH 2 CHOH COOH CH 3 -CO-COOH + CO 2 + 2 NADPH L (-) jabučna kiselina Mg 2+ Pirogrožđana kiselina Međutim pored malatnog enzima, postoji još jedan enzim, malat dehidrogenaza koji je puno rjeđi (potreban NAD + ) i od manje važnosti za malolaktičnu fermentaciju. Posredstvom ovog enzima iz jabučne kiseline stvara se oksaloctena kiselina, iz koje se zatim pomoću enzima oksalacetat dekarboksilaze stvara pirogrožđana kiselina i CO 2. COOH CH 2 CHOH COOH L (-) jabučna kiselina malat dehidrogenaza COOH-CH 2 -CO-COOH oksaloctena kiselina oksalacetat dekarboksilaze COOH-CH 2 -CO-COOH CH 3 -CO-COOH + CO 2 oksaloctena kiselina pirogrožđana kiselina 21

Kad je stvorena pirogrožđana kiselina, kao što je već rečeno, pomoću enzima mliječne dehidrogenaze, pirogrožđana kiselina transformira se u mliječnu kiselinu. CH 3 -CO-COOH L - jabučna kiselina Enzim laktat dehidrogenaza CH 3 -CHOH-COOH + NAD L-mliječna kiselina Budući da je ovaj enzim, laktat dehidrogenaza koji je pronađen u malolaktičnim bakterijama, odgovoran za produkciju D - mliječne kiseline, neki autori smatraju da je za malolaktičnu fermentaciju zaslužan tzv. malolaktični enzim, koji bi u stvari bio odgovoran za direktnu pretvorbu jabučne kiseline u L oblik mliječne kiseline, a koja je utvrđena kao finalni produkt malolaktične fermentacije. Ova bi se transformacija odvijala dakle prema sljedećoj shemi: malolaktični enzim COOH - CH 2 - CHOH - COOH CH 3 -CHOH-COOH + CO 2 L - jabučna kiselina L - mliječna kiselina 2.1.2 SEKUNDARNI PRODUKTI Malolaktičnu fermentaciju prati i određena fermentacija šećera i stvaranje octene kiseline. Diacetali i aceton povećavaju se 2-3 puta. Produkcija diacetala i acetona vezana je za iskorištavanje limunske kiseline od strane bakterija. Ova kiselina nalazi se u vinu oko u količini od oko 0,5 g/l i može biti djelomično ili potpuno metabolizirana od strane bakterija. Količina diacetala i acetona ima direktan utjecaj na kvalitetu vina, jer diacetali imaju neugodan miris na maslac. 2.2 POSLJEDICE MALOLAKTIČNE FERMENTACIJE Vidljiva posljedica malolaktične fermentacije je značajno smanjenje ukupne kiselosti, razgradanja grube jabučne kiseline i stvaranje blaže mliječne kiseline i produkcija CO 2, što izaziva zamućenje vina. Pojavljuju se i drugi sastojci kao octena kiselina, diacetal, aceton i 22

različiti esteri. Karakteristike mirisa i okusa se mijenjaju najčešće izazivajući poboljšanje u kvaliteti vina, ali ponekad može i degradirati kvalitetu vina. Malolaktična fermentacija prema Gnaegi (1984) može imati i neke negativne posljedice: ako zaostane manja količina jabučne kiseline, može se javiti naknadna malolaktična fermentacija u boci, što izaziva zamućenje vina, trajanje malolaktične fermentacije ponekad može biti predugačko, rizik pojave Pediococcusa (zbog bakteriofaga na Oenococcus ili zbog niskog ph), efikasnost uniformnih sojeva može češće biti ugrožena sa bakteriofagima (virusi koji napadaju bakterije). Potreba za smanjenjem kiselosti je: 1. posljedica vremenskih prilika: veći sadržaj ukupnih kiselina-sjeverni krajevi i 2. povećanja kakvoće vina. Smanjenje kiselosti može se izvesti i kemijskim putem, ali se neutralizira i određena količina vinske kiseline, dok jabučne koju inače želimo odstraniti odstranjujemo samo djelomično. Značajno smanjenje jabučne kiseline dolazi kod karbonske maceracije tzv. enzimatskim putem, zbog prisutnosti potrebnih enzima (to je također biološko odkiseljavanje). Biološko odkiseljavanje vrši se pomoću malolaktičnih bakterija kao i pomoću specijalnih sojeva kvasaca Roda Scchizosaharomyces. 2.3 ČIMBENICI KOJI UTJEČU NA MALOLAKTIČNU FERMENTACIJU. ph jedan je od najznačajnijih faktora. Njegova uloga je višestruka. U spontanoj fermentaciji ph vrijednost vrši selekciju prisutnih bakterija. Niže vrijednosti od ph 3,5 idu u prilog Oenococcus oeni dok više vrijednosti pogoduju Lactobacillus i Pediococcus. Međutim i Oenococcus oeni može biti blokiran ako je ph ispod 3,0, jer ph bitno utječe na brzinu (dužinu) fermentacije. Tako neka istraživanja pokazuju da je kod ph 3,8 malolatična fermentacija trajala samo 14 dana, dok je kod ph 3,15 i na 12 C trajala čak 164 dana. Kod viših ph vrijednosti malolaktična fermentacija ide lakše međutim lakše dolazi do povišenja hlapivih kiselina. 23

SO 2 usporava rad malolaktičnih bakterija i zajedno sa karbonatima djeluje na bakterije. Vrijednost ukupnog SO 2 trebala bi se kretati maksimalno između 50 100 mg/l i do 10 mg/l slobodnog SO 2. Kod niske ph vrijednosti i relativno niske doze SO 2 mogu stvarati velike probleme. Kvasci zadržavanje kvasaca u vinu nakon fermentacije, djeluje pozitivno na mliječne bakterije. Ovo je povezano sa procesom autolize kvasaca, jer sastojci koji se oslobađaju raspadom kvasaca predstavljaju najneophodnija hranjiva za bakterije (aminokiseline i faktori rasta i razvoja). Kisik potpomaže razvoj bakterija. Temperatura malolaktične bakterije su mezofilne. Za Oenococcus oeni je minimalna temperatura 10 C, a optimalna 18 24 C. 2.3.1 POSTUPCI ZA STIMULIRANJE MALOLAKTIČNE FERMENTACIJE Sredina u kojoj je ph između 3,3 3,4 je optimalna za početak fermentacije. Međutim ph nije jedini faktor o kojem ovisi aktivnost malolaktičnih bakterija. To ovisi o još puno faktora koji su izvan naše kontrole (klimatski uvjeti, stanje grožđa i dr.). Fermentacija na komini djeluje pozitivno posebno zbog inicijalnog ph, kakvog ovakva tehnologija daje, kao i zbog bogatstva aditiva (hrane). Nasuprot tomu postupci bistrenja i odvajanja od taloga utječu negativno, jer se mošt osiromašuje sa hranjivima koja su potrebna za rad bakterija. 2.3.2 POSTUPCI ZA SPREČAVANJE MALOLAKTIČE FERMENTACIJE Dodavanjem veće količine SO 2 prije fermentacije kao i kasnije nakon fermentacije, može se spriječiti malolaktična fermentacija. Sorbinska kiselina daje dobre rezultate kod mirnih vina, međutim treba izbjegavati za vina koja su predviđena za refermentaciju, jer inhibiraju rad kvasaca, kao i zbog moguće konverzacije (pretvaranja) u geraniol. Drugi antiseptici nisu dozvoljeni odnosno zabranjeni su zbog štetnosti za ljude. Dobri rezultati 24

postižu se i filtriranjem kroz pore 0,22 0,45 µm (dovoljno fina filtracija, da se eliminiraju skoro sve stanice bakterija). Pasterizacija također daje dobre rezultate samo treba prilagoditi pojedinom soju, tako se soj Oenococcus oeni inaktivira na temperaturi od 55 C u trajanju 30 minuta. Najefikasnija metoda za eliminiranje malolaktičnih bakterija je upotreba enzima lizocima. Ovaj enzim otkrio je Fleming, 1921. godine kad i penicilin. Lizocim je jedan hidrolitički enzim čijim posredstvom dolazi do razgradnje stanica bakterija, što izaziva njihovo uginuće. Ovaj enzim prisutan je u prirodi, u suzama, u slini (životinje ližu rane za dezinfekciju) i u bjelancetu jajeta odakle se i industrijski proizvodi (koristi se i u mljekarstvu). Opsežna istraživanja primjene lizocima u vinarstvu obavio je Amati (1992). On je ustanovio da ako vino nije jako kontaminirano malolaktičnim bakterijama dovoljna je količina od 250 500 ppm ovog enzima. Ako je velika količina bakterija, potrebno je povećati dozu. 2.3.3 STIMULIRANJE SPONTANE MALOLAKTIČNE FERMENTACIJE Kako bi izazvali spontanu malolaktičnu fermentaciju moramo osigurati optimalnu temperaturu i eliminirati sve one faktore koji usporavaju ili sprečavaju malolaktične bakterije i nadati se da su bakterije Oenococcus oeni prisutne u vinu. Ovakvo se odkiseljavanje vrši u nekim najpoznatijim vinskim regijama Evrope kao npr. u Bordeauxu, ali se često i dogodi da malolaktična fermentacija ne krene. U koliko u nekim bačvama dođe do malolaktične fermentacije, tim vinom može se inokulirati (cca 5 % vina) druge bačve (neki autori sugeriraju i više,15 pa čak 50%). Alternativna mogućnost je inokulacija sa talogom ili izdvojenim stanicama putem centrifugiranja ili filtriranja. Izolirani sojevi bakterija mogu se i čuvati u smrznutom stanju i po potrebi aktivirati. 2.4 ODABIR I SELEKCIJA BAKTERIJA Malolaktičnih bakterija je puno ali značajne su samo Oenococcus oeni koje podnose nisku vrijednost ph. Može se smatrati važnim i Lactobacillus plantarum koji je vrlo 25

snažan i otporan na nepovoljne uvjete. Poradi toga je ova vrsta idealna za početak fermentacije. Kasnije je od značaja jedino Oenococcus oeni kojeg Balloni (1981), kako smo već vidjeli, po značaju uspoređuje sa važnošću Saccharomyces cerevisiae kod kvasaca. U selekciji Oenococcus oeni postignute su sljedeće karakteristike: tolerantan na alkohol do 15 vol %, tolerantan na ukupan SO 2 do preko 50 mg/l, aktivan i u sredini ispod ph 3,0, aktivan na temperaturi 10 15 C, daje dobre organoleptičke karakteristike, otporan na bakteriofage i ne proizvodi smole i druge sastojke. Osim ovoga Heinck i Kling (1992) dodaju: značajni su za pokretanje malolaktične fermentacije, ne producira strane mirise, aktivni su kod različitih tipova vina i podnose različite uvjete u minivinifikaciji. 2.5 PRIPRAVA PREDKULTURE Prilagodba Oenococcus oeni u vinu je problematična jer nakon inokulacije velik broj stanica ugiba. Zato treba dodati predkulturu razvijenu u sredini koja otprilike odgovara sastavu vina. Priprava predkulture: pripremi se mošt razrijeđen sa 50 % vode, tako da se ph kreće oko 4,5 i doda se 5g ekstrakta kvasca. Ovu sredinu se inokulira sa bakterijama na temperaturi od 25 C. Nakon cca 7 dana doda se u mošt ili vino. Razvijena (umnožena) kultura Oenococuus oeni u punom razvoju sadrži preko 1 milj. / ml. Uzimajući to u obzir inokulacija sa tom predkulturom od 1 % odgovara dodatku 10 mil stanica / ml. Prema mišljenju autora na ovaj način ostaje dio stanica živ. Kao što je rečeno ugibanje bakterija je veliko, pogotovo ako je ph nizak. Prema autorima od inicijalnog 26

broja od 1 100 miliona stanica/ml, broj stanica može pasti na 10 1 000 stanica/ml, što znači da se riskira gubitak kulture. Predkulture Oenococcus oeni mogu se dodati u tri različita trenutka vinifikacije: u mošt prije fermentacije u mošt u punoj fermentaciji u vino nakon alkoholne fermentacije. Po Beelman (1982) i Beelman i Kunkee (1985) inokulacia u mošt je dobra jer je pogodna sredina za prilagodbu stanica bakterija (nema etanola i bogata sredina hranjivima). Ovom postupku se protive neki autori (Lafon Lafourcade, 1983) jer malolaktične bakterije troše i šećer i produciraju osim mliječne i octenu kiselinu, što povisuje hlapive kiseline. I Gallanger (1979) smatra da, s obzirom da malolaktične bakterije ne možemo koristiti kada dodajemo SO 2, ne može se prakticirati u ovo vrijeme. Inokulacija u vrijeme alkoholne fermentacije prema (Davis, 1985) prakticira se u proizvodnji kalifornijskih vina. Gallanger (1979) tvrdi da na ovaj način izbjegnut je utjecaj negativnih faktora (alkohol i SO 2 slobodni) i malolaktične bakterije imaju dobre uvjete za adaptaciju i početak umnožavanja. Najveći broj autora favorizira dodatak malolaktičnih bakterija nakon završetka alkoholne fermentacije jer se tako dobivaju najbolji rezultati. 2.6 KOMERCIJALNI PREPARATI Sve ovo ranije navedeno pokazuje kako u upotrebi selekcioniranih kultura Oenococcus oeni nailazimo na mnogo problema. U rješavanju ovih problema nedavno su razvijeni liofilizirani preparati Oenococcus oeni sa dehidriranom hranom za pokretanje. S ovim preparatima moguće je riješiti prvu fazu razmnožavanja ali ostaju problemi pri dodatku u vino. Svi autori su uvjereni da reaktivacija u vino je bolja i efikasnija i u pogledu umnožavanja i u pogledu preživljavanja stanica nakon inokulacije. Dobri rezultati postižu se i dodatkom u mošt. 27

Metode aktivacije liofiliziranih malolaktičnih bakterija Aktivacija u vinu Aktivacija u moštu Aktivacija u moštu (Valde, 1987) (Valde i Laurent, 1987) (Gerbaux i Nault, 1994) Rehidratacija: 50 g bakterija u 200 ml otopine u kojoj je otopljeno 50 g/l glukoze Rehidratacija: 50 g bakterija u 200 ml otopine u kojoj je otopljeno 50 g/l glukoze Reaktivacija: 10 l razrijeđenog mošta, 10 8 stanica / ml liofiliziranih bakterija + 2 g / l ekstrakta kvasca Reaktivacija: 20 l razrijeđenog vina + 2,5 g ekstrakta kvasca Reaktivacija: 20 l razblaženog mošta + 10 g / hl suhog aktivnog kvasca Privikavanje: 5 hl vina u kojem je završena fermentacija Privikavanje: 5 hl mošta u fermentaciji Inokulacija:100 hl vina sa završenom fermentacijom Inokulacija:100 hl vina sa završenom fermentacijom Inokulacija: 100 hl mošta koji fermentira 48 sati. 28

2.7 BOLESTI IZAZVANE MLIJEČNIM BAKTERIJAMA Mliječno-kiselo vrenje Bolest koja se javlja u slatkim vinima, češće u crnim vinima i južnim krajevima. Vino zaraženo ovom bolešću opalescira i postaje mutno. Miris postaje sladkast sa izraženom aromom octene kiseline. Stvara se mliječna kiselina, octena kiselina (daje okus ljut-oštar) u količini 2 3 g/l i alkohol manit (slatkast okus) do 10 g/l. Fermentacija šećera mliječna kiselina + octena kiselina + CO 2 + alkoholi Glukoza Fruktoza etanol manitol Sluzavost Zahvaća također slatka vina. Vina su sluzava i viskozna koja se prelijevaju kao ulje. Izazivači su bakterije Leuconostoc. Aktivnošću ovih bakterija formiraju se polisaharidi (dekstran i fruktozan) iz monosaharida, koji su konzistencije gume. Sluzavost može nestati ali ostaje niži ph. Uzročnici mogu biti isti kao kod mliječno kiselog vrenja. Prevrnutost Javlja se nakon skidanja sa taloga. Manifestira se ponovnim vrenjem, mućenjem i pojavom taloga. Fermentira prvenstveno vinsku kiselinu ali i određenu količinu jabučne kiseline i glicerola. Posljedice su: značajna količina mliječne kiseline, hlapivih kiselina (octena i propionska). 2.8 ODKISELJAVANJE KOMENTAR Malolaktična fermentacija uspijeva ako se primjenjuju svi postupci koji potpomažu razvoj bakterija. Najbolja garancija je inokulacija sa laboratorijskim bakterijama ili komercijalnim preparatima. Odkiseljavanje sa malolaktičnim bakterijama je složenije ako je vino sastava koji sprečava rad bakterija. To se na primjer događa u sjevernim krajevima (npr. berba 1984. godine). Te godine moštevi, odnosno vina, imali su inhibirajući sastav od 29

7 10 g/l jabučne kiseline i ph ispod 3,0. U takvim uvjetima kada malolaktične bakterije ne mogu djelovati treba tražiti drugi put, a to je upotreba tzv. maloalkoholnih kvasaca Schizosaccaromyces. Za sprečavanje mnogih smetnji u malolaktičnoj fermentaciji nastoji se koristiti druge postupke kao biološko odkiseljavanje sa enzimima i imobiliriziranim stanicama. 30

3 JABUČNO ALKOHOLNA FERMENTACIJA Kvasci roda Schizosaccharomyces posjeduju sposobnost da jabučnu kiselinu transformiraju u etilni alkohol i CO 2, pa se mogu koristi za biološko odkiseljavanje i odstranjivanje kiselina. Sojevi koji se najviše koriste su Schizosaccharomyces pombe, jer pored ove sposobnosti, imaju i druge potrebne osobine tj. da podnose alkohol (cca 10 vol %) i uobičajene količine SO 2. Također su interesantni Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus. Odkiseljavanje sa kvascima može se obavljati u fermentaciji ili u refermentaciji. Odkiseljavanje u fermentaciji: Kvasci roda Schizosaccharomyces imaju dobre enološke karakteristike i mogu se koristiti umjesto S. Cerevisiae. 1. Imaju određenu sposobnost fermentiranja i relativno su otporni na SO 2, međutim ne posjeduju kvalitetu Saccharomysec cerevisiae, tako da u sulfitiranom moštu često ne uspijevaju nadmašiti prisutne divlje kvasce. 2. Snaga fermentacije Schizosaccharomyces prelazi malo preko 10 vol % alkohola i često puta ovi kvasci imaju poteškoća pri završetku fermentacije. Potpuna fermentacija dolazi jedino ako se koristi sa S. Cerevisiae (bayanus). 3. Količina proizvedenih sekundarnih spojeva je slična kao kod S. Cerevisiae. 31

4 OCTENA FERMENTACIJA Octenu fermentaciju izazivaju bakterije octenog vrenja, koje su sposobne fermentirati etilni alkohol u octenu kiselinu. Octene bakterije otkrio je Kützing 1837. godine i nazvao ih Ulvina aceti. Pasteur je kasnije, 1864. godine utvrdio da su upravo ovi mikroorganizmi odgovorni za oksidaciju etanola, te ih nazvao Mycoderma aceti. Godine 1898. uveden je naziv Acetobacter koji je ostao do danas. To je dosta ujednačena grupa bakterija kojima je zajedničko da su u stanju oksidirati etanol u octenu kiselinu (kisela sredina), a razlikuju se po brzini produkcije ove kiseline i po brzini pretvaranja octene kiseline u vodu i ugljični dioksid. Octene bakterije, zbog svoje aktivnosti pri niskim ph vrijednostima, predstavljaju veliku opasnost u proizvodnji vina jer se mogu javiti u svim fazama vinifikacije. U moštu su većinom prisutne bakterije Gluconobacter, a u vinu Acetobacter. 4.1 KEMIZAM FERMENTACIJE Transformacija etanola u octenu kiselinu (bioksidacija etanola) odvija se prema sljedećoj jednadžbi: CH 3 CH 2 OH + O 2 CH 3 COOH + H 2 O Do ove transformacije dolazi na sljedeći način. Najprije etanol transformira u acetaldehid CH 3 CH 2 OH CH 3 CHO + 2H + O 2 Acetaldehid se zatim hidratizira H CH 3 CHO + H 2 O CH 3 C OH OH 32

Dehidratizirani acetaldehid se zatim transformira na dva načina: (a) aerobnom dehidrogenacijom (b) anaerobnom dismutacijom (formira se i etanol) H (a) CH 3 C OH CH 3 COOH + 2H i O H 2 O OH H (b) CH 3 C OH + CH 3 CHO CH 3 COOH + CH 3 CH 2 OH OH Dismutacijom se proizvede 50 % octene kiseline i 50 % etanola. Ovaj etanol ponovo podliježe octenoj fermentaciji, do potpunog pretvaranja u octenu kiselinu. 4.2 UVJETI ZA RAD OCTENIH BAKTERIJA Kisik - Octene bakterije su aerobne i za njihov razvoj je potrebno prisustvo zraka. Temperatura octenim bakterijama u pravilu odgovara viša temperatura cca 30 C, ali podnose i dosta niske temperature sve do 5 C. Octena fermentacija najintenzivnija je na temperaturi između 23 C i 28 C. ph aktivne su u kiseloj sredini. Optimalni ph je između 5,4 do 6,3, međutim većina bakterija dobro se razvija i u ph vina. Dupy (1957) utvrdio je da se vrlo brzo razvijaju kod ph 3,2 pa sve do ph 3,0. Alkohol njegov utjecaj ovisi o soju i o hranjivima u vinu. U pravilu povećanjem alkohola smanjuje se aktivnost ovih bakterija ali ima i sojeva koji podnose i preko 14 vol 33

%. Ova osobina nije stabilna i ovisi o adaptaciji na sredinu. Verona i sur. (1938) su utvrdili da su mutanti mnogo otporniji od originalnih kultura, te budući da se otpornost na alkohol «stječe» možemo zaključiti da su za vino opasni upravo oni sojevi koji se nalaze u vinu ili moštu, dakle «unutarnji» koji se postepeno privikavaju na alkohol tijekom vinifikacije. SO 2 - Vrlo su osjetljive na SO 2 i to u normalnim dozama korištenja. Nisu međutim osjetljive na K-sorbat koji se inače koristi kao antiseptik. Hranjiva - octene bakterije ne traže posebno bogatu sredinu s hranjivima, već mogu opstati i djelovati i u siromašnoj sredini. 34

5 NJEGA I ČUVANJE VINA Po završetku alkoholne fermentacije nastaje nova etapa u kojoj se odigrava niz fizičko - kemijskih transformacija s kojima vino postepeno stječe svojstva, koja mu daju određenu kakvoću. Sa sve većim upoznavanjem prirode pojedinih promjena, ulaženjem u mehanizam i kemizam procesa koji se pri tome dešavaju, u stanju smo da ove promjene usmjerimo u pravcu kojim ćemo postići najbolju kakvoću, kojim će organoleptična svojstva vina, njegov okus i buke doći do maksimalnog izražaja. Njega i čuvanje vina obuhvaćaju niz raznovrsnih postupaka, koji imaju za cilj zaštitu vina od kvarenja i mana, te osiguravanje takvih organoleptičnih osobina vina, s kojima ono može izaći na tržište. 5.1 DOPUNJAVANJE SUDOVA Prestankom alkoholne fermentacije smanjuje se volumen vina, a razloga ovoj pojavi ima više. Uslijed razlaganja šećera prvobitni volumen mošta u tijeku alkoholne fermentacije smanjuje se za cca. 1%. Smanjenja zapremine vina nakon završene fermentacije dolazi i uslijed promjene njegove temperature. Osim toga stvoreni ugljični dioksid kao novi produkt fermentacije lako isparava (povlačeći za sobom i određenu količinu vode i alkohola), uzrokujući daljnje smanjenje volumena, koje po svršetku alkoholne fermentacije može iznositi i do 3,4 %. Na ovaj način u posudama sa vinom stvara se veći ili manji otpražnjeni prostor, u kojem vino dolazi u kontakt sa zrakom čime se stvaraju povoljni uvjeti za oksidaciju i rad aerobnih mikroorganizama. Budući se smanjenje volumena vina ne može u potpunosti izbjeći, to je potrebno pravovremeno otkloniti nastali otpražnjeni prostor, što se najčešće postiže dopunjavanjem bačava, još za vrijeme tihog vrenja, i dalje tijekom njegovog čuvanja. 35

Osim dopunjavanja sudova sa vinom što sličnijih karakteristika, zaštita vina u otpražnjenom prostoru obavlja se i unošenjem sumpornog dioksida, inertnih plinova (dušik ili ugljični dioksid), te inertnog ulja (npr. parafinsko ulje). 5.2 PRETAKANJE VINA Ovo je jedna od radnji, koja se u toku čuvanja vina najčešće primjenjuje. Pored odvajanja bistrog vina od njegova taloga, pretakanjem se podstiču i mnoge druge pojave često veoma značajne za njegovu kakvoću. Otvoreni pretok u pravilu prvi pretok novog, mladog vina, te vina s nekim stranim mirisom (npr. miris na H 2 S). Pretakanjem mladog vina odstranjujemo iz njega grube čestice mutnoće radi bržeg bistrenja. U prisustvu zračnog kisika mnogi sastojci vina prelaze u netopljivo stanje i talože se, tako da vino postaje stabilnije. Apsorbiranjem izvjesne količine kisika u vinu se odigrava niz oksido redukcijskih reakcija važnih za formiranje njegovih organoleptičnih osobina, naročito okusa i mirisa. Osim toga pretakanjem vina uz pristup zračnog kisika, možemo se osloboditi i nekih stranih mirisa ukoliko ih ima u vinu. vina. Zatvoreni pretok zatvoreno se pretaču vina s već formiranim bukeom, aromatična Broj pretakanja i vrijeme njihovog izvođenja u prvoj godini u velikoj mjeri ovise o vrsti i tipu vina, njihovom kemijskom sastavu i načinu čuvanja (obično 2 3). Prvi pretok (studeni), drugi pretok (veljača/ožujak), eventualno treći pretok (rujan), da bi se u idućim godinama pretok smanjio na jedan, ili tek jedan na dvije i više godina. 5.3 KUPAŽIRANJE (SLJUBLJIVANJE) VINA Kupažiranje predstavlja postupak kojim se dva ili više vina mješaju u određenom odnosu radi dobivanja vina sa izmijenjenim sastavom i organoleptičnim osobinama. Svrha 36