Mutacije, genetička šifra prof. dr. sc. Jasna Puizina, Prirodoslovno-matematički fakultet Split
Mutacije DNA Mutacije promjene u strukturi genetičkog materijala (slijedu nukleotida). Podjele mutacija: 1. S obzirom na strukturu 2. S obzirom na način nastanka 3. S obzirom na funkciju
1. Podjela mutacija s obzirom na strukturu 1. Točkaste mutacije (mikromutacije) 2. Kromosomski prerasporedi (makromutacije) 1. Točkaste mutacije (mikromutacije) - obuhvaćaju jedan ili nekoliko parova baza Bazne supstitucije Tranzicije : purin drugi purin pirimidin drugi pirimidin Transverzije : purin pirimidin pirimidin purin Duplikacije Inverzije Adicije frame shift mutacije (pomak Delecije okvira čitanja genetičke šifre) Mutacije u nekodirajućoj DNA
Bazne supstitucije najčešći tip točkastih mutacija
Bazne supstitucije mogu imati različite posljedice Pogrešne (missense), odgovorne za 45-50 % svih humanih patogenih mutacija Besmislene (nonsense), mutacije preuranjene terminacije, odgovorne za oko 11% svih humaih patogenih mutacija Istosmislene (tihe, silent)
Srpasta anemija primjer za pogrešnu (missense) mutaciju Adultni hemoglobin tetramerni protein, α 2 β 2 Srpasta anemija nastaje zbog mutacije u genu za sintezu β-lanca hemoglobina Alel za zdravi β-lanac je HbA eritrocit ima diskoidalni oblik Alel za mutirani β-lanac HbS eritrocit ima srpasti oblik Razlika između HbA i HbS u jednoj aminokiselini Umjesto glutaminske kiseline, (nabijena i polarna), javlja se valin (nepolaran) utjecaj na prostornu konformaciju polipeptida
Mutaciju pomaka okvira čitanja frame shift mutation izazivaju insercije i delecije
Krvna grupa 0 posljedica je pomaka okvira čitanja Krvna grupa 0, genotip I O I O Alel I O ima deleciju G na 261. mjestu u genu za glikoziltransferazu (kojeg čini 1062 nukleotida) Rezultat je preuranjena pojava terminacijskog kodona, degradacija mrna
2. Kromosomski prerasporedi (makromutacije) Obuhvaćaju dio gena, gen, dio kromosoma, kromosom ili setove kromosoma translokacije inverzije delecije duplikacije transpozicije amplifikacije
2. Podjela mutacija prema načinu nastanka 1. Spontane 1.1. Pogrešno ugrađeni nukleotid pri replikaciji i popravku DNA 1.2. Tautomerizacije baza 1.3. Deaminacija 1.4. Gubitak baze 2. Inducirane 2.1. Kemijski agensi 2.1.1. Alkilirajući spojevi 2.2.2. Agensi koji premošćuju DNA (interkalirajući) 2.2.3. Analozi baza 2.2.4. Kemijski spojevi koji se metaboliziraju u elektrofilni oblik 2.2. Fizički agensi 2.2.1.Ultravioletno zračenje 2.2.2.Ionizirajuće zračenje
Spontane mutacije 1.1. Pogrešno ugrađen nukleotid pri replikaciji DNA učestalost 10-9 10-10 1.2. Tautomerizacija baza spontani prelazak amino (NH 2 ) u imino (NH) oblik, uz mijenjanje osobina komplementarnog vezivanja baza A i = C (umjesto s T) C i = A (umjesto s G
Spontane mutacije 1.3. Deaminacija gubitak amino skupine Deaminacija citozina najčešća Deaminacija češća u jednolančanoj nego dvolančanoj DNA Može biti i inducirana, npr. s HNO 2 Deaminacija Sparivanje s Posljedice
Spontane mutacije 1.4. Gubitak baze depurinacija depirimidinacija Posljedica spontane hidrolize N-glikozidne veze Gubitak purina češći od gubitka pirimidina Gubitak baze češći u jednolančanoj nego u dvolančanoj DNA Nastalo AP mjesto može zaustaviti replikaciju i/ili uzrokovati jednolančani lom
Inducirane mutacije 2.1.1. Alkilirajući spojevi elektrofilni spojevi s afinitetom za nukleofilne centre u organskim molekulama alkilacija pripajanje alkilnih grupa (metilne, CH3, etilne CH3 CH2 -) monofunkcionalni i polifunkcionalni alkilirajući spojevi primjeri alkilirajućih spojeva: bojni otrov iz 2. svjetskog rata, nitrogen mustard metilmetasulfonat (MMS) etilmetasulfonat (EMS)
Alkilacijama su najpodložniji N 7 gvanina N 3 adenina Različite posljedice za stanicu: a) nije štetno za stanicu ( N 7 metilgvanin) b) letalno, jer uzrokuju zastoj u replikaciji (N 3 metiladenin i N 3 metilgvanin) c) mutageno, uzrokuju supstituciju baza (O6 alkilgvanin i O6 alkiltimin) jaki mutageni!!!!!
Alkilacija 0 6 gvanina vrlo mutagena Alkilacija O 6 uzrokuje gubitak protona sa susjednog N 1 0 6 metil stvara stabilnu vezu s timinom U idućoj replikaciji T se sparuje s A Umjesto CG AT par baza
Inducirane mutacije 2.1.2. Agensi koji premošćuju DNA (interkalirajući) kovalentno se vežu na po dva mjesta u DNA u istom (intrakalirajući spojevi ) ili u suprotnim (interkalirajući spojevi) lancima Primjeri: Dušična kiselina Neki antibiotici i citostatici Psoraleni za lječenje kožnih oboljenja Dušikove i sumporne gorušice Akridinske boje Etidijev bromid Premoštenje u DNA nastalo kovalentnim vezanjem dušikove gorušice na položaje N 7 u molekulama dvaju gvanina suprotnih lanaca
2.1.3. Analozi baza u DNA Inducirane mutacije spojevi slični normalnim DNA bazama, ugrađuju se u DNA i krivo sparuju prilikom sljedeće replikacije Primjeri: analozi adenina 2-aminopurin analozi timina 5-bromouracil 5-fluorouracil 5-jodouracil
Inducirane mutacije Uporaba analoga timina, azidotimidina (AZT) u lječenju AIDS-a Zaustavlja replikacije virusne DNA Stanične kinaze fosforiliraju ga u AZT trifosfat Učinkovit u tretmanu AIDS-a 1-2 godine Prirodna selekcija razvija reverznu transkriptazu sa niskim afinitetom za AZT Potrebna kombinirana terapija sa drugim baznim analozima Azidotimidin (AZT)
Inducirane mutacije 2.1.4. Kemijski spojevi koji se metaboliziraju u elektrofilni oblik benzapiren (iz duhanskog dima) u jetri se metabolički aktivira u mutagen koji izaziva transverziju gvanina u timin kad se aplicira na kulturu bronhijalnih stanica, aktivirani benzapiren izaziva mutacije u genu p53 p53 je tumor supresor protein i jedan od glavnih čuvara genoma od oštećenja
Inducirane mutacije In vitro eksperiment: aktivirani benzapiren apliciran na kulturu bronhijalnih stanica, izaziva inaktivacije (promjene) na kodonima 175, 248 i 273 u genu p53 In vivo nalaz: Iste pozicije mutacija u genu p53 pronađene u karcinomu pluća u čovjeka-pušača. Neoboriv dokaz o direktnoj korelaciji između kemijskog karcinogena i karcinoma u čovjeka Na slici je prikazan shematski prikaz proteina P53, sastoji se od 393 aminokiseline. Obojeni boksovi su sekvence koje su tijekom evolucije ostale visoko konzervirane i važne za funkciju proteina. Vertikalne linije pokazuju učestalost mutacije u različitim tumorima.
Inducirane mutacije Aflatoksin B iz plijesni koja napada sjemenke nakon enzimatske modifikacije u jetri vezuje se za gvanin i izaziva transverziju gvanin timin također izaziva mutacije u genu p53 povećan rizik od raka jetre
Inducirane mutacije 2.2.1.Ultravioletno zračenje svjetlost valne duljine bliske maksimumu apsorpcije (oko 260 nm) posljedice: dimer pirimidina 6,4 fotoprodukt
Inducirane mutacije- Ionizirajuće zračenje x - zrake i γ zrake neposredno djelovanje posredno djelovanje zbog nastanka reaktivnih molekula glavni uzročnici oštećenja produkti radiolize vode vodikov peroksid H 2 0 2 hidroksilni radikali OH superoksidradikal O 2 - posljedice: lomovi DNA jednolančani i dvolančani
Inducirane mutacije- Ionizirajuće zračenje Posljedice X-zračenja na kromosome čovjeka
3. Podjela mutacija s obzirom na funkciju 1. Mutacije gubitka funkcije, loss of function Genski produkt ima smanjenu funkciju (hipomorf) ili uopće nema funkciju ( null alel amorf). Te mutacije su najčešće recesivne. Aktivnost normalnog alela dostatna je za obavljanje aktivnosti. Primjer: hemofilija, srpasta anemija Iznimka je mutacija haploinsuficijencija u heterozigota. Smanjena doza normalnog genskog produkta nije dovoljna za normalni fenotip. Primjer: obiteljska hiperkolesterolemija i akutna intermitentna porfirija
3. Podjela mutacija s obzirom na funkciju 2. Mutacije dobitka funkcije gain of function Genski produkt je promijenjen, te je dobio novu, abnormalnu funkciju. Često ima povećanu razinu ekspresije i aktivnost. Te mutacije su najčešće dominantne. Primjeri: Huntingtonova bolest, mutirani protein huntingtin stvara stanične nakupine koje imaju neurotoksični učinak. Ahondroplazija: mutacija u FGFR3 rezultira u povećanoj aktivnosti staničnih receptora i posljedičnoj blažoj ili težoj supresiji rasta kostiju
3. Podjela mutacija s obzirom na funkciju 3. Dominantno negativna mutacija dominant negative mutation Mutirani genski produkt interferira s funkcijom normalnog genskog produkta normalnog alela. Često se događa u proteina dimera ili multimera: Primjeri: Bolest lomljivih kostiju, Osteogenesis imperfecta, uzrokovana mutacijama u jednom od dva gena COL1A1 i COL1A2 koji kodiraju za peptidne lance koji se kombiniraju u trimer, kolagen tip I.
Mutacije u nekodirajućoj DNA 1. Regulatorne (transkripcijske) mutacije - Događaju se u promotoru ili drugoj regulatornoj sekvenci kao što je prigušivač, pojačivač ili sl. - Najčešća posljedica je redukcija razine mrna, ali nekada povećana transkripcija 2. Mutacije prekrajanja - Događaju se u visokokonzerviranim donorskim (GU) ili primateljskim (AG) mjestima prekrajanja primarnog transkripta i završavaju poremećajem prekrajanja: gubitak egzona, zadržavanje introna, mutacije pomaka okvira čitanja - Kriptična mjesta izrezivanja mogu biti aktivirana kad su mutirana prava mjesta prekrajanja
Genetička šifra
Genetička šifra kod Skup pravila koji određuje kako će se slijed tripleta nukleotida u mrna prevesti u slijed aminokiselina u proteinu Obilježja genetičkog koda 1. Specifičnost kodona 1 kodon 1 aminokiselina Izuzetak: inicijalni kodoni u prokariota AUG i GUG AUG N-formilmetionin ( na početku mrna) i metionin (bilo koja druga pozicija u mrna) GUG metionin (na početku mrna) i valin (bilo koja druga pozicija u mrna) Genetički kod prikazan kao mrna kodoni
Genetička šifra kod 2. Redundancija (preopširnost, degeneriranost ili izrođenost kodona) Jednu aminokiselinu može kodirati nekoliko kodona Posljedica viška kodona (64 tripleta - 20 aminokiselina) Samo Trp i Met imaju po jedan kodon Redundancija se uglavnom odnosi na kolebljivo treće slovo kodona Primjer: šifra za alanin GCX, gdje je X bilo koja od 4 baze Redundancija pridonosi većoj stabilnosti genetičkog koda sprječavaju se ekspresije nekih mutacija 3. Odsustvo interpunkcije Između 2 kodona ne postoji razmak nukleotidi koji ne nose informaciju
Genetička šifra kod 4. Odsustvo preklapanja nukleotida Nukleotidi jednog kodona ne mogu biti istovremeno nukleotidi drugog kodona Izuzetak virusi: preklapajući overlapping genes 5. Univerzalnost genetičkog koda Sva živa bića na Zemlji imaju isti genetički kod dokaz zajedničkog podrijetla Rijetke, male iznimke trepetljikaši, mitohondrijski i kloroplastni genetički kodovi
Aminoacil trna sintetaza Važna adaptorska molekula, koja pozna jezik genetičkog koda Povezuje određenu aminokiselinu i njoj specifičnu trna Uz pomoć ATP-a katalizira uspostavu energetski bogate esterske veze između njih
Adaptorska molekula Prosječna duljina 70-90 nukleotida 4S brzina taloženja Mr = 25 kda Transportna RNA (trna) Dva ključna mjesta: Nevarjabilno CCA slijed na 3' kraju vezivanje aminokiseline Varjabilno antikodon vezivanje mrna 60-ak vrsta trna molekula u stanicama E. coli 10 5 molekula u stanici E. coli 10 7 molekula u jetrenoj stanici čovjeka Zanimljivost primarne strukture trna: Značajan broj modificiranih dušičnih baza: Metiladenozin (MeA) Metilgvanozin (MeG) Metilcitidin (MeC) Metiluridin (MeU) Inozin (I) Dihidrouridin (D) Pseudouridin Ψ Ribotimidin 3' fosfat (T) Dvodimenzionalni prikaz: model lista djeteline