Biološki materijal U biohemijskim laboratorijama izvode se brojne kvalitativne i kvantitativne analize različitih sastojaka biološkog materijala uzetog od pacijenata u cilju postavljanja dijagnoze (potvrđivanje ili isključivanje bolesti na koju se sumnja) i praćenje toka bolesti (procena efikasnosti terapije i prognoza bolesti). U tu svrhu najčešće se koristi krv (puna krvi i serum ili plazma koji se iz nje dobijaju) i urin. Međutim, za dijagnozu i praćenje velikog broja bolesti neophodne su i analize drugih vrsta biološkog materijala, pa se u laboratorijama ustanova u kojima se leče takve bolesti, vrše ispitivanja uzoraka znatno većeg broja različitih vrsta biološkog materijala: Krv: venska, kapilarna, arterijska Serum, plazma Urin: prvi jutarnji, 24-časovni Mokraćni kamenac Žučni kamenac Cerebrospinalna tečnost Amnionska tečnost Sinovijalna tečnost Serozne tečnosti: pleuralna, peritonealna, perikardijalna Želudačni sok Duodenalni sok Znoj Saliva Sperma Čvrsto tkivo Uzimanje i obrada krvi U laboratorijskim ispitivanjima obično se koriste uzorci venske i kapilarne krvi, dok se arterijska krv koristi znatno ređe i to samo za određene analize. Kapilarna krv Kapilarna krv se najčešće uzima iz jagodice prsta, koja se najpre obriše gazom natopljenom alkoholom i osuši. Posle uboda sterilnom lancetom ili iglom za injekcije, dozvoljeno je da se primeni samo blagi pritisak, što potpomaže izlazak krvi. Kapilarna krv se takođe može uzeti i iz ušne školjke, a kod beba se obično uzima iz pete. Najčešće se koristi za hematološka ispitivanja (npr. ispitivanje krvne slike ručnim metodama, tj. brojanjem različitih krvnih ćelija pod mikroskopom) ili za određivanje glukoze (posebno kod dijabetičara, kod kojih se vrlo često kontroliše nivo glukoze u krvi, pa je za pacijenta nezgodno da se svaki put podvrgava venepunkciji). Venska krv Venska krv je najčešće korišćen biološki materijal, a uzima se iz vena u lakatnom pregibu ili na dorzalnoj strani ruke. Pre izvođenja venepunkcije postavlja se podveska nekoliko centimetara iznad 1
lakta. Puna venska krv, koja je uzeta uz dodavanje odgovarajućeg antikoagulansa, najčešće se koristi kao uzorak za ispitivanje krvne slike pomoću automatskih analizatora. Za ostala ispitivanja iz venske krvi se izdvajaju serum (posle koagulacije krvi) ili plazma (iz krvi kojoj je dodat odgovarajući antikoagulans). Odvajanje seruma ili plazme treba izvršiti što pre, da bi se izbegle promene do kojih dolazi prilikom dužeg stajanja pune krvi (npr. sniženje koncentracije glukoze zbog potrošnje u eritrocitima). Arterijska krv Arterijska krv se retko koristi kao uzorak, a potrebna je za određene analize, kao npr. za određivanje parametara acido-baznog statusa i za analizu gasova u krvi (uz heparin kao antikoagulans). Dobija se uvođenjem igle u radijalnu, brahijalnu ili femoralnu arteriju, a vađenje arterijske krvi može da izvodi jedino lekar. Kapilarna krv po svom sastavu sličnija arterijskoj nego venskoj krvi. Za uzimanje krvi koriste se špricevi, vakutejneri, serumski separatori (u separatorima se nalaze gelovi, kuglice ili kristali). Špricevi se sve ređe koriste, osim u slučaju uzimanja krvi za gasne analize, kao i za uzimanje cerebrospinalne ili amnionske tečnosti. Danas se u laboratorijama koriste specijalne epruvete za sakupljanje krvi (vakutejneri). Epruvete mogu da budu obložene silikonom, čime se sprečava hemoliza i prilepljivanje krvi na zidove epruveta. U epruvetama mogu biti različiti antikoagulansi, što je naznačeno zapušačima različitih boja, a koriste se igle odgovarajućeg promera (npr. od 20-gejdži, ili 21- i 22- za pedijatrijske pacijente ili one sa lošim i traumatizovanim venama). Ako se koriste igle izvan ovog promera povećava se mogućnost hemolize. Tabela 1. Vrste vakutejner epruveta Boja zapušača Uzorak Antikoagulans Žuta Sterilna unutrašnjost epruvete nema Crvena Serum nema Siva Plazma ili puna krv sa inhibitorom glikolize oksalat (Na ili K), fluorid (Na), jodacetat Zelena Plazma ili puna krv heparin (Na, Li ili NH 4 ) Plava Plazma ili puna krv Na-citrat Ljubičasta Plazma ili puna krv Na 2 ili K 2 -EDTA Slika 1. Vakutejneri 2
Pošto kod jednog broja parametara postoje značajne dnevne varijacije koncentracija u krvi (npr. gvožđe, kateholamini, glukoza, trigliceridi, kortizol, estriol, kortikosteroidi), u većini slučajeva je najbolje uzimati krv nakon noćnog gladovanja i to obično između 7 i 9 sati ujutru, a nakon 10-15 min opuštanja u ležećem položaju. Položaj tela prilikom uzimanja krvi utiče na preraspodelu vode između intravaskularnog i ekstravaskularnog prostora: zapremina krvi odrasle osobe je za oko 600-700 ml manja u stojećem, nego u ležećem stavu. Zbog toga je sadržaj proteina plazme, kao i svih supstanci koje su vezane za proteine veći u stojećem nego u ležećem stavu (ukupni proteini, albumin, lipidi, gvožđe, kalcijum i enzimi). Na rezultate laboratorijskih analiza utiče i produženo korišćenje podveske, pa je stoga treba izbegavati pri određivanju gasova u krvi ili laktata (kao posledica usporavanja protoka krvi smanjuje se po 2 a povećavaju ph, pco 2 i koncentracija laktata, usled anaerobnog metabolizma). Prilikom uzimanja krvi, pa sve dok se serum ne izdvoji, mora se voditi računa da ne dođe do hemolize. Hemoliza može nastati usled upotrebe suviše velike ili male igle, snažnog mešanja krvi (antikoagulans se rastvara blagim mešanjem) ili pri procesima presipanja i razdvajanja. Osim toga, kako bi se sprečila hemoliza, centrifugiranje treba vršiti pri umerenim brzinama (2000-3000 obrtaja/min). Ukoliko je koncentracija hemoglobina u uzorku seruma (plazme) veća od 0,2 g/l, hemoliza je vidljiva golim okom. U hemolizovanim uzorcima mogu da se jave tri tipa grešaka: - Povećanje koncentracije svih supstanci koje se u eritrocitima nalaze u većim koncentracijama nego u serumu ili plazmi (npr. kalijum, magnezijum, enzimi laktat-dehidrogenaza, kisela fosfataza ). Ako je hemoliza veoma izražena, doći će i do blagog sniženja nivoa onih supstanci čija je koncentracija manja u eritrocitima nego u plazmi (dilucioni efekat), na primer, ukupnih proteina, albumina itd. - Kako hemoglobin intenzivno apsorbuje svetlost talasne dužine 405 nm (molarna apsorbancija na ovoj talasnoj dužini iznosi 1,3 10 5 ), njegovo prisustvo u reakcionoj smeši ometa spektrofotometrijska merenja u oblasti talasnih dužina bliskih navedenoj vrednosti (npr. prilikom određivanja bilirubina). Greške prouzrokovane ovim efektom mogu da se eliminišu primenom slepe probe. - Hemoglobin prisutan u hemolizovanom uzorku može da ometa neke hemijske reakcije (npr. inhibicija aktivnosti lipaze). Do analiziranja, uzorke krvi treba držati na ledu, ili ukoliko je moguće, odmah izdvojiti serum ili plazmu. Stajanje krvi dovodi do povećanja njene alkalnosti, usled gubitka ugljen-dioksida (difuzija iz plazme u atmosferu), a ovaj fenomen posebno utiče na rezultate analize gasova u krvi. Usled hidrolize organskih fosfata u eritrocitima, u plazmi može da dođe do povećanja neorganskog fosfata. Kako bi se ovo izbeglo serum ili plazmu treba odvojiti odmah nakon uzimanja krvi. Usled kontaminacije bakterijama povećava se nivo amonijaka iz azotnih jedinjenja (uglavnom ureje), a da bi se ovo sprečilo, uzorak treba uzimati pod sterilnim uslovima, a krv ohladiti nakon uzimanja. Proteaze iz krvi mogu da hidrolizuju peptide i peptidne hormone, te stoga uzorke krvi treba čuvati na 4 o C i odmah vršiti centrifugiranje. Serum se dobija centrifugiranjem krvi uzete bez antikoagulansa, a centrifugiranje se izvodi pri brzini od 2000-3000 obrtaja/min posle završenog procesa koagulacije. Vreme potrebno za koagulaciju je 20-30 min ako se koagulacija vrši u vodenom kupatilu, brže je ako se u krvi nalazi aktivator koagulacije, a sporije ako se uzorak nalazi na ledu. U toku centrifugiranja, fibrinska mreža sa krvnim ćelijama (koagulum) izdvaja se na dnu epruvete, a iznad nje ostaje serum, koji normalno ima izgled bistre, žućkaste tečnosti. Serum se u praksi koristi kao uzorak za određivanje većine 3
biohemijskih parametara, iako se u najvećem broju slučajeva umesto seruma može koristiti i plazma. Koncentracija pojedinih parametara je ista u serumu i plazmi (npr. bilirubin, holesterol i kreatinin), dok su vrednosti nekih parametara više u plazmi (kalcijum, ukupni proteini), a drugih u serumu. Plazma je krv bez krvnih ćelija, a dobija se centrifugiranjem pune krvi koje se može izvršiti neposredno posle vađenja krvi. Osnovna razlika u sastavu seruma i plazme je da plazma sadrži fibrinogen, koji se pri dobijanju seruma konvertuje u fibrin i na taj način uklanja iz uzorka. Ako je potrebno da se iz krvi izdvoji plazma, ili ako se za analizu kao uzorak koristi puna krv, neophodno je da se koagulacija krvi spreči dodatkom nekog antikoagulansa, koji se dodaje u epruvete u kojima se sakuplja krv. Kao antikoagulansi se mogu koristiti: - Heparin inhibira konverziju protrombina u trombin i time sprečava koagulaciju. Ne utiče na preraspodelu vode između krvnih ćelija i plazme i ne interferira u najvećem broju laboratorijskih analiza. Koristi se oko 2 mg/10 ml krvi natrijum-, kalijum-, amonijum- ili litijum-heparinata. Upotreba heparina je ipak ograničena zbog znatno veće cene u poređenju sa drugim antikoagulansima. - EDTA (dikalijumova ili dilitijumova so; dinatrijumova so ima nešto manju rastvorljivost), u koncentraciji od 10 do 20 mg/ml krvi, sprečava koagulaciju na taj način što vezuje slobodne jone kalcijuma u helat. Kako ne utiče bitno na preraspodelu vode između eritrocita i plazme, a time ni na zapreminu eritrocita, pogodan je za primenu prilikom uzimanja krvi za hematološka ispitivanja. - Oksalat (kalijumova so je najrastvorljivija) sprečava koagulaciju taloženjem kalcijuma. Primenjuje se 10-20 mg/10 ml krvi ili 20-30 mg praškaste soli. Izaziva prelazak vode iz krvnih ćelija u plazmu, pa dolazi do razblaživanja plazme za nekoliko procenata. - Citrat (natrijumova so) stvara helat sa kalcijumovim jonom. Koristi se oko 60 mg natrijumcitrata/10 ml krvi, mada već 30 mg/10 ml sprečava koagulaciju. I ovaj antikoagulans dovodi do preraspodele vode između ćelija i plazme, slično oksalatu. Citratna plazma se koristi kao uzorak za određivanje fibrinogena i druga ispitivanja funkcije sistema koagulacije. - Da bi se sprečila koagulacija pomoću natrijum-fluorida potrebno je koristiti oko 10 mg/ml krvi. Natrijum-fluorid se obično koristi pre kao konzervans (inhibitor glikolize u eritrocitima, pa povećava stabilnost glukoze u punoj krvi), nego kao antikoagulantno sredstvo. Meša se sa kalijumoksalatom (3 dela oksalata + 1 deo fluorida) ili 1 deo dinatrijumove soli EDTA sa 2 dela fluorida, a zatim se koristi od ovakve smeše po 30 mg/10 ml krvi. Pored hemolize, na rezultat analize mogu da utiču i ikteričnost seruma i lipemija. Ikterični uzorci se dobijaju iz krvi pacijenata sa žuticama, a karakteristična žuta boja je posledica povećane koncentracije bilirubina, što uglavnom utiče na spektrofotometrijska merenja u oblasti talasnih dužina između 400 i 500 nm. Greške koje mogu nastati usled ikteričnog uzorka se koriguju primenom slepe probe analize. Lipemični uzorci seruma ili plazme su mutni i beličasti, a mogu se dobiti na dva načina: 1. Ako se ne poštuje opisana procedura pripreme pacijenta za uzimanje krvi (tj. ako se krv ne uzme natašte, već kraće vreme posle obroka) 2. Ako pacijent boluje od neke hiperlipoproteinemije koja se karakteriše povećanim nivoom hilomikrona, VLDL-a, ili obe navedene klase lipoproteina. Lipemija je vidljiva golim okom ako je koncentracija triglicerida u uzorku veća od 4,56 mmol/l. Prisutni trigliceridi ometaju mnoga spektrofotometrijska merenja, naročito u oblasti talasnih dužina između 400 i 500 nm. Greške izazvane lipemijom koriguju se primenom slepe probe analize ili uklanjanjem lipida iz uzorka ekstrakcijom ili ultracentrifugiranjam. 4
Za većinu biohemijskih analiza, serum ili plazma se mogu čuvati 24 h na temperaturi od 4 o C. Ako se izvođenje analize odlaže na duži period, uzorke treba zamrznuti na -20 o C ili -80 o C. Bilirubin, koji se često određuje u biohemijskim laboratorijama, vrlo je nestabilan metabolit (brzo se razlaže pod dejstvom svetlosti), pa određivanje bilirubina treba izvršiti u svežem uzorku. Urin Način na koji će se izvršiti sakupljanje urina zavisi od vrste ispitivanja. Postoji veći broj mogućih načina sakupljanja, ali se kao uzorci najčešće koriste prvi jutarnji urin i 24-časovni urin. Prvi jutarnji urin se uzima rano ujutru, natašte, uz korišćenje potpuno čistog suda. Kako je ovaj uzorak urina najkoncentrovaniji, pogodan je za kvalitativno ispitivanje tj. za fizičko-hemijski pregled urina i sedimenta. Ne treba ga koristiti za kvantitativna određivanja, zbog toga što u toku dana postoje izrazite varijacije u ekskreciji pojedinih supstanci urinom. Zato se na osnovu koncentracije u prvom jutarnjem urinu ne može pouzdano proceniti dnevna ekskrecija ispitivane supstance, koja ima veći klinički značaj od koncentracije te supstance u urinu. 24-časovni urin, odnosno ukupna količina urina koja se izluči u toku 24 h, sakuplja se počev od jutra, zaključno do jutra sledećeg dana. Ujutru u određeno vreme, npr. u 7.00 sati, pacijent treba potpuno da isprazni bešiku i ovu porciju urina odbaci. Sve ostale porcije urina koje se izluče u toku celog tog dana i noći treba sakupljati, pazeći da ne dođe do gubitaka. Sledećeg jutra u isto vreme (u datom primeru u 7.00 h), sakupi se poslednja porcija urina, ponovo uz potpuno pražnjenje bešike. Celokupna količina urina nosi se u laboratoriju, gde će biti izvršeno merenje zapremine urina. Kod zdravih osoba koje unose prosečne količine hrane i tečnosti, zapremina 24-časovnog urina se obično kreće između 1200 i 1500 ml. 24-časovni urin se koristi za kvantitativno određivanje raznih sastojaka. U laboratoriji se izmeri zapremina urina (diureza), uz pomoć menzura odgovarajuće veličine. Kompletan urin mora dobro da se izmeša, pa se zatim odvoji određena količina za dalju analizu. Po određivanju koncentracije ispitivane supstance, izračunava se dnevna ekskrecija te supstance (količina supstance prisutne u celokupnoj količini urina) množenjem dobijene koncentracije sa zapreminom 24-časovnog urina. Pri sakupljanju urina pacijentu treba davati odgovarajuće uputstvo o načinu sakupljanja, kao i o načinu ishrane i uzimanja lekova, pošto različiti sastojci u urinu mogu da interferiraju sa analitičkim postupcima. Da bi se sprečile promene u sastavu urina (najčešće 24-časovnog), u mnogim slučajevima se koriste različiti konzervansi. Oni se dodaju direktno u bocu u kojoj će se sakupljati urin, a deluju tako što sprečavaju rast bakterija, razlaganje nestabilnih supstanci ili sprečavaju taloženje nekih sastojaka. Izbor konzervansa se vrši zavisno od vrste analize: - Hlorovodonična kiselina (10 ml koncentrovane HCl ili 50 ml rastvora HCl koncentracije 2 mol/l) koristi se kod određivanja amonijum-jona, kalcijuma, oksalata i nekih hormona, - Borna kiselina (5 mg/30 ml) kod određivanja većeg broja hormona, - Natrijum-bikarbonat (5 g) kod određivanja urobilinogena i porfirina, - Toluen kod određivanja aminokiselina, - Petroletar kod određivanja urobilinogena. 5
Za izvođenje nekih analiza nije dozvoljena upotreba konzervanasa, pa se urin može zaštititi od rasta bakterija i promene sastava zamrzavanjem (npr. kod određivanja osmolalnosti urina, cistina ili aldosterona). Pri stajanju urina dolazi do promena njegovog sastava, pre svega zbog delovanja bakterija. Pošto se urin obično ne sakuplja pod aseptičnim uslovima, često dolazi do kontaminacije. Bakterije obično dovode do razlaganja glukoze, ali i ureje na amonijak i ugljen-dioksid, što povećava alkalnost urina, te ovakav uzorak nije pogodan za određivanje glukoze, ureje, amonijaka, ph i ukupnog azota. Osim toga, u alkalnom urinu dolazi do taloženja fosfata. Stajanjem urina dolazi do taloženja mokraćne kiseline i urata (gube rastvorljivost u hladnom urinu), te stoga uzorke urina pre analiziranja treba dobro izmešati. Istaloženi urati se rastvaraju umerenim zagrevanjem urina, a fosfati dodavanjem male količine kiseline. Feces Za ispitivanje fecesa koriste se različiti uzorci: pojedinačni (za kvalitativne analize, najčešće za dokazivanje okultnog krvarenja), celodnevni (sakupljen u toku 24-sata, za kvantitativne analize) i uzorak koji se sakuplja u toku 72 sata (za metabolička ispitivanja). Prilikom sakupljanja uzoraka treba izbegavati kontaminaciju urinom (dokaz za prisustvo urina su povećane količine hlorida, kojih ima neznatno u normalnom fecesu). Za kvantitativna ispitivanja celodnevni uzorak treba dostaviti laboratoriji u što je moguće kraćem periodu. Treba koristiti sveže uzorke kako bi se izbegla potreba za konzervisanjem (najbolje je da se uzorci čuvaju u frižideru). Ako je neophodno da se u fecesu određuje azot, feces treba izmešati sa oko 200 ml vode i nakon toga homogenizovati. Jednom alikvotu se uz pažljivo mešanje dodaje ista zapremina koncentrovane sumporne kiseline i ovako pripremljen uzorak se čuva do analiziranja. Za metabolička ispitivanja uzorci fecesa se, slično uzorcima urina, sakupljaju u tačno definisanom periodu. U ovom slučaju se koristi nekoliko supstanci (npr. ugalj, karmin i gencijana violet), pomoću kojih se označava početak i kraj eksperimentalnog perioda. Obično se dodaje 0,5 do 1 g u kapsulama pre doručka prvog jutra kad otpočinje ispitivanje, odnosno sakupljanje fecesa i ponovo pre doručka zadnjeg dana sakupljanja, kad se završi sakupljanje fecesa. Sa sakupljanjem fecesa se otpočinje kad se prvi put pojavi boja u stolici. Sakupljanje obuhvata sve uzorke stolice do onog uzorka koji ponovo sadrži boju (ovaj uzorak se odbacuje). Po završetku sakupljanja izmeri se posuda sa fecesom. Masa fecesa se dobija oduzimanjem težine posude koja je izmerena pre početka sakupljanja. Sakupljeni feces se homogenizuje i odgovarajući alikvoti se koriste za dalja ispitivanja. Druge telesne tečnosti Likvor (cerebrospinalna tečnost) ispunjava šupljine u mozgu i prostor između mozga i kičmene moždine i njihovih opni (subarahinoidalni prostor). Odvojen je od krvi krvno-moždanom barijerom. Uloga likvora je da štiti tkivo centralnog nervnog sistema, u njemu se sakupljaju razmenjene materije i cirkulišu hranljive materije. Likvor se uzima lumbalnom punkcijom u položaju L4-L5, pod aseptičnim uslovima i pomoću sterilne kanile. Punkcijom treba uzimati otprilike uvek isti volumen, oko 15 do 20 ml, s obzirom da se sastav likvora menja. Prilikom uzimanja likvora prvih nekoliko kapi se odbaci, a preostala količina raspodeli u tri epruvete. Uzorak iz prve epruvete se 6
koristi za hemijska i imunološka ispitivanja, iz druge za mikrobiološka ispitivanja, a iz treće epruvete za utvrđivanje ukupnog i diferencijalnog broja ćelija. Amnionska tečnost okružuje fetus i štiti ga od spoljašnjih trauma, osigurava stalnu temperaturu ploda, delimično ga hrani, učestvuje u razmeni gasova i služi za izlivanje sekreta i ekskreta (ima zaštitnu, prenosnu i metaboličku funkciju). Uzorci amnionske tečnosti se uzimaju transabdominalnom amniocentezom nakon 16-te nedelje od poslednjeg menstrualnog perioda ili 14-te nedelje od početka trudnoće. Ne treba uzimati više od 10-20 ml uzorka. Uzorak se zatim centrifugira u toku 5 min na 500-1000g, pošto se za ispitivanja koristi supernatant. Kao i u slučaju likvora, prvo se ispituje izgled uzorka amnionske tečnosti, a zatim se primenjuju i sva druga neophodna ispitivanja: mikroskopska, hemijska, genetska i mikrobiološka. Serozne tečnosti se nalaze unutar telesnih šupljina (pleuralna, peritonealna, perikardijalna), između parijetalne i visceralne membrane, u količini od nekoliko mililitara. Membrana obično ne sprečava razmenu tečnosti i elektrolita između telesnih šupljina i intersticijalne tečnosti koja ga okružuje. Akumulirana tečnost unutar pleuralne, perikardijalne ili peritonealne šupljine se naziva izliv. Aspiracija pleuralne tečnosti se naziva toracenteza, perikardijalne je perikardiocenteza, a aspiracija peritonealne tečnosti je peritoneocenteza. Ove tehnike se primenjuju u dijagnostičke ili terapeutske svrhe u cilju oslobađanja od pritiska. Izlivi mogu biti transudati ili eksudati. Transudati nastaju kao posledice sistemskih oboljenja (kongestivno oštećenje srca), a eksudati usled oštećenja površina membrana (inflamacija, maligna stanja, infekcije). Transudati i eksudati se razlikuju po boji, izgledu i broju ćelija. Sinovijalna tečnost je ultrafiltrat plazme koji sadrži mukopolisaharide (hijaluronat), a sintetišu je ćelije sinovijalne membrane. Ova tečnost podmazuje zglobove i prenosi hranljive sastojke, omogućavajući tako ishranu zglobnog tkiva. Analiza sinovijalne tečnosti se koristi za postavljanje dijagnoze oboljenja zglobova. Tehnika uzorkovanja sinovijalne tečnosti se naziva artrocenteza, vrši se pomoću šprica, uz upotrebu Na-heparina kao antikoagulansa. Čvrsta tkiva koja se najčešće ispituju u biohemijskim laboratorijama su maligna tkiva dojke, u kojima se određuju receptori za estrogen i progesteron. Uzorak se uzima biopsijom i odmah zamrzava u tečnom azotu. Paralelno sa biohemijskim ispitivanjima neophodno je da se tkivo i histološki ispita kako bi se potvrdilo da se radi o malignom tkivu. Izvori preanalitičke varijacije Ako se u jednom uzorku određena analiza ponavlja više puta, dobijeni rezultati neće biti potpuno identični, zbog izvesne nepreciznosti analitičke metode koja se koristi za određivanje date supstance. Ukoliko je preciznost metode manja, utoliko će se rezultati ponovljenih određivanja više razlikovati, iako je stvarna koncentracija supstance koja se određuje u uzorku uvek ista. Ovaj tip varijacije rezultata naziva se analitička varijacija. Različite bolesti dovode do karakterističnih promena koncentracija pojedinih sastojaka biološkog materijala (npr. povećanje koncentracije glukoze u krvi kod dijabetes melitusa), što omogućava primenu rezultata laboratorijskih ispitivanja za procenu zdravstvenog stanja pacijenata. Međutim, i kod zdravih osoba, brojni faktori utiču na koncentracije pojedinih sastojaka telesnih tečnosti in vivo. Ovi faktori, zajedno sa faktorima koji deluju u samom postupku uzimanja biološkog materijala utiču na stvarnu koncentraciju ispitivane supstance u dobijenom uzorku i predstavljaju izvore preanalitičke varijacije. 7
Fiziološki faktori koji utiču na sastav telesnih tečnosti mogu da se podele u dve grupe: 1. Faktori koji ispoljavaju dugoročne efekte (ovi efekti se najčešće ne mogu kontrolisati) 2. Faktori koji ispoljavaju kratkoročne efekte (efekti koji se mogu kontrolisati). Faktori koji ispoljavaju dugoročne efekte U većini slučajeva nije moguće eliminisati uticaj ovih faktora na koncentraciju sastojaka telesnih tečnosti. Na neke se ne može delovati uopšte (npr. starost, genetski faktori), dok na druge može, ali ne trenutno, u trenutku kad se ukaže potreba da se osoba podvrgne laboratorijskom ispitivanju (npr. uobičajeni način ishrane). Zbog toga je neophodno poznavati efekte ovakvih faktora i uzeti ih u obzir prilikom interpretacije dobijenih rezultata. U ovu grupu spadaju: Starost (koncentracije mnogih sastojaka telesnih tečnosti različite su kod novorođenčadi, dece, odraslih i starih osoba), Genetski faktori (pol, rasa i dr.), Faktori sredine (npr. klima i nadmorska visina), Dugoročne ciklične promene (uticaj godišnjih doba ili menstrualnog ciklusa kod žena), Telesna težina (npr. prosečne koncentracije triglicerida u plazmi rastu sa povećanjem telesne težine) Način ishrane (npr. kalorična ishrana sa velikim sadržajem masti utiče na parametre lipidnog statusa; vegetarijanska ishrana pokazuje vrlo povoljne efekte na lipidni status, ali može da dovede do deficijencije nekih vitamina; duže gladovanje takođe dovodi do karakterističnih promena, npr. do porasta koncentracije ketonskih tela u krvi i urinu). Stepen uobičajene fizičke aktivnosti. Faktori koji ispoljavaju kratkoročne efekte Dejstvo ove grupe faktora se može kontrolisati, pa se njihov uticaj na rezultate laboratorijskih ispitivanja eliminiše adekvatnom pripremom pacijenta pre i u toku uzimanja biološkog materijala. Kratkoročne uticaje na sastav telesnih tečnosti ispoljavaju sledeći faktori: Položaj tela prilikom uzimanja krvi: položaj tela utiče na preraspodelu vode između intravaskularnog i ekstravaskularnog prostora: zapremina krvi odrasle osobe je za oko 600-700 ml manja u stojećem, nego u ležećem stavu. Zbog toga je sadržaj proteina plazme, kao i svih supstanci koje su vezane za proteine veći u stojećem nego u ležećem stavu. Vreme poslednjeg obroka: uzimanje hrane utiče na koncentraciju brojnih sastojaka krvi. Kao što je ranije rečeno, krv se zbog toga u pravilu uzima natašte, najmanje 10 h posle obroka. Cirkadijalni ritam: koncentracija nekih sastojaka telesnih tečnosti podleže promenama u toku dana (hormoni; gvožđe - koncentracija gvožđa u serumu je najviša ujutru, dok je uveče čak 30% niža). Efekti se eliminišu uzimanjem biološkog materijala u određeno vreme u toku dana (krv se po pravilu uzima ujutru). Imobilizacija i hospitalizacija. Posle nekoliko dana neaktivnosti dolazi do određenih promena (npr. smanjenje zapremine plazme, povećanje hematokrita itd). Vežbanje (kraće vreme pre uzimanja biološkog materijala): efekti zavise od trajanja i intenziteta fizičke aktivnosti. Pušenje, unošenje alkohola ili lekova. 8
Primena spektrofotometrije u medicinskoj biohemiji U biohemijskim laboratorijama se vrše kvalitativna ispitivanja (dokazivanje prisustva određenih supstanci u biološkom materijalu) i kvantitativna određivanja pojedinih biohemijskih parametara. Od analitičkih metoda primenu u medicinskoj biohemiji imaju: 1. Metode separacije: hromatografija i elektroforeza 2. Kvantitativna određivanja: - gravimetrija - titrimetrija - spektrofotometrija - elektrohemija - imunohemija - hromatografija Od pomenutih metoda najčešće se primenjuje spektrofotometrija, koja se zasniva na Lambert Beer-ovom zakonu: А = а b c ili А = ε b c А - apsorbancija (еkstinkcija) а (ε) molarni apsorpcioni koeficijent (ε zavisi od prirode supstance, λ i T ) b - dužina optičkog puta = širina kivete (cm) c - koncentracija rastvora Hemijskom reakcijom između parametra koji se određuje u uzorku i reagensa stvara se proizvod reakcije, čija se apsorbancija meri spektrofotometrijski (UV ili VIS). Merenja u UV oblasti vrše se u kvarcnim ili plastičnim kivetama (ukoliko se u reakcionoj smeši ne nalaze korozivne supstance), a u VIS oblasti u staklenim ili plastičnim kivetama. Merenje apsorbancije se vrši na λ max. Izračunavanje nepoznate koncentracije je moguće ostvariti na 3 načina: 1. primenom standarda 2. primenom standardne krive 3. primenom molarnog apsorpcionog koeficijenta Izračunavanje koncentracije primenom jednog standarda podrazumeva da se paralelno sa analizom uradi i standard, a zatim se na osnovu izmerenih apsorbancija analize i standarda računa nepoznata koncentracija analize iz sledeće izraza: A A C A = C A St St C A koncentracija analize C St koncentracija standarda A A izmerena apsorbancija analize A St izmerena apsorbancija standarda 9
Standard je rastvor poznate, tačno određene koncentracije ispitivanog parametra u odgovarajućem rastvaraču. Koncentracija standarda se bira tako da bude u opsegu referentnih vrednosti parametra čije se koncentracija određuje. Standardi mogu biti primarni ili sekundarni. Primarni standardi se dobijaju rastvaranjem određene, tačno izmerene količine ispitivane supstance, u odgovarajućem rastvaraču, a sekundarni standardi se dobijaju razblaživanjem primarnih standarda, pri čemu njihova koncentracija mora biti određena referentnom metodom za dati parametar. Izračunavanje koncentracije primenom standardne krive podrazumeva konstruisanje standardne (kalibracione) krive zavisnosti apsorbancija od koncentracija standardnih rastvora. U tu svrhu koristi se serija standardnih rastvora rastućih koncentracija ispitivanog parametra. Sa svakim od standardnih rastvora se izvodi reakcija, a zatim izmeri apsorbancija. Na osnovu dobijenih parova vrednosti za koncentracije i apsorbancije izračuna se jednačina prave i nacrta standardna kriva: А А x у = ах + b а - nagib prave b - odsečak na у оsi y - apsorbancija x - koncentracija С х C Idealna standardna kriva je linearna i prolazi kroz koordinatni početak, a metoda ima dobar analitički opseg ako oko 95% očekivanih vrednosti u uzorcima pacijenata može da se odredi bez prethodnog razblaživanja. Ako je apsorbancija analize suviše visoka i van opsega linearnosti metode, analiza se mora ponoviti sa razblaženim uzorkom (razblaženja se obično prave sa fiziološkim rastvorom). Izračunavanje koncentracije primenom molarnog apsorpcionog koeficijenta zahteva da se za merenje apsorbancije koristi monohromatska svetlost (tačna talasna dužina), odnosno da se merenja vrše isključivo na spektofotometru. Koncentracija nepoznate analize se računa prema formuli: C A A A = ε b А A - apsorbancija analize ε molarni apsorpcioni koeficijent (ε zavisi od prirode supstance, λ i T ) b - dužina optičkog puta = širina kivete (cm) Molarni apsorpcioni koeficijent je apsorbancija rastvora koncentracije 1 mol/l, pri dužini optičkog puta od 1 cm. Ova vrednost zavisi od λ i temperature na kojoj se vrši merenje. 10
Slepe probe se koriste za eliminisanje neželjenih apsorbancija koje mogu da utiču na rezultat. U tu svrhu se mogu koristiti slepa proba reagensa i slepa proba analize (uzorka). Slepa proba reagensa služi za eliminisanje apsorbancije koja potiče od reagensa i priprema se istim postupkom kao analiza i standard, ali se umesto uzorka dodaje voda ili rastvarač, u istoj zapremini. Slepom probom reagensa se vrši podešavanje nule spektrofotometra. Ukoliko je apsorbancija slepe probe reagensa suviše visoka, nula aparata se podesi destilovanom vodom, a apsorbancija slepe probe reagensa izmeri, a zatim se oduzme od apsorbancije analize i apsorbancije standarda. U slučaju da reagensi ne apsorbuju na talasnoj dužini merenja, nula aparata se podešava destilovanom vodom. Slepa proba analize se koristi za eliminisanje apsorbancije koja potiče od uzorka i priprema se na isti način kao analiza, uz određene modifikacije kojima se sprečava reakcija ispitivanog parametra sa reagensom. Apsorbancija slepe probe analize se uvek mora izmeriti, a njena vrednost se oduzima samo od apsorbancije analize. Referentni materijali koji se koriste u biohemijskoj laboratoriji U biohemijskim laboratorijama se kao referentni materijali koriste kalibratori i kontrolni materijali. Kalibratori se koriste za kalibraciju analitičkih instrumenata i imaju tačno određenu vrednost parametara čije se koncentracije određuju. Kontrolni serumi se koriste za procenu preciznosti i tačnosti rezultata. Analiziraju se na potpuno isti način kao i uzorci pacijenta, a koncentracija parametara u kontrolnim serumima mora biti poznata. Kontrolni serum se ne koristi za kalibraciju instrumenata. Eksperimentalni rad I Provera tačnosti pipeta 1. Gravimetrijska metoda Izmeriti težinu destilovane vode na elektronskoj vagi sa tačnošću 0,001g koju ste u merni sud dodali pipetom koja odmerava odgovarajuću deklarisanu zapreminu. Izračunati odstupanje u procentima od deklarisane zapremine (greška ne bi smela da bude veća od 1%) 2. Spektrofotometrijska metoda Reagensi koji se koriste za sprektrofotometrijsku kalibraciju automatskih pipeta su: NaOH, 0,01 mol/l p-nitro-fenol (pnp), 0,105 g/l Referentno razblaženje I - Napuniti normalni sud od 250 ml do crte sa 0,01 mol/l NaOH. Dodati 1 ml rastvora pnp 0,105g/L. U 5 epruveta dodati po 2,5 ml NaOH. U svaku epruvetu pipetom koju proveravamo dodajemo po 10 µl pnp referentnog rastvora I. Pročitati apsorbanciju svakog rastvora iz 5 epruveta na 401 nm. Očekivana vrednost A je 0,550. Iz 5 očitanih vrednosti izračunati srednju vrednost i računati odstupanje prema formuli: Asr/0,550*D*V= zapremina u µl koju odmerava pipeta 11
D razblaženje test rastvora (1:251 u ovom primeru) a V je ukupna zapremina u µl 2510 u ovom primeru. Odstupanje ne bi smelo da pređe 1%. II Tačnost spektrofotometra Za ispitivanje tačnosti spektrofotometra koristi se rastvor kalijum-dihromata. K 2 Cr 2 O 7 se suši na 110 C tokom 1h. Pripremaju se dva rastvora različitih koncentracija u 0,005 mol/l sumporne kiseline. Rastvor A: 0,05 g/l K 2 Cr 2 O 7 Rastvor B: 0,1 g/l K 2 Cr 2 O 7 0,005 mol/l sumporne kiseline se koristi kao slepa proba Merenja apsorbancije rastvora A i B prema sumpornoj kiselini kao slepoj probi se izvode na T C od 15-25 C. U tabeli su date očekivane vrednosti apsorbancija rastvora A i B na talasnim dužinama λ= 235, 257, 313, 350 nm. λ Rastvor A Rastvor B 235 (min) 0,626 ± 0,009 1,251 ± 0,019 257 (max) 0,727 ± 0,007 1,454 ± 0,015 313 (min) 0,244 ± 0,004 0,488 ± 0,007 350 (max) 0,536 ± 0,005 1,071 ± 0,011 III Načini izračunavanja koncentracije u biohemiji Za pravljenje rastvora standarda pnp koristiti stock rastvor 1 mmol/l p-nitrofenola u 10 mmol/l NaOH. p-nitrofenil fosfat + H 2 O p-nitrofenol + fosfat p-nitrofenol + OH - ε(pnp) = 18 500 L/mol x cm. p-nitrofenoksidni anjon zuto obojen 1. Apsorpcioni spektar Nacrtati apsorpcioni spektar jedinjenja pnp na spektrofotometru Beckman u laboratoriji 204. Pregledati spektar, uočiti apsorpcione maksimume i minimume. Očitati karakterističan A max na oko 400 nm i tako određenu talasnu dužinu koristiti za određivanje koncentracije u uzorku preko standarda, preko standardne krive i pomoću molarnog apsorpcionog koeficijenta. 12
2. Određivanje koncentracije pnp u uzorku upotrebom STANDARDA Izmeriti apsorbancije u nepoznatom uzorku i standardu, pa izračunati koncentraciju nepoznate analize. Koristiti standard pnp koncentracije 50 µmol/l. 3. Određivanje koncentracije pnp u uzorku upotrebom STANDARDNE KRIVE Za pravljenje standardne krive koristiti standarde pnp koncentracija: 20 µmol/l 40 µmol/l 60 µmol/l 80 µmol/l Izmeriti apsorbancije standardnih rastvora, a zatim konstruisati standardnu krivu. Iz jednačine standardne krive izračunati koncentraciju nepoznate analize. 4. Određivanje koncentracije pnp u uzorku upotrebom MOLARNOG APSORPCIONOG KOEFICIJENTA Preračunati koncentraciju pnp u istom uzorku upotrebom molarnog ekstinkcionog koeficijenta (ε) pnp od 18 500 L/mol cm. 13