Sylabus prednášok z Biochémie nukleových kyselín II

Σχετικά έγγραφα
Obvod a obsah štvoruholníka

Matematika Funkcia viac premenných, Parciálne derivácie

Ekvačná a kvantifikačná logika

Start. Vstup r. O = 2*π*r S = π*r*r. Vystup O, S. Stop. Start. Vstup P, C V = P*C*1,19. Vystup V. Stop

C. Kontaktný fasádny zatepľovací systém

PRIEMER DROTU d = 0,4-6,3 mm

POKROČILÉ PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE A MOLEKULOVEJ BIOLÓGIE

7. FUNKCIE POJEM FUNKCIE

1. písomná práca z matematiky Skupina A

1. Limita, spojitost a diferenciálny počet funkcie jednej premennej

Prechod z 2D do 3D. Martin Florek 3. marca 2009

Matematika 2. časť: Analytická geometria

Cvičenie č. 4,5 Limita funkcie

Goniometrické rovnice a nerovnice. Základné goniometrické rovnice

AerobTec Altis Micro

Pevné ložiská. Voľné ložiská

KATEDRA DOPRAVNEJ A MANIPULAČNEJ TECHNIKY Strojnícka fakulta, Žilinská Univerzita

HASLIM112V, HASLIM123V, HASLIM136V HASLIM112Z, HASLIM123Z, HASLIM136Z HASLIM112S, HASLIM123S, HASLIM136S

Motivácia Denícia determinantu Výpo et determinantov Determinant sú inu matíc Vyuºitie determinantov. Determinanty. 14. decembra 2010.

SLOVENSKO maloobchodný cenník (bez DPH)

Vyhlásenie o parametroch stavebného výrobku StoPox GH 205 S

Zateplite fasádu! Zabezpečte, aby Vám neuniklo teplo cez fasádu

Harmonizované technické špecifikácie Trieda GP - CS lv EN Pevnosť v tlaku 6 N/mm² EN Prídržnosť

Kontrolné otázky na kvíz z jednotiek fyzikálnych veličín. Upozornenie: Umiestnenie správnej a nesprávnych odpovedí sa môže v teste meniť.

Matematika prednáška 4 Postupnosti a rady 4.5 Funkcionálne rady - mocninové rady - Taylorov rad, MacLaurinov rad

Život vedca krajší od vysnívaného... s prírodou na hladine α R-P-R

Akumulátory. Membránové akumulátory Vakové akumulátory Piestové akumulátory

Základné poznatky molekulovej fyziky a termodynamiky

Priamkové plochy. Ak každým bodom plochy Φ prechádza aspoň jedna priamka, ktorá (celá) na nej leží potom plocha Φ je priamková. Santiago Calatrava

Nukleové kyseliny a proteosyntéza

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA AGROBIOLÓGIE A POTRAVINOVÝCH ZDROJOV KATEDRA GENETIKY A ŠĽACHTENIA RASTLÍN

3. Striedavé prúdy. Sínusoida

Analýza nukleových kyselín

α 1 2- Cloning and Expression of alpha 1 2-fucosyltransferase in E. coli BIOTECHNOLOGY BULLETIN

Rozsah hodnotenia a spôsob výpočtu energetickej účinnosti rozvodu tepla

Modelovanie dynamickej podmienenej korelácie kurzov V4

Výpočet. grafický návrh

Moderné vzdelávanie pre vedomostnú spoločnosť Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ M A T E M A T I K A

KATALÓG KRUHOVÉ POTRUBIE

ZADANIE 1_ ÚLOHA 3_Všeobecná rovinná silová sústava ZADANIE 1 _ ÚLOHA 3

Podnikateľ 90 Mobilný telefón Cena 95 % 50 % 25 %

Metódy vol nej optimalizácie

VYBRANÉ BIOCHEMICKÉ A MOLEKULÁRNE-BIOLOGICKÉ METÓDY V LEKÁRSKOM VÝSKUME A MEDICÍNSKEJ DIAGNOSTIKE. Skriptá. Oľga Križanová

Izolácia a purifikácia nukleových kyselín Pri konštrukcii rekombinantnej DNA spájame vektorovú a darcovskú-donorovú DNA


STREŠNÉ DOPLNKY UNI. SiLNÝ PARTNER PRE VAŠU STRECHU

Einsteinove rovnice. obrázkový úvod do Všeobecnej teórie relativity. Pavol Ševera. Katedra teoretickej fyziky a didaktiky fyziky

M6: Model Hydraulický systém dvoch zásobníkov kvapaliny s interakciou

replikačná vidlica (ori), jednosmerná-dvojsmerná replikácia

Kompilátory. Cvičenie 6: LLVM. Peter Kostolányi. 21. novembra 2017

TECHNICKÁ UNIVERZITA VO ZVOLENE. Prof. Ing. Dušan Gömöry, DrSc. GENETIKA

difúzne otvorené drevovláknité izolačné dosky - ochrana nie len pred chladom...

Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Gramatická indukcia a jej využitie

Φαρμακευτική Bιοτεχνολογία

(1 ml) (2 ml) 3400 (5 ml) 3100 (10 ml) 400 (25 ml) 300 (50 ml)

Erik Birčák, Filip Brázdovič, Andrea Cillingová, Filip Červenák, Katarína Juríková, Lucia Zeiselová. Katedra geneaky PriF UK, BraAslava

ARMA modely čast 2: moving average modely (MA)

ΓΙΑΝΝΗΣ ΑΡΓΥΡΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ. Γενικής Παιδείας ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ

(Pseudorabies,PR) , ge. , ( Pichia pastoris) ppic9k, ,Multi2Copy Pichia Expression Kit Invitrogen, Vol. 42 October No. 5

Rozsah akreditácie 1/5. Príloha zo dňa k osvedčeniu o akreditácii č. K-003

Odporníky. 1. Príklad1. TESLA TR

ŠNEKÁČI mýty o přidávání CO2 založenie akvária Poecilia reticulata REPORTÁŽE

Vybrané kapitoly genetiky pre lesníkov

Návrh vzduchotesnosti pre detaily napojení

Vektorový priestor V : Množina prvkov (vektory), na ktorej je definované ich sčítanie a ich

Biogénne pozitrónové PET rádionuklidy

Γηαγώληζκα Βηνινγίαο Γ Λπθείνπ Θεηηθή θαηεύζπλζε (Κεθ. 1, 2,4) ΕΖΤΖΜΑ 1 ν Α. Δπηιέμηε κία απάληεζε ζηηο παξαθάηω εξωηήζεηο:

Zrýchľovanie vesmíru. Zrýchľovanie vesmíru. o výprave na kraj vesmíru a čo tam astronómovia objavili

,Zohrievanie vody indukčným varičom bez pokrievky,

ODPOVEĎ MIKROORGANIZMOV NA ZMENY PROSTREDIA

Numerické metódy matematiky I

MIDTERM (A) riešenia a bodovanie

Gymnázium Jána Adama Raymana. Penicilín. Ročníková práca z chémie. 2005/2006 Jozef Komár 3.C

igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση

Termodynamika. Doplnkové materiály k prednáškam z Fyziky I pre SjF Dušan PUDIŠ (2008)

Motivácia pojmu derivácia

u R Pasívne prvky R, L, C v obvode striedavého prúdu Činný odpor R Napätie zdroja sa rovná úbytku napätia na činnom odpore.

Materiály pro vakuové aparatury

1. písomná práca z matematiky Skupina A. 1. písomná práca z matematiky Skupina B

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ

Tomáš Madaras Prvočísla

Nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny sú polymérne reťazce pozostávajúce z monomérov, ktoré sa nazývajú nukleotidy.

Biochémia nukleových kyselín I

Příloha č. 1 etiketa. Nutrilon Nenatal 0

Τάξη: Γ Λυκείου Τμήμα: Βαθμός: Ονοματεπώνυμο: Καθηγητές:

DOMÁCE ZADANIE 1 - PRÍKLAD č. 2

6 Limita funkcie. 6.1 Myšlienka limity, interval bez bodu

Deliteľnosť a znaky deliteľnosti

6 APLIKÁCIE FUNKCIE DVOCH PREMENNÝCH

Staromlynská 29, Bratislava tel: , fax: http: // SLUŽBY s. r. o.

Jednotkový koreň (unit root), diferencovanie časového radu, unit root testy

Magneti opis i namena Opis: Napon: Snaga: Cena:

Kontrolné otázky z jednotiek fyzikálnych veličín

PROMO AKCIA. Platí do konca roka 2017 APKW 0602-HF APKT PDTR APKT 0602-HF

Komplexné čísla, Diskrétna Fourierova transformácia 1

- pravac n je zadan s točkom T(2,0) i koeficijentom smjera k=2. (30 bodova)

Margita Vajsáblová. ρ priemetňa, s smer premietania. Súradnicová sústava (O, x, y, z ) (O a, x a, y a, z a )

Modul pružnosti betónu

Kaskadna kompenzacija SAU

Transcript:

Sylabus prednášok z Biochémie nukleových kyselín II 1. Úvod do problematiky génového inžinierstva: základná stratégia, charakteristika dielčích postupov používaných pri manipulácii s genetickým materiálom (2) 2. Izolácia nukleových kyselín: princípy izolácie DNA, RNA (2) 3. Enzýmy v génovom inžinierstve: polymerázy, restrikčné endonukleázy, nukleázy, ligázy, fosfatázy, transferázy, kinázy, topoizomerázy (2x2) 4. Príprava rekombinantných DNA: základné požiadavky na vektory, klasifikácia vektorov podľa mechanizmu replikácie, expresné vektory, fragmentácia, úprava a značenie fragmentov, adaptorové molekuly, ligácia fragmentov DNA, príprava kompetentných buniek, transformácia rekombinantnej DNA, selekcia rekombinantov, stabilita transformovaných buniek, genómové knižnice (3x2) 5. Amplifikačné metódy: PCR, stratégia a celkové požiadavky... (2) 6. Analýza nukleových kyselín: elektroforetická analýza, Southern, Northern, West blotting, dot blot... (2) 7. Sekvenčná analýza: primerová syntéza, +/- metóda, sekvenovanie krátkych oligonukleotidov, Sangerova terminačná metóda, použitie fágovej DNA M13, Maxam-Gilbertova chemická metóda, syntéza oligonukleotidov, cielená mutagenéza 8. Základy bioinformatiky: Analýza sekvencií a získavanie dát (7-8, 2) 9. Praktické aplikácie: diagnostika dedičných a nádorových ochorení, génová terapia, molekulárna genetika priemyselne dôležitých mikroorganizmov, génové manipulácie bachorových baktérií... (2x2) Doporučená literatúra: Turňa, J. a kol.: Rekombinantné DNA a biotechnológie, Alfa, Bratislava, 1990. Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

V prírode mnohokrát dochádza k spontánnemu prijímaniu génov s vonkajšieho prostredia alebo k ich prenosu medzi príbuznými mikroorganizmami v procesoch ako sú: konjugácia, transpozícia, prípadne transdukcia. Na úrovni príbuznych baktérií je napr. konjugácia vcelku úspešná, v prípade nepríbuzných baktérií alebo úplne cudzorodej DNA (napr, cicavčej alebo rastlinnej DNA) je tento prirodzený transformačný proces viac-menej neúspešný. Čo s tým súvisí: Cudzorodú DNA, môže sice nepríbuzná bunka prijať, ale nemusí ju prepisovať-transkribovať. Ak sa však cudzorodá DNA transkribuje, vzniknutá mrna sa nemusí ďalej verne preložiť do funkčnej bielkoviny. Zložitejším problémom je, či bunky prijatú DNA udržia, či táto DNA bude v bunke stabilne replikovaná. Ak sa totiž určitá DNA nemôže integrovať do hostiteľského chromozómu, nebude sa replikovať a pri delení buniek sa z bunkovej populácie postupne vyriedi. Aj v prípade, ak cudzorodá DNA obsahuje všetky potrebné regulačné prvky na vlastnú replikáciu, nemusí tieto signály hostiteľská bunka rozoznávať. Tieto isté problémy nás však čakajú aj pri snahe o prenos cudzorodej DNA do hostiteľských buniek in vitro, čiže v procese génových manipulácií v skúmavke. Ak predpokladáme, že najčastejším a najbežnejším dôvodom eliminácie cudzorodej DNA z bunky je jej neschopnosť replikácie, najjednoduchším spôsobom na prekonanie tejto prekážky je pripojenie fragmentu cudzorodej DNA k vhodnému nosiču, ktorý by mal vlastnosti samostatného replikónu nezávislého na replikácii chromozómu, čo sa viac-menej úspešne využíva v procese tvorby a prenosu rekombinantnej DNA in vitro.

Génové manipulácie, génové inžinierstvo, klonovanie génov, techniky rekombinantnej DNA, technológia rekombinantných DNA génová manipulácia je činnosť, ktorou sa vytvárajú nové kombinácie genetického materiálu tým, že molekuly nukleových kyselín sa integrujú mimo bunky do plazmidu, vírusu alebo iného vektorového systému tak, že sa môžu inkorporovať do hostiteľského organizmu, v ktorom sa pôvodne nevyskytovali, ale môžu sa v ňom rozmnožovať (klonovať)

Základné etapy prípravy rekombinantných DNA 1. Izolácia DNA: vektorová (plazmidová - fágová) a donorová (chromozómová, mrna fi cdna) DNA 2. Príprava rekombinantnej DNA: spojenie vektorovej a donorovej DNA (príprava špecifických fragmentov donorovej DNA a jej integrácia do vektorovej molekuly pomocou DNA ligázy in vitro, konštrukcia vhodného klonovacieho systému pre daný cieľový organizmus) 3. Prenos rekombinantnej DNA do cieľového organizmu: (klonovací systém zahrňuje vhodný vektor a metódu prenosu), štúdium regulácie bunkovej expresie, získavanie nových vlastností pre biotechnologické účely 4. Selekcia, analýza a úprava rekombinantov: odlíšenie rekombinantov od nerekombinantov, výber hľadaného rekombinanta z celkového množstva pozitívnych rekombinantov a ich analýza (určenie restrikčnej mapy, primárnej štruktúry, upresnenie polohy hľadaného génu a jeho regulačných úsekov, reklonovanie do iného vektora)

Základné vlastnosti vektorov: vektor musí byť dostatočne malý, aby sa ľahko transformoval do bunky, prípadne ľahko izoloval a purifikoval, mal by sa replikovať nezávisle na chromozóme, mal by obsahovať unikátne restrikčné miesta najlepšie v úseku, ktorý kóduje vlastnosti selekčného markeru, do ktorého sa cudzorodá DNA vkladá, pričom sa tento gén vlastne inaktivuje. Plazmidy: predstavujú extrachromozómové bakteriálne častice dvojvláknovej-kruhovej-uzavretej DNA so schopnosťou nezávislej replikácie s veľkosťou 1-200 kb, úsek 1kb = 1000 bázových párov je dlhý 0,34 mm s molekulovou hmotnosťou cca 660 kd, často kódujú pre bunku životne dôležité enzýmy alebo iné proteínové substancie potrebné pre vitálne funkcie bunky ako sú antibiotická rezistencia, rezistencia na ťažké kovy, produkcia antibiotík, bakteriocínov, restrikčných enzýmov, degradácia organických látok alebo môžu mať kryptický charakter. Pre potreby tvorby rekombinantnej DNA boli skonštruované rôzne plazmidové vektory, medzi najpoužívanejšie patria plazmid pbr322 a plazmidy série puc. Plazmid pbr322 má veľkosť 4,3 kb a nesie gény pre rezistenciu na tetracyklín a ampicilín. Plazmidy série puc sú menšie (2,7 kb), obsahujú polylinker v oblasti lacz génu a gén zodpovedný za rezistenciu na ampicilín.

Restrikčná mapa plazmidu puc18 Amp Ssp I (2504) puc18 2686 bp LacZ-alfa Hind III (400) Sph I (410) Pst I (416) Sal I (418) BamH I (430) Sma I (437) Kpn I (443) Eco R I (451) Lac promotor ORI Replikón: pmb1 Veľkosť : 2,7 kb Promótor: lac Gén rezistencie: Amp (ampicilín) Klonovacie miesta: polylinker obsahujúci 13 unikátnych restrikčných miest Hostiteľský organizmus: Escherichia coli s delta lac mutáciou (len pre modro/bielu selekciu, napr. JM109), prípadne ľubovoľný iný

Restrikčná mapa plazmidu pbr322 Eco R I (4360) Ssp I (4171) Amp Pst I (3612) Cla I (25) Hind III (30) BamH I (376) Sph I (567) Sal I (652) Tet pbr322 4361 bp ORI ROP Replikón: pmb1 Veľkosť : 4,3 kb Promótor: žiadny Gén rezistencie: Amp (ampicilín), Tet (tetracyklín) Klonovacie miesta: EcoRV, BamHI, SphI, SalI pre inzerčnú inaktiváciu génu rezistencie na tetracyklín, PstI pre inzerčnú inaktiváciu génu rezistencie na ampicilín plus unikátne EcoRI miesto bez možnosti selekcie Hostiteľský organizmus: ľubovoľný kmeň Escherichia coli (napríklad HB101)

Bakteriofágy: sú vlastne parazity bakteriálnych buniek a ich reprodukčný cyklus je úzko spojený s reprodukčným cyklom hostiteľskej bunky. Po infekcii bunky (transdukcia) je jej substrátový a energetický potenciál využívaný na syntézu vírových DNA a proteínov, potrebných pre vznik nových fágových častíc, čo infikovanú bunku prakticky zničí (lytická funkcia), za určitých okolností sa môže fágová DNA inkorporovať do chromozómu bunky (lyzogénna funkcia, inkorporovaná DNA sa prenáša do nových jedincov pri delení spolu s chromozómom) a vplyvom environmentálnych faktorov sa môže neskôr z neho uvoľniť a prejsť do lytickej formy. Napr. bakteriofág l, ktorý je najčastejšie využívaný ako vektor pre konštukciu rekombinantnej DNA, predstavuje asi 50 kb veľkú, dvojvláknovú lineárnu DNA s prečnievajúcimi-komplementárnymi-12 nukleotidov dlhými koncami. Po vniknutí do bunky sa však kruhovo uzavrie a hneď v počiatočnej fáze infekcie sa replikuje

Životný cyklus fágových častíc l-dna predstavuje asi 50 kb veľkú, dvojvláknovú lineárnu DNA s prečnievajúcimi-komplementárnymi-12 nukleotidov dlhými koncami. Po vniknutí do bunky sa však kruhovo uzavrie a hneď v počiatočnej fáze infekcie sa replikuje

Základný princíp klonovania cudzorodej DNA v plazmidovom vektore Chimerická molekula DNA» rekombinantná DNA: v gréckej mytológii chiméra predstavuje stvorenie s hlavou leva, telom kozy a chvostom hada

Inzerčná inaktivácia

Priame klonovanie

Životný cyklus fágových častíc a využitie fágovej DNA na klonovanie cudzorodej DNA L P DNA molekula l bakteriofága > 105% < 78%

Klonovanie do l fágových vektorov: do žiadneho fágového vektora nemôžeme klonovať ľubovoľne veľké DNA fragmenty. Z celkového fágového genómu je len 60% nevyhnutne potrebné na propagáciu jeho lytickej funkcie (ľavé, asi 20 kb dlhé rameno, kóduje syntézu proteínov hlavičky a chvosta; pravé, približne rovnako veľké, rameno kóduje syntézu jeho DNA a lytickú funkciu), preto jeho stredná časť, ktorá nie je dôležitá pre jeho lytickú funkciu, môže byť nahradená cudzorodou DNA (asi jedna tretina). Pri celkovej stratégii klonovania do fágových vektorov musíme brať na zreteľ, že viabilita rekombinantných fágových častíc výrazne klesá, keď ich DNA je dlhšia ako 105% a menšia ako 78%, než DNA divokého typu, preto musíme dôsledne dodržovať dĺžku klonovaných fragmentov. Táto zdanlivá nevýhoda je vcelku prospešná pri selekcii rekombinantov, lebo zligované ramená a fragmenty DNA, ktoré nie sú v danom limite veľkosti DNA sa po zbalení in vitro nebudú propagovať a my získame len pozitívne rekombinanty. Ďalšou výhodou použitia fágových vektorov je ich schopnosť autotransformácia do bakteriálnej hostiteľskej bunky.

V prírode možno pozorovať medzi bakteriálnou populáciou spontánny príjem voľnej DNA, efektívnosť tohoto prirodzeného procesu je však veľmi nízka, len 1 z 10 6 molekúl DNA sa môže takýmto spôsobom dostať do bakteriálnej bunky. Prirodzený prenos (konjugácia, transdukcia, transpozícia: transpozómy-pohyblivé gény sa v prírode väčšinou vyskytujú ako súčasť konjugatívnych plazmidov prokaryontov, ktoré sú po prenose do recipientnej bunky schopné integrácie do chromozómu hostiteľa, pričom môžu spôsobiť zmeny v štruktúre a expresii genómu, mutáciu. Transpozómy sú väčšinou nositeľmi génov rezistencie na antibiotiká, môžu sa navzájom spájať a integrovať do seba cudzorodé gény), umelý prenos (chemická transformácia, transformácia protoplastov a sféroplastov, fúzia protoplastov, elektroporácia) je bezprostredne spojený s existenciou vhodných vektorov, ktoré sú schopné replikovať sa v príslušnom organizme (E. coli, B. subtilis, kvasinky, )

Konjugácia bakteriálnych buniek E. coli Elektrónoptické snímky konjugujúcich buniek E. coli

Fágová infekcia bakteriálnych buniek

Elektroporačná aparatúra Schéma prepojenia elektroporačnej aparatúry. Údaje sú uvedené v angličtine, tak ako sú vyznačené na jednotlivých častiach aparatúry (Gene Pulser, Pulse Controller a Sample chamber).

Selekcia, analýza a úprava rekombinantov Selekcia zahrňuje oddelenie rekombinantných molekúl DNA od nerekombinantných (dá sa zabezpečiť celkom úspešne voľbou vhodných vektorov, napr. antibiotickej selekcie pri pbr322). Analýza je výber hľadaného rekombinantu z množstva celkových rekombinantov, obyčajne najzložitejší krok. Pri úprave sa môžu oddeliť funkčné častí génu od nefunkčných, upresní sa jeho restrikčná mapa, určí sa primárna štruktúra, upresní sa jeho poloha a okolie. Na základe týchto informácií môžeme pristúpiť k jeho úprave a reklonovaniu do iného vektora a pod. Analýza rekombinantných génov ja často posledným štádiom práce s rekombinantmi, prenos rekombinantného génu do iného organizmu nie je vždy jediným cieľom génových manipulácií.

Selekcia pozitívnych transformantov

Schéma postupu prác pri príprave rekombinantných DNA 1. 1. 4. 2. 3. 4. Turňa a kol.: Rekombinantné DNA a biotechnológie (1990)