Rang & Dale's Pharmacology (7th) IZBRANA POGLAVJA IZ SPLOŠNE FARMAKOLOGIJE (prevod)

Rang & Dale's Pharmacology (7th) IZBRANA POGLAVJA IZ SPLOŠNE FARMAKOLOGIJE (prevod) Domen Sever, študent 3. letnika medicine

Kazalo 2. POGLAVJE: MEHANIZMI DELOVANJA ZDRAVIL... 3 3. POGLAVJE: MEHANIZMI DELOVANJA ZDRAVIL II... 10 8. POGLAVJE: ABSORPCIJA IN PORAZDELITEV ZDRAVIL... 23 9. POGLAVJE: METABOLIZEM IN IZLOČANJE ZDRAVIL... 35 10. POGLAVJE: FARMAKOKINETIKA... 40 12. POGLAVJE: KEMIČNI MEDIATORJI IN AVTONOMNI ŽIVČNI SISTEM... 45 13a. POGLAVJE: HOLINERGIČNA TRANSMISIJA... 52 13b. POGLAVJE: UČINKI ZDRAVIL NA HOLINERGIČNO TRANSMISIJO... 57 14a. POGLAVJE: NORADRENERGIČNA TRANSMISIJA... 68 14b. POGLAVJE: UČINKI ZDRAVIL NA NORADRENERGIČNO TRANSMISIJO... 74 15. POGLAVJE: 5-HIDROKSITRIPTAMIN IN FARMAKOLOGIJA MIGRENE... 82 16. POGLAVJE: PURINI... 87 17. POGLAVJE: LOKALNI HORMONI... 89 37. POGLAVJE: AMINOKISLINSKI TRANSMITERJI... 97 38. POGLAVJE: OSTALI TRANSMITERJI IN MODULATORJI... 104 2

2. POGLAVJE: MEHANIZMI DELOVANJA ZDRAVIL ed glavne tarče za vezavo zdravil štejemo 4 glavne M tipe regulatornih proteinov oz. receptorjev (v širšem pomenu): Farmakološki receptorji (pravi receptorji, receptorji v ožjem pomenu, receptorji za endogene prenašalce - mediatorje) Encimi Transporterji Ionski kanali Vezava zdravila na receptorje rezultira v specifičnem fiziološkem učinku. Mnoga zdravila se poleg vezave na specifične receptorje vežejo tudi na plazemske proteine, kjer pa ne pride do fiziološkega učinka. 2.1. DEFINICIJA RECEPTORJEV 1. Definicija pravih oz. farmakoloških receptorjev (receptorji v ožjem pomenu) je, da so tarčne molekule, na katere se vežejo topni fiziološki mediatorji (hormoni, nevrotransmiterji, inflamatorni mediatorji, itn.) in povzročijo specifičen fiziološki učinek. Primeri farmakoloških receptorjev so npr. acetilholinski receptorji, receptorji za citokine, steroidni receptorji in receptorji za GH. 2. Receptorji so lahko definirani kot katerakoli tarčna molekula, s katero se mora povezati molekula zdravila (ali katerikoli eksogeni mediator), da pride do specifičnega učinka. Tem receptorjem pravimo tudi tarče za zdravila. Mednje štejemo ionske kanale, transporterje ter encime. Primer takšnih receptorjev je npr. napetostno odvisni hitri Na + kanal, na katerega se vežejo lokalni anestetiki. Tudi encimi služijo kot receptorji, npr. dihidrofolat reduktaza, na katerega se veže METOTREKSAT. 3. V kontekstu celične biologije se med receptorje uvršča različne površinske molekule celic (T-celični receptor CD3, integrini, fibronektinski receptorji, itn.). Ti receptorji imajo adhezijsko funkcijo (celica-celica, celicamedceličnina) in so pomembni npr. pri imunskem odzivu, celični rasti, migraciji ter diferenciaciji. Ti receptorji po definiciji ne ustrezajo farmakološkim receptorjem, saj tvorijo predvsem interakcije s površinskimi proteini celic ter elementi medceličnine, ne tvorijo pa interakcij s topnimi mediatorji. Nekateri od teh receptorjev pa so lahko tarče za zdravila (spadajo pod receptorje za zdravila). 2.2. RECEPTORJI V FIZIOLOŠKIH SISTEMIH Receptorji so pomembna komponenta kemične komunikacije, ki je pomembna za regulacijo in koordinacijo aktivnosti celic in organov. Splošne značilnosti receptorjev lahko prikažemo na primeru stimulacije srca z adrenalinom. Adrenalin se najprej veže na β-adrenergične receptorje, ki služijo za vezavo adrenalina in ostalih kateholaminov (noradrenalin). Ob vezavi na receptor pride do signalne kaskade reakcij, ki v končni fazi povzroči povečanje kontraktilnosti srca (dpdt) in srčne frekvence (HR) (fosforilacija fosfolambana, fosforilacija Ca 2+ kanala, fosforilacija troponina I). V odsotnosti adrenalina so receptorji neaktivni. To velja za večino farmakoloških receptorjev za endogene mediatorje (hormoni, nevrotransmiterji, citokini, itn.). Obstaja tudi nekaj izjem receptorjev, ki so ''konstitutivno aktivni'', kar pomeni, da so deloma aktivni tudi v odsotnosti vezave mediatorja. Pomembna je razlika med AGONISTI, ki aktivirajo receptorje, in ANTAGONISTI, ki se vežejo na receptor in receptorja ne aktivirajo, ampak inhibirajo učinek agonista na receptor. Razlika med agonisti in antagonisti velja samo pri farmakoloških receptorjih. Pri ostalih receptorjih (tarče za zdravila) ne moremo govoriti o agonistih in antagonistih. 2.3. SPECIFIČNOST ZDRAVIL Da je zdravilo uporabno v terapevtske ali raziskovalne namene, mora delovati specifično oz. selektivno na celice in tkiva. Tudi receptorji, ki služijo kot tarče za zdravila, morajo imeti visoko specifičnost za točno določen ligand. Principe vezavnih mest in ligandne specifičnosti lahko ponazorimo z delovanjem angiotenzina. Ta peptid deluje zelo močno na gladko muskulaturo krvnih žil in na ledvične tubule (stimulira reabsorbcijo NaCl), vendar ima zelo majhen učinek na ostale gladke mišice ali intestinalne epitelije. To nakazuje na dejstvo, da mediatorji delujejo tkivno specifično, kar je posledica tkivno specifičnega izražanja genov za receptorje. Majhna sprememba liganda, npr. pretvorba 1 aminokisline iz L v D obliko ali odstranitev 1 aminokisline, povzroči inaktivacijo celotne molekule, ker se ta molekula ne more vezati na receptor, ker je ta skrajno specifičen. Pomembno je, da nobeno zdravilo ne deluje popolnoma specifično! Npr. triciklični antidepresivi so blokatorji monoaminskih transporterjev, vendar povzročajo 3

številne stranske učinke (suha usta), kar je posledica blokade številnih drugih receptorjev poleg monoaminskih transporterjev, ki so primarna tarča. V splošnem velja, da manjša ko je MOČ zdravila (višji EC50) in večja ko je doza zdravila, večja je verjetnost, da bo zdravilo poleg na primarne vplivalo tudi na sekundarne tarče in prišlo bo do stranskih učinkov. Stranski učinki so prisotni pri vseh zdravilih! 2.4. INTERAKCIJE ZDRAVILO-RECEPTOR To, da se zdravilo veže na receptor, še ne pomeni, da je receptor aktiviran! Okupacija receptorja namreč lahko rezultira v aktivaciji, ni pa nujno. Aktivacija receptorja pomeni, da interakcija zdravila z receptorjem povzroči konformacijsko spremembo receptorja, ki ima za posledico nek fiziološki učinek. Če se zdravilo veže na receptor in ga ne aktivira, ampak preprečuje vezavo agonista na receptor, potem se taka molekula imenuje receptorski antagonist. Tendenca zdravila za vezavo na receptor je odvisna od njegove AFINITETE, medtem ko je tendenca zdravila za aktivacijo receptorja (ko je zdravilo že vezano na receptor) odvisna od konstante e (efficacy, pri Stephensonovem ničelnem pristopu) oz. konstante α (intrinzična aktivnost zdravila, po Ariensovi klasični okupacijski teoriji). Koncentracija zasedenih receptorjev je premo sorazmerna koncentraciji vseh receptorjev. Ariensova klasična okupacijska teorija Učinek zdravila (E) je po tej teoriji premo sorazmeren koncentraciji zasedenih receptorjev [AR]: Po Ariensu je konstanta v enačbi intrinzična aktivnost zdravila (α). Maksimalni učinek oz. UČINKOVITOST zdravila se pojavi, ko so z agonistom zasedeni vsi receptorji. Vrednost intrinzične aktivnosti zdravil je merilo za sposobnost zdravila, da aktivira receptor. Če je α = 1, gre za AGONISTE. Če je α = 0, so to ANTAGONISTI, kjer je E vedno 0. Če pa velja, da je 0 < α < 1, so to DELNI AGONISTI. Če vemo, da velja: Slika 2.1. Razlika med vezavo zdravila in aktivacijo receptorja. 2.5. OKUPACIJSKE TEORIJE RECEPTORJEV Učinek zdravila (E) je odvisen od deleža receptorjev zasedenih z agonistom [AR]. V reakcijo vstopata [A] in prosti receptorji [Rp], kjer nastane kompleks [AR]: Kjer je disociacijska konstanta: Potem velja tudi: Stephensonova teorija ničelnega pristopa Ugotovilo se je, da pri nekaterih močnih agonistih ni potrebna zasedenost vseh receptorjev za maksimalni učinek (E max ). Tukaj se pojavi nov pojem, stimulus, ki je premo sorazmeren kompleksu [AR] ter konstanti e (učinkovitost, efficacy), ki je podobna intrinzični aktivnosti zdravil (α). Koncentracije prostih receptorjev ne poznamo, poznamo pa konc. vseh receptorjev in tudi konc. kompleksa [AR]: Učinek zdravila (E) je premo sorazmeren stimulusu, le da konstanta ni znana in variira od tkiva do tkiva. 4

2.6. VEZAVA ZDRAVILA NA RECEPTOR Vezavo zdravila na receptor lahko merimo direktno z uporabo nekega zdravila (ki je lahko agonist ali antagonist). To zdravilo označimo z radioaktivnimi izotopi (ponavadi 3 H, 14 C ali 125 I). Najprej inkubiramo vzorce tkiva, ki jim dodamo različne koncentracije radioaktivnega zdravila. Ko reakcija doseže ravnotežje, vzorcem izmerimo radioaktivnost. Zdravilo pa se ne veže samo na receptorje (specifična vezava), ampak tudi na ostale proteine (nespecifična vezava). Nespecifična vezava zdravila je vedno konstantne koncentracije in jo lahko izmerimo, če vzorcu tkiva poleg radioaktivnega zdravila dodamo nek ligand (ki ni radioaktiven), ki blokira vezavo radioaktivnega zdravila na receptorje. Radioaktivno zdravilo se v tem primeru lahko veže samo nespecifično, vrednost nespecifične vezave pa je izmerjena radioaktivnost tega vzorca. Pri ostalih vzorcih, kjer smo tkivu dodajali različne koncentracije, smo izmerili totalno radioaktivnost. Če želimo določiti dejansko radioaktivnost specifične vezave, odštejemo od totalne radioaktivnosti nespecifično (ki je vedno konstantna). Ko dobimo radioaktivnosti pri različnih koncentracijah zdravila, lahko podatke grafično pokažemo kot vezavno krivuljo. Vezavna krivulja definira vezavo zdravila na receptorje (B) v odvisnosti od koncentracije zdravila (c). Krivulja, ki jo dobimo, je pravokotna hiperbola, ki limitira proti vrednosti B max (vezavna kapaciteta). B max predstavlja gostoto receptorjev v tkivu in je na grafu asimptota maksimalno število zasedenih receptorjev, ki ga ne moremo preseči, tudi če koncentracija limitira proti neskončno. Če koncentracijo logaritmiramo, dobimo (B) v odvisnosti od log(c). Dobimo sigmoidno krivuljo, ki je v centralnem delu linearna. Vrednosti na krivulji v centralnem delu lahko aproksimiramo kot linearno funkcijo. Pri transformaciji linearnega predela prejšnje funkcije v recipročno funkcijo (po Lineweaver-Burku), dobimo funkcijo, ki je v celoti linearna. Slika 2.2. Meritve vezave zdravila na receptor. 2.7. ODNOS MED KONCENTRACIJO ZDRAVILA (c) IN UČINKOM (E) Čeprav se vezavo zdravila na receptorje lahko meri direktno, nas ponavadi zanima nek biološki odziv, ki ga povzroči zdravilo, npr. dvig krvnega tlaka, kontrakcija ali relaksacija gladke muskulature, aktivacija encima ali vedenjski odziv organizma. Ta odnos prikažemo s krivuljo učinka v odvisnosti od koncentracije (in vitro pogoji) ali s krivuljo učinka v odvisnosti od doze (in vivo pogoji). Na podlagi krivulj lahko določimo maksimalni učinek (E max ) in tudi efektivno koncentracijo, ki je potrebna za dosego 50% maksimalnega učinka (EC50). E max opisuje UČINKOVITOST ZDRAVILA. Višji ko je E max, bolj je zdravilo učinkovito. EC50 pa opisuje MOČ ZDRAVILA. Manjši ko je EC50, močnejše je zdravilo. EC50 je pomemben parameter za primerjavo moči različnih zdravil, ki sicer povzročajo podoben učinek. Slika 2.3. Krivulja učinka (E) v odvisnosti od koncentracije (c). 5

SPLOŠNA FARMAKOLOGIJA 2012 Krivulja učunka (E) v odvisnosti od koncentracije (c) sicer izgleda podobno kot krivulja vezave (B) v odvisnosti od koncentracije (c) (opisana v prejšnjem odstavku). Koncentracije ne moremo uporabiti za merjenje afinitete agonista za receptor, saj fiziološki odziv ni povsem premo sorazmeren z zasedenostjo receptorjev z agonistom. Npr. adrenalin stimulira povišanje arterijskega tlaka preko povečanega pretoka (CO) in vazokonstrikcijo arteriol (α-adrenergični učinek) ter vazodilatacijo ostalih arteriol (β-adrenergični učinek). Povišan tlak nato vpliva še na dodatno povišanje tlaka. Zato ne moremo govoriti, da je učinek (E) linearno odvisen od zasedenosti receptorjev. To ne velja samo za primer adrenalina, ampak za večino zdravil. Tudi funkcijo učinka (E) v odvisnosti od konc. (c) lahko izrazimo s krivuljami. V tem primeru dobimo 3 krivulje, prva je pravokotna hiperbola, druga je sigmoidna krivulja, tretja pa Lineweaver-Burkova transformirana premica. Pri tem veljajo enačbe: Pomembno je, da je koncentracija zdravila na receptorjih lahko povsem različna koncentraciji zdravila v raztopini. Agonisti so lahko podvrženi encimski razgradnji ali transportu v intracelular in ko se vzpostavi ravnotežje, je koncentracija agonista na receptorjih precej manjša kot koncentracija v raztopini. Acetilholin se razgrajuje z holinesterazo, ki jo najdemo v večini tkiv. Koncentracija ACh na receptorjih je lahko manjša kot 1% celotne konc. ACh v raztopini. Pri noradrenalinu je ta razlika še večja. Slika 2.4. Krivulje reverzibilnega in ireverzibilnega kompetitivnega antagonizma. Reverzibilni kompetitivni antagonizem Je vrsta antagonizma, kjer je antagonist v interakciji z receptorjem s šibkimi vezmi, zato lahko agonist zlahka izrine antagonista z receptorja. Učinek (E) bo zaradi prisotnosti antagonista v raztopini zmanjšan. Da bi dosegli učinek, ki se pojavi v raztopini brez antagonista, moramo višati koncentracijo agonista. Na ta način se kompenzira supresorski efekt antagonista. Krivulja zasedenosti receptorjev (B) v odvisnosti od log(c) se premakne v desno, pri čemer Bmax ostaja enak, prav tako je naklon krivulje enak. Tudi na krivulji efekta (E) v odvisnosti od log(c), bi Emax ostal enak, prav tako tudi naklon (EC50Emax). Koncentracija dodatnega agonista za dosego enakega učinka je premo sorazmerna koncentraciji antagonista v raztopini: Razmerje [A]'[A] imenujemo tudi DR (dose ratio). 2.8. KOMPETITIVNI ANTAGONIZEM Ob prisotnosti kompetitivnega antagonista je koncentracija zasedenih receptorjev z agonistom zmanjšana, ker receptor lahko naenkrat veže samo 1 molekulo. Pri kompetitivnem antagonizmu velja, da imata agonist in antagonist na receptorju isto vezavno mesto in če sta oba prisotna v raztopini, ''tekmujeta'' za vezavno mesto. Glavne značilnosti reverzibilnega kompetitivnega antagonizma: Premik krivulje E(log(c)) v desno brez spremembe Emax in EC50Emax. Linearno razmerje med DR (dose ratio) in koncentracijo antagonista. Pri reverzibilnem kompetitivnem antagonizmu velja, da se pri višanju konc. agonista poveča disociacija antagonista z receptorjev (agonist zlahka izrine antagonista z receptorja, ker je slednji na receptor vezan s šibko vezjo. 6

Ireverzibilni kompetitivni antagonizem Je antagonizem, kjer je antagonist v interakciji z receptorjem z močno kovalentno vezjo, zato se kljub višanju koncentracije agonista ne more vzpostaviti novo ravnotežje. Antagonist zelo počasi disociira iz receptorjev, zato ne pride do povečanega učinka (E) kljub dodatku agonista. Po Stevensonovi teoriji pa 100% zasedenost [AR] ni potrebna za E max, ker se E max pojavi že pri manjših zasedenostih. Pod to kategorijo štejemo tudi ireverzibilne inhibitorje encimov, npr. aspirin, omeprazol, inhibitorji monoaminske oksidaze, itn. 2.9. ALOSTERIČNI UČINKI Receptorji imajo poleg vezavnega mesta za agonista tudi številna druga alosterična (akcesorna) vezavna mesta, na katera se vežejo zdravila in vplivajo na funkcijo receptorja tako, da povečajo ali zmanjšajo afiniteto vezavnega mesta za agonista ali pa vplivajo na aktivacijo receptorja (efficacy). Alosterični ligandi (zdravila) so torej lahko alosterični aktivatorji ali inhibitorji. Pri alosteriji se na krivulji spremeni E max in tudi naklon (EC50E max ). 2.10. DELNI AGONISTI Nekatera zdravila so POLNI AGONISTI, ki lahko povzročijo maksimalni odziv, ki je možen v nekem tkivu. Precej zdravil pa kaže lastnosti DELNIH AGONISTOV, ki pa lahko povzročijo zgolj submaksimalni odziv v tkivu. Polne in delne agoniste si ilustrativno lahko prikažemo na primeru α-adrenergičnega receptorja. Na sliki 2.7 je prikazan vpliv agonistov na α-adrenergične receptorje, kar rezultira v kontrakciji aorte. FENILEFRIN je polni agonist, ki povzroči maksimalni tkivni odziv. Ostali agonisti povzročijo le submaksimalni odziv (našteti so od največjega učinka do najmanjšega): Oximetazolin Nafazolin Klonidin Tolazolin Razlika med polnimi in delnimi agonisti je v odnosu med zasedenostjo receptorjev [AR] in odzivom (E). To pomeni, da je pri delnih agonistih učinek (E) pri neki določeni zasedenosti receptorjev VEDNO manjši kot pri polnih agonistih. Zasedenosti receptorjev [AR] je odvisna od koncentracije (c) ter od afinitete (K D ): Stimulus je torej premo sorazmeren [AR], konstanta pa je e (efficacy). Učinek (E) pa je funkcija stimulusa, konstanta pa ni znana in je odvisna od vrste tkiva. Konstanta e (efficacy) pove tendenco zdravila da aktivira [AR] kompleks. Zdravila, ki imajo e=0, nimajo tendence za aktivacijio [AR] komplexa in so ANTAGONISTI (ne povzročajo učinka). Zdravila z e=1, ki povzročijo E max kljub temu, da je zasedenost [AR] manjša od 100% so POLNI AGONISTI. Za DELNE AGONISTE velja, da je 0<e<1, kar pomeni, da pri 100% zasedenosti [AR] povzročijo submaksimalni učinek. 2.11. ALOSTERIČNA TEORIJA MODEL DVEH STANJ RECEPTORJA Agonisti in antagonisti se vežejo na receptorje, vendar aktivacijo receptorja povzročajo samo agonisti. Zaseden receptor lahko prehaja iz mirovnega stanja (R) v aktivirano stanje (R*), kar se dogaja pri vezavi agonista na receptor. Receptorji pa kažejo tudi lastnosti konstitutivne aktivacije, kar pomeni (R*) konformacijo brez vezanega liganda. Dodano zdravilo vpliva na ravnotežje (R) in (R*) konformacije receptorjev. Če ima ligand višjo afiniteto za (R*), se ravnotežje pomakne proti (R*), povečana aktivacija receptorjev pa rezultira v povečanem učinku, zato je takšen ligand AGONIST. Če je afiniteta liganda za R* zelo visoka, bodo praktično vsi receptorji prešli v R* stanje, zato je takšen ligand POLNI AGONIST. Če je afiniteta liganda za R* manjša, je ligand DELNI AGONIST. Če se ligand veže na obe konformaciji, R in R*, bo ravnotežje R*R ostalo enako, zato je ligand ANTAGONIST. Če pa ima ligand višjo afiniteto za neaktivno obliko (R), se ravnotežje premakne proti R obliki. Takšen ligand ima konstanto e manjšo od nič (negative efficacy) in se imenuje INVERZNI AGONIST ali NEGATIVNI ANTAGONIST. Po Ariensovi teoriji je učinek (E) premo sorazmeren [AR] (ta je odvisna od K D in konc.), ter intrinzični aktivnosti zdravila (α): 7

2.12. NEKOMPETITIVNI ANTAGONIZEM Antagonist se v tem primeru veže na drugo vezavno mesto na receptorju kot agonist in povzroči konformacijsko spremembo, ki blokira učinek agonista. Vezavno mesto antagonista mora biti povezano s komponento, ki povezuje aktivacijo receptorja z učinkom. Primera nekompetitivnih antagonistov sta VERAPAMIL in NIFEDIPIN, ki preprečujeta prehajanje Ca 2+ ionov v intracelular, kar rezultira v zmanjšani kontrakciji gladke muskulature. Na grafu učinka (E) v odvisnosti od koncentracije agonista (c) se pri nekompetitivnem antagonizmu zmanjša E max in naklon (EC50E max ), krivulja pa se premakne tudi nekoliko v desno (pri ireverzibilnem kompetitivnem antagonizmu se ne premika v desno!). Pri nekompetitivnem antagonizmu prav tako poznamo reverzibilni in ireverzibilni tip. Kompetitivnemu in nekompetitivnemu antagonizmu s skupnim imenom pravimo tudi FARMAKOLOŠKI ANTAGONIZEM. Sicer poznamo tudi nefarmakološki antagonizem (opisan spodaj). 2.13. NEFARMAKOLOŠKI ANTAGONIZEM Ločimo 3 tipe nefarmakološkega antagonizma: Kemični antagonizem Farmakokinetični antagonizem Fiziološki antagonizem 2.14. KEMIČNI ANTAGONIZEM Pri kemičnem antagonizmu pride do kemične interakcije med agonistom in antagonistom, še preden se vežeta na receptorje, kar rezultira v zmanjšani koncentraciji agonista, ki se lahko veže na receptorje. DIMERCAPROL tvori kelate s težkimi kovinami ter zmanjša njihovo toksičnost. INFLIXIMAB veže TNF-α in deluje kot protivnetno zdravilo. 2.15. FARMAKOKINETIČNI ANTAGONIZEM Pri farmakokinetičnem antagonizmu antagonist zmanjšuje koncentracijo agonista s tem ko vpliva na 1 ali več farmakokinetičnih nivojev agonista (absorpcija, porazdelitev, metabolizem, izločanje). FENOBARBITAL (barbiturat) pospeši metabolizem v jetrih, kar pospeši metabolizem agonista (npr. warfarina) in to rezultira v znižanju koncentracije agonista in učinku (v primeru warfarina je to zmanjšanje antikoagulacijskega učinka). Farmakokinetični antagonisti lahko zmanjšajo absorpcijo agonista v GIT ali pa povečajo sekrecijo agonista z delovanjem na ledvice. 2.16. FIZIOLOŠKI ANTAGONIZEM Pri fiziološkem antagonizmu agonist in antagonist delujeta na različne tarče, ki so lahko v različnih tkivih ali organih, in povzročata nasprotne fiziološke učinke. HISTAMIN deluje na receptorje parietalnih celic tunicae mucosae želodca in pospešuje izločanje želodčne kisline. OMEPRAZOL je ireverzibilni kompetitivni antagonist protonske črpalke. Histamin in omeprazol povzročata nasprotne efekte, OMEPRAZOL je v tem primeru tudi fiziološki antagonist. 2.17. DESENZITIZACIJA IN TAHIFILAKSIJA Pogosto se učinek zdravila zmanjša, če se ga vnaša prepogosto. Desenzitizacija in tahifilaksija sta sinonima, ki opisujeta ta pojav, ki se ponavadi pojavi v intervalu nekaj minut. Toleranca je pojem, ki se po dogovoru uporablja, ko je upadanje učinka zdravila bolj postopno (dnevi ali tedni). Refraktarnost je pojem, ki pomeni prenehanje učinkovanja zdravila. Resistenca zdravila je pojem, ki se nanaša na prenehanje učinkovanja antimikrobnih in antitumorskih zdravil. Do zmanjšanja ali prenehanja učinkovanja zdravila pride zaradi številnih mehanizmov: Sprememba v receptorjih Translokacija receptorjev Izčrpanje mediatorjev Spremembe v metabolizmu zdravila Fiziološka adaptacija Aktivno izločanje zdravila iz celice (relevantno predvsem pri kemoterapiji) Spremembe v receptorjih Pri receptorjih povezanih z ionskimi kanali, je desenzitizacija najhitrejša in najbolj izrazita. Pri motorični ploščici pride so desenzitizacije zaradi konformacijske spremembe receptorja, ki preprečuje odprtje ionskega kanala, kljub agonistu, ki je trdno vezan na receptor. Fosforilacija intracelularne regije receptorja je drugi, počasnejši mehanizem, ki povzroča desenzitizacijo ionskega kanala. Tudi z G-proteinom povezani receptorji (GPCR) so podvrženi desenzitizaciji. Številne fosforilacije receptorja rezultirajo v okrnjeni aktivaciji kaskad sekundarnih prenašalcev, kljub agonistu, ki je vezan na receptor. Translokacija receptorjev Podaljšana izpostavljenost agonistu ima za posledico postopno zmanjšanje števila receptorjev na membrani. Število receptorjev se zmanjša v procesu internalizacije 8

(prenosa receptorjev v intracelular). Na sliki 2.10B je prikazan primer internalizacije β-adrenergičnih receptorjev. Število β-adrenergičnih receptorjev se lahko zmanjša na 10% v 8h ob prisotnosti nizkih koncentracij IZOPRENALINA. Za regeneracijo števila receptorjev nazaj na prvotno vrednost je potrebnih vsaj nekaj dni. Receptorji se internalizirajo z endocitozo kot odziv na povečano fosforilacijo. Takšen tip adaptacije z internalizacijo je značilen predvsem za hormonske receptorje, ko so ti izpostavljeni zdravilom dlje časa. Podoben primer je tudi podaljšana izpostavljenost GnRH-ju, ki se klinično uporablja za zdravljenje endometrioze ali raka na prostati (GnRH sicer izločajo parvicelularni nevrosekretorični nevroni preoptičnega jedra hipotalamusa). Povišan vnos GnRH-ja kot zdravilo paradoksalno inhibira sekrecijo GnRH-ja iz hipotalamičnih nevronov. Izčrpanje mediatorjev V nekaterih primerih je desenzitizacija povezana z izčrpanjem mediatorja. Zdravila, kot npr. AMFETAMIN, delujejo tako, da stimulirajo izločanje aminov iz aksonskih terminalov. Ob zlorabah amfetaminov oz. podaljšani izpostavljenosti, se zaloge aminov izčrpajo. Spremembe v metabolizmu zdravila Toleranca na nekatera zdravila, npr. BARBITURATE in ETANOL se pojavi zaradi pospešene metabolne razgradnje zdravila, ki je posledica podaljšanega vnosa zdravila. Toleranca na NITROVAZODILATATORJE pa je posledica zmanjšanega metabolizma, kar rezultira v zmanjšanem izločanju NO. Fiziološka adaptacija Zmanjšanje učinka zdravila se lahko pojavi, ker homeostatični mehanizmi izničijo učinek. Npr. učinek TIAZIDNIH DIURETIKOV, ki se uporabljajo za zniževanje krvnega tlaka, se lahko izniči zaradi postopne aktivacije sistema renin-angiotenzin. Če se homeostatični mehanizmi pojavljajo postopno, bo tudi toleranca na zdravilo naraščala postopoma. 2.18. DODATEK: KVANTITATIVNA ANALIZA INTERAKCIJ ZDRAVILA Z RECEPTORJEM Prvi korak delovanja zdravil na specifične receptorje je nastanek reverzibilnega [AR] kompleksa. Reakcija poteka po zakonu ohranitve mas. Nek kos tkiva, npr. srčna mišičnina, vsebuje določeno število receptorjev za agonista (v tem primeru adrenalin). Ko je tkivo izpostavljeno neki koncentraciji adrenalina [A], adrenalin vstopa v reakcijo vezave na receptorje, kjer kot produkt nastaja kompleks [AR]. Po vzpostavitvi ravnotežja se število receptorjev zmanjša na vrednost [Rt]-[AR]. *REAKCIJA VEZAVE AGONISTA NA RECEPTOR Hitrosti reakcij v obe smeri: V ravnotežju mora biti hitrost nastajanju produkta enaka hitrosti nastajanja reaktanta, zato velja: Zanima nas delež zasedenih receptorjev [AR][Rt] ali y: K A je ravnotežna konstanta (disociacijska konstanta) in je lastnost agonista in receptorja. K A predstavlja afiniteto agonista za receptor in pomeni koncentracijo agonista pri kateri je zasedenih 50% vseh receptorjev. Pri Ariensovi okupacijski teoriji je K A (ali K D ) kar enaka EC50. Višja ko je afiniteta agonista, nižja bo K A (reakcija gre bolj v desno) in višje bo razmerje [AR][Rt] pri neki dani koncentraciji. Spodnja enačba opisuje odvisnost med zasedenostjo receptorjev [AR] in koncentracijo agonista [A]. Na grafu bo ta zveza v obliki pravokotne hiperbole, zato lahko koncentracijo [A] logaritmiramo ter dobimo graf [AR] v odvisnosti od (log[a]), ki je na grafu v obliki sigmoidne krivulje s centralno linearnim predelom. **ANALIZA KOMPETITIVNEGA ANTAGONIZMA Pri kompetitivnem antagonizmu se agonist [A] in antagonist [B] vežeta na isto vezavno mesto na receptorju z ravnotežnima konstantama K A in K B. Delež zasedenih receptorjev z agonistom (y) bo v tem primeru: Ker kompetitivni antagonist pomika sigmoidno krivuljo v desno (brez spremembe E max in spremembe EC50), je treba za ohranjanje učinka povišati koncentracijo agonista. Za koliko jo je treba povečati, pove naslednja enačba: DR je dose ratio, ki pove, koliko agonista moramo dodati, da kompenziramo zmanjšanje učinka (E), pri čemer pride do premika sigmoidne krivulje v desno. DR je odvisen samo od koncentracije antagonista [B] ter od K B antagonista. Iz prejšnje enačbe sledi pomembnejša Schildova enačba: 9

3. POGLAVJE: MEHANIZMI DELOVANJA ZDRAVIL II arče za delovanje zdravil (receptorje v širšem pomenu) T lahko razdelimo v več kategorij: Farmakološki receptorji (pravi receptorji, receptorji v ožjem pomenu) Ionski kanali Transporterji Encimi Velika večina zdravil deluje na enega izmed zgoraj naštetih tipov proteinov, vendar obstajajo tudi izjeme: KOLHICIN: veže se na strukturni protein tubulin na mikrotubulih. CIKLOSPORIN (imunosupresor): veže se na citosolne proteine imunofiline. TERAPEVTSKA PROTITELESA: vežejo se na citokine. 3.1. FARMAKOLOŠKI RECEPTORJI Pravi receptorji so senzorski elementi udeleženi v kemično komunikacijo, ki koordinira funkcijo vseh vrst celic v telesu. Nanje se vežejo endogeni mediatorji; to so razni hormoni, nevrotransmiterji, itn. Na farmakološke receptorje delujejo številna zdravila, ki so lahko agonisti ali antagonisti. V večini primerov so bili endogeni mediatorji odkriti še preden je bil dokazan farmakološki pomen receptorjev. Obstajajo pa tudi izjeme, kjer so endogene mediatorje odkrili kasneje (npr. kanabinoidni receptor). rezultira v zmanjšani prepustnostiprevodnosti membrane za Na+ (gna+). Zdravila pa se vežejo tudi na alosterična (akcesorna) mesta kanala ter vplivajo na odprtostzaprtost kanala in se imenujejo MODULATORJI KANALOV: Vazodilatacijska zdravila DIHIDROPIRIDINSKEGA tipa inhibirajo odpiranje L-tipa Ca2+ kanala. BENZODIAZEPINI (spadajo pod glavne anksiolitike oz. trankvilizatorje) se vežejo na Cl- kanal GABA A receptorja. GABA-A receptor je sklopljen s Clkanalom, GABA se veže na receptor, benzodiazepini (valium, diazepam) pa modulirajo Cl-kanal in povečajo prepustnost kanala, ko je na receptor vezan GABA. Na ta način se poveča IPSP na postsinaptičnem terminalu, kar izzovejo benzodiazepini, z namenom zmanjšanja anksioznih motenj s povečano trankvilizacijo CŽS (napadi panike, panični status, agorafobije, ipd.). SULFONILUREA se uporablja za zdravljenje diabetesa. Sulfonilurea je blokator ATP odvisnih K+ kanalov na β-celicah Langerhansovih otočkov. Posledica blokade K+ kanalov je zmanjšana prepustnost membrane za K+ ione, kar povzroči depolarizacijo membrane, to pa je stimulus za odprtje napetostno odvisnih Ca2+ kanalov, ki povzročajo dvig Ca2+ v IC in izločanje insulina. 3.2. IONSKI KANALI Ionski kanali na plazmalemi selektivno omogočajo prehod ionov preko membrane. Odprtje in zaprtje kanalov je regulirano preko številnih mehanizmov. Poznamo 2 pomembna tipa kanalov: Ligandno odvisni kanali: odprejo se, ko se nanje veže agonist. Napetostno odvisni kanali: se odprejo kot posledica spremembe transmembranskega potenciala (Um). Zdravilo lahko vpliva na kanal, ko se veže na vezavno mesto na kanalu (direktna interakcija), lahko pa vpliva na kanal po indirektni poti (preko G-proteina in podobnih intermediatov), vendar gre v primeru indirektne poti za delovanje zdravila na farmakološke receptorje, ki so sklopljeni s kanali. Zdravila, ki direktno vplivajo na kanale so lahko BLOKATORJI ali MODULATORJI. BLOKATORJI kanalov, npr. lokalni anastetiki delujejo na napetostno odvisne Na+ kanale tako, da kanal fizično blokirajo in kanal postane neprepusten za Na+ kar 3.3. ENCIMI Veliko zdravil deluje na encime. Ta zdravila delimo na INHIBITORJE, LAŽNE SUBSTRATE in PROZDRAVILA Inhibitorji Pogosto je zdravilo analog substratu in deluje kot kompetitivni inhibitor encima: KAPTOPRIL je kompetitivni inhibitor angiotenzin konvertaze. V drugih primerih je vezava zdravila ireverzibilna in nekompetitivna: ASPIRIN, ki se veže na COX. Lažni substrati Lažni substrat se normalno veže na encim, ki ga transformira v nepravilen produkt, ki nato inhibira neko metabolno pot. FLUOROURACIL, zdravilo za zdravljenje raka, zamenja uracil kot intermediat sinteze purinov, vendar se ne more pretvoriti v timin. Ker je sinteza timidin-3-fosfata zmanjšana je s tem zmanjšana sinteza DNA ter proliferacija celic. 10

Prozdravila Včasih se zdravila vnaša v telo v pre obliki (neaktivna oblika), kar zahteva encimsko pretvorbo v aktivno obliko zdravila. 3.4. TRANSPORTERJI Prehajanje ionov in manjših organskih molekul preko membrane lahko poteka prek kanalov ali preko transportnih proteinov. Pogosto so molekule preveč polarne, da bi lahko prosto prehajale lipidni dvosloj, zato se takšne molekule prenašajo preko raznih transporterjev. Primeri farmakološko pomembnih transporterjev so npr. transporterji v ledvičnih tubulih, GIT epiteliju, krvno-likvorski barieri, transport Na+ in Ca2+ iz celic, transport prekurzorjev nevrotransmiterjev (npr. holin) ali transport celotnih nevrotransmiterjev v sinaptične terminale (noradrenalin, 5-hidroksitriptamin 5-HT, glutamat, peptidi). V številnih primerih je hidroliza ATP molekule vir energije za aktivni transport molekule, ki poteka v nasprotno smer elektrokemijskega (EK) gradienta. Takšni transporterji vsebujejo vezavno mesto za ATP molekulo in se imenujejo ABC transporterji (ABC-binding cassette). Najpomembnejši ABC transporter je Na+K+ ATP-aza in pa tudi MDR transporterji (multi-drug resistance). MDR transporterji prenašajo citotoksična zdravila iz tumorskih celic in celic mikroorganizmov, kar povzroča resistenco na zdravilo. Transport nevrotransmiterjev in organskih molekul je ponavadi sklopljen z ionskim transportom (največkrat Na+ ion). Sklopljeni transport lahko poteka v isto smer (simport) ali pa se molekuli prenašata v nasprotnih smereh (antiport). Energijo za sklopljeni transport omogoča elektrokemijski gradient Na+ iona, ki ga vzdržuje Na+K+ ATP-aza. 11

Tabela 3.1. RECEPTORJI IN EFEKTORJI Tip tarče Efektor PRAVI RECEPTORJI AGONISTI ANTAGONISTI Nikotinski ACh receptor Acetilholin (ACh) Nikotin Tubokurarin α-bungarotoxin Vareniklin β-adrenergični receptor Noradrenalin Propranolol Izoprenalin (izoproterenol) Histaminski H 1 receptor Histamin Mepiramin Opioidni receptor Morfij Naloxon Dopaminski D 2 receptor Dopamin Klorpromazin Bromokriptin Estrogenski receptor Etinilestradiol Tamoxifen EGF receptor Trastuzumab IONSKI KANALI BLOKATORJI MODULATORJI Napetostno odvisni Na + kanali Lokalni anestetiki Veratridin Tetrodotoxin (TTX) Strup škorpijona (ScTX) Na + kanali v ledvičnih tubulih Amilorid Aldosteron Napetostno odvisni Ca 2+ kanali Divalentni kationi (npr. kadmij Dihidropiridini ATP občutljivi K + kanali (nekateri nevroni, miociti in β celice Langerhansovih otočkov) Cd 2+ ) ATP Sulfonil urea GABA odvisni Cl- kanali Picrotoxin Benzodiazepini, npr. valium (diazepam) ENCIMI INHIBITORJI Acetilholinesteraza Neostigmin Ciklooksigenaza (COX) Aspirin Angiotenzin konvertaza Kaptopril HMG-CoA reduktaza Simvastatin Monoamin oksidaza-a Iproniazid Fosfodiesteraza V Sildenafil (viagra) Dihidrofolat reduktaza Trimetoprim Metotrexat Timidin kinaza Aciklovir HIV proteaza Saquinavir TRANSPORTERJI INHIBITORJI LAŽNI SUBSTRATI Noradrenalinski transporter Triciklični antidepresivi Kokain Amfetamin Metildopa Transporter šibkih kislin (ledvični Probenecid tubuli) Na + K + 2Cl - kotransporter (debeli Diuretiki ascendentni del Henlejeve zanke) H + transporter (gastrična mukoza) Omeprazol MDR transporter Verapamil DRUGO Imunofilini Ciklosporin Tacrolimus Tubulin Kolhicin, Taxol 12

3.5. TIPI FARMAKOLOŠKIH RECEPTORJEV Receptorji povzročajo različne tipe celičnega odziva. Nekateri odzivi so zelo hitri (npr. cel. odzivi pri sinaptični transmisiji) in učinek ponavadi nastopi po nekaj milisekundah. Nekateri receptorji povzročajo učinek, ki se pojavi po nekaj urah ali dnevih (tiroidni hormoni, steroidni hormoni). Poznamo pa tudi srednje hitre receptorje (kateholamini), ki delujejo v nekaj sekundah, medtem ko peptidi delujejo nekoliko počasneje kot kateholamini. Hitrost učinka mediatorja je torej odvisna od receptorja, ki povzroča različno hitre intracelularne odzive. JEDRNI (NUKLEARNI) RECEPTORJI: so receptorji, ki regulirajo transkripcijo genov. Čeprav se imenujejo jedrni receptorji, se nekateri receptorji tega tipa nahajajo v citosolu in migrirajo v jedro šele ob vezavi liganda. Med jedrne receptorje štejemo receptorje za steroidne hormone, tiroidne hormone in tudi za ostale molekule (npr. retinojska kislina, vitamin D). Poznamo 4 družine farmakoloških receptorjev: IONOTROPIČNI RECEPTORJI (z ionskim kanalom vezani receptorji): primeri takšnih receptorjev so nikotinski acetilholinski receptor (nachr), GABA A receptor, receptorji za glutamat, itn. METABOTROPIČNI RECEPTORJI (z G-proteinom vezani receptorji ali GPCR): značilnost teh receptorjev je, da imajo 7 transmembranskih domen in da intracelularni odziv mediira G-protein, vezan na receptor. Pod metabotropične receptorje štejemo receptorje za številne hormone in počasne transmiterje (muskarinski ACh receptor, adrenergični receptorji, receptorji za kemokine). S KINAZO VEZANI RECEPTORJI: na te receptorje se v glavnem vežejo proteinski mediatorji. Ti receptorji vsebujejo ekstracelularno domeno (ki vsebuje vezavno mesto za ligand), ki je z enojnim transmembranskim heliksom povezana z intracelularno domeno. Ponavadi je intracelularna domena encimsko aktivna, lahko gre za protein kinazno ali gvanilat ciklazno aktivnost. Pod kinazne receptorje štejemo receptor za insulin, številne citokine ter rastne faktorje. Tudi receptor za atrijski natriuretični peptid (ANP) je kinaznega tipa in ima na intracelularni domeni gvanilat ciklazno aktivnost. Slika 3.1. Družine farmakoloških receptorjev 13

SPLOŠNA FARMAKOLOGIJA Tabela 3.2. FARMAKOLOŠKI RECEPTORJI IONOTROPIČNI METABOTROPIČNI RECEPTORJI RECEPTORJI Lokacija Membrana Membrana Efektor Ionski kanal Kanal ali encim Delovanje Direktno Preko G-proteina receptorja Primeri Nikotinski ACh Muskarinski acetilholinski receptorja receptorji receptorji (machr) (nachr) Adenergični receptorji GABA A Dopaminergični receptorji receptor 5-HT receptorji (5 Receptor za hidroksitriptaminski glutamat receptorji) Opioidni receptorji Receptorji za mnoge peptide Purinski receptorji Olfaktorni kemoreceptorji Struktura 5 transmembranskih domen 7 transmembranskih domen, intracelularna domena se povezuje z G-proteinom KINAZNI RECEPTORJI Membrana Proteinska kinaza Direktno NUKLEARNI RECEPTORJI Intracelular Transkripcija genov Preko DNA Receptor za insulin Receptorji za rastne faktorje Citokinski receptorji Receptorji za ANP 1 transmembranska domena z EC receptorsko domeno in IC encimsko aktivno domeno 2012 Steroidni receptorji Monomerna struktura z receptorsko domeno in DNA vezavno domeno (cinkovi prsti) Slika 3.2. Farmakološki receptorji. 14

3.6. MOLEKULARNA STRUKTURA RECEPTORJEV Na sliki 3.2. so prikazane vse 4 družine farmakoloških receptorjev. Čeprav posamezni receptorji vsebujejo različne AK sestave ter dolžine IC in EC domen, jih lahko razvrstimo v 4 družine glede na strukturno analogijo in podobnosti v celični signalizaciji. V fazi MMP je membranski potencial negativen (npr. - 70mV), zato je vrednost električnega gradienta 70mV in je usmerjen v IC. Kemijske gradiente za Na + in K + ion lahko izračunamo: 3.7. IONOTROPIČNI RECEPTORJI Primer ionotropnega receptorja je NIKOTINSKI ACETILHOLINSKI RECEPTOR (nachr). nachr je pentamer (5 podenot) iz 2α, β, γ in δ podenot, ki se razlikujejo po Mr in po AK sestavi, vsaka podenota pa je sestavljena iz 4 α heliksov, ki so vsajeni v membrano. Pentamerna struktura nach receptorja vsebuje 2 vezavni mesti za acetilholin, ki ležita med obema α podenotama ter vmesno γ podenoto. Za aktivacijo receptorja je potrebna vezava obeh acetilholinov. Ionotropični receptorji sodelujejo pri najhitrejših sinaptičnih prenosih, kjer se nevrotransmiter veže na postsinaptični terminal nevrona ali mišične celice in povzroči začasno povečanje prepustnosti postsinaptične membrane za določen ion (g). Večina ekscitatornih (EPSP) nevrotransmiterjev, kot so ACETILHOLIN v motorični ploščici ali GLUTAMAT v CŽS, povzročijo povečanje prepustnosti membrane za Na + in K +, ker je kanal prepusten tako za Na + kot za K + ione. Ker je elektrokemijski gradient za Na + ion (usmerjen v IC) večji kot EK gradient za K + ione (usmerjen v EC), bo skupni tok ionov usmerjen v IC. EK gradient za Na + ion je 140mV usmerjen v IC, za K + pa - 20mV usmerjen v EC. Skupni EK gradient je 120mV usmerjen v IC. EK gradient 120mV v IC povzroči depolarizacijo membrane in poveča se verjetnost za sprožitev AP. Učinek hitrih nevrotransmiterjev doseže maksimalno vrednost v delcu milisekunde in se konča po nekaj milisekundah. Hitrost odziva hitrih nevrotransmiterjev je posledica direktne povezave med receptorjem in ionskim kanalom in odsotnosti kaskade signalnih reakcij. 3.8. METABOTROPIČNI RECEPTORJI (Z G-PROTEINOM VEZANI RECEPTORJI) Pod metabotropične receptorje štejemo številne receptorje: Muskarinski acetilholinski receptorji (machr) Adenergični receptorji Dopaminergični receptorji 5-HT receptorji (5-hidroksitriptaminski receptorji) Opioidni receptorji Receptorji za mnoge peptide Purinski receptorji Olfaktorni kemoreceptorji Za vse metabotropične receptorje velja, da imajo heptahelikalno strukturo (7 transmembranskih domen). Številni nevrotransmiterji (razen peptidnih nevrotransmiterjev) lahko delujejo tako na metabotropične receptorje kakor tudi na ionotropične receptorje, kar omogoča molekuli nevrotransmiterja, da povzroči številne efekte. Peptidni hormoni lahko delujejo na metabotropične receptorje ali na kinazne receptorje, vendar redko na oba tipa receptorjev. Slika 3.3. Molekularna struktura nach receptorja. Metabotropični receptorji (GPCR) so zgrajeni iz 1 polipeptidne verige, ki tvori 7 transmembranskih α heliksov. Receptor ima v EC usmerjeno N-terminalno domeno ter v IC usmerjeno C-terminalno domeno. GPCR razdelimo v 3 različne družine; A, B in C. Receptorji, ki spadajo v določeno družino so podobne AK sestave, vendar se njihova AK sestava močno razlikuje od receptorjev drugih družin. Skupno vsem 3 družinam je, da imajo receptorji 7 transmembranskih domen, 15

razlikujejo pa se po dolžini ekstracelularne N-terminalne domene ter po lokaciji vezavnega mesta za agonista. Družina A je največja in vsebuje receptorje za aminske nevrotransmiterje, nevropeptide in kemokine. Družina B vsebuje receptorje za ostale peptide, npr. kalcitonin in glukagon. Družina C je najmanj zastopana in vsebuje receptorje za glutamat, GABA receptorje in Ca2 + senzorične receptorje (Ca2 + sensing receptors). Tabela 3.3. METABOTROPIČNI RECEPTORJI Družina Receptorji Strukturne lastnosti A: rodopsinska družina B: sekretinglukag on receptorska družina C: metabotropična glutamatca2+ senzor družina Receptorji za aminske nevrotransmiterj e Receptorji za nevropeptide Receptorji za purine Receptorji za prostanoide Kanabinoidni receptorji Receptorji za glukagon Receptorji za sekretin Receptorji za kalcitonin Receptorji za glutamat GABA B receptorji Ca2+ senzorji Kratka N- terminalna domena. Ligand se lahko veže na transmembranske helixe (amini) ali pa na ekstracelularne zanke (peptidi). Ekstracelularna domena je srednjih dolžin. Dolga N- terminalna domena. 3.9. G-PROTEINI G-proteini so družina proteinov, ki so vsajeni v membrano na IC strani. Funkcija G-proteinov je, da prepoznajo aktivirane metabotropične receptorje in prenesejo signal do efektorjev (razni encimi ali ionski kanali), ki nato povzročijo nek celični odziv s tvorbo sekundarnih prenašalcev. G-proteini so ime dobili zaradi njihovih interakcij z gvaninskimi nukleotidi (GDP in GTP). G-proteini se sestojijo iz 3 podenot; α, β in γ. Gvaninski nukleotidi imajo vezavno mesto na α podenoti, ki je encimsko aktivna in omogoča hidrolizo GTP molekule v GDP, pri čemer se sprošča energija. β in γ podenota sta združeni skupaj kot βγ komplex. Vse 3 podenote so na membrano povezane preko maščobnih kislin fosfolipidov. Vezava podenot G-proteina na MK poteka v reakciji prenilacije. G-proteini so deloma topni v membrani, kar omogoča interakcijo G-proteina s številnimi receptorji in efektorji. V mirovnem stanju, je G-protein v obliki αβγ trimera in ni povezan z receptorjem ter ima na α podenoti vezano molekulo GDP. Ko pride do vezave agonista na receptor, pride do konformacijske spremembe receptorja, kar povzroči, da se poveča afiniteta intracelularne domene receptorja za αβγ komplex G-proteina. Do vezave αβγ komplexa na receptor pride v 50ms po aktivaciji receptorja. Interakcija G-proteina z receptorjem povzroči, da GDP oddisociira iz α podenote in se nadomesti z molekulo GTP. Vezava molekule GTP povzroči, da G-protein razpade na α podenoto in βγ podenoto, ki sta aktivni obliki G-proteina. Aktivna α in βγ podenota nato difundirata po membrani in se vežeta na razne encime in ionske kanale, kar povzroči neko signalno kaskado reakcij. Sprva se je domnevalo, da ima signalno funkcijo samo α podenota in da je βγ zgolj šaperon, ki se veže na efektorske proteine in preprečuje, da bi jih α podenota aktivirala. Danes vemo, da βγ podenota prav tako sodeluje pri aktivaciji raznih efektorjev. Vezava α in βγ podenot na encime in ionske kanale lahko sproži AKTIVACIJO ali INHIBICIJO, kar je odvisno od vrste G-proteina. Do terminacije signala pride, ko poteče hidroliza GTP na α podenoti. α podenota ima GTPazno aktivnost, kar povzroča hidrolizo GTP v GDP (ki ostane vezan na podenoti) in Pi (ki oddisociira). α podenota z vezanim GDP nato oddisociira iz efektorja in se poveže nazaj z βγ podenoto in G-proteinski cikel je zaključen. Vezava α podenote na efektorsko molekulo namreč poveča GTPazno aktivnost, hitrost hidrolize GTP je odvisna od vrste efektorja. Hidroliza GTP povzroča terminacijo učinka α podenote na efektorski protein, GTPazno aktivnost pa regulira efektorski protein, kar pomeni da je latenca vezanega GTP-ja na α podenoti odvisna samo od vrste efektorskega proteina. Že 1 sam kompleks receptor-agonist lahko aktivira številne G-proteine, ki nato ostanejo vezani na efektorje dovolj dolgo, da se poveča koncentracija sekundarnih prenašalcev (obveščevalcev), ki so produkt efektorjev. Kako je mogoče, da lahko določen receptor povzroči specifičen celični odziv? To je mogoče zaradi številnih vrst G-proteinov. Npr. muskarinski ACh receptor (machr) in β-adrenergični receptor, ki se nahajata v kardiomiocitih, povzročata nasprotne efekte, čeprav sta oba sklopljena z G-proteini. Razlog za specifični odziv je variabilnost v α podenoti G-proteinov. Danes poznamo vsaj 20 različnih α podenot G-proteinov. Glede na variabilnost α podenote, lahko G proteine razdelimo v 4 razrede: Gs, Gi, Go in Gq. G-proteini kažejo selektivnost do receptorjev in efektorjev, na katere se vežejo z različnimi vezavnimi domenami. Gs in Gi G-proteini delujejo na adenilatno ciklazo, Gs jo stimulirajo, Gi pa inhibirajo. 16

Slika 3.4. Delovanje G-proteina. Tabela 3.4. PODENOTE G-PROTEINOV Podenota G- proteina Gα (s) Gα (i) Gα (o) Gα (q) βγ podenota Receptorji Efektorji Značilnosti Receptorji za amine in ostali receptorji (kateholami ni, histamin, serotonin) Isti receptorji kot za Gs, poleg tega še opioidni in kanabinoidn i receptorji Isti receptorji kot za Gs, poleg tega še opioidni in kanabinoidn i receptorji Receptorji za amine, peptide in prostanoide Vsi metabotrop ični receptorji Aktivacija adenilat ciklaze in povečanje koncentracije camp Inhibicija adenilat ciklaze in zmanjšanje konc. camp Α podenota nima efekta. Efekt povzroča le βγ podenota. Aktivacija fosfolipaze C in povišanje konc. IP3 in DAG. Efektorji so isti kot pri α podenoti. Poleg tega tudi: Aktivacija K+ kanala Inhibicija napetostno odvisnih Ca2+ kanalov Aktivacija GCPR kinaz Aktivacija MAP kinaze Aktivira jih kolera toxin, ki blokira GTPazno aktivnost, kar prepreči inaktivacijo Blokira jih pertussis toxin, ki preprečuje disociacijo αβγ komplexa. Blokira jih pertussis toxin, ki ima učinek predvsem v živčnem sistemu. 3.10. TARČE G-PROTEINOV Glavne tarče (efektorji) G-proteinov so: ADENILATNA CIKLAZA: pretvorba ATP v camp FOSFOLIPAZA C: encim, odgovoren za nastanek inozitol fosfata (IP3) in diacilglicerola (DAG) IONSKI KANALI: predvsem Ca2+ in K+ kanal Rho ARho kinaza: sistem, ki regulira aktivnost številnih signalnih poti in je odgovoren za celično rast in proliferacijo ter kontrakcijo gladke muskulature Mitogen aktivirana proteinska kinaza (MAP kinaza): sistem, ki regulira številne celične funkcije, med drugim celično delitev 3.11. ADENILATNA CIKLAZA camp je nukleotid, ki nastane v citosolu iz molekule ATP, reakcijo pa katalizira adenilatna ciklaza, ki je vezana na IC del membrane. V celici neprestano poteka sinteza camp in prav tako razpad camp v 5'AMP s hidrolizo, ki jo omogočajo fosfodiesteraze (PDE). Številna zdravila, hormoni in nevrotransmiterji delujejo na metabotropične receptorje in povzročajo povečanje ali zmanjšanje katalitične aktivnosti adenilatne ciklaze, kar rezultira v povišanju ali zmanjšanju koncentracije camp v IC. camp regulira številne celične funkcije, npr. encime energijskega metabolizma, celično delitev in diferenciacijo, transport ionov, ionske kanale in kontraktilne proteine v gladki muskulaturi. Do teh različnih učinkov pride vedno po istem mehanizmu, to je aktivacija PROTEINSKE KINAZE s camp molekulo. Proteinska kinaza regulira funkcijo številnih celičnih proteinov predvsem s fosforilacijami. Spodnja slika prikazuje, kako povišana koncentracija camp zaradi aktivacije β-adrenergičnih receptorjev, vpliva na encime, ki so udeleženi v metabolizem glikogena in maščob v jetrih, adipocitih in mišičnini. Končni učinek aktivacije β-adrenergičnih receptorjev je nastanek proste glukoze, ki služi kot vir E za mišično kontrakcijo. 17

3.12. FOSFOLIPAZA C Pri fosfolipaza Cinozitol fosfatnem sistemu igra ključno vlogo fosfatidilinozitol 4,5 bisfosfat (PIP2), ki ima dodatno fosfatno skupino vezano na inozitolni obroč. PIP2 je substrat za membransko vezan encim FOSFOLIPAZO Cβ, ki cepi PIP2 na diacilglicerol (DAG) in inozitol 1,4,5 trifosfat (IP3). DAG in IP3 sta pomembna sekundarna prenašalca. Aktivacijo fosfolipaze C mediira G-protein (Gq). Po cepitvi PIP2 na DAG in IP3, se zaloge PIP2 obnavljajo, ko se DAG fosforilira v fosfatidno kislino (PA), IP3 pa se defosforilira. Defosforiliran IP3 se nato veže s fosfatidno kislino in nastane nov PIP2. Litij, ki se uporablja v psihiatriji (za zdravljenje shizofrenije), blokira obnavljanje (reciklažo) PIP2. Slika 3.5. Uravnavanje energetskega metabolizma s camp. Primer regulacije preko camp odvisne kinaze je tudi povečana aktivnost napetostno odvisnih Ca2 + kanalov v kardiomiocitih. Fosforilacija stimulira kanale in to poveča tok Ca2 + ionov v IC med akcijskim potencialom kar poveča silo kontrakcije. V gladkomišični celici, camp odvisna kinaza fosforilira in s tem inhibira encim myosin-light chain-kinazo, ki je pomembna za fosforilacijo lahke verige miozina in s tem za kontrakcijo. Če se fosforilacija lahke verige miozina zmanjša zaradi povečane konc. neaktivnih myosin-light chain-kinaz, bo zmanjšana tudi kontrakcija in povečana relaksacija. Receptorji, ki so povezani z Gi proteini, inhibirajo adenilatno ciklazo in povzročajo zmanjšanje koncentracije camp. Primeri receptorjev povezanih z inhibitornimi Gi proteini so npr. muskarinski receptor (machr) na membrani kardiomiocitov, α 2 adrenergični receptor v gladki muskulaturi ter opioidni receptorji. Adenilatna ciklaza se lahko aktivira tudi direktno, npr. z forskolinom ali fluoridnimi ioni. camp je v IC podvržen hidrolizi, ki jo katalizirajo FOSFODIESTERAZE (PDE). Obstaja 11 vrst fosfodiesteraz, nekatere so specifične za camp (PDE3 in PDE4), nekater pa za cgmp (PDE5). Fosfodiesteraze lahko inhibirajo številna zdravila, npr. METILKSANTINI (teofilin in kofein). ROLIPRAM (za zdravljenje astme): je selektiven za PDE4 v inflamatornih celicah. MILRINON (za zdravljenje srčne odpovedi): je selektiven za PDE3 v kardiomiocitih. SILDENAFIL (viagra): je selektiven za PDE5. Viagra poveča vazodilatacijski učinek NO. Slika 3.6. Strukturna formula PIP2. Inozitol 1,4,5 trifosfat (IP3) je vodotopni mediator, ki v citosolu deluje na specifične IP3 receptorje, ki so ligandno odvisni Ca2+ kanali in se nahajajo na membrani endoplazmatskega retikuluma (sarkoplazmatskega). Funkcija IP3 je, da povzroči prehajanje Ca2+ ionov iz ER v citosol. IP3 se v citosolu dodatno fosforilira v inozitol 1,3,4,5 tetrafosfat (IP4), reakcijo katalizira specifična kinaza. Vloga IP4 še ni znana, predvideva pa se da IP4 in ostali višji inozitol fosfati sodelujejo pri uravnavanju izražanja genov. 18